Piruvato deshidrogenasa deficiencia de E2:

una causa potencialmente tratable de

distona episdica
Abstracto: La asociacin de la distona
episdica
progresiva
y
dificultades
de
aprendizaje con los hallazgos caractersticos de
neuro-imagen puede llevar a consideracin de
atpica
pantotenato
quinasa
asociada
Neurodegeneracin
(PKAN)
y
las
investigaciones dirigidas a ese diagnstico.
Informes recientes indican que la deficiencia de
dihidrolipoamida
acetiltransferasa,
el
componente E2 del complejo Piruvato
deshidrogenasa, puede presentar de manera
similar, y que este trastorno tambin deben
considerarse en el diagnstico diferencial. Se
describen dos hermanas con inicio precoz
distona episdica y la deficiencia de Piruvato
deshidrogenasa causadas por defectos en la
subunidad E2. Ambos tienen neuro-imagen
caractersticas similares a pacientes descritos
anteriormente y tienen mutaciones en el gen
DLAT. Como esta condicin es potencialmente
tratable con una dieta geognica, la posibilidad
de este diagnstico debe considerarse en casos
similares.
Introduccin:
La combinacin de distona episdica y
progresiva con el aprendizaje de la discapacidad
y la seal de RM anormal en el globo plido es
ms comnmente asociado con pantotenato
quinasa neurodegeneracin asociada (PKAN),
una subcategora del grupo de condiciones
definido como la neurodegeneracin con
accumulation.1,2 hierro cerebral en la forma
clsica de este trastorno, el inicio suele ser en la
primera dcada y hay una rpida progresin.
Trastornos de la marcha, disartria, distona y la
disfuncin extrapiramidal son caractersticas
comunes,
junto
con
alteraciones
del
comportamiento y demencia. Degeneracin de
la retina tambin se encuentra en una
proporcin significativa de casos. El hallazgo
caracterstico en la resonancia magntica del
cerebro es el '' ojo del tigre '' cartel con bilateral
disminuy la intensidad de la seal en el globo
plido en T2 imgenes ponderadas con un rea
central de hiperintensidad. Esta condicin se
debe a mutaciones en el pantotenato quinasa 2
genes (PANK2) y dos mutaciones comunes,
c.1231 G> A y c.1253 C> T representan ms de
un tercio de las mutaciones gen PANK2 casos.1
definido
tambin
se
encuentran
en
aproximadamente un tercio de los pacientes con
PKAN atpico. En estos pacientes, el inicio suele
retrasarse, la progresin es ms lenta y el
patrn de los sntomas ms heterognea.
Recientemente, tres pacientes se han descrito
con las caractersticas y lesiones clnicas en el
globus pallidus similares a los de los pacientes

con PKAN (aunque las lesiones palidales no

tenan el ojo caracterstica del patrn de tigre)
que no tienen mutaciones en el gen PANK2. En
lugar de ello, estos pacientes, tienen piruvato
deshidrogenasa (PDH) deficiencia debido a
mutaciones en DLAT, el gen para el componente
dihidrolipoamida acetiltransferasa (E2) del
complejo PDH deficiencia de 3,4 tiene un
fenotipo de expansin, lo que refleja una amplia
variacin genotpica y bioqumica. Mientras que
algunos pacientes presentan con acidosis
lctica severa en el perodo neonatal, muchos
tienen un trastorno neurolgico asociado
principalmente con una gama de lesions.5
neuropatolgico del desarrollo y degenerativa.
PDH es un complejo enzimtico grande
compuesta de mltiples copias de tres enzimas:
E1
(piruvato
deshidrogenasa,
un
heterotetrmero A2B2), E2 (acetiltransferasa
dihidrolipoamida)
y
E3
(dihidrolipoamida
deshidrogenasa), junto con la protena de unin
a E3 que est implicada en la interaccin entre
el subunits.6 E2 y E3 Dentro del complejo PDH,
la subunidad E2 forma el ncleo estructural y
acepta grupos acetilo de E1 y los transfiere a la
coenzima A. la descarboxilacin irreversible de
piruvato y su conversin a acetil coenzima A por
las precede complejo PDH la entrada de
carbono de la glucosa en el cido (TCA) ciclo
tricarboxlico. Este proceso es fundamental para
la oxidacin aerobia de la glucosa y es de
particular importancia en el cerebro donde es la
va obligatoria para la generacin de energa en
condiciones
normales.
En este informe se describen los hallazgos
genticos
clnicos,
neurorradiolgicos
y
novedosos en dos hermanas que son
heterocigotos compuestos para dos mutaciones
en el gen DLAT. En estos pacientes, el
diagnstico de PKAN se consider en un
principio, pero la ausencia de mutaciones gen
PANK2 impuls la investigacin del complejo
PDH.
Metodos:
Informes de casos:
El propositus fue el primer hijo, nacido a
trmino, a los padres no consanguneos tras un
parto, el parto y la lactancia normal. Ella se
describe como una "de abajo shuffler 'y no
anduvo hasta la edad de 20 meses. El
estrabismo se observ en alrededor de 2 aos
de edad y la evaluacin visual en ese momento
revel una prdida del campo visual inferior en
ambos ojos. Inicialmente pensado para tener
dispraxia, por la edad de 4 aos un trastorno
motor era evidente con distona episdica y ella
se cree que tienen deterioro cognitivo
moderado. A lo largo de la infancia no ha habido
un deterioro evidente en sus capacidades de

aprendizaje,
pronunciada.

pero

la

distona

es

ms

Cuando una segunda hija nacida a esta pareja

sigui un curso clnico muy similar, aunque con
problemas de desarrollo ms graves que su
hermana mayor, la sospecha surgi que la
condicin puede deberse a un trastorno de
herencia recesiva. Ni chica era dismrfico y,
aparte
de
los
hallazgos
neurolgicos
mencionados anteriormente, no haba otras
anomalas encontradas en el examen fsico
general, Investigaciones normales incluyen:
urea en sangre y electrolitos, glucosa, lactato,
piruvato, aminocidos, creatinina quinasa,
biotinidasa, cobre, ceruloplasmina y carnitina,
cidos y glicosaminoglicanos orgnicos de
orina, protenas en el lquido cefalorraqudeo,
glucosa, lactato y neurotransmisores, examen
de la mdula sea, el hgado y biopsias rectales,
cariotipo y FMR1 y anlisis de la mutacin
PANK2. RM cerebral revel hiperintensidad
globo plido.
Los estudios bioqumicos:
Un cultivo de fibroblastos de la propositus se
estableci a partir de una biopsia de piel,
tomada con el consentimiento informado. Se
cultiva en medio Eagle modificado de Dulbecco mezcla de nutrientes F-12 Ham (DMEM / F12)
con 10% de suero fetal de ternera, 100 unidades
/ ml de penicilina y 100 mg / ml de
estreptomicina. La actividad del complejo PDH
En general se midi utilizando [1-14C] piruvato
como sustrato despus de la activacin mxima
del complejo enzima con dicloroacetato como se
describi previamente.
El anlisis gentico: De fibroblastos ARN se
extrajo usando un kit de aislamiento de ARN de
alta Pure Roche y se convierte a ADNc
utilizando el kit de AffinityScript (Agilent
Technologies). El cDNA E2 se amplific como un
solo producto por PCR (primer secuencias
disponibles bajo peticin), purificado utilizando
un kit de purificacin de Qiagen QIAquick PCR y
secuenciado utilizando ABI Big Dye Terminators
(Applied Biosystems). Se prepar ADN
genmico a partir de fibroblastos usando un kit
de Nucleon BACC2 (Life Sciences Tepnel).
Para el anlisis de las transcripciones
anormales que normalmente se degrada por
descomposicin mediada por el antisentido, de
forma activa las clulas en crecimiento se
incubaron durante 7 h a 37C en 100 mg / ml
emetina en DMEM-F12 medium.8 continuacin,
se cosecharon las clulas, el ARN aislado,
deriva de ADNc y transcripciones analizados
mediante amplificacin por PCR como
anteriormente. Posiciones de las mutaciones en
cDNA se basan en la numeracin comenzando
con la A del codn de iniciacin ATG.

Para el anlisis del procesamiento de las

transcripciones DLAT, los exones 6 y 7 y sus
secuencias de intrones adyacentes fueron
amplificados a partir de ADN genmico de
pacientes usando el Expand High Fidelity PCR
System (Roche). El producto de PCR 3074 pb
se clon inicialmente en un vector de clonacin
pCRII-TOPO TA (Invitrogen), despus se
transfiri a un vector de Exontrap (MoBiTec)
usando los sitios de restriccin nicos BamH1 y
Not1. Constructos, ya sea con la secuencia
normal o mutante se transfectaron en clulas
COS-7 usando el reactivo Lipofectamine2000
(Invitrogen). Se aisl ARN despus de 24 h de
cultivo, se convirti en cDNA, y las
transcripciones analiz por PCR.
El tratamiento y el resultado:
Ambos pacientes se han iniciado en una dieta
cetognica modificado y ambos han mostrado
una mejora significativa. Los padres informan
mejoras en la concentracin, el control de la
motricidad fina y la disminucin de la
fatigabilidad. Clnicamente, las nias son menos
atxica y tanto las habilidades motoras finas y
gruesas han mejorado mucho. Cabe destacar
que no se han producido episodios distnicas
desde que comienza la dieta. Pacientes
anteriores con deficiencia de PDH E2 fueron
prescritos cido lipoico suplementario y tiamina,
lo que resulta en una mejora notable en las
habilidades motoras, pero se consider que
estos pacientes no toleran los suplementos y,
como resultados hasta ahora han sido muy
prometedores, no hay nuevas medidas se han
tomado.
Diagnstico bioqumico y gentico:
Actividad de los fibroblastos PDH fue de 0,49
nmol / mg protena / min (normal 0,7 a 1,1 nmol /
mg protena / min). Si bien esto es una
reduccin significativa, la actividad residual es
mayor que se encuentra generalmente en
pacientes con deficiencia de PDH. Aunque
defectos E2 parecen ser una causa
extremadamente rara de la deficiencia de PDH,
el gen DLAT fue analizada de inmediato en este
caso porque las caractersticas clnicas y
radiolgicas de los pacientes eran tan similares
a las de los pacientes reportados previamente
con mutaciones DLAT.
Demostracin de la base gentica de la
deficiencia de PDH E2 no fue sencillo. La
amplificacin de cDNA DLAT revel un producto
aparentemente nica que, cuando se secuenci,
se encontr que contena dos componentes,
uno de tamao normal y secuencia normal y
otro con una delecin de 33 pb en el inicio del
exn 3. En el ADN genmico, un sin sentido
heterocigotos mutacin se encontr en el exn 3
(c.412 G> T, p.E138X). Esta sustitucin de

nucletidos genera un nuevo sitio aceptor de

empalme en el exn 3 que se traduce en miscorte y empalme de los exones 2 y 3 (Fig. 2). La
supresin est en el marco y dara lugar a
prdida de 11 residuos de aminocidos de la
protena codificada.

Cualquier
transcripcin
mutante
que
normalmente se empalma parece estar
degradado por la decadencia tontera mediada
ya que ninguno se detect. La madre del
paciente se encontr que era heterocigtico
para esta mutacin (Fig. 3A). Secuencia inicial
de todos los exones DLAT restantes y los lmites
intrn / exn no identific una segunda
mutacin. Como la deficiencia de PDH E2 se
hereda de forma autosmica recesiva, se
llevaron a cabo m Bs estudios para tratar de
identificar a un segundo alelo mutante.
Fibroblastos de pacientes se incubaron con
emetina antes de la extraccin de ARN para
bloquear la traduccin y por lo tanto suprimir la
degradacin de transcripts.8 anormal Bajo estas
condiciones, un producto de menor importancia,
ms pequeo pareca que no se observa en las
muestras de control (Fig. 4A). El anlisis de
secuencias demostr que este es un DLAT
transcripcin mis-empalmados, falta el exn 6.
Esto condujo a la reevaluacin de la secuencia
de ADN genmico y la identificacin de un
heterocigoto A> G sustitucin de 7 pb aguas
abajo desde el lmite entre el exn 6 y el intrn
6. El padre del paciente es heterocigtico para
esta sustitucin.
La secuencia de consenso aceptado para sitios
donantes de corte y empalme incluye los ltimos
3 bases del exn y los primeros 6 bases del
intrn. En un amplio estudio de la literatura, no
se encontraron ejemplos de mutaciones en la
posicin TH7 que resultan en el empalme
anormal. 9 Para demostrar que la sustitucin de
bases fue de hecho responsable de la
transcripcin aberrante revelado por emetina
pre-incubacin,
normal
y
mutante
construcciones que contienen los exones 6 y 7
junto con intrones adyacentes en un vector de
exontrap se expresaron en clulas COS-7 y
transcripciones analizados. Una proporcin
sustancial de las transcripciones de la
construccin mutante se encontr que omitir el
exn 6. Este resultado en un desplazamiento del
marco y un codn prematuro de terminacin
amino cidos 32 aguas abajo del extremo del
exn 5. Como algunas transcripciones
normalmente
empalmados
pueden
ser
generados a partir de este alelo mutante.
estos son los principales responsables de la
actividad bioqumica residual. La hermana de la
propositus es tambin un heterocigoto
compuesto para las dos mutaciones.

Discusin:
Las manifestaciones comunes de la deficiencia
de PDH son bien reconocidos. La gran mayora
de los pacientes desarrollan sntomas durante el
primer ao de vida. Algunos presentes en el
perodo de recin nacido con acidosis lctica
severa, sin embargo, la mayora tiene una
presentacin predominantemente neurolgicos y
esto puede tomar un nmero de formas
diferentes. De stos, el ms comn es el retraso
del desarrollo no especfica e hipotona. Algunos
pacientes tienen las caractersticas clnicas y
neuropatolgicas caractersticos del sndrome
de Leigh mientras que otros tienen episodios de
ataxia, generalmente en asociacin con
enfermedades intercurrentes. LA
nmero de pacientes de sexo femenino tiene un
trastorno neurodegenerativo crnico con ms
microcefalia
y
profunda
neurolgica
impairment.5 Las diversas formas de disfuncin
neurolgica se acompaan de una serie de
anomalas neuropatolgicas, entre los que las
lesiones de los ganglios basales son
relativamente comunes. Con el aumento de la
conciencia de la deficiencia de PDH, y la
investigacin de una gama ms amplia de
pacientes, una serie de presentaciones atpicas
se han identificado recently.10-12 Uno de ellos
es el desarrollo de la distona ms tarde en la
infancia con poca o ninguna impairment.13
mentales El espectro ampliado de La deficiencia
de PDH significa que ste entre en el
diagnstico diferencial de una serie de otras
condiciones, incluyendo PKAN, como en los
pacientes descritos aqu.
La deficiencia de PDH E2 parece ser
particularmente rara con slo tres pacientes
describen previously.3,4 Las caractersticas
clnicas y bioqumicas de estos pacientes son
todos muy similares y difieren significativamente
de las presentaciones ms comunes asociados
con defectos en las otras subunidades de PDH.
Los tres pacientes han tenido una enfermedad
relativamente leve con la supervivencia a travs
de la infancia. Distona ha sido una
caracterstica particular y ataxia tambin ha sido
destacado. La funcin mental es normal en un
paciente, los otros tienen deterioro levemoderada. Los tres tenan cambios similares en
la RM cerebral con seal anormal en el globo
plido bilateral.
En los pacientes con presentaciones leves o
variantes de la deficiencia de PDH, las
indicaciones habituales para la investigacin
pueden estar ausentes o de importancia
mnima. El marcador bioqumico caracterstico
de la deficiencia de PDH es una elevacin de la
concentracin de lactato. Este puede estar
presente en la sangre, pero en pacientes con
manifestaciones neurolgicas principalmente, es

ms probable que el lactato CSF ser

informativo. En los pacientes con deficiencia de
PDH E2 se ha descrito anteriormente, de lactato
en sangre se eleva slo ligeramente en un
paciente y normal en los otros dos. Tanto la
sangre y CSF lactato fueron normales en uno de
los pacientes, como fue el caso con el
propositus en este informe. En consecuencia, un
lactato normal de LCR no debe excluir la
posibilidad de este diagnstico.
La combinacin especfica de caractersticas
clnicas y neurorradiolgicos puede proporcionar
las pistas ms tiles. Existe un considerable
solapamiento entre la deficiencia de PDH E2 y
PKAN debido a mutaciones en el gen PANK2,
aunque no parece haber una diferencia
importante, y esto es en la aparicin de
resonancia magntica de las lesiones en el
globo plido. Mientras que el '' ojo del tigre ''
patrn se ha encontrado en todos los pacientes
con mutaciones gen PANK2, 2 las lesiones en
los pacientes con mutaciones DLAT han sido
homogneo en apariencia. Sin embargo, PKAN
fue el diagnstico provisional inicial en dos de
los pacientes con deficiencia de PDH conocidos
E2 y las investigaciones bioqumicas solamente
fueron perseguidos cuando el anlisis de
mutacin PANK2 result negativo. En otro
paciente
deficiente
E2,
investigaciones
bioqumicas fueron motivadas por una estrecha
similitud con un caso identificado previamente.
Todos los pacientes con deficiencia de PDH E2
han tenido significativa actividad enzimtica
residual, ya sea en cultivos de fibroblastos o en
muestras de biopsia de msculo. La actividad es
generalmente mucho ms alta que se encuentra
generalmente con defectos en las otras
subunidades, aunque es comparable a algunos
casos de deficiencia de la protena de unin a
E3, y esto se refleja en su mayor supervivencia.
Se espera que la deficiencia completa E2 sera
incompatible con el desarrollo fetal, como es el
caso con la deficiencia completa de la
subunidad E1a.
El anlisis gentico de pacientes con deficiencia
de PDH se centra generalmente en el gen ligado
al cromosoma X PDHA1. Las mutaciones en
este gen en cuenta para la gran mayora de los
casos y la mayora son espordicos y debido a
una nueva mutacin en las clulas germinales
de uno de los padres.

Los defectos en las subunidades restantes del

complejo son todos heredan como recesivos
autosmicos y la participacin de estas
subunidades pueden ser sugeridos por la
consanguinidad de los padres. Los tres de los
pacientes con deficiencia de PDH E2 se inform
anteriormente eran homocigotos y dos nacieron
primeros padres primo.

Fig. 4 - Demostracin de la patogenicidad de la

mutacin intrn 6. A. Anlisis de genes de ADNc
DLAT despus del pretratamiento de los
fibroblastos con emetina. Los resultados se
muestran para los fibroblastos de control no
tratados y tratados (carriles 2 y 3) y no tratados
y fibroblastos paciente tratado (carriles 4 y 5). El
carril 1 es un espacio en blanco de reaccin. En
las clulas del paciente tratado emetina, hay un
producto ms pequeo que normal, que es una
transcripcin aberrante empalmado falta el exn
6. B. Expresin y procesamiento de los exones
6 y 7 DLAT in vitro. Construcciones de vectores
que contienen los exones DLAT Exontrap 6 y 7,
el intrn 6 y parte de los intrones 5 y 8, ya sea
con la secuencia normal o mutante intrn 6 se
expresaron en clulas COS-7 y transcripciones
analizados en las preparaciones de ADNc. Carril
1: Reaccin en blanco; carril 2, constructo
normal de exontrap; carril 3, exontrap construir
con IVS6 D 7A> G mutacin. 352 Revista
Europea de neurologa peditrica 14 (2010) 349353 La situacin era ms compleja en el caso
de autos, ya que los padres no estn
relacionados y las dos hermanas son ambos
heterocigotos compuestos.
El gen DLAT fue analizado en estos pacientes
debido a similitudes con pacientes anteriores y
porque extensa investigacin, incluyendo el
anlisis de la mutacin de PANK2, no haba
podido
establecer
un
diagnstico.
La
identificacin de las mutaciones subyacentes
result particularmente difcil. Anlisis de cDNA
a partir de fibroblastos de pacientes revel una
mutacin de empalme que result en una
delecin en marco de 11 aminocidos. Cuando
se analiz el ADN genmico, esto se encontr
que el resultado de una mutacin sin sentido en
el exn 3. No se detectaron las transcripciones
mutante con la mutacin sin sentido en ADNc y
se presumiblemente degradados por la
descomposicin mediada por el antisentido. Es
fortuito que la mutacin llev a corte y empalme
aberrante en una proporcin de transcritos y que
el producto mis-empalmados tiene una delecin
en marco, por lo que no se degrada.
El segundo alelo mutante se observ en la
secuencia inicial de ADN genmico, pero su
importancia no fue inmediatamente apreciado.
Esto era debido a que es una sustitucin de
base 7 pb aguas abajo de un sitio de empalme
50 donante. Esta posicin no est incluido en la
secuencia de consenso del sitio de empalme y
no hay mutaciones de corte y empalme en esta
posicin haber sido reported.9 La importancia
funcional de la mutacin fue revelado cuando se
detect un producto mis-empalmado cuando la
caries mediada por el antisentido fue suprimida
por el cultivo de la paciente fibroblastos en
emetina antes de la extraccin de RNA. Esto fue
confirmado posteriormente por estudios in vitro

en el que el procesamiento aberrante del

transcrito mutante fue demostrado directamente.
Esta mutacin de empalme inusual destaca el
hecho de que los exones simplemente
secuenciacin y lmites intrn / exn en el ADN
genmico, como se realiza comnmente en los
estudios de gentica molecular de diagnstico,
pueden fallar para identificar mutaciones cuyas
posiciones o consecuencias son atpicos.
Estos
pacientes
proporcionan
evidencia
adicional de un fenotipo relativamente especfico
asociado con mutaciones en el gen DLAT y la
deficiencia de PDH E2. Este phenotpype tiene
solapamiento significativo con PKAN y le
sugerimos que en casos de PKAN atpica,
donde el anlisis de mutacin es poco
gratificante, este diagnstico debe ser
considerado y el ensayo de la actividad de la
piruvato deshidrogenasa cabo. El diagnstico de
la deficiencia de PDH E2 es de particular
importancia debido a la posibilidad de la terapia
basada en la manipulacin diettica y la
suplementacin cofactor. Todos los pacientes
han mostrado una mejora clnica significativa en
una dieta cetognica, aunque esto no puede
revertir estableci lesiones estructurales.

Fig. 1 - T2 ponderado imgenes de RM del

propositus (axial, derecha) de entre seis aos y
su hermana (coronal, izquierda) de edad de 4
aos. Hiperintensidad de seal simtrica se ve
en el globo plido.
Fig. 2 - anlisis de la secuencia de ADNc DLAT.
A. Parte de la secuencia de cDNA DLAT del
paciente. La flecha indica el final del exn 2 y
donde la secuencia de doble debido al exn 3
comienza mis-empalme. La mutacin sin sentido
exn 3 no aparece en esta secuencia. B. Las
secuencias de los transcritos de DLAT en la
regin del exn 3. El extremo del exn 2 se
muestra en maysculas normales, la secuencia
al comienzo del exn 3 est en negrita. Las
lneas superiores muestran la secuencia normal
con la parte del exn 3 que se suprime en las
transcripciones empalmados de forma aberrante
subrayado. La lnea inferior es la secuencia de
las transcripciones empalmados de manera
aberrante en los fibroblastos de pacientes.

Fig. 3 - Anlisis de ADN genmico parental. La

secuencia muestra heterocigosidad huella
dejada por el G> T en el exn 3 de sustitucin
en el ADN genmico de la madre del paciente.
El derecho secuencia traza muestra el
heterocigoto Una sustitucin> G en el intrn 6
en el ADN genmico del padre del paciente. La
posicin del lmite exn / intrn se muestra por
la flecha. El propositus y su hermana son
heterocigotos compuestos para ambos alelos
mutantes parentales.
Fig. 4 - Demostracin de la patogenicidad de la
mutacin intrn 6. A. Anlisis de genes de ADNc
DLAT despus del pretratamiento de los
fibroblastos con emetina. Los resultados se
muestran para los fibroblastos de control no
tratados y tratados (carriles 2 y 3) y no tratados
y fibroblastos paciente tratado (carriles 4 y 5). El
carril 1 es un espacio en blanco de reaccin. En
las clulas del paciente tratado emetina, hay un
producto ms pequeo que normal, que es una
transcripcin aberrante empalmado falta el exn
6. B. Expresin y procesamiento de los exones
6 y 7 DLAT in vitro. Exon constructos trampa
vector que contiene los exones DLAT 6 y 7, el
intrn 6 y parte de los intrones 5 y 8, ya sea con
la secuencia normal o mutante intrn 6 se
expresaron en clulas COS-7 y transcripciones
analizados en las preparaciones de ADNc. Carril
1: Reaccin en blanco; carril 2, constructo
normal de exontrap; carril 3, exontrap construir
con IVS6 D 7A> G mutacin.