-LUPITA, EN LA PAGINA 173 DEL VOLUMEN 1 EST LA EXPLICACION DEL ANTIBIOTICO

CARBENICILINA!!!!
PURIFICACIN DE FRAGMENTOS DE DNA, DE GELES DE AGAROSA Y LIGACIN DE
STOS
La purificacin del DNA de interes es un paso muy importante que no se puede omitir ya que en
estos tipos de mtodos siempre estn contaminados con cantidades considerables de RNA y
DNA cromosomal de E. coli. Es por eso que los comtaminantes deben ser removidos mediante
la purificacin con kits comerciales, por ejemplo; tomando en cuenta la pureza requerida para
ciertos protocolos.
Ya se han desarrollado varios mtodos para purificar plsmidos de bacterias, en todos stos se
incluyen 3 pasos:
crecimiento de un cultivo de bacterias
cultivo y lisis de la bacteria
purificacin del plsmido de DNA
(Sambrook J. y Russell,D. E. (2001). Molecular Cloning a Laboratory Manual. By Cold Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Thrid Edition)
Para esta prctica se us el kit comercial de Quick Gel Extraction kit (Invitrogen) para purificar
los fragmentos de DNA directamente del gel de agarosa usando una base de resina de slica la
cual es libre de protenas,tintes y agarosa. www.invitrogen.com
Siguiendo la metodologa indicada, se cort la zona del gel donde se contena el fragmento de
DNA de inters, para despus pesarlo. Nuestro equipo trabaj con la muestra rotulada como
gb3 que se refiere al gen bacteriano digerido. Primero se pes en la balanza analtica un tubo
Eppendorf, el cual tubo un peso de 1.04 g despus se agreg el gel cortado y se introdujo en el
tubo para pesarlo, el resultado fue un peso de 1.3530g ; esto indica que el gel pes 0.307 g o
307mg, lo cual es un peso que est dentro del rango permitido (400mg). Tambin se pes el
vector inferior, rotulado como (V9) y el resultado fue 496mg; ya que ste supera los 400 mg
slo se le agreg 1mL de buffer de solubilizacin no los 3 volmenes que marcaba la prctica.
Despus de esto se pasaron las muestras al Termoblock durante 15 minutos (5 minutos ms a
los indicados) a 50C para que stas se descongelaran, mezclndolas por inversin cada 3
minutos y al final se incubaron 5 minutos ms para as garantizar la disolucin completa del
gel.
Ya logrado esto, las muestras pasan a centrifugarse para que se separen los componentes y
purificar el DNA, para esto se requieren los buffers de lavado y de elucin.
El proceso de purificacin se est en la figura X. donde se observa que se us una columna
sobre un tubo lavado; en general, el proceso consiste en la centrifugacin de la muestra
desechando el lquido que se filtr al tuvo lavado y regresando ste a la columna para agregar
los buffers respectivos ( de solubilizacin, lavado y elucin) y as ir logrando una muestra ms
pura. En esta prctica se realizaron 4 centrifugaciones a 12000 x g y entre cada una de ellas se
agregaron los volmenes de los buffers indicados. En la ltima centrifugacin se obtiene el
DNA purificado y se procede a desechar la columna de extraccin.

Figura X. Representacin grfica de la purificacin del DNA mediante la columna.

Cabe mencionar que en este proceso de extraccion por columna empacada es muy util en los
laboratiorios de analisis molecular;debido a que por ser la matriz de la columna a fin al DNA
este queda adherido a ella, desprendiendose completemanete del gel de agarosa. Para
posteriormente solo eluir el DNA con un buffer de elusin de mayor afinidad a la columna
provocando el desprendimiento del mismo. (Los componentes de los Buffers de lavado y
elusion; asi como la composicion de la matriz de la columna empacada, no son descritos a
profundidad por ser un Kit comercial).
Ya purificado el DNA, ste se guard a -20C durante 72 horas aproximadamente.
En la prctica se marcaba Cuantificacin de DNA en el nanodrop, este paso se suprimi por
falta de tiempo, por lo tanto, no se sabe cunto DNA se obtuvo.
LIGACIN DE UN FRAGMENTO DE DNA AL VECTOR pBlueScriptSKII
La mezcla de digestin fue modificada y preparada en el siguiente orden (tabla x)
Tabla X. Mezcla de digestin
Agua

9.5L

Buffer

4L

DNA vector

1L

DNA inserto

5L

Enzima T4 ligasa

0.5L

Esta mezcla se prepara con el fin de unir los fragmentos de DNA, que ya han sido aislados y
pufiricados, con el vector (pBlueScript SKII+ ).

El vector pBlueScript SKII+ (imagen X)tiene 2961 pb y es un vector de clonacin diseado para
simplificar los procedimientos de clonacin y secuenciacin de DNA, para la generacin de
transcripciones de RNA in vitro y mapeo de genes. Este vector tiene un polilinker con 21 sitios
nicos de reconomiento para las enzimas de restriccin. Flanqueando el polilinker, se
encuentran los promotores T7 y T3 RNA polimerasa. La eleccin de cul promotor usar,
determinar cul secuencia del inserto clonado en el polilinker ser transcrita. Los promotores
estn presentes en la porcin N-terminal del fragmento del gen lacZ.
Para la ligacin, la relacin que hay entre el vector de DNA y el inserto es 2:1
(inserto:vector),sin embargo, dicha relacin es variable. Cuando no se tiene inserto en el
polilinker se producen colonias azules y cuando se tiene inserto, se producen colonias blancas,
esto porque el inserto rompe la secuencia de codificacin del fragmento del gen lacZ.
(pBluescript II Phagemid Vectors, INSTRUCTION MANUAL, Agilent Technologies, Inc. 2008.)
Imagen X. Vector pBlueScript SKII+

Para llevar a cabo la ligacin, se requieren DNA ligasas, en este caso se us la T4 DNA ligasa.
En la siguiente tabla se muestran algunas de sus caracterstica (tabla X)
TablaX. T4 DNA ligasa
Es codificado por el gen 30 del bacterifago T4

Es una protena monomrica de 487 aminocidos

Tiene cortes cohesivos y romos (en este caso la velociadad de reaccin no es linealmente
dependiente de la concentracin de la enzima y trabaja eficientemente con concentraciones
altas de DNA y enzima.
Participa en la hibridacin DNA-RNA y RNA-RNA (poca efieciencia)
(Wilson G.G y Murray N.E. 1979. Molecular cloning of de DNA ligase gene from bacteriophage
T4. I Characterisation of the recombinants. J Mol.Bio. 132: 471-491)

TRANSFORMACIN DE E. coli Y PLAQUEO EN MEDIO SLIDO

Se descongelaron las clulas en hielo para evitar la degradacin de DNA, se utilizaron dos
tipos se celulas TOP10 y DHS. Estas dos celulas tienen genotipos diferentes. Las clulas de
E. coli TOP 10 proven una transformacion de una eficiencia de 1x10^9 cfu/g adems de que
son ideales para una alta frecuencia de clonacin y propagacin de plasmidos. Permiten una
estable replicacin de un gran nmero de plsmidos. Las clulas DHS se conocen por ser
muy verstiles porque se pueden usar en un gran nmero de aplicaciones en clonacin, tienen
una alta estabilidad al insertar un nuevo plasmido. Su eficiciencia de clonacin es de 1x10^6.
Estas celulas se separaron en diferentes volmenes TOP10 en 3 volumenes de 18l y DHS
en 2 volumenes de 13l.
A cada volumen se le adiciono un ligando diferente. Los resultados se muestra a continuacin

Equipo

celula utilizada

inserto (7l)

TOP

gh1

TOP

p661

TOP

gb1

DHS

gb2

DHS

PCD4 (control positivo)

Tabla X
Se pasaron a incubar las celulas en 30min en hielo, despus se llevaron a 42C por 50
segundos, nuevamente se incubaron en hielo por 10 minutos. Este proceso se llama choque
termico, el cual es un procedimiento de transferencia de ADN; el cual consiste en tratar la
membrana con CaCl2 la cual queda afectada y puede aderirse el DNA a la pared y mediante el
choque trmico este se incorpora a la clula.
Las celulas se incubaron a 37C durante 1 hora antes de ser sembradas en el medio selectivo.

las cluas se inocularon por plaqueo en las cajas petri, despues de 48h se hiz la seleccin.
Resulto que ninguna caja petri tena crecimiento bacteriano, ms que el control positivo.
El control positivo en un plsmido pequeo muy estable para sistemas de clonancin. El mapa
de restriccin del vector se muestra a coninuacin:

en la figura X se muestra como esta conformado el plsmido

En usan medios selectivos se con el fin de eliminar todas aquellas bacterias que no fueron
transformadas. La ampicilina y la carbanicina son sustancias que inhiben el crecimiento de
cualquier celula gram negativa.
las celulas que tiene el plasmido tienen la enzima beta-lactasa que catalisa la hidrolisis del
enlace amida de la beta.lactam que tiene la intoxicacin por ampicilina y carbonicina.
la beta- lactasa esta presente en los plasmidos.
cuando se tiene expresada la beta-lactasa en laclonacin, la enzima es secretada en el medio,
por lo que sufienciente beta-lactasa puede producir una zona de proteccion, para que las

colonias puedan crecer.

figura x mecanismo de accion de la beta-lactasa contra el antibiotico

las colonias que no tienen interrumpido el gen Lac-z codifican la beta-galactosidasa la cual
hidroliza el disacarido lactosa en monosacaridos: glucosa y galactosa. la actividad de la
enzimapuede determinarse con el sustrato X-gal (5-bromo-4-cloro-indoli-beta-D-galactosidasa)
este medio es convertido por la beta-galactosidasa en compuesto azul.
en cambio las colonias que se veian blancas eran las que interesaban ya que tenian el gen
Lac-z interrumpido, lo que comprueba que la transformacin fue completa. Estas colonias
fueron tomadas para despues ser transplantadas en tubos enppendorf con medio LB
(Sambrook J. y Russell,D. E. (2001). Molecular Cloning a Laboratory Manual. By Cold Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Thrid Edition)
El plasmido pCD4 es un nombre trivial en realidad es el plasmido pbluescrip mas un fragmento
3.3kpb. Este plasmido tiene una celula especfica que es la E.coli blue xi este puedo hbaer sido
un factor deter minante para no tener una transdformacion genetica mas precisa.
otro factor que pueo haber afectado a los resultados fue que no se hizo cuantificacion por
nanodrop

no se porque no nos salio ninguna colonia azul

EXTRACCIN DE DNA PLASMIDICO

Una vez que han sido identificadas las clulas con el plasmido recominante que en este caso
solo hubo crecimiento en la cepa con el control positivo(colonias blancas), el siguiente paso es
extraer el DNA plasmidico para confirmar aquellas colonias bacterianas que expresen el DNA
recombinante.
se han desarrollado varios mtodos para la purificacion de DNa plasmidico de bacterias. En
general dichos mtodos consisten en tres pasos:
-Crecimiento del cultivo bacteriano
-Cosecha y lisis celular
-purificacion del DNA
Crecimiento del cultivo bacteriano

Siempre que sea posible, los plsmidos se purifican a partir de cultivos de bacterias
que se han inoculado de una sola colonia transformada en una placa de agar. como
se realizo anteriormente.
Cosecha y lisis celular
las bacterias se recuperaran por centrifugacin y se lisan por cualquiera de un gran
nmero de mtodos, incluyendo el tratamiento con detergentes inicos o no inicos,
disolventes orgnicos, lcalis y calor.
Los plsmidos mayores a 15kb son susceptibles al dao durante la lisis celular y a su
posterior manipulacin. La lisis suave se logra mejor mediante la suspensin de las
bacterias en una solucin isosmotica de sacarosa posteriormente son tratados con
lisozima y EDTA, que elimina gran parte de la pared celular.
Los plasmidos menores a 15kb son mas duraderos y se pueden utilizar mtodos mas
fuertes y no se necesita ningn cuidado especial. Se puede utilizar el mtodo con
detergentes, por ebullicin o tratamiento con alcalis.(Sambrook, 2001).
EL plasmido utilizado en esta practica (pBluecript II) contenia 2961pb. debido a eso se
utiliz el mtodo alcalino el cual en el cual se utilizaron los siguientes reactivos:
Solucion de lisis alcalina I

solucion de lisis alcanila II

solucion de lisis alcalina III

50mM glucosa
25mM Tris-Cl (pH 8)
10mM EDTA (pH 8)
Guardar a 4C

0.2N NaOH
1%(w/v) SDS

5M acetato de potasio 60mL

acido acetico glacial 11.5mL
H2O 28.5mL
guardar a 4C

Tabla X Componentes de la soluciones alcalinas

los pasos que se llevaron a cabo para la extraccion del DNA plasmidico fue el siguiente:
Los tubos con el control positio fueron centrifugados a 12 000rpm y se removio la mayor
cantidad posible de sobrenadante, se agrego 100ML de la solucion I fra y se resuspendio la
pastilla, se agrego 200ML de solucin II y se mezclo por inversin, se le agregaron 150ML de
solucin III fra y de igual manera se mezclo por inversin. el tubo se dejo en hielo 5minutos y
se centrifugo a 12 000 por 5min a 4C, una ves finalizado esto se transfiri el sobrenadante a
otro tubo eppendorff donde se le agrego 500ML de fenol: cloroformo y se mezclo en vortex,
despus se volvi a centrifugar 12 000rpm por 2min. a 4C, el sobrenadante se translado a un
tubo eppendorff nuevo y se adiciono 800ML de etanol absoluto, se incubo a -20C durante
20min. se centrifugo 12 000rpm por 5min a 4C y se tiro el sobrenadate para luego adicionar
1mL de etanol al 70%, se centrifugo a 12000rpm por 2min a 4C, se tiro el sobrenadante y se
dejo secar y finalmente se resuspendio en 50ML de agua desionizada esteril y se guardo a
-20. debido a la falta de tiempo no se realizo cuantificacion en nanodrop por lo tanto no se
obtuvo la cantidad de DNA plasmidico presente.
Dicho mtodo tiene como finalidad que a pH alto se abre la pared celular, se desnaturaliza

el ADN cromosmico y
las protenas y se libera el DNA plasmidico en el
sobrenadante .aunque la solucin alcalina altera el apareamiento de bases, las hebras
de ADN plsmidico circular cerrado no pueden ser separados el uno del otro porque
son topolgicamente entrelazados. siempre y cuando la intensidad y la duracin de la
exposicin de OH- no sea demasiado grande.
durante la lisis, las protenas bacterianas, paredes celulares rotas y el ADN
cromosmico desnaturalizado se enredan en grandes complejos que estn recubiertos
con dodecil sulfato. estos complejos son precipitados de la solucin eficiente cuando
los iones de sodio son reemplazados por iones de potasio. despus de que el material
desnaturalizado se ha eliminado por centrifugacin, el ADN del plsmido nativo se
pueden recuperar de sobrenadante. (Sambrook,2001)

(Sambrook J. y Russell,D. E. (2001). Molecular Cloning a Laboratory Manual. By Cold Harbor

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Thrid Edition)