AGRADECIMENTOS
NDICE
Resumo
Summary
ii
Abreviaturas
III
I - Introduo
11 - Objetivos
10
11
11
2 - Enzimas e reagentes
11
3 - Vetores de clonagem
12
4 - Material radioativo
12
12
13
13
13
14
8 - Eletroeluio
14
9 - Ligao
15
15
11 - Experimento de transformao
16
16
17
17
17
18
18
18
14 - Seqenciamento do DNA
19
19
19
20
a)Sequenase
20
b) Klenow
20
21
21
22
23
23
17 - Extrao de RNA
23
24
24
26
27
28
28
28
22.3 - Eletroporao
28
23 - Ensaio de "dot-blot"
28
29
30
31
27 - Ensaio de imunoprecipitao
31
32
32
33
31 - "Western-blot"
33
IV - Resultados
35
35
35
3 - Caracterizao do clone 1
38
42
46
51
51
56
56
58
v - Discusso
67
VI - Referncias Bibliogrficas
76
86
RESUMO
duas clulas filhas a cada diviso celular, a clula mvel e a clula talo, que se
distinguem por sua morfologia, programa de desenvolvimento e capacidade de
replicao do DNA. O gene a/kB de C. crescentus foi identificado num clone que
contm os genes de choque trmico dnaK e dnaJ (Gomes et ai, 1990). Em E
co/i, o gene a/kB mostrou estar envolvido, juntamente com os genes a/kA e ada,
no reparo de leses do DNA causadas por agentes alquilantes (Teo et ai, 1986).
O gene a/kB de E co/i forma um operon com o gene ada, sendo que o gene ada
precede o gene a/kB. A expresso de ambos os genes induzida por doses no
letais de agentes alquilantes,
a nvel de transcrio.
A seqncia de
de Eco/i (Kondo et ai, 1986). Ao contrrio do que ocorre em Eco/i, este gene
no faz parte de um operon com o gene ada e sua expresso no induzida
por agentes alquilantes. Atravs do ensaio de proteo nuclease S1 foi
demonstrada a existncia de um nico incio de transcrio para este gene.
Para medir o nvel de expresso do gene a/kB foi construda a fuso de
transcrio alkB-placZl290, onde o vetor reprter de transcrico (placZl290)
(Gober & Shapiro, 1992) contendo o gene da (3-galactosidase sem o seu
promotor foi ligado ao fragmento Sall/Stul (0,3 kb) que contm apenas a regio
promotora do gene a/kB. Observou-se que a transcrio do gene a/kB
regulada durante o ciclo celular de Cau/obacter crescentus, apresentando nveis
mximos na clula talo. Verificou-se ainda, atravs do experimento de dupla
sincronia, que a protena AlkB de C. crescentus sintetizada na clula prdivisional segregada tanto para a clula mvel como para a clula talo, no
apresentando um padro polar de expresso. A resposta adaptativa a agentes
alquilantes foi demonstrada em C. crescentus pela deteco de um aumento na
sobrevivncia aos efeitos letais dos agentes alquilantes em clulas pr-tratadas
com baixas doses destes agentes e pela identificao de uma protena induzida
por agentes alquilantes utilizando anticorpos monoclonais anti-Ada de E co/i.
ABREVIATURAS
~-D-galactopiranosdeo
kb - quilobases
KS - p81uescript 11 KS
MMS - metil metanosulfonato
MNNG - N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
MNU - N-metil-N-nitrosourea
MOPS - cido 3-[N-morfolino]propanossulfnico
pb - pares de bases
PEG - polietilenoglicol
Pipes - piperazina-N,N'-bis 2-cido etanossulfnico
ORF - quadro aberto de leitura
RF - forma replicativa do fago lambda
rprn - rotaes por minuto
RNA - cido ribonuclico
RNAse - nuclease de RNA
RNAsin - inibidor de nucleases de RNA
iii
X-gal -
5-bromo-4-cloro-3-indolil-~-D-galactosdeo
iv
INTRODUO
~ULA
VEL
Q
~~
o
:;
Q_O/9
C~LA ~Q
ClULA
TAlO
?R-DIVISIONAL
clULA
TALO
REPLICAAO 00 DNA
estruturais
originando
uma
clula
com
plos
marcados
dois
plos
da clula
prdivisional
esto
de
alguma
forma
marcados,
P da haloenzima da
realizados
em
E.
coli
(Kondo
colaboradores,
1986)
frequncia de
GC~AT
(Richardson e colaboradores,
1987).
Convm ressaltar que apesar das leses causadas pelos agentes
alquilantes MNNG, MNU, MMS, DMS e EMS serem as mesmas, o mecanismo
diferente, pois estes produzem leses em diferentes propores (Lawley &
Thatcher, 1970). Existem dois tipos de vias pelos quais atuam os agentes
alquilantes, a via SN1 e a via SN2. A via SN2, mecanismo pelo qual atuam os
agentes alquilantes MMS, DMS e EMS, alquila predominantemente o nitrognio
das bases do DNA, produzindo pouca alquilao nos oxignios das bases e do
fosfato. Enquanto que os agentes que atuam pela via SN1, como o MNNG e
MNU, alquilam de modo eficaz tanto os nitrognios quanto os oxignios do DNA
(Daye colaboradores, 1987 e Singer & Grunberger, 1983).
Exposio das clulas de E. coli a baixas concentraes de agentes
alquilantes induz a resistncia a efeitos mutagnicos e letais das exposies
subsequentes a agentes metilantes e etilantes (Samson & Cairns, 1977). Esta
resposta, denominada resposta adaptativa a agentes alquilantes, regulada
positivamente pelo produto do gene ada e induz a sntese de pelo menos quatro
protenas: a 06-metil-guanina-DNA metiltranferase e 3-metil-adenina-DNA
glicosilase 11, codificada respectivamente pelos genes ada e alkA e os produtos
do gene aidB e alkB (Schendel & Robins, 1978; Karran e colaboradores, 1982).
A enzima 3-metil-adenina-DNA glicosilase 11 (AlkA) ativa para reparar 3metil-adenina, 3-metil-guanina, 7-metil-guanina, 02-metil-citosina e 02-metiltimidina (Lindahl e colaboradores, 1982 e 1984), enquanto a enzima 06-metilguanina-DNA-metiltransferase (Ada) repara 06-metil-guanina, 04-metil-timidina
e metilfosfotrister (Ahmed & Lavai, 1984). As protenas AlkS e AidS ainda no
tem sua funo caracterizada.
7
possue
atividade
de
DNA
metiltransferase
que
repara
realizados
em
Salmonella
typhimurium
(Yamada
OBJETIVOS
LO
MATERIAIS E MTODOS
Caulobacter
crescentus NA100 mantida em nosso laboratrio em placas de meio slido
A
(50~g/ml)
ou tetraciclina (2
~g/ml).
~g/ml)
ou tetraciclina
2. Enzimas e reagentes
11
3. Vetores de clonagem
Os vetores utilizados foram os seguintes:
.pBluescript KS e SK: Stratagene
.pBluescribe: Stratagene
.M13mp18 e 19: Yanish-Perron e colaboradores, 1985
.pUC: Yanish-Perron e colaboradores, 1985
.placZl290: Gober & Shapiro, 1992
4. Material radioativo
Os compostos radioativos foram obtidos da Amersham: [a- 32 P]-dATP
(3000 Ci/mmol); [a- 32 P]-dCTP (3000 Ci/mmol); [y_32p]ATP (1000Cilmmol); [a35S]-dATP (1000 Cilmmol) e [35S]-metionina (1000-1400 Ci/mmol).
12000 rpm em minifuge por 5 minutos, o DNA foi precipitado pela adio de dois
volumes de etanol absoluto. Aps centrifugao a 12000 rpm em Minifuge por
30 minutos a 4 0 C, o DNA precipitado foi lavado com 1 ml de etanol 80 %, seco
a vcuo e ressuspenso em 50 /lI de TE contendo RNAse (20 /lg/ml).
8. Eletroeluio
A fatia do gel contendo o inserto isolado foi colocado em um saco de
dilise imersa em tampo TBE 0,5 X (tris-base 54 g/I, EDTA 0,5 M, cido brico
14
27,S g/l), e submetida a uma voltagem de 100 V durante duas horas. Aps a
inverso da polaridade por 2,S minutos, ao lquido contendo o DNA
foi
e 1
~I
de tRNA de levedura (1
~g/ml).
~I
de TE (Tris-HCI 10
~I
de TE contendo
9. Ligao
Os vetores de interesse foram digeridos com as enzimas de restrio
adequadas nas mesmas condies descritas no item 7. Os vetores foram
ligados ao inserto em tampo Tris-HCI 80 mM pH 7,6 contendo MgCI2 8mM,
DTI 1mM, ATP 1mM, PEG S% e S U de T4 DNA ligase em um volume final de
20 ~1. A reao de ligao foi feita a 190 C durante a noite.
Convm ressaltar que em alguns casos, os vetores foram defosforilados
para evitar que o vetor religue sem a presena do inserto. Para tanto, o vetor
digerido foi tratado com fosfatase alcalina (1
U/~I)
17
13.3. Marcao da sonda do fragmento de DNA de interesse com [0.32p]-dATP e [a- 32 P]-dCTP
O sistema usado para a marcao da sonda foi o de "random primed
synthesis", que utiliza como "primer" o hexanucleotdeo pd(N)6 (Pharmacia),
segundo o mtodo de Feinberg & Vogelstein (1983).
A marcao foi iniciada com 2 JlI do fragmento de interesse e 1 JlI (6Jlg)
do "primer", sendo a mistura fervida por 2 minutos e resfriada rapidamente no
gelo. A seguir foi adicionado 3 JlI de tampo RP 10X ( Tris-HCI pH 7,2 0,5 M;
MgCI2 100 mM e OTI 10 mM); 1,5 JlI de dTIP (750 Jlm); 1,5 JlI de dGTP (750 Jl
m); 50 JlCi (a- 32 P]-dCTP; 50 JlCi (a- 32 P]-dATP; 1 JlI de BSA acetilada (2,5 g/ml)
e 1 JlI da polimerase Klenow (5 unidades) num volume final de 30 Jll.
A reao foi incubada temperatura ambiente por 3hs, e aps este
perodo foram adicionados 2 JlI de EOTA 0,2 M; 90 JlI de STE (TE contendo
NaCI 0,1 M); 2 JlI de SOS 10% para parar a reao. Com a finalidade de
remover os nucleotdeos livres e os fragmentos pequenos, a mistura foi
submetida a separao em uma coluna de 0,9 ml de resina Sephadex G-50,
equilibrada em 20 ml de STE (TE contendo NaCI 0,1 M). Para tanto, a coluna
equilibrada em STE foi centrifugada a 2500 xg por 4 minutos para o
empacotamento. A seguir, a mistura foi adicionada coluna e procedeu-se nova
centrifugao.
A radioatividade da amostra foi determinada aps precipitao de uma
alquota da amostra com TCA 10% em papel 3MM e contagem
em
espectrmetro de cintilao.
13.4. Hibridao com sonda marcada
Os filtros de nitrocelulose ou nylon, com o ONA j fixado, foram
incubados com 10 ml de tampo fosfato de potssio pH 6,2 60 mM, contendo
SSC 5X concentrado; EOTA 10 mM; SOS 0,4%; formamida 30% e leite
desnatado por 2 horas a 37 0 C. Aps este perodo, a soluo foi substituda por
outros 10 ml da mesma soluo contendo a sonda marcada (5 x 106 cpm/ml)
desnaturada por fervura. A hibridao foi realizada a 37 0 C sob fraca agitao
por aproximadamente 15 horas.
13.5. Lavagem dos filtros
Aps a hibridao, os filtros foram lavados trs vezes a 37 0 C sob
agitao por 45 minutos. As lavagens foram realizadas sucessivamente com
18
SSC 2 X contendo SOS 0,1 %; SSC 1,0 X contendo SOS 0,1 % e SSC 0,1 X
contendo SOS 0,1 %. O filtro foi seco por 30 minutos a tempertura ambiente e
exposto a filme de raio X a -70 0 C.
Estas condies de hibridao e lavagem so condies de alta
exigncia.
Os sinais positivos obtidos correspondem as colnias recombinantes que
possue o gene de interesse. A seguir foi efetuada a mini preparao de ONA
das provveis colnias positivas, seguida de uma digesto com a enzima de
restrio adequada para a retirada do inserto e anlise em gel de agarose ou
acrilamida para confirmar se os plasmdeos realmente contm o inserto de
interesse.
As reaes
de seqncia foram
realizadas
utilizando
a enzima
20
21
minutos.
precipitado contendo o ONA foi lavado com 1 ml de etanoI 80 %,
seco a vcuo e ressuspenso em 40 J..l1 de TE. Para verificar a quantidade de
ONA obtida, 1 J..l1 da amostra foi diluda em 1 ml de gua e foi realizada a leitura
da amostra em 0.0.260 e 0.0'280. A amostra ser considerada boa quando a
razo da 0.0.260'0.0.280 for em torno de 1,8-2,0.
14.2.2)Seqenciamento do DNA dupla fita
Inicialmente, foi realizada a desnaturao alcalina do ONA fita dupla.
Para tanto, foi utilizado 5 J..lg do ONA preparado conforme descrito acima e ao
qual foi adicionado 3 J..l1 de uma soluo recm preparada de NaOH 2 M e 3 J..l1
EOTA 20 mM num volume final igual a 30 J..ll. Aps uma incubao de 20
minutos a 37 0 C, o ONA desnaturado foi precipitado pela adio de 0,1 volume
de NaOAc 3 M e 2 volumes de etanoI absoluto, incubado em banho de gelo
seco/etanol, centrifugado por 15 minutos a 40 C a 12000 rpm em Minifuge, seco
a vcuo e ressuspenso em 3 J..l1 de H20.
22
~I
de uma
~I
de
25
o ensaio foi
da
seguinte
maneira:
Aproximadamente
10
pmoles
do
marcado
foram
gel de poliacrilamida 6%-uria 8,3 M em TBE. Aps a corrida, o gel foi seco e
exposto a filme de raioX temperatura de -70C.
no
possvel
transformar
Caulobacter
pelos
mtodos
27
(~bla,
=0,8.
28
~-galactosidase
~-galactosidase
~-mercaptoetanol
SO mM) e SO JlI de
29
unidades
p-galactosidase
cultura
foi
incubada
30 0 C
sob
agitao
durante
Foi
acrescentado mais meio lquido M2 para se obter uma 0.0.600 igual a 0,5. As
clulas foram calocadas a 30 0 C sob agitao e deixadas prosseguirem no ciclo
celular. Nos tempos determinados foram retiradas alquotas para marcao de
protenas com pulsos de [35S]-metionina.
~I
~I
~I
de SOS/PHAGE (40
31
~I).
final foi
5 minutos e
adicionado 1
minutos e seco sob vcuo a aooc por 2 horas. O gel foi exposto a filme de raio
X temperatura de -70 0 C.
LS (Oupont)
31. "Western-blot"
por Towbin
filtros foram lavados 4 vezes com TBST (TBS com detergente Tween 0,05%) e
uma vez com TBS. O complexo antgeno-anticorpo foi incubado por uma hora
com soro anti IgG de camundongo conjugado fosfatase alcalina. O filtro foi
novamente lavado com TBST por 40 minutos (4 lavagens de 10 minutos) e uma
vez com TBS por 10 minutos para remover os resduos de Tween 20. A seguir,
o filtro foi incubado no escuro com uma soluo de BCIP/NBT (Tris-HCI 100 mM
pH 9,5; NaCI 100 mM; MgCI2 5 mM; nitro-azul de tetrazolium 0,3 mg/ml e 5bromo-4-c1oro-3-indolil fosfato 0,15 mg/ml). Os precipitados residuais foram
lavados com TBS e o filtro foi seco ao ar e guardado protegido da luz.
34
RESULTADOS
1.
Isolamento
do
clone
genmico
contendo
toda
regio
trmico
dnaK
dnaJ
de
Caulobacter crescentus
(Gomes
1,0 kb
, ,
B
S
~
8r:}=.
I.LU
--.
x
I
@j~trf ~? ::~r~t~\m~~j
;
alkB
.t:t.
SpRS
dnaJ
dnaK
fragmento Sam-Sal (0,9 kb)
~:{::::<:=:ff_
(fragmento
BamHI-Sall)
BamHI-Pstl)." Enzimas
de
e para
restrio:
seqenciamento
B,BamHI;
C,Clal;
36
PM 1 2
23,130 9,416 -
6,557 -
FIGURA 03:
Auto-radiograma do "Southern-blot"
de
DNA total
de
colnias
brancas
carregando
X-gal
plasmdeos
foram
contendo
plaqueadas
em
insertos,
duplicatas
3. Caracterizao do clone 1
Para caracterizar o clone 1, foi realizada preparao de DNA de
plasmdeo em grande escala, que foi utilizada para obter o seu mapa de
restrio parcial. Para isso, foram realizadas digestes simples ou duplas com
vrias enzimas de restrio. As enzimas utilizadas foram as seguintes: BamHI;
BamHI
e Pst/; Pst/; Kpnl; BamHI e Kpn/, Clal, Clal e BamHI, Xho/, BamHI e Xhol
38
----_ .. _--
...---.------
--- ---
PM 1 2 3
PM 1 2 3 4
23,130 -
23,130 -
9,416 -
9,416 -
6,557 -
6,557 -
4,361 -
4,361 -
2,322 -+
2,027 -
2 322 2:027 -
.... 7,Okb
.:.:.:
possveis clones positivos digeridos com a enzima Pstl foi trasferido para um
filtro de nylon e hibridado com o fragmento Bam-Pst marcado com [a- 32 P]-dATP
e (a- 32 P]-dCTP.
40
A
PM 1 2
23,130
9,416
6,557
4,361
3 4 5
7 8
9 10
7 8
9 10
2,322 _
2,027 -
B
PM 1 2
23,130
9,416
6,557
4,361
3 4 5
2,322 _
2,027 -
lambda digerido com a enzima Hindlll. B) Auto-radiograma do "Southernblot" do gel de agarose em condies de alta exigncia. O filtro de nylon foi
hibridado com o fragmento Bam-Sal marcado com [a- 32 P]-dATP e [a- 32 p]-
dCTP.
41
de
oligonucleotdeo
com
transcriptase
reversa
utilizamos
=1
a uma temperatura de 30 0 C. O
42
t@:M%JW._
1 kb
S 8 X
alkB
4,7 kb
2,3 kb
---~
-289
-280
-250
-240
-270
-260
GTCGACGAA AATCAAACGG GCGGAATGCG TTGTGCGAAG TTGACGAGCC CGTCAACCCC
SaiI
-230
-220
-210
-190
-180
-200
GCTTCGGAGC CGGATATGGG GGATAGGGGC CGCCACGCAA GGCCATAACC CCTCCCACGA
-170
CGGGGGAATC
-160
TGGATTCCGG
-150
GCCAAGAAAA
-140
ACGGCCGCAG
-130
CCGATGCGCC
-120
GGGGGCAAAC
-110
GATGCATGAG
-100
CGGCGGTTTT
-90
GTGGAAAATG
-80
GCTGTTGTTC
-70
GCCGGGCTGT
-60
GGCGGCGCGT
-50
GGGCTCCAGA
-10
-40
TGATCGCCAA
-30
GCCTCTCACC
-20
GTTGTCCCCG
-10
GCTTTGACGT
StuI 15
30
45
60
CCT GCT GGA TAC TCG GCG CAG CGC GCC TTG GTC GAA GCG GTG CTA GCG GGC GCC
Pro Ala Gly Tyr Ser Ala Gln Arg Ala Leu Vai Glu Ala Vai Leu Ala Gly Ala
75
90
105
GAA CAG GCG CCC TTT TCG AAC TAT AGG ACC GCC TAC GGG AAG
Glu Gln Ala Pro Phe Ser Asn Tyr Arg Thr Ala Tyr Gly Lys
ABl
120
135
150
GCG ATG ACG GCG CTT GGG TCG CTG GGC TGG ACC AGC GAC GCG
Ala Met Thr Ala Leu Gly Ser Leu Gly Trp Thr Ser Asp Ala
180
TAT GTC GAT CGT CAT CCC
Tyr Vai Asp Arg His Pro
PvuI
240
CTG CTC GAC CTC TGG ACG
Leu Leu Asp Leu Trp Thr
195
210
225
GAA ACG GGC CGA CCC TGG CCC GAC ATG CCG CCG GCC
Glu Thr Gly Arg Pro Trp Pro Asp Met Pro Pro Ala
255
270
GTG CTC GGC GAC CCG GAA ACC CCG CCG GAT TCC GTT
Vai Leu Gly Asp Pro Glu Thr Pro Pro Asp Ser Vai
285
300
315
330
CTG GTC AAC CTC TAC GCG ACG CGG ACG GGC GCG CGC ATG GGA CTG CAT CAG GAC
Leu Vai Asn Leu Tyr Ala Thr Arg Thr Giy Ala Arg Met Gly Leu His G1n Asp
D55
360
345
375
CGT GAC GAG GCC GAT CCC CGA TTT CCG GTG ATG TCG ATC TCG CTG GGC GAC ACG
Arg Asp Giu Ala Asp Pro Arg Phe Pro Vai Met Ser Iie Ser Leu Giy Asp Thr
390
405
420
435
GCG GTG TTC CGG ATC GGC GGC GTC AAC CGC AAG GAC CCG ACA AGA AGC CTT CGC
Ala Vai Phe Arg Iie Giy Gly Vai Asn Arg Lys Asp Pro Thr Arg Ser Leu Arg
450
465
495
480
TTG GCGTCG GGC GAC GTC TGT CGC CTC TTG GGC CCT GCG CGC CTG GCG TTC CAC
Leu Ala Ser Giy Asp Vai Cys Arg Leu Leu G1y Pro Ala Arg Leu Ala Phe His
510
GGC GTC GAC CGG ATT CTG CCC GGA TCC
Gly Vai Asp Arg Iie Leu Pro Giy Ser
BamHI
555
570
GCG CGG CGG TCC GCG TGG GGA TCT CTA
Ala Arg Arg Ser Ala Trp Giy Ser Leu
525
540
GCC TGG CCG GCG AAG GCG ACG CCG CGC
Ala Trp Pro Ala Lys Ala Thr Pro Arg
585
600
CAT CTT CCT GTC AGT GAC CCC GCA CGA
His Leu Pro Vai Ser Asp Pro Ala Arg
615
GCT GTT CGA GCG TGA
Ala Vai Arg Ala *
10
20
30
40
50
60
AlkB C.c. RPAGYSAQRALVEAVLAGAEQAPFSNYRTAYGKPMSVAMTALGSLGWTSDARGYRYVDRH
....
. . .. .. .
.
.
..
.. .. .
. "
.
AlkB E.c. RRFAFNAAEQLIRDINDVASQSPFRQMVTPGGYTMSVAMTNCGHLGWTTHRQGYLYSPID
30
40
50
60
70
80
70
80
90
100
110
AlkB C.c. PETGRPWPDMPPALLDL----WTVLGDPETPPDSCLVNLYATGARMGLHQDRDEADPRFP
:.: .. : : : . : : . . . . :
: . : : . . X:.::.:
::.:: ... : : : : . : : . :
. : . : .. :: .. : . : :
.. :
:.
:::
: . : : . :X . . . . . :
45
=1 a
de Caulobacter
crescentus
.t6
T CG A
PE
....
.....
.....
TCGA
MW
310 pb
271 pb
234 pb
194 pb
+-178 pb
118 pb
~8
A
-289
GTCGACGAAAATCAAACGGGCGGAATGCGTTGTGCGAAGTTGACGAGCCCGTCAACCCC
SaiI
-230
GCTTCGGAGCCGGATATGGGGGATAGGGGCCGCCACGCAAGGCCATAACCCCTCCCACGA
-170
CGGGGGAATCTGGATTCCGGGCCAAGAAAAACGGCCGCAGCCGATGCGCCGGGGGCAAAC
-1l0
-10
GATGCATGAGCGGCGGTTTTGTGGAAAATGGCTGTTGTTCGCCGGGCTGTGGCGGCGCGT
-35
-35
**
-10
-50
GGGCTCCAGATGATCGCCAAGCCTCTCACCGTTGTCCCCGGCTTTGACGT ATG GCC AGG
00
Met Ala Arg
-50
-O
51
--70
~ -30
r-I
20
--------
-10
49
secundria deduzida pelo programa (Fig. 12B), foi possvel observar a formao
de uma ala na regio promotora, que poderia causar uma pausa inespecfica
da transcriptase reversa.
quanto
atividade
de
p-galactosidase.
Para
realizar
este
alkB-placZl290
foram
inoculadas
em
meio
lquido
PYE
51
Prom. alkB
Sc
placZl290
~Xb
Sp H
'~,J
!=W/J
&!4r-13---ga-Ia-ct-os-id-as-'efww~
iiN??WA
(St)
B
.-
F;;;;;;;;;;;;l
alkB
pGR24
SP~
I
I
1111
r..jr,(1r........
St S
pBluescript 11 KS
AX
....................1
...1..
S S5
RS
t;;;;;;;;;;;;;;:I
alka..........
I ..r....
I
f;
5..
Sm B
!... ..1
'.
K
placZl290
Sc
I
...1. '.'
Xb
I.:.:.;.;.:)
Sc
!..
K
;.:.;.1:.:
Sma I
Xma I Bam HI
;.:.".:.:1:.:.;
;;
J ;
Xb
:.:.:.;.:.:. :.!
Sp
;........
H
!.;.;.;;.
13 - galactosidase
-.
~-galactosidase
sem o seu
~-galactosidase
sob o controle do
uma 0.0.600 =0,1 e dividida em duas amostras. Estas foram incubadas com ou
sem 0,01 % de MMS a 30 0 C
e a atividade de l3-galactosidase foi determinada nos tempos de O, 30, 60, 120 e
180 minutos aps a adio da droga. Constatou-se que a transcrio do gene
alkB de Caulobacter no induzida pelo MMS (Fig. 14). Foram testadas outras
concentraes de MMS (0,1 % e 0,05 %) e tambm no foi observada induo
(resultado no mostrado).
A fim de verificar se o promotor do gene alkB de C. crescentus sensvel
a outros agentes alquilantes, o mesmo ensaio foi realizado utilizando os
agentes alquilantes etil metanosulfonato (EMS) e dimetil metanosulfonato
(OMS). Com esta finalidade as clulas nas mesmas condies acima descritas
foram tratadas com 0,01 %; 0,05 % e 0,1 % de EMS ou OMS. Como controle foi
realizado um experimento em paralelo sem adio de agentes alquilantes.
Atravs deste experimento no observamos nenhuma induo devido a adio
destes agentes (resultados no mostrados).
Para verificar atravs do ensaio de imunoprecipitao, que mais
sensvel do que a simples determinao da atividade de l3-galactosidase se a
transcrio do gene alkB de C. crescentus induzida pelo agente alquilante
MMS, as clulas de Caulobacter que contm a fuso de transcrio alkBplacZl290, foram incubadas com MMS 0,01 % durante O, 10, 30, 60, 90 e 120
minutos. Como controle positivo foi utilizada uma cepa de Caulobacter que
contm a fuso de transcrio groESL-placZl290 (onde o vetor reprter de
transcrio placZl290 contendo o gene da l3-galactosdase sem o seu promotor
foi ligado a regio promotora do operon groESL de Caulobacter), cedida pelo
aluno de doutoramento Marcelo Avedissian. Tal construo, pode ser usada
como controle positivo, pois algumas protenas de choque trmico so induzidas
por agentes alquilantes, entre elas GroES e GroEL (Lemotte & Walker, 1985).
Alquotas de clulas dos vrios tempos de tratamento com MMS foram
marcadas com pulsos de [35S]-metionina por 10 minutos. Os extratos celulares
obtidos foram imunoprecipitados com anticorpo anti-l3-galactosidase e os
imunoprecipitados foram resolvidos em gel de poliacrilamida-SOS. O autoradiograma mostrou que a transcrio do gene alkB de C. crescentus no
induzida por MMS, enquanto que a transcrio dirigida pelo promotor de groESL
induzida, conforme o esperado (Fig. 15).
53
1000
l i)
Q)
"O
cu
"O
C
:J
.........
750
Q)
li)
cu
li)
.....uo
cu
roO>
500
.....CUQ)
.o
Q)
"O
Q)
250
"O
cu
"O
's;
:;:;
- . - controle
o
O
50
150
100
200
tempo (min)
= 0,5 e ento
A
o
10 30 60 90 120
B
O 10 30 60 90 120
+- f3 -
galactosidase
utilizado
para transformar
Caulobacter.
No
recombinante foi
Caulobacter.
No
55
em
gel
de
poliacrilamida-SOS.
autoradiograma
deste
= 0,9.
As
----.-
~-
Q?QOv0~
--- -=-====-=
200 kOa
-13 - gal
174 kOa
1-0-
p-'tlalac1Dsidase
-G-flagetinas
69 kDa
35
30
46 kOa
~ 25
~
! 20
~
~ 15
30 kOa
'ii
c:
B
ftagelinas
10
5
30 0Cl
00
I!::.i<~:~ ~:
oI
O
'n----------df-----+----+----f
30
60
90
120
150
tempo (min)
180
prdivisionais (2 horas). A seguir, estas clulas foram marcadas com [35S]metionina por 10 minutos e depois foi feita a -caa com metionina fria 0,1 mMpeptona 0,2%. As clulas marcadas prosseguiram no ciclo at a diviso celular,
e ento as clulas mveis e as clulas talo foram isoladas por centrifugao em
novo gradiente de densidade de LUDOX. Os extratos destas clulas foram
imunoprecipitados com anticorpo anti-p-galactosidase e os imunoprecipitados
resolvidos
em
gel
de
poliacrilamida-SDS.
Os
extratos
tambm
foram
realizar
este
experimento,
fragmento
Stul/BamHl,
de
" "
MW
200 kDa
174 kDa
69 kDa
46 kDa
f1agelinas
<
30 kDa
4.3 kDa
= 0,9
59
c-*-.--'.-_
__
_ ,
__ o
Se
Xb
K X S H
'
____
(St) B
Sl
~A
i........
_ _ _._
StB
-JJ-
3,5 kb
B
1000000000000000
St
stB
000000",000000000",>00",00000000000000.000000000000000"'.00000000.0.0.0.0.0.0...............
0000000000000000.11I
,~
B
1,0,0,0,0
stB
000>0;;0;0;"'0;000;0;0000;;.;.;0;;.;;.;.,.:",.,.,.,
,', ......,.:.:.:.:.:.:.,.,.,.,.,.,.:.:.,,,,,,:.;0;;00;;;000>0/0;;;0;0;;;0;;0
;ooo,o,o;oo;;ooo,ooo,o,o,o;o;;,;;;,ooti
3,5 kb
B
I
3,35 kb
& B
~
e Xb, Xbal.
60
inserto foi feita via eletroporao. As clulas foram plaqueadas em placas PYEgar contendo ampicilina (50 /lg/ml).
As colnias capazes de crescer em meio PYE contendo ampicilina,
provavelmente so colnias que integraram o vetor KS contendo o fragmento
Stul/BamHI atravs do processo de recombinao (Fig. 18B), pois a resistncia
a ampicilina conferida pelo vetor KS. Para verificarmos se a integrao
ocorreu no local esperado e somente em um local foi realizada a preparao do
ONA genmico das 8 colnias de C. crescentus obtidas da eletroporao com o
plasmdeo.
Aps a digesto do ONA com a enzima de restrio BamHI (Fig. 18C) as
amostras foram analisadas em duplicatas em gel de agarose 1% (Fig. 19A). A
seguir, o ONA foi transferido para um filtro de nylon segundo o mtodo de
Southern (1975) e hibridado. Um dos filtros foi hibridado com o fragmento
BamHI-Sall (Fig. 02) e o outro com o vetor KS digerido com a enzima BamHI,
ambos marcados com [u_ 32 p]-dATP e [u_ 32 p]-dCTP. Aps a lavagem dos filtros
em condies de alta exigncia, os filmes foram expostos a filme de raio X a 70 0 C. Atravs da Fig. 19C, o resultado esperado era que o fragmento
Stul/BamHI marcado com 32p reconhecesse duas bandas, uma de 3,5 kb e
outra de aproximadamente 3,35 kb. O vetor KS marcado 32p, por outro lado,
deve reconhecer apenas a banda de 3,35 kb. Atravs do autoradiograma (Fig.
19B) foi observado que no foi obtida nenhuma colnia que tivesse o gene de
adaptativa
ao
MMS em
Caulobacter
crescentus
Com o intuito de investigar se a bactria C. crescentus apresenta
resposta adaptativa foi realizado o seguinte experimento: a cepa selvagem
NA100 foi inoculada em meio mnimo M2 suplementado com CaCI2 0,5 mM e
incubada durante a noite sob agitao a 30 0 C. No' dia seguinte, a cultura foi
diluda para uma 0.0.600 = 0,1 e mantida sob agitao constante a 3a o C at
atingir 0.0.600
= 0,4.
A
1
PM Cc3
5 S 7 S G 10
62
81
1
Cc 3
5 S 7 S G 10
Cc3 4 5 S 7 S 9 10
3,5kb -
62
nos tempos O, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 minutos foi adicionado a 1
ml da cultura 1 % ou 0,5 % de MMS seguindo-se incubao por 5 minutos. Aps
a incubao, a cultura foi filtrada, diluda, plaqueada em placas PYE gar e
incubada por 3-4 dias a 30 0 C. Aps este perodo, foi efetuada a contagem dos
sobreviventes (Fig. 20). Verificou-se que aps 180 minutos de pr-incubao
com 0,01 % de MMS houve um aumento no nmero de sobreviventes. Com
estes resultados podemos supor a presena de uma resposta adaptativa fraca
em C. crescentus, que comearia aps 3 horas do tratamento. Convm ressaltar
que no experimento onde foi utilizado 1 % de MMS, no foram obtidos
sobreviventes.
Devido ao fato de termos observado uma resposta adaptativa em C.
imunoprecipitados
com
anticorpo
anti-p-galactosidase
os
0,4. A seguir, a cultura foi incubada com 0,01 % de MMS e nos tempos O, 30,
60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 minutos foram preparados extratos de C.
45CXXJ
4OXO
35OCO
111
41
C 3OC'OO
41
>
'>41
...
.Q
25CXXJ
S
41
'O
2CXXXl
...
O
41
E 15COO
.~
1CXXXJ
5COO
O
C
30
00
00
120
150
180
210
240
tempo (mini
64
A
PM Cc
30
60
c
16
14
<1l
>
12
~1
30
60
B
PM Cc
90 120 150180210240
00
180
50
100
150
200
tempo (min)
116
84
58
48,5
36,S
26,6
65
250
66
Discusso
de
alkB
consequentemente
foi
possvel
realizar
(Morohoshi
e colaboradores,
1990),
Salmonella typhimurium
(Hakura
1986)
parcialmente
em
S.
typhimurium
(Hakura
colaboradores, 1991).
Em S. typhmurum o gene alkB tambm forma um operon junto com o
gene ada, mas o cdon de terminao do gene ada no se sobrepe ao cdon
de iniciao do gene alkB como em E. col, pois estes esto separados por 2 pb.
No se investigou, porm a quantidade de protena sintetizada por cada um
destes genes (Hakura e colaboradores, 1991). Em B. subtils, no entanto, no foi
encontrado a 3' do gene ada nenhuma seqncia que apresentasse homologia
com o gene alkB (Morohoshi e colaboradores, 1990). Com esses dados
podemos concluir que se existe o gene alkB neste microorganismo este no faz
parte de um operon junto com o gene ada.
Atravs da comparao da seqncia de aminocidos deduzida da
seqncia de nucleotdeos do gene alkB de C. crescentus foi observado uma
identidade de 42,5 % com a protena AlkB de E. cal (Kondo e colaboradores,
1986). Essa porcentagem de identidade bastante significativa, tendo em vista
que a identidade encontrada entre protenas envolvidas na resposta adaptativa
em diferentes organismos inferior a esta ou de igual porcentagem, com a
ressalva de que neste ltimo caso foram comparadas regies da protena e no
a protena inteira. A protena AlkA de B. subtls, por exemplo, apresenta uma
identidade de 26 % com a protena AlkA de E. cal (Morohoshi e colaboradores,
1993). Entretanto a protena AdaB de B. subtls apresenta uma identidade de 46
% com a poro amino terminal da protena Ada de E. cal (Morohoshi e
.<
typhmurium
(Yamada
efeitos
respectivamente
(resultados no
realizado
por outros
de
nucleotdeos nas 3 fases de leitura e nas duas orientaes foi enviada para o
GenBank. Entretanto no foi encontrado nenhum quadro aberto de leitura. Outra
explicao que foi utilizado um fragmento pequeno, cerca de 350 pb, o que
dificultaria a recombinao homloga.
Para investigar a presena de resposta adaptativa em Caulobacter
Nestes
Resposta Adaptativa
Detectvel
No detectvel
Aspergillus nidulans
Aerobacter aerogenes
Bacillus subtilis
Chaetodipus intermedius
Bacillus thuringiensis
Chlamydomonas reinhardtii
Escherichia col
Haemophilus influenzae
Escherichia hermanii
Lactobacillus lactis
Escherichia fergusonii
Neisseria gonorrhoeae
Gloetrichia ghosei
Klebsiella aerogenes
Rhizobium meliloti
Saccharomyces cerevisae
Micrococcus luteus
Salmonella typhimurium
Pseudomonas aeruginosa
Streptococcus aureus
Rhodobacter capsulatus
Rhodobacter sphaeroides
Streptomyces fradiae
Shigella sonnei
Shigella boydii
Xanthomonas maltophilia
em
2),
os
anticorpos
crescentus.
Convm ressaltar que os extratos de C. crescentus foram incubados
separadamente com os anticorpos anti-Ada de E. col MC-A1 e MC-A2, sendo
que somente o anticorpo MC-A2 reconheceu a protena de 39 kDa indutvel por
MMS. O epitopo do anticorpo MC-A2 est localizado no domnio carboxiterminal da protena Ada de E. col enquanto que o epitopo do anticorpo MC-A1
est localizado no domnio amino-terminal (Vaughan & Sedgwick, 1991). Tal
resultado sugere que a protena de 39 kDa reconhecida pelo anticorpo MC-A2
em C. crescentus deve possuir o domnio carboxi-terminal, que corresponde
atividade de metiltransferase capaz de reparar as leses 06-metilguanina e 0 4 metiltimina. Devido ao fato de que a protena de C. crescentus no foi
reconhecida pelo anticorpo MC-A1, esta protena no deve possuir um domnio
amino-terminal semelhante ao da protena de E. col. O domnio amino terminal
da protena Ada de E. col repara metilfosfotrister e converte Ada num potente
ativador de transcrio.
Algumas especulaes tem sido realizadas no sentidO' de associar uma
baixa resposta adaptativa a agentes alquilantes a microorganismos que
possuem um alto contedo de GC, pois acredita-se que devido ao alto contedo
73
pela
via
SN1)
(Kataoka
colaboradores,
1983
Chen
colaboradores, 1994).
Vrios estudos tem sido realizados com o intuito de elucidar a funo da
protena AlkB de E. cal. Alguns autores verificaram a hiptese de que a protena
AlkB poderia estar atuando como parte de um complexo multiprotico ou
regulando a transcrio de outros genes cujo produto repara as leses no DNA
causadas pelos agentes alquilantes. No entanto, foi verificado que a expresso
da protena AlkB de E. cal em clulas de mamferos (HeLa) confere resistncia
a alquilao por agentes alqui/antes que atuam pela via SN2 nestas clulas
mesmo na ausncia de outras protenas e genes de E. cal. Ou seja, a
resistncia a alquilao a agentes alquilantes que atuam pela via SN2 uma
funo intrnseca da protena AlkB de E. cal (Chen a colaboradores, 1994).
A hiptese de que a protena AlkB atuaria prevenindo a alquilao do
DNA tambm foi verificada e descartada, pois foi verificado que a quantidade de
74
.-
75
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