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ANTIBIOTICOS

PRODUCCION DE PENICILINA
Definicin y Procedencia. Un antibitico es una sustancia qumica producida por un
organismo vivo que muestra actividad inhibidora o germicida frente a
microorganismos.
La actividad antibitica se califica en ocasiones de:
antibacteriana, antifngica o antimicrobiana.
Produccin de antibiticos. Los antibiticos son producidos por ciertos hongos,
bacterias, actinomicetos, algas y lquenes.
El origen ms importante y frtil de antibiticos de importancia comercial es el
gnero Streptomyces de los actinomicetos. Muchos mohos producen antibiticos,
tales como la penicilina que es el ejemplo ms destacado producido por los mohos.
En la produccin de antibiticos muchos de los detalles especficos siguen siendo,
con algunas excepciones secretos industriales.
Produccin de Penicilina. Para la produccin de penicilina se siguen los siguientes
pasos:
1) Aislamiento de mohos.
Mtodo de incubacin directa. Para este mtodo se hace lo siguiente:
a) Se prepara un medio de cultivo de bacterias, el ms usado es el Staphylococcus
aureus. Para el cultivo de estas bacterias se preparan tres medios de nutricin,
que son los siguientes:
Medio 1. Cuya composicin es la siguiente:
Peptona
6,0
Hidrolizado pancretico de caseina
4.0
Extracto de levaduras
3,0
Glucosa
1,0
Agar
15,0
Agua destilada c.s. hasta
1000,0
PH 6,5 6,6 tras la esterilizacin

g.
g.
g.
g.
g.
ml.

Medio 2. Denominado agar base, su composicin es la siguiente:


Peptona
6,0 g.
Extracto de levaduras
3,0 g.
Agar
1,5 g.
Agua destilada c.s. hasta
1000,0 ml.
PH 6,5 6,6 tras la esterilizacin.
Medio 3. Denominado caldo de cultivo, su composicin es la siguiente:
Peptona
Extracto de levaduras
3,0
Extracto de carne de buey
1,5 g.
CLNa
3,5 g.
K2HPC4
3,68 g.
KH2PO4
1,32 g.
Agua destilada c.s. hasta
1000,0 ml.

5,0

g.

El sembrado de bacterias se obtiene de la siguiente forma:


El microorganismo obtenido (Staphylococcus aureus) en tubos inclinados con el
medio 1, se inocula al caldo de cultivo (medio 3), este caldo se deja incubar a 37C
por 16 a 24 horas; 2 ml. De este caldo se mezclan con 100 ml. del medio 1, que se
ha fundido y enfriado a 48C y se tiene listo el cultivo de bacterias. Posteriormente
en una caja petri de 20 x 100 mm. se hecha 21 ml. de agar base (medio 2), se deja
solidificar y se aade 4 ml. de agar sembrado (cultivo de bacterias) y se reparte
uniformemente haciendo oscilar la placas.
b) Las cajas petri con sembrado de bacterias se incuban a 2 37C durante uno a
dos das, despus se deja caer sobre la superficie pequeas partculas de suelo
(fresco o enriquecido), se deja incubar por espacio de 5 a 10 das.
c) Despus de los das indicados se observan las cajas petri, los organismos
antagonistas producirn zonas claras alrededor de sus colonias como resultado
de la inhibicin del crecimiento de las bacterias adyacentes o de su destruccin.
d) Estos microorganismos (mohos) se aislan en colonias o cultivos puros y se
analiza las caractersticas deseadas de las razas productoras de penicilina, que
son principalmente del grupo Penicillium notatun chrysogenun.
e) Pruebas de seleccin del moho aislado: Esta prueba se realiza en medio de
cultivo de bacterias (Staphylococcus aureus). Para sto el cultivo de moho
aislado se somete a crecimiento en un medio que se prepara de la siguiente
forma: se aade 1% en volumen de lquido de remojo de maz (55% de slidos) a
la solucin ezapek ajustando el pH a 7, adicionando 2% de agar y distribuyendo
20 ml. en cada tubo de ensayo, luego se vierte en cajas petri y se siembra el
moho aislado y se incuba; al mismo tiempo se preparan placas testigo con dos
cultivos diferentes de P. Notatun o P. Chrysogenun conocidos como buenos
productores de penicilina, cada placa se debe incubar por espacio de 6 das a
24C. Al final del periodo de incubacin se cortan 4 o 5 muestras con un
sacabocados y se coloca en la superficie del medio de agar sembrado con
Staphylococcus aureus, las plazas se incuban durante una noche a 37C y las
zonas de inhibicin se mide empleando una lupa con una precisin no inferior a
0,25mm. y los resultados se comparan con los testigos.
2.

Produccin de penicilina. La penicilina se puede producir por medio de


cultivo superficial o sumergido. En los medios de cultivo superficial el moho
crece en la superficie de capas poco profundas del medio de fermentacin. En
los medios de cultivo sumergido, el moho se desarrolla sumergido en el medio de
fermentacin.

Mohos usados. Ningn otro detalle tiene mayor importancia en la produccin en


un antibitico que la seleccin de una capa seleccionada apropiada. Las cepas ms
usadas para la produccin de la penicilina son:
P. Notatun y P.Crysogenun.
Medios de esporulacin. En la produccin de penicilina es necesario desarrollar
rpidamente gran nmero de esporas para la inoculacin y resiembra.
Se tiene varios mtodos de esporulacin de los cuales se expondr uno de ellos.
Para el medio de esporulacin se cortan en cubos de un centmetro de lado pan

integral fresco (libre de inhibidos de mohos) y se esteriliza con vapor en capas finas
en matraces Erlenmeyer. El pan enfriado se inocula masivamente con esporas de
mohos y se incuba a 25 - 27C durante 4 - 5 das, despus de sacar los cultivos de
pan se puede guardar durante al menos dos semanas a 40 El plan cubierto de
esporas se puede pulverizar perfectamente a los 6 7 das y se usa para la
inoculacin.
Mtodos de inoculacin. En los mtodos de cultivo superficial, la superficie del
medio se inocula con esporas secas, bien solos o mezcladas con algn tipo de
material de tipo de harina de trigo.
En mtodos de cultivo sumergido al medio de inolucin se puede hacer con esporas
secas, con esporas sin germinar, en suspensin o con grnulos inoculantes.
En un procedimiento de produccin de penicilina, las esporas del moho se usan para
sembrar un medio de germinacin de matraces, despus de un periodo de
incubacin en el sacudidor se transfiere los contenidos de los matraces a recipientes
especiales de metal, este tanque especial se conecta acpticamente al tanque de
siembra y se impulsa al interior del fermentador la suspensin del moho utilizando
aire estril.
Materias primas. En la seleccin de materias primas para la produccin de
penicilina es esencial considerar las necesidades nutricias del hongo, las
condiciones ptimas para la acumulacin de la penicilina y la subsiguiente
extraccin y purificacin de la penicilina.
Fuentes de carbono. La lactosa es la mejor fuente de carbono para la produccin de
penicilina, usndose una concentracin del 6%. Tambin puede usarse 3% de
lactosa, almidn de maz, y dextrina de maz.
A pequeas velocidades de
alimentacin se puede usar glucosa y sacarosa en vez de lactosa.
Fuentes de nitrgeno. Las sustancias usadas como fuente de nitrgeno son: nitrato
sdico, sulfato, acetato, y lactato amnico, lquido de remojo de maz y otros
materiales.
Elementos minerales. Ciertos elementos (P, K, Mg, S, Mn, Cu) parecen esenciales o
al menos beneficiosos para la produccin de penicilina, aunque algunos de ellos se
encuentran en el lquido de remojo de maz. Los diferentes minerales se suministran
en forma de Kh2PO4, MgSD4, 7H20. Las concentraciones de estas sales en el medio
son: KH2PO4, 0,019 M, MgSO47H20 0,002 M y NaN03 0,019 M.
Lquido de remojo de maz. El uso de lquido de remojo de maz en el medio de
fermentacin, aumenta grandemente los rendimientos de penicilina, el lquido de
remojo de maz debe tener la siguiente composicin:
Slidos
40 60%
Acido lctico
12 27% x
Nitrgeno total
7,4 7,8% x
Nitrgeno amnico
2,6 3,3% x
Azcar reductor en glucosa
1,5 14% x
Cenizas
18 20% x
x = referido a producto seco.

Harina de semillas de algodn.


remojo de maz.

Puede usarse como sustituyente del lquido de

Precursores. Sustancias utilizadas en la produccin de antibiticos (penicilina)


para incrementar el rendimiento del producto. Los precursores ms usados son:
fenil actico que favorece la produccin de la penicilina G por P. Chrisogenun.
El cido p-hidroxifenil actico incrementa la produccin de penicilina X Aminocido
L-cistina, L-cinteina y valinas.
Condiciones de fermentacin.
Temperatura. La temperatura ptima para la produccin de penicilina parece ser de
24C.
Regulacin de pH. Es esencial la regulacin de pH durante la fermentacin, ya que
un pH alto o bajo origina considerables prdidas de penicilina.
El pH de fermentacin debe mantenerse de 5 a 7.5.
El pH del medio resulta afectado por el tipo y cantidad de azcar presente, cantidad
de lquido de remojo de maz, existencia de amortiguadores, etc.
Aireacin. La adecuada aireacin es esencial para mantener rendimientos ptimos
de penicilina ya que los mohos son microorganismos aerobios.
Taylor describe en un mtodo usado por l, que es conveniente una insuflacin de
aire 11.500 litros por hora para un fermentador de 20.000 litros de capacidad.
Presin. El uso de presin en los tanques para incrementar la efectividad de la
aireacin es una prctica comn en los procesos de produccin.
Se realiza generalmente las fermentaciones en tanques a una presin de 1,5
atmsferas. La reduccin de presin a 0,15 atmsferas no afecta la produccin,
pero una presin mayor a 3 atmsferas reduce la produccin del mismo.
Agitacin. El uso de un tipo apropiado de agitacin y a una velocidad adecuada
suele mejorar los rendimientos de penicilina, pues comunica una velocidad de
aireacin constante durante la fermentacin.
Agentes antiespumantes.
La eliminacin de la espuma excesiva mejora el
rendimiento de la penicilina.
Entre las sustancias antiespumantes que se usan estn las siguientes: Citrato de
tributilo, octadecanol, en solucin al 3% en aceite de manteca de cerdo, octadecanol
al 3% en aceite de soya.
Prevencin de la contaminacin. Es muy importante prevenir la contaminacin del
medio de fermentacin, la contaminacin produce la rpida destruccin de la
penicilina, para evitar se debe esterilizar todos los tanques de fermentacin,
tuberas o instalaciones en las que puede tener contacto la penicilina. Es necesario
utilizar aire esterilizado para la aireacin, los agentes antiespumantes tambin se
deben esterilizar antes de introducir al tanque de fermentacin.
Aislamiento y purificacin de la penicilina. El objeto del aislamiento consiste
en separar las cantidades relativamente mnimas de antibitico de las clulas
productoras y del considerable volumen del medio agotado.

La primera fase es el proceso de recuperacin es la separacin del micelio o clulas


por filtracin o centrifugacin. Se pueden usar filtros contnuos de vaco, filtros de
Bird-Young, centrfugas de cesto u otra instalacin, dependiendo de la naturaleza de
las clulas. La segunda fase importante consiste en extraer el antibitico del medio
de produccin agotado, con disolventes, por adsorcin, por precipitacin o por una
combinacin de estos mtodos.
La extraccin en disolventes puede efectuarse en extractores a cortacorriente como
los del tipo Podhielniak, en tornos, en frascos, en el sistema de distribucin de Graig
o de otras formas dependiendo del volumen del material y del objetivo perseguido.
Para la extraccin se puede usar acetato de amilo, ter, cloroformo, acetona y otros
disolventes segn la solubilidad del antibitico, posibilidad prctica, y otros factores.
La temperatura, la regulacin del pH son factores muy importantes para la
consecusin de elevados rendimientos de extraccin de antibiticos.
La adsorcin se puede realizar sobre carbn activo, resinas de intercambio inico u
otros materiales.
La purificacin se realiza por extraccin adicional con disolventes, destilacin,
sublimacin, cromatogrfica en colmna o por otros procedimientos dependiendo de
la naturaleza del antibitico, su costo y otros factores. El antibitico se esteriliza,
eliminndole los pirgenos (sustancias que producen reacciones febriles) por
filtracin a travs de filtros Seitz, moleculares u otros bacterianos de tipo apropiado.
Comprobacin, ensayo y certificacin.
Se realizan ensayos para la
comprobacin de la potencia del antibitico y prueba de esterilidad, pirgenos,
humedad y otras caractersticas segn se requiera.
La potencia de la penicilina se determina de una manera similar al mtodo de
aislamiento de cultivos de mohos puros. Es decir se emplean los mismos medios de
cultivo para las bacterias, el mismo tipo de bacteria, slo se diferencia en que en
vez de las partculas de suelo se coloca la penicilina obtenida, y al mismo tiempo
penicilinas patrones despus de la incubacion se mide las zonas claras alrededor del
antibitico y se los compara con el antibitico patrn y los resultados de
comparacin se evalua por medio de grficas y de esta manera se puede conocer la
potencia de la penicilina obtenida.
Mtodos de valoracin de la penicilina.
penicilina se tienen los siguientes:

Entre los mtodos de valoracin de

Mtodo del cilindro y placa (mtodo microbiolgico).


Mtodo yodomtrico (metodo qumico).
Propiedades de la penicilina. La penicilina es activa frente a ciertas bacterias Grampositivas en presencia de sangre, pus y fluidos orgnicos.
Puede ser considerada como atxica, ya que es posible administrar dsis muy
grandes durante un periodo de tiempo sin efectos perjudiciales. En un pequeo
porcentaje se pueden presentar alergias individuales a la penicilina. Urticaria, ardor
y picazn son algunas de las respuestas que se observan en personas sensibles.
Segn Welch y colaboradores la penicilina produce una inhibicin parcial de la
fagocitsis.

La penicilina es soluble en agua, muy soluble en acetona, acetado de amilo,


ciclohexano, dioxano, acetato de etilo, etanol y ter, y poco soluble en benceno,
cloroformo y tretracloruro de carbono.
Es inestable frente a un gran nmero de agentes por Ej. la descomponen los cidos
y alcalis fuertes. Se inactiva por los agentes oxidantes, debe evitarse el contacto
con ciertos metales pesados como cobre, plata, plomo y mercurio ya que tienden a
destruir la penicilina. Destruye tambin la penicilinasa, enzima producida por
algunos mohos, levaduras y bacterias. Las soluciones acuosas de la penicilina son
inestables y se debe conservar refrigeradas, tambin el pH influye en la estabilidad
de la solucin acuosa.
Tipos de penicilina. Los tipos ms comunes de penicilina son: Penicilina F, G, X, K.,
cuyas estructuras se indicarn despus.
La mayor parte de las penicilinas son mezclas generalmente de los tipos F, G, K,
aunque la penicilina G es la que se produce en mayor cantidad y la que se considera
ms prctica. La penicilina G sdica cristalina debe contener al menos 90% de
penicilina G.