Lab. Microbiologia

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA
VEGA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y
BIOQUIMICA
GUA DE PRCTICA
MICROBIOLOGIA
CDIGO
CICLO
VIII
2016-I
LIMA - PER
MICROBIOLOGIA GENERAL
INTRODUCCION:
La Microbiologa es una ciencia que estudia a los organismos microscpicos
denominados microorganismos los cuales se definen como aquellos seres vivos
unicelulares o pluricelulares carentes de organizacin tisular y que no pueden
ser visualizados al ojo humano necesitando para ello el microscopio
Para el estudio de este tipo de seres vivos se necesita el conocimiento de
tcnicas nicas denominadas Tcnicas microbiolgicas
Estas Tcnicas han permitido el conocimiento de las diferentes estructuras y
composicin bacteriana pudiendo comprenderse como muchas bacterias se
relacionan con el hombre ya sea como integrantes de la flora normal o como
agresoras para el mismo
El estudio de la composicin bioqumica de la estructura bacteriana junto al
conocimiento de su metabolismo permite hoy la comprensin del mecanismo de
accin de los diferentes antibiticos
Hoy en da los avances de la gentica bacteriana hacen posible el desarrollo de
tcnicas de Biologa molecular con aplicaciones a nivel de la investigacin
cientfica y el diagnstico donde los microorganismos cumplen un rol protagnico
El conocimiento, ,manejo y utilizacin de los principales equipos, instrumentos y
materiales utilizados en el laboratorio de microbiologa es indispensable para la
ejecucin y desarrollo de las prcticas durante el curso de microbiologa general
que permitirn al alumno, futuro profesional de la salud
aplicar estos
conocimientos en el estudio de diferentes especialidades en el campo de la
microbiologa
Los alumnos ingresarn al laboratorio con guardapolvo, cabello recogido en un
moo alto, con zapatos cerrados y sin objetos colgantes como pulseras, aretes
largos o anillos. Los ensayos a su vez se realizarn con mascarilla, gorro cobertor,
guantes descartables y lentes de proteccin.
FACULTAD DE CIENCIAS
FARMACEUTICAS Y BIOQUIMICA
I- PRCTICA N 1
MANEJO DE LOS PRINCIPALES EQUIPOS E INSTRUMENTOS,
PREPARACIN DE MATERIAL DE VIDRIO, MATERIAL AUXILIAR Y SU
FORMA DE ESTERILIZACIN
1.1 Marco terico
En el laboratorio de Microbiologa es necesario utilizar material limpio, sin trazas de detergente y
estriles para el aislamiento y posterior identificacin de los grmenes que se est investigando,
se entiende por
Limpieza al proceso fsico utilizado en los objetos en uso del laboratorio para eliminar materia
orgnica y residuos, mediante el lavado con agua con o sin detergente.
Desinfeccin Es un proceso en el que se utilizan principalmente agentes qumicos y
Esterilizacin que viene a ser la destruccin de toda forma de vida, sta puede ser por vapor
saturado (autoclave) o por calor seco ( horno )
1.2 Competencias
Maneja y equipos y materiales en el usa Laboratorio.

Estudia in Vitro a los microorganismos.
Prepara e identifica el material de vidrio y su forma de esterilizacin
1. 3 Materiales y equipos
Equipos e instrumentos tales como: Autoclave, horno, incubadora, bao Mara, refrigeradora,,
equipo para luz ultravioleta , equipo de esterilizacin por filtracin, cmara de flujo laminar,
centrifuga y microscopio compuesto,
Portaobjetos y cubreobjetos
Papel para lente
Aceite de inmersin
Torundas de algodn
Gasa
Asa de Kolle
Cultivo bacteriano
Papel kraft
Tubos de prueba
Placas Petri
Balones, vaso de precipitados, pipetas y matraces de vidrio
Cinta indicadora de esterilizacin (para autoclave)
1. 4 Procedimiento
1. Examina laminar , bao mara, equipo de esterilizacin por filtracin, centrifuga y microscopio
e identifica sus componentes , su aplicacin y utilizacin en el laboratorio cada uno de los
siguientes equipos e instrumentos del laboratorio: autoclave, horno, incubadora, cmara de
flujo
2. Observa al microscopio las muestras que a continuacin se indican:
Cultivo bacteriano:
Coloca sobre la lmina portaobjeto una gota de cultivo bacteriano y deja caer la lmina
cubreobjeto.
3. .Preparacin de material de vidrio y material auxiliar
Confecciona tapones de algodn para el material de vidrio proporcionado, estos deben ser
consistentes y de un tamao apropiado que permita su manipulacin.
Empaqueta este material con papel kraft, en igual forma tambin se procede con todo
el material auxiliar que se use en el laboratorio para someterlo
a un proceso de
esterilizacin y luego conservar su esterilidad .un tiempo adecuado
Las placas Petri y los tubos de prueba (previamente taponados) se envuelven formando
paquetes de tres y seis unidades respectivamente. Debe tenerse especial cuidado en que
el papel utilizado se encuentre ntegro y sin orificios. Para las torundas e hisopos se
procede de igual forma.
En el caso de las pipetas, se cortan bandas largas (tiras) de papel kraft y se las envuelve
en forma diagonal y empezando por la punta, colocando un refuerzo de papel en esta
seccin, de esta forma la pipeta quedar ntegramente cubierta por el papel. Al final de la
envoltura se dejar una porcin en la que se escribir en nmeros la capacidad de
volumen de la pipeta.
1. 5 Resultados
Se registra detalladamente cada una de las observaciones hechas Y se realiza los esquemas y
dibujos necesarios: Equipo de laboratorio (indicando sus componentes). Procede de igual forma
con el material de laboratorio empleado
1. 6
Cuestionario.
1. Con qu propsito se envuelve totalmente el material a esterilizar?

2. En un cuadro comparativo explicar las diferentes formas y condiciones del proceso de
esterilizacin que se emplea segn el tipo de material a esterilizar.
3. Informar en forma concisa el uso e importancia de los equipos descritos en la prctica
1. 7 Fuentes de informacin
Tortora,Berdell, Funke Christine.L.Case Introduccin a la Microbiologa 9 Edicion. Editorial
Mdical Panamericana Espaa , 2007
Tortora G. J.; Funke, B. R.; Case, C. L.: Introduccin a la Microbiologa, Buenos Aires, 9 d.
Editorial Acribia. 2000
II .- PRACTICA N 2
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SU FORMA DE
ESTERILIZACIN MEDIOS DE CULTIVO
SLIDOS, SEMISLIDOS Y LQUIDOS
2.1 Marco terico
Es importante aislar y observar el crecimiento de un microorganismo para su identificacin, por lo
que se utilizan materiales alimenticios artificiales preparados en el laboratorio llamados medios
de cultivo y su desarrollo es el cultivo
Sus requerimientos varan considerablemente algunos slo requieren sustancias simples (bacterias
no exigentes ) y otros requieren de sustancias complejas ( bacterias exigentes )
Medios de Cultivo
Son sustancias o compuestos nutritivos estriles que permiten el crecimiento y multiplicacin de
los microorganismos en el laboratorio, este medio debe cumplir una serie de condiciones como
son temperatura, grado de humedad, y presin de oxgeno adecuados, adems de nutrientes y
factores de crecimiento y estar exento de todo microorganismo contaminante con el objeto de
aislar las diferentes especies bacterianas y proceder a su identificacin mediante estudios
complementarios.
Clasificacin de los medios de cultivo:
Segn su composicin;
-Medios empricos.- Extrados de alimentos naturales
-Medios semi- sintticos.- Son medios de cultivo empricos enriquecidos de ciertos compuestos
qumicos
-Medios sintticos.- Medios qumicamente definidos
Segn su estado fsico: Medios lquidos, medios semislidos (con 0,3 a 0,5% de agar), medios
slidos (con 1 a 2% de agar).
Segn su aplicacin:
Medios comunes o simples: permiten el desarrollo de la mayora de bacterias, sobre todo las
no exigentes.
Medios especiales: Medios de enriquecimiento, medios enriquecidos, medios de conservacin

y transporte medios selectivos y medios diferenciales.
Preparacin de medios de cultivo:

Es preciso ejercer un cuidado meticuloso en su preparacin los que debern ser esterilizados
inmediatamente una vez preparados
- Los tubos de ensayo que contienen los medios se tapan con tapones de algodn o tapas
metlicas o plsticas con el fin de evitar la penetracin de microorganismos extraos, luego se
esterilizan Las placas Petri se esterilizan por separado y luego los medios se vierten
aspticamente en ellas.
2.2 Competencias
2.3 Realiza un listado de los principales medios de cultivo y su aplicacin, as como los
indicadores mas usados
Prepara y esteriliza diversos medios de cultivo
2.3 Materiales y equipos:
2.4
Probetas de 1000 mL y frascos de 250, 500, 1000 mL

Solucin de: NaOH 1N y HCl 1N
Trpodes con rejilla metlica
Tubos estriles y placas Petri estriles ,baguetas ,beakers
Papel indicador de pH
Agar: Tripticase de Soya (TSA), SIM (Azufre Indol Motilidad).EMB,gelatina
Caldo: Tripticase de Soya (TSB). peptona
Cloruro de sodio
Procedimiento
-
Disuelve en agua destilada los medios comerciales proporcionados, segn la indicacin del
envase, a los que contengan agar ser necesario someterlos a la accin del calor hasta su
completa disolucin.
Enfra este preparado hasta aproximadamente 50C.
Mide el pH del medio, con la cinta indicadora.
Si es necesario, ajusta el pH empleando NaOH 1N o HCL 1N.
Envasa, rotula, sealando el tipo de medio y la fecha de preparacin.
Esteriliza por autoclave a 15 lb de presin por 15 a 20 minutos.
Controla la esterilidad del medio, por incubacin del mismo a 37C por 24 horas.
Para el caso del caldo peptonado, se proceder a la disolucin de los siguientes
componentes: peptona 10 g y cloruro de sodio 10 g, luego se completa con agua destilada
hasta 1000 mL; y se llevar a pH de 8.8 +/- 0,1.
2. 5 Resultados
Se describir su composicin y el fundamento de las diferentes clases de medios de cultivo
utilizados
2.6 Cuestionario:
1. Que importancia tiene el uso de los medios slidos?
2. Qu sustancia es la encargada de solidificar los medios de cultivo slido? De dnde se

extrae?
2.7 Fuentes de informacin
- Madigan, M. T.; Martinko, J. M.; Parker, J.: Brook Biologa de los Microorganismos, 10ed. Madrid,
Prentice Hall Iberia. Madrid, 2000.
- Levinson,W.E Jawetz,E Microbiologa e Inmunologa, 2ed. Editorial El Manual Moderno.
Mxico,2000
III.- PRACTICA N 3
TCNICAS DE SIEMBRA, ESTUDIO DEL DESARROLLO BACTERIANO EN
MEDIOS LQUIDOS, SEMISLIDOS Y SLIDOS
3.1 Marco terico
1. Tcnicas de siembra:
Las muestras a analizar pueden presentar poblaciones microbianas mixtas, por esta razn se
utilizan diversas tcnicas para separar un microorganismo de otro y obtener as un cultivo
puro que permita identificar al microorganismo aislado.
El diagnstico bacteriolgico se basa en el aislamiento de microorganismos a partir de una
muestra, por lo que es indispensable tener en cuenta las mximas condiciones de asepsia, desde
la toma de muestra hasta la siembra, la cual debe efectuarse lo ms rpido posible.
Trminos importantes:
Siembra
Inculo
Cultivo puro
Cepa
Se denomina tcnica de siembra al procedimiento mediante el cual se pone en contacto a los
microorganismos con un medio de cultivo y despus de un perodo de incubacin se produce el
desarrollo de colonias bacterianas. Existen varios tipos de siembra, entre los cuales estn los
siguientes:
-Siembra por dispersin y agotamiento
-Siembra por puntura
-Siembra por estra
-Siembra por inoculacin
-Siembra por incorporacin, en placa vertida, en masa o en todo el medio
-Siembra por diseminacin o en superficie o con cayado
2. Desarrollo bacteriano
Algunas veces las especies bacterianas se pueden identificar basndose en el aspecto que tienen
sobre o dentro de los distintos medios de cultivo , es as que la observacin de las caractersticas
de crecimiento de las colonias de microorganismos en medio slido (agar) y lquido (caldo), puede
ser de gran utilidad.
Estudio bacteriano en medio lquido:
- Velocidad de desarrollo (crecimiento): lento, moderado, rpido.
- Aspecto: turbio, claro o transparente, difuso, granulado. Se registran las observaciones como:
presencia o ausencia de: turbidez, sedimento y pelcula.
- Produccin de gas: formacin de burbujas.
Estudio bacteriano en medio semislido:
- Movilidad
- Cambios metablicos
Estudio bacteriano en medio slido:
- Caractersticas morfolgicas de las colonias en cuanto a: elevacin, forma, borde, superficie,

tamao, consistencia y color de pigmentacin.
3.2 Competencias
-
Realizar diversas tcnicas de siembra para su cultivo y aislamiento

Aplica las tcnicas de aislamiento hasta la obtencin de cultivos puros
-
Describe sus observaciones usando la terminologa tcnica apropiada
3.3 Materiales y equipos

1. Tcnicas de Siembra en Medios Lquidos, Semislidos y Slidos:
- Placas petri con agar TSA
- Tubos con agar SIM y TSA en agar inclinado
- Tubos con caldo TSB
- Cultivos de: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Pseudomonas
aeruginosa
2. Desarrollo bacteriano:
- Utilizar los medios de cultivo preparados en la prctica anterior y proceder a realizar los
sembrados en los distintos medios segn tcnicas
Ver figuras 3-1 a 3-4: Caractersticas morfolgicas de los cultivos bacterianos.
3.4 Procedimiento:
1. Tcnicas de Siembra en Medios Lquidos, Semislidos y Slidos:
Siguiendo la metodologa descrita segn los esquemas anexos, proceder tal como sigue:
- Con el asa en aro previamente esterilizada, tomar una asada del cultivo de
microorganismos, y sembrar por el mtodo de dispersin y agotamiento en las placas de
TSA .
- Con el asa en punta previamente esterilizada, tomar el inculo del cultivo de bacterias y
sembrar en agar SIM, por el mtodo de puntura.
- Con el asa en aro, toma el inculo del cultivo bacteriano y siembra en el tubo con agar en
pico de flauta o plano inclinado, por el mtodo de estra.
- Con el asa en aro previamente esterilizada tomar una asada del cultivo, y sembrar por el
mtodo de inoculacin en el tubo con TSB.
- Efectuar la lectura de los cultivos proporcionados por la profesora y observa. Tener sumo
cuidado de no sacudir los cultivos en caldo ya que esto puede trastornar los crecimientos
superficiales; describir. Hacer los esquemas de todas las observaciones.
Resultados:
Reporta y describe
3.5
3.6 Cuestionario:
1. Con qu propsito se emplean cada una de las diferentes tcnicas de siembra?
2. Describe las caractersticas del crecimiento de cada uno de los cultivos bacterianos
proporcionados en la prctica.
3.
Describe el mtodo de siembra por incorporacin y seala en que casos se emplea
3.7 Fuentes de informacion

Madigan, M. T.; Martinko, J. M.; Parker, J.: Brook Biologa de los Microorganismos. 10 ed,
Madrid Prentice Hall Iberia., 1999.
Prescott L/ Harley J ,/ Klein D 576/P 85 2000 Madrid
IV .- PRACTICA N 4
MTODOS DE COLORACIN
4.1 Marco terico
1. Coloracin Simple:
Aquella coloracin en la que se utiliza slo un colorante, el cual va a permitir visualizar la
morfologa de los microorganismos.
2. Coloracin Gram:
La diferenciacin de Gram se basa en el color que adquieren las bacterias cuando se tratan con el
colorante cristal violeta seguido por una solucin yodoyodurada de potasio, para luego someterlas
a una decoloracin despus de la cual se usa una coloracin de contraste, casi siempre
safranina. Las bacterias gram-positivas (coloracin azul o morada) son resistentes a la
decoloracin y conservan el complejo cristal violeta-yodo, los microorganismos gram-negativos,
toman la coloracin de contraste (coloracin rosa o roja).
3. Coloracin cido Resistente (Coloracin de Ziehl Neelsen):
En este mtodo de tincin, el colorante primario, fucsina cida, se formula con fenol para permitir el
paso a travs de las paredes celulares de las micobacterias. El portaobjeto se calienta para facilitar
la penetracin y se utiliza alcohol etlico como decolorante. Sin embargo, el reactivo se prepara con
cido clorhdrico para ayudar a la decoloracin de las clulas que no son cido resistentes.
4. Coloracin de Esporas:
Para la observacin de esporas, es necesario que el colorante penetre la pared de la espora, la
cual es relativamente impermeable, razn por la que se necesita de calentamiento.
5. Coloracin Negativa:
La tcnica de la tincin negativa incorpora materiales tales como la nigrosina o la tinta china, que al
estar compuesta de partculas demasiado grandes para penetrar en una clula, permiten observar
algunos microorganismos que permanecen sin teir y que resaltan sobre un fondo oscuro; se utiliza
principalmente para observar la cpsula bacteriana.
4. 2 Competencias
Capacita y adiestra al estudiante para que (el) (la):
- Realice manualmente mtodos de tincin habituales usados en la
lminas de observacin
- Describa minuciosamente sus observaciones, al microscopio
preparacin
de
Cultivos bacterianos:
- Cultivo de Escherichia coli
- Cultivo de Staphylococcus aureus
- Cultivo de Klebsiella
Lmina fijada con frotis de Mycobacterium tuberculosis
1. Coloracin simple:
- Azul de Metileno
2. Coloracin Gram:
- Violeta de genciana (colorante primario)
- Lugol (mordiente)
- alcohol acetona (decolorante)
- Fucsina bsica (colorante de contraste)
3.
Coloracin cido Resistente:

- Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)
- Alcohol cido (decolorante)
- Azul de metileno (colorante de contraste)
- Solucin de azul de metileno
- Solucin saturada alcohlica de eosina
5. Coloracin negativa:
- Tinta china
4.4
Procedimiento
1. Coloracin simple:
Prepara un frotis a partir del cultivo proporcionado.

Fija al calor.
Cubre el frotis con el colorante Azul de Metileno y deja actuar por 3 a 5 minutos.
Lava con agua y deja secar.
Observa al microscopio con objetivo de inmersin.
2. Coloracin Gram:
Prepara frotices de cultivos de E. coli y S. aureus.

Deja secar al aire y fija con calor.
Cubre los frotices con reactivo de cristal violeta durante un minuto.
Lava los portaobjetos con agua corriente durante 5 segundos.
Cubre el frotis con la solucin de lugol y deja actuar durante 2 minutos.
Lava con agua corriente, y aplica lentamente el alcohol acetona y seguir agregando
hasta que la tintura ya no fluya del frotis.
Lava inmediatamente con agua corriente.
Cubrir el frotis con la solucin de safranina durante 30 segundos.
Lava con agua corriente y deja secar la preparacin.
Observa al microscopio utilizando el lente de inmersin.
3. Coloracin cido Resistente:
- Cubre el frotis proporcionado con fucsina fenicada al 5% (carbolfucsina) y dejarlo

reposar de 30 a 60 segundos antes de calentarlo.
- Calienta la preparacin con suavidad, haciendo pasar el mechero de alcohol por debajo
-
del portaobjeto. Seguir calentando hasta que se observe el desprendimiento de

vapores. Evitar que el colorante hierva. Repetir 2 veces ms.
Enfra y lava con agua corriente.
Decolora con alcohol cido hasta que no arrastre colorante.
Lava con agua corriente.
Cubrir el frotis con azul de metileno, durante 1 minuto.
Lava con agua corriente.
Deja secar al aire.
Observa al microscopio con lente de inmersin. Las bacterias cido alcohol
resistentes se tien de rojo y los dems microorganismos de color azul.
10
Haga un frotis fino y fije a la llama.

Cubre con azul de metileno y calienta hasta hervir en forma intermitente por 1 minuto.
Lava con agua destilada.
Cubre con una mezcla de solucin saturada alcohlica de Eosina por 30 segundos.
- Lava con agua destilada y deja secar al aire.
- Examina al microscopio con lente de inmersin.
5. Coloracin negativa:
- Coloca varias asadas de cultivo en un portaobjetos limpio, cerca de uno de los bordes.
- Coloca un volumen igual de tinta china cerca del cultivo.
- Mezcla bien con el asa y luego extiende la mezcla a lo largo del portaobjetos, utilizando
la tcnica del frotis sanguneo.
- Deja secar el frotis.

- Cubre con safranina durante 10 segundos, luego enjuaga con cuidado y deja secar al
4.5
aire.
Observa al microscopio con lente de inmersin. Al examinar la preparacin, la cpsula
aparecer como una zona transparente que rodea a la pared celular.
Resultados
Registra, dibuja y colorea la morfologa de cada una de las muestras coloreadas
4.6 Cuestionario
1. Qu importancia tiene la pared celular bacteriana en la coloracin de Gram?
2.
Cules son las diferencias qumicas importantes que explican el estado cido-resistente?

Ingraham, J. L. y C.A.: Introduccin a la Microbiologa: Vol. 1 y 2. 3 ed./Editorial Revert, S.A.
Espaa, 1998.
Jawetz, .;Melnlick y Adelberg. Brooks Geo F, Butel Janet S

Mxico 2005
Microbiologa Mdica.23 ed.
Agurto Saenz,Toms-Ramos Gobea. Juan Carlos Sena, Chumbes Fernando Microbiologa

Bsica, 1 ed. Lima 2004
11
V.-
PRACTICA N 5
METABOLISMO MICROBIANO
5.1. Marco terico

En esta prctica se presentar un panorama general de las reacciones bioqumicas microbianas
relacionadas con el metabolismo de los carbohidratos y sobre las protenas, haciendo uso de las
pruebas bioqumicas diferenciales que permiten la identificacin de microorganismos (en especial
los microorganismos patgenos)
.
5.2 Competencias
5.3
Manipula e identifica los microorganismos en funcin a su comportamiento bioqumico.

Materiales y equipos
- Placas con agar nutritivo con 1% de almidn

- Tubos con: gelatina, caldo peptonado, caldo MR VP (Rojo de Metilo Voges Proskauer),
caldo lactosado con indicador de Andrade.
- Tubos con medio de: Citrato de Simmons en plano inclinado, Urea, TSI en plano inclinado
y . .
con TSA.
- Cultivos de: E. coli, B. subtilis,Ps. aeruginosa, Enterobacter, Proteus vulgaris, Staphylococcus.
aureus, Streptococcus viridans.
- Lugol.
- Reactivos de: kovacs, rojo de metilo, Voges Praoskauer: alfa-naftol al 5%, en alcohol
amlico, KOH creatina al 40%
- Tiras de papel de filtro impregnadas con solucin saturada de acetato de plomo.
- Perxido de hidrgeno al 3%.
- Campanas de Durham y pipetas Pasteur.
5.4
Procedimientos
1. Accin sobre los hidratos de carbono

Fermentacin de hidratos de carbono:
Primer da
- Inocula cada tubo de caldo lactosado con E.coli, S.aureus, P.vulgaris.
- Toma un cuarto tubo sin sembrar como control.
- Rotula los tubos e incuba todos los tubos a 37C por 24 horas.
Segundo da
- Despus del perodo de incubacin, compara cada uno de los tubos inoculados, con el tubo
control.
- Cuando la bacteria ha degradado el hidrato de carbono (lactosa), se detecta por la inclusin del
indicador de Andrade.
- Si el microorganismo tiene la capacidad de desdoblar un subproducto metablico a CO2 e H+
se observar la presencia de gas, en forma de burbujas.
12
Hidrlisis del almidn:
Primer da
- Con ayuda del lpiz de cera, divida por fuera la base de la placa Petri en 3 partes.
- En la seccin 1, siembra B. Subtilis, en la seccin 2 siembra E. Coli y en la seccin 3 siembra
Ps. aeruginosa
- Incuba a 37C por 24 horas.
Segundo da
- Agrega a toda la superficie del medio la solucin de lugol.
Observa la reaccin alrededor del crecimiento microbiano.
Produccin de cidos y acetil-metil-carbinol (acetona):
Prueba de Voges Proskauer (VP)
Primer da
Rotula los tubos con el nombre del microorganismo.
Por la tcnica de inoculacin, siembra cada cepa (E. coli y Enterobacter) en su tubo
correspondiente.
Incuba a 37C por 24 horas.
Segundo da
A cada tubo agrega 10 a 12 gotas de la solucin de alfa-naftol y 4 gotas de la solucin de KOH
creatina.
Agita despus de agregar las soluciones por 1 minuto.
Deja en reposo durante 15 minutos.
La reaccin es positiva, si aparece una coloracin rosada localizada en la mitad superior o en todo
el tubo dentro de los primeros 15 minutos, lo que nos indica la presencia de acetil-metil-carbinol.
Si la lectura se realiza despus de 1 hora, los cultivos pueden presentar una coloracin cobriza,
siendo esta una respuesta falsa positiva.
La reaccin es negativa, si el color inicial del medio de cultivo no cambia.
Prueba de rojo de metilo:
Primer da
- Rotula los tubos con el nombre del microorganismo.
- Por la tcnica de inoculacin, siembra cada cepa (E. coli y Enterobacter) en su tubo
correspondiente.
- Incuba a 37C por 48 a 72 horas.
Segundo da
- Agrega 4 5 gotas del indicador rojo de metilo a cada tubo, cuyo rango de viraje esta entre pH
4.4 (rojo) y 6.0 (amarillo).
- La prueba es negativa si da una coloracin amarillo naranja.
- La prueba es positiva si se mantiene un color rojo estable.
Principios bioqumicos de las reacciones en TSI:
Primer da
- Con el asa de siembra, inocula una porcin pequea de la colonia en el centro del tubo y estra
la superficie del pico de flauta.
- Rotula e incuba a 37C por 24 horas.
Segundo da
- Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubacin indicada.
- Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
- Fermentacin de la glucosa nicamente (rojo/amarillo): esto se debe a que la glucosa (que se
encuentra en baja concentracin con respecto a los otros azucares) ha sido utilizada y la
cantidad de cido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados
por la utilizacin de las peptonas. Estos procesos que son oxidativos, ocurren en la superficie
13
-
del medio, mientras que en el fondo, por no estar en contacto con el oxgeno, solo hay
fermentacin y el medio permanece cido.
Fermentacin doble o triple de carbohidratos (amarillo/amarillo): la fermentacin de la glucosa
y alguno (o ambos) de los otros dos azcares produce gran cantidad de cido, por lo que el
tubo permanece amarillo.
No fermentacin de carbohidratos (rojo/anaranjado): se presenta nicamente utilizacin
oxidativa de peptonas, por lo que solo la superficie del tubo se alcaliniza.
Produccin de gas: formacin de burbujas, grietas o desplazamiento del medio.
2. Accin sobre las protenas

Hidrlisis de la gelatina:
Primer da
- Rotula cada tubo con el nombre de la cepa correspondiente: E. Coli y B. Subtilis.
- Inocula cada cepa en un tubo con gelatina, haciendo uso de un asa en punta,
introduciendo de manera vertical hasta el fondo del tubo.

Segundo da
- Observa los resultados. Observa la hidrlisis de la gelatina
Produccin de indol:
Primer da
- Rotula sus tubos con el nombre del microorganismo: E. coli y B. subtilis.
- Inocula cada cepa en su tubo correspondiente.
- Incuba a 37C por 24 horas
Segundo da
- Agrega 4 gotas del reactivo de Kovacs, dejando resbalar por la pared interna de cada tubo
que presenta desarrollo bacteriano, luego agite suavemente.
- La reaccin es positiva, si se forma un anillo de color rojo fucsia brillante en la zona
superior del tubo, pocos segundos despus de haber agregado el reactivo.
- Las bacterias que a pesar de desarrollar en el medio no producen indol, permanecern sin
cambio alguno (reaccin negativa).
Produccin de sulfuro de hidrgeno:
Primer da
- Por la tcnica de puntura y estra, siembra separadamente en el medio TSA las cepas de
E. coli y P. vulgaris.
- Coloca una tira de papel de filtro impregnada con acetato de plomo.
Segundo da
- Observa el ennegrecimiento del papel de filtro, por la produccin del sulfuro de hidrgeno
(reaccin positiva).
3. Pruebas bioqumicas diferenciales

Utilizacin del citrato:
Primer da
- Siembra por la tcnica de estra en cada tubo con las cepas de E.coli y Enterobacter
aerogenes.
Segundo da
- La prueba es positiva si observa crecimiento bacteriano y un color azul intenso del agar en
24 a 48 horas.
14
- Es negativa si no hay crecimiento ni cambio de color.
Hidrlisis de la rea:
Primer da
- Por la tcnica de estra, siembra los tubos con medio de urea con E.coli y P.vulgaris. No
inocular el fondo.
Segundo da
- La prueba es positiva si el medio presenta un color rosado en la superficie o en todo el
tubo.
- La prueba es negativa, si el medio permanece del color original.
Prueba de la catalasa:
- Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubos con el cultivo de
Staphylococcus aureus o Streptococcus viridans, y transferir el inculo a un portaobjetos
limpio.
- Aade de 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
- Observa si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade el reactivo.
- Descarta la lmina en un recipiente con desinfectante.
Reaccin de la citocromo oxidasa:
- Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubos con el cultivo de
E.coli o Ps. aeruginosa, y transferir el inculo a una tira del reactivo de oxidasa.
- Considera la prueba positiva cuando los cultivos dan una coloracin azul violceo intensa
en la tira, en un mximo de 5 segundos.
5.5
Resultados
Reporta los resultados y explica el fundamento bioqumico de cada una de las pruebas
realizadas en la prctica
5.6
Cuestionario.
1. Cmo podra emplear las conclusiones que derivan de esta prctica para clasificar a las
bacterias?
Prescott L / Harley J, / Klein D. Microbiologa 576/P 85, 2000
Mac faddin, Jean F. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia
clnica. Madrid. 574.19285/412. 2003
15
VI
PRACTICA N 6
METODOS FISICOS Y QUIMICOS DE CONTROL MICROBIANO
6.1 Marco terico

1. Accin de los agentes fsicos y qumicos sobre la viabilidad de las bacterias
La muerte microbiana se produce cuando una clula no puede volver a dividirse para formar
dos nuevas clulas o sea pierden su viabilidad
En esta prctica vamos a determinar si un tratamiento especfico mata todas las clulas, si
reduce su nmero hasta niveles aceptables o si simplemente detienen el crecimiento durante
un perodo de tiempo limitado
Los aspectos qumicos de esta prctica se limitan a los compuestos que son normalmente
txicos y que se consideran como materiales desinfectantes o antispticos
2. Efecto de los desinfectantes qumicos:
Con frecuencia se desea una rpida desinfeccin y esterilizacin a temperatura ambiente,
sobre todo para diferentes objetos que pueden daarse al aplicarles calor.
Existen varios compuestos qumicos tales como los fenlicos, el formaldehdo, alcoholes,
halgenos y detergentes, para la desinfeccin a la temperatura ambiente.
Una prctica muy comn ha consistido en considerar al etanol al 70% y el isopropanol como
soluciones esterilizantes universales.
6.2 Competencias
-
Elabora un listado de productos farmacuticos cuya fabricacin sea resultado de procesos

biotecnolgicos
Ensaya y observa el efecto de los agentes fsicos y qumicos sobre la viabilidad de las
bacterias.

- Cultivos de la prctica anterior sembrados en los distintos medios

Caractersticas morfolgicas de los cultivos bacterianos.
2. Accin de los agentes fsicos y qumicos sobre la viabilidad de las bacterias:
16
Lmpara de luz ultravioleta

Solucin de: merthiolate 1/1000, tintura de yodo, cristal violeta, fenol al 5%, Savlon 1/200
Discos de Papel filtro
Placas con agar nutritivo
Cultivo de: Escherichia coli, Staphylococcus, Bacillus subtilis
Bao maria
-
Frasco con 30 mL de caldo nutritivo

Pipetas estriles de: 1 mL y 5mL
Placas petri estriles (6 por cada grupo)
Tubos estriles (8 por cada grupo)
Tubos con Agar nutritivo (4 por cada grupo)
Hisopos estriles
Asas de siembra
6. 4 Procedimiento
3. Accin de los agentes fsicos y qumicos sobre la viabilidad de las bacterias:
Accin del calor (llama directa)
- Esteriliza el asa de siembra a la llama directa del mechero.
- Toma el inculo y siembra en la mitad de la placa con agar nutritivo
- Esteriliza el asa de siembra, tomar otro inoculo, somete a la accin de la llama directa y
siembra en la otra mitad del agar.
- Rotula e incuba a 37C durante 24 horas.
Accin del calor hmedo

- Contamina el fondo de cada uno de cuatro tubos con una gota de cultivo de Bacillus
subtilis, evitando tocar las paredes del tubo.
- Calienta cada uno de los tubos por flameado, desde la boca del tubo hasta unos 3 cm del
fondo.
- Sumerge por 10 minutos cada uno de los tubos, en un bao de agua tal como sigue: el
primer tubo a 40C, el segundo tubo a 70C, el tercer tubo a 100C; el cuarto tubo servir
de control.
- Aade a cada uno de los tubos en condiciones aspticas 5 mL de caldo nutritivo.
- Procede de manera similar con los otros 4 tubos, pero usando como cepa, el cultivo de
Escherichia coli.
Accin de la radiacin ultravioleta

- Licua el agar en bao maria a 50C.
Siembra en superficie:
- Vierte el contenido de un tubo de agar licuado en una placa estril y deja solidificar.
Hacer lo mismo en la placa restante.
- Coloca una gota del cultivo asignado en el centro de cada una de las 2 placas y siembra
con un hisopo estril en toda la superficie de la placa. Dejar secar 30 minutos
Siembra en el medio:
- Transfiere 0.1 mL de los cultivos asignados, en cada uno de los 2 tubos restantes.
- Mezcla por rotacin y vierte todo el contenido en su respectiva placa Petri. Deja
solidificar
- Exponer las placas a la lmpara ultravioleta en la forma siguiente:
Mtodo de siembra
Siembra en superficie
Siembra en todo el medio
Placa N 1
Placa N 2
Placa N 1
Placa N 2
Tiempo de exposicin a la luz
2 minutos
5 minutos
ultravioleta
- Incuba por 24 horas y anota los resultados
17
2 minutos
5 minutos
Accin de los agentes qumicos
- Inocula abundantemente la superficie de una placa de agar, con 3 asadas del
microorganismo en estudio. Disemina uniformemente.
- Con una pinza previamente esterilizada, coloca los discos de papel embebidos con las
sustancias suministradas y equidistantes entre s.
Efecto de los desinfectantes qumicos:
- Inocula 0,1 mL de Escherichia coli, en un tubo conteniendo desinfectante.
- Repite lo anterior utilizando TSB en lugar del desinfectante (tubo control).
- Toma una asada del primer tubo a los 5 minutos y siembra por el mtodo de estra en un
cuadrante de la placa de agar nutritivo.
- Repite el procedimiento en los tres cuadrantes restantes a los 10, 20 y 30 minutos.
- Procede de igual forma con el tubo control.
6. 5
Resultados
Reporta y describe:
1. Las caractersticas del crecimiento de cada uno de los cultivos bacterianos ensayados.
6.6 Cuestionario
1. El cuestionario se proporcionara a medida que se desarrolle la prctica

Brooks G. F Butel, J.S Morse S.A Microbiologa mdica de Jawetz, Melnick, y Adelberg
Editorial El Manual Moderno S.A de C.V 23. Edicin. Mxico, 2005.
18
VII PRACTICA N 7
EFECTOS DE LOS ANTIBITICOS SOBRE LAS BACTERIAS
7.1 Marco terico
Los antibiticos (anti, -contra; bios , -vida) constituyen un grupo de compuestos teraputicamente
tiles.
Estos compuestos qumicos se caracterizan por ser subproductos metablicos de un
microorganismo, y casi siempre son letales para otro microorganismo no relacionado. A partir de
1940, se aislaron numerosos antibiticos, que probaron ser eficaces contra una variedad de m.o
patgenos (bacterias y hongos)
La investigacin en este campo sigue constituyendo uno de los principales objetivos de la industria
farmacutica.
La accin de los antibiticos sobre las bacterias se puede demostrar in vitro de diferentes maneras.
Un modo preciso de ellos es por el mtodo de dilucin en tubo. Existe tambin el mtodo del disco
nico de sensibilidad ideado por Kirby y Bauer.
7. 2 Competencias
7. 3
Aplica mtodos para evaluar la actividad antimicrobiana in -vitro

Obtiene la concentracin mnima inhibitoria de antibiticos en estudio
Frasco con 100 mL de caldo Mueller Hinton

Placas con agar Mueller Hinton
Escala de Mc Farland 0.5
Cultivo de E.coli
Cultivo de S.aureus
Cultivo de Ps.aeruginosa
Discos de antibiticos
Hisopos estriles
Pinzas estriles
Solucin de antibitico a una concentracin de 1000 mg/mL
Tubos estriles de 16 x 150
Pipetas estriles de 10 mL
Pipetas estriles de 5 mL
7. 4 Procedimiento
1. Mtodo de difusin en agar
Primer da
19
- Prepara una dilucin de la bacteria en estudio equivalente a 0.5 de la escala de Mc Farland
(1.5 x 108 bacterias).
- Siembra una placa de agar Mueller Hinton con un hisopo embebido en la dilucin
anterior.
- Coloca los discos de los antibiticos con ayuda de las pinzas estriles a 2 cm del borde de
la placa y equidistantes entre si.
- Presiona suavemente cada disco para que se adhiera al agar.
Segundo da
- Despus de la incubacin, observa los halos de inhibicin alrededor de los discos de
antibiticos.
- La sensibilidad del microorganismo a los antibiticos utilizados, se establece por
comparacin en una grfica de tamaos de la zona.
2. Mtodo de dilucin en tubo
Primer da
- Con una pipeta de 10 mL tomar el cultivo proporcionado y dejar caer una gota al frasco que
contiene 100 mL de caldo Mueller Hinton.
- Mezcla y con la misma pipeta, repartir el caldo en 10 tubos estriles, inoculando el primer
tubo con 9 mL y los restantes con 5 mL del caldo.
- Prepara una fila de diluciones del antibitico de 100 mg a 4 ug; con la pipeta de 5 mL toma
1 mL de la solucin de antibitico e inocula el primer tubo.
- Mezcla y saca 5 mL para el segundo tubo y as sucesivamente hasta el noveno tubo.
- Del noveno tubo, saca 5 mL y elimina conjuntamente con la pipeta.
- El tubo N 10 no recibir antibitico y servir como control del desarrollo bacteriano.
- Incuba los tubos a 37C por 24 horas.
Segundo da
- Observa la turbidez de los tubos comparndola con la del tubo control (N 9).
- Los tubos que no presentan turbidez se debe a que la bacteria fue inhibida en su
desarrollo.
- La menor concentracin de antibitico que inhibi el desarrollo bacteriano ser la MIC.
7.5 Resultados
1. Reporta los resultados obtenidos (dimetro de los halos) de los microorganismos empleados
frente al antibitico analizado.
7.6 Cuestionario
- Se realizar a medida del desarrollo de la prctica
Brooks Geo F.; Butel, Janet. S., Morse Stephen. A.: Microbiologa mdica. 17a. Edicin.
Mxico, Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V. 2002.
Madigan, M. T.; Martinko, J. M.; Parker, J. Brook.
Madrid,. Prentice Hall Iberia. 1999
Biologa de los Microorganismos 10 ed.
Ramos Gorbea Juan Carlos Sena Chumbes, Fernando Agurto Saenz Torres . Microbiologia
bsica Colora ciones de bacterias y la bioqumica en los medios de cultivo 2004.
20
VIII
PRACTICA N 8
PRINCIPALES GRUPOS BACTERIANOS DE IMPORTANCIA MEDICA ( I )

8. 1 Marco terico
1. Estudio de los estafilococos
La patogenicidad de una especie de Estafilococo, se determina por produccin de hemolisina,
fermentacin del manitol y produccin de las enzimas coagulasa y desoxiribonucleasa.
2. Estudio de los estreptococos
Agrupados originalmente por su capacidad para producir lisis de los hemates, as tenemos los
estreptococos alfa, beta y gama hemolticos, segn sea la lisis parcial, total o nula.
Existen varias pruebas especficas para el estudio de estos microorganismos como son:
- Prueba de la bacitracina, que se usa para la diferenciacin de un estreptococo Beta
hemoltico del Grupo A, de los Beta hemolticos del Grupo No A.
- Prueba de CAMP, que se usa para la diferenciacin de un estreptococo beta hemoltico
Grupo A, del estreptococo beta hemoltico grupo B.
- Prueba de la catalasa, para evidenciar la presencia de esta enzima sobre el perxido de
hidrgeno.
- Prueba de Optochin, para evidenciar la sensibilidad del S. pneumoniae al Optochin del y la
resistencia del S. viridans
8. 2 Competencias
-
Ensaya los mtodos de identificacin diagnstica in Vitro de especies representativas del

gnero Staphylococcus y Streptococcus.
8. 3 Material y mtodos
Placas con agar sangre
Placas con agar manitol salado
- Placas con agar DNA

- Cultivo de: Staphylococcus aureus y S. epidermidis; Streptococcus viridans, S. pyogenes,
21
S. pneumoniae y S. agalactiae
Set de colorantes Gram
Reactivo de coagulasa
Solucin HCl 1N
Solucin de perxido de hidrgeno al 3%
Discos de Bacitracina
Discos de Optochin
8.4 Procedimiento
1. Estudio de los estafilococos
Coloracin y morfologa
- Efecta frotices en lminas portaobjetos con cada una de las cepas.
- Despus de fijarlas al calor, realiza coloraciones de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersin y anota las caractersticas morfolgicas.
Inoculacin en agar sangre
Primer da
- Toma una placa de agar sangre y lo di vide en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estafilococos: S.
aureus y S. epidermidis.
Segundo da
Observa el crecimiento en agar sangre.
Crecimiento en agar manitol salado
Primer da
- Toma una placa de agar manitol salado y dividelo en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con las mismas cepas del ejercicio anterior.
Segundo da
- Observa el crecimiento en agar manitol salado y describe la morfologa de las colonias.
- Observa el viraje del color del indicador rojo de fenol, debido a la acidez
Prueba de la coagulasa
Primer da
- Toma dos tubos que contienen 0.5 mL de plasma de conejo (reactivo de coagulasa).
- Inocula cada uno de ellos con 0.1 mL de cada una de las dos cepas de estafilococos.
- Incuba a 37C.
- Observa cada hora la aparicin de cogulos, por espacio de 4 horas.
- De ser negativo el resultado, se deja incubando y se hace una lectura final a las 24 horas.
- Si aparece un cogulo, la bacteria posee la enzima coagulasa.
Accin de la DNAsa
Primer da
- Toma una placa de agar DNA y la divide en dos sectores.
- Inocula en una mitad con el cultivo de S. aureus y la otra mitad con S. epidermidis.
- En ambos casos, la siembra la realiza con un solo trazo lineal perpendicular a la lnea
divisoria.
Segundo da
- Agrega a la superficie del agar 1 ml de HCl 1N y espera unos minutos.
- El HCl 1N precipita el DNA contenido en el medio de cultivo, enturbindolo.
- Observa la presencia de la enzima DNAsa, por la aparicin de un halo transparente
alrededor de la siembra, que indica la ausencia de DNA.
Prueba de la catalasa
- Toma una asada de cada cultivo de S. aureus y S. epidermidis y lo coloca sobre un
portaobjetos limpio.
- Aade 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
2. Estudio de los estreptococos
- Efecta frotis en laminas portaobjetos con cada una de las cepas.
22
- Despus de fijarlas al calor, realice coloraciones de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersin y anota las caractersticas morfolgicas.
Inoculacin en agar sangre
Primer da
- Toma una placa de agar sangre y la divide en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estreptococos: S.
viridans (alfa hemoltico) y S. pyogenes (beta hemoltico).
Segundo da
- Observa las diferencias de hemlisis en agar sangre.
Prueba de la bacitracina
Se usa para la diferenciacin de un estreptococo Beta hemoltico del Grupo A, de los Beta
hemolticos del Grupo No A.
Primer da
- Toma una placa de agar sangre y divde en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estreptococos:
S.agalactiae y S.pyogenes y coloca cuidadosamente y en forma estril con ayuda de una
pinza, un disco de Bacitracina en cada mitad.
Segundo da
- Observa el halo de inhibicin, indicando la susceptibilidad a la Bacitracina del S.
pyogenes.
Prueba de CAMP
Se usa para la diferenciacin de un estreptococo beta hemoltico Grupo A, del estreptococo
beta hemoltico grupo B.
Primer da
- Inocula con trazo lineal en una placa de agar sangre, una colonia de S. aureus.
- Luego perpendicular al trazo anterior, inocula las cepas de estreptococos: S. agalactiae y
S. pyogenes en cada mitad de la placa sin tocar la cepa de estafilococo.
Segundo da
- Observa los resultados obtenidos.
- El estreptococo beta hemoltico Grupo B (S.agalactiae), produce una sustancia (factor
CAMP), que agranda la zona de hemlisis producida por el estafilococo, factor que no
posee el estreptococo beta hemoltico Grupo A (S. pyogenes).
Prueba de la catalasa
- Toma una asada del cultivo de Streptococcus pyogenes y coloca sobre un portaobjetos
limpio.
- Aada 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
Prueba de Optochin
Primer da
- Toma una placa de agar sangre y la divde en dos mitades.
- Inocula una mitad de la placa con S. viridans y la otra mitad con S. Pneumoniae y coloca
cuidadosamente y en forma estril con ayuda de una pinza, un disco de Optochin en cada
mitad.
8. 5 Resultados
Observa y reporta los resultados
8.6 Cuestionario
Qu factores condicionan la patogenicidad del S. aureus en comparacin con otras especies
de estafilococos?
23
1. Qu enfermedades produce el S. epidermidis y el S. saprophyticus?
2. Es recomendable en un paciente que presenta un cuadro de faringoamigdalistis, hacerse un
examen de secrecin farngea a fin de descartar la presencia de Streptococcus pyogenes
8. 7 Fuentes de informacin
Brooks, G. F.; Butel, J. S., Morse, S. A.: Microbiologa mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. ,
23a ed. Mxico. Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V. 2005 616.01/B84/ 2005.
IX.- PRCTICA N 9
PRINCIPALES GRUPOS BACTERIANOS DE IMPORTANCIA MEDICA ( II )
9.1 Marco terico
1. Grupo Enterobacterias
Las diferentes especies de enterobacterias se identifican por su actividad metablica en
diferentes medios de cultivo que contienen carbohidratos, protenas, aminocidos, etc. Estos
microorganismos no producen citocromo oxidasa, lo que las diferencia de las Pseudomonas,
Alcalgenes, Aeromonas y Vibrios.
2. Grupo Pseudomonas
Algunas especies son patgenas oportunistas para el hombre, siendo la mas importante
Pseudomonas aeruginosa por ser la especie mas frecuentemente asociada con enfermedad
humana. P.aeruginosa desarrolla fcilmente en los medios de cultivo, la mayora de las
especies son identificadas en base a su olor caracterstico, morfologa colonial, pigmentos y
otros.
3. Grupo Vibrios
En el gnero Vibrio se describen dos grupos: un grupo comprende a Vibrio cholerae,
causante del clera y los Vibrio no aglutinantes que pueden producir diarreas no epidmicas.
Otro grupo, lo conforman las especies halofilicas, que tienen afinidad por el cloruro de sodio.
Entre estos, V. parahaemoliticus, que puede producir enfermedades similares al clera pero
sin ser tan severas.
9.2 Competencias
-
Ensaya los mtodos de identificacin diagnstica in Vitro en el laboratorio de especies

representativas: Escherichia coli, Salmonella, Shigella , Vibrio.y Pseudomonas aeruginosa
9.3 Materiales y mtodos

Grupo Enterobacterias
24
Placas con agar: Mc Conkey, SS, EMB, TSI, Citrato de Simmons

Tubos con agar: Urea, SIM
Tubos con caldo: VP RM, peptonado, lactosado
Campanas de Durham
Cultivo de: E.coli, Salmonella tiphy, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter
aerogenes, Proteus vulgaris
Set de colorantes Gram
- Reactivos de: Kovacs, Rojo de Metilo, Voges Proskauer: (alfa naftol al 5% y KOH
creatina al 40%), oxidasa
- Lminas porta y cubreobjetos

Grupo Pseudomonas
- Tubos con: TSA y TSI
- Tubos con TSB
- Cultivo de Pseudomonas aeruginosa
- Set de coloracin Gram
- Reactivo de oxidasa
Grupo Vibrio
- Cultivo de Vibrio cholerae
- Cultivo de Vibrio parahaemolyticus
- Placas con agar TCBS
- Tubos con agar TSI
- Reactivo de oxidasa
- Set de coloracin Gram
- Desoxicolato de sodio
9.4 Procedimiento
1. Grupo Enterobacterias
- En su mesa encontrar una cepa representativa de los siguientes grupos: Proteae,
Escherichiae, Salmonellae, Shigellae, y Klebsiellae; con la cual trabajar durante toda la
prctica.
- Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por tincin de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersin.
Movilidad
- Toma una asada de la cepa del cultivo proporcionado y lo coloca sobre un portaobjetos
limpio.
- Coloca una laminilla encima del portaobjetos y observa la movilidad del microorganismo
utilizando el objetivo de 40x.
Inoculacin en agar Mc Conkey
Primer da
- Siembra la cepa proporcionada por el mtodo de dispersin agotamiento la placa con
agar Mc Conkey.
Segundo da
- La degradacin de la lactosa a cidos se manifiesta por el viraje de color a rojo del
indicador de pH rojo neutro; siendo estas colonias, lactosa positivas.
- Las colonias que son lactosa negativas son incoloras
Inoculacin en agar EMB (Eosina Azul de Metileno)
Primer da
- Siembra la cepa proporcionada por el mtodo de dispersin agotamiento en la placa con
agar EMB.
Segundo da
- En el medio EMB observa colonias negruzcas con brillo metlico verdoso, cuando
metabolizan la lactosa o sacarosa y translcidas o de color mbar si son lactosa
negativas.
Inoculacin en agar SS (Salmonella Shigella)
Primer da
- Siembra la cepa proporcionada por el mtodo de dispersin agotamiento en la placa con
agar SS.
25
- Incubar a 37C por 24 horas.
Segundo da
- En el medio SS, la deteccin de coliformes se comprueba cuando hay degradacin a cido
mediante el indicador de pH rojo neutro y observar colonias negras, si las bacterias
producen sulfuro de hidrgeno.
Diferenciacin metablica del grupo de Enterobacterias
Primer da
- Con la cepa asignada, procede a inocular por los mtodos de siembra adecuados, los
siguientes medios:
- Caldos: Lactosado, peptonado y MR-VP
- Agar: Urea, TSI, SIM, Citrato
Segundo da
- El alumno anotar los resultados de este ejercicio y efectuar la identificacin de la cepa
proporcionada. Comparar los resultados con la tabla proporcionada: Ver tabla: 10-1.
a) Caldo Lactosado: despus del perodo de incubacin, observe el resultado obtenido
(cambio de coloracin, presencia de gas) y compare con los resultados de los dems alumnos
de la clase.
b) Agar Urea: la prueba es positiva si el medio presenta un color rosado en la superficie o en
todo el tubo y es negativa, si el medio permanece del color original. Observe el resultado
obtenido y compare con los resultados de los dems alumnos de la clase.
c) Agar TSI: es indispensable que la lectura en el plazo establecido y observe:
- Produccin de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
- Fermentacin de la glucosa nicamente (rojo/amarillo).
- Fermentacin doble o triple de carbohidratos (amarillo/amarillo).
- No fermentacin de carbohidratos (rojo/anaranjado).
- Produccin de gas: formacin de burbujas, grietas o desplazamiento del medio.
d) Agar SIM (Azufre Indol Movilidad):
- Detecta la produccin de hidrgeno sulfurado por medio de la observacin de un
precipitado negro en el medio.
- Realiza la prueba de produccin de indol como en (e)
- Observa la movilidad del microorganismo, y realiza un examen macroscpico del medio
por una zona de desarrollo difuso que parte de la lnea de inoculacin.
e) Caldo peptonado: despus del perodo de incubacin:
- Agrega en zona 4 gotas del reactivo de Kovacs, en cada tubo que presenta desarrollo
bacteriano, luego agitar suavemente.
- La reaccin es positiva, si se forma un anillo de color rojo fucsia brillante en la zona
superior del tubo, pocos segundos despus de haber agregado el reactivo y es negativa si
no hay cambio alguno.
f) Caldo MR VP (reaccin de Rojo de Metilo):
- Agrega 4 5 gotas del indicador rojo de metilo a cada tubo, cuyo rango de viraje esta
entre pH 4.4 (ROJO) y 6.0 (AMARILLO).
- La prueba es positiva si se mantiene un color rojo estable y negativa si da una coloracin
amarillo naranja.
g) Caldo MR VP (reaccin de Voges Proskauer): agregar a cada tubo:
- 10 a 12 gotas de la solucin de alfa-naftol y 4 gotas de la solucin de KOH creatina.
- Agita despus de agregar las soluciones por 1 minuto y deja en reposo durante 15
minutos.
- La reaccin es positiva, si aparece una coloracin rosada localizada en la mitad superior o
en todo el tubo dentro de los primeros 15 minutos (presencia de acetil-metil-carbinol) y
negativa, si el color inicial del medio de cultivo no cambia.
h) Agar Citrato:
- La prueba es positiva si observa crecimiento bacteriano y un color azul intenso del agar en
24 a 48 horas y negativa si no hay crecimiento ni cambio de color.
26
Nota: para la lectura se recomienda hacer uso de las tablas de identificacin bioqumica que describen
las reacciones de diagnstico clave para identificar los gneros de las bacterias entricas
.
Reaccin de la Citocromo Oxidasa

- Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento del tubo con la cepa proporcionada, y
transferir el inculo a una tira del reactivo de oxidasa.
- Considerara la prueba positiva cuando los cultivos dan una coloracin azul violceo
intensa en la tira, en un mximo de 5 segundos.
2. Grupo Pseudomonas
- Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por la tincin de Gram.
Inoculacin en TSA
Primer da
- Siembra la cepa de Pseudomonas aeruginosa en TSA por el mtodo de dispersin
agotamiento.
Segundo da Observa las caractersticas de la colonia y presencia de pigmentacin
Inoculacin en agar TSI
Primer da
- Con el asa de siembra, inocula en el centro del tubo y estra la superficie del pico de
flauta.
Segundo da
Realiza la lectura tal como se indica para las enterobacterias
Reaccin de la Citocromo Oxidasa, proceder tal como se indica para las enterobacterias
Cultivo a 42C
Primer da
- Siembra la cepa de P. aeruginosa en los tubos de TSB por la tcnica de inoculacin.
Segundo da
- Observa la presencia o no de crecimientomicrobiano a 42 C, en los tubos
3. Grupo Vibrio
- Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por tincin de Gram.
Inoculacin en agar TCBS (Tiosulfato Citrato Sales biliares Sacarosa)
Primer da
- Divide la placa de TCBS por la mitad y sembrar en cada mitad las cepas de Vibrio por el
mtodo de dispersin agotamiento.
Segundo da
- Las colonias de Vibrio cholerae que desarrollan en TCBS son circulares, con el borde
ligeramente opaco, con un halo claro alrededor y son amarillas por que metabolizan la
sacarosa.
- Las colonias de Vibrio parahaemolyticus que desarrollan en TCBS son circulares,
pegajosas, con halo claro alrededor, y son de color verde porque no degradan la sacarosa
Inoculacin en agar TSI
Primer da
- Con el asa de siembra, inocula en el centro del tubo y estra la superficie del pico de
flauta.
Segundo da
Realiza la lectura tal como se indica para las enterobacterias.
27
Reaccin de la Citocromo Oxidasa, proceder tal como se indica para las enterobacterias.
Prueba del filamento o String Test
- Deposita una gota de la solucin de desoxicolato de sodio al 0.5% sobre una lamina
portaobjeto.
- Emulsiona en ella una colonia de V.cholerae o V. Parahaemolyticus con el asa de siembra.
- Detecta la presencia de filamento al levantar el asa.
9.5 Resultados
1. Esquematiza, registra y reporta
especie.
los resultados obtenidos, identificando en cada caso la
9.6 Cuestionario.
Describa el fundamento de las pruebas realizadas
9.7 Fuentes de informacion
Koneman, E. W.; Allen, S. D.; Dowell Jr., V. R.; Janda, W. M.; Sommers, H. M.; Winn Jr, W. C.:
Color, Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. J. B. Lippincott Company. Third Edition.
Philadelphia, 1997.
X. PRACTICA
N 10
MICOLOGIA
10. 1 Marco terico

Los hongos normalmente se encuentran en la naturaleza como organismos saprofitos libres y
son principalmente patgenos oportunistas, la mayora de los hongos no son patgenos para el
hombre. Solo unas 50 especies causan enfermedades en el hombre y la incidencia de
enfermedades fngicas graves es muy baja, sin embargo ciertas infecciones fngicas
superficiales son bastante comunes.
Su estudio en el laboratorio, es posible mediante un dispositivo para cultivo en Cmara
Hmeda sistema esterilizado que consta de una placa petri conteniendo un disco de papel filtro
y una varilla de vidrio en Uque soporta dos lminas porta y cubre objetos. Aspticamente
seccionar una pequea porcin de medio de Agar Sabouraud y colocar sobre la lmina porta
objetos. Sembrar el hongo y cubrir la preparacin con la otra lmina. La placa es incubada a
temperatura ambiente (20-25C) por 4 5 das.
10. 2
Competencias
Ensaya los mtodos de estudio in vitro para la identificacin e investigacin de especies
representativas del medio ambiente y de importancia clnica.
10. 3
Placas petri con colonias de hongos aislados del medio ambiente.

Agua destilada estril.
Dispositivo para cultivo en Cmara Hmeda.
Mechero de alcohol.
Solucin de KOH al 10%
Azul de metileno.
Papel filtro.
Varilla de vidrio en U.
Agar Sabouraud.
Lminas porta y cubre objetos, aspticas.
10. 4 Procedimiento
- Utilizando aguja de Kolle o estilete, picar una colonia y extrae una fraccin mnima o
micelio.
28
- Deposita esta fraccin sobre la porcin de agar dispuesta en el portaobjeto de la cmara
hmeda.
- Con ayuda de una pinza estril cubrir la preparacin con la lmina cubre objetos.
- Humedece el papel filtro de la placa con agua estril. y examina diariamente al
microscopio la lmina sembrada hasta verificar el completo desarrollo del hongo.
- Retira cada vez la lmina de cultivo y observa y si es necesario, aade ms agua al

sistema.
- Observa la germinacin de las esporas, el crecimiento y ramificacin del micelio, la

-
aparicin de hifas diferenciadas y el desarrollo de las estructuras de reproduccin.

Con ayuda de un Manual de identificacin de hongos determina
el gnero
correspondiente.
10.5 Resultados
Observa esquematiza e informa los resultados. Elabora esquemas en cada etapa de
desarrollo
10.6 Cuestionario
1. Cul es la ventaja del empleo de la cmara hmeda en el estudio de los hongos?
2. Existe diferencias entre hongos a nivel del crecimiento y diferenciacin del micelio?. Explique.
10 .7 Fuentes de informacin
Levinson, W. E.; Jawetz, E.: Microbiologa e Inmunologa. Editorial El Manual Moderno.

Segunda Edicin. Mxico, 2000.
Brooks, G. F.; Butel, J. S., Morse, S. A.: Microbiologa mdica de Jawetz, Melnick y
Adelberg. 16 dicion. Mxico. Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V.,.1999.
29
XI. PRCTICA N 11
CONTAMINACION MICROBIANA DE LOS ALIMENTOS
11.1.- Marco terico:
La contaminacin biolgica de los alimentos, incluye sobre todo a microorganismos y es
cuantitativamente mayor que la contaminacin por sustancias qumicas y agentes fsicos.
As, la contaminacin microbiana merece gran atencin, tanto desde la perspectiva de la
alteracin de los alimentos como de la salud de los consumidores.
11.2.- Competencias:
Determina la higiene de los productos crnicos durante su proceso de preparacin y
manipulacin.
Mtodo: Determinacin de la calidad de los alimentos crnicos por mtodos analticos
adaptados de los recomendados por la AOAC Norteamericana.
11.3.- Materiales y Equipos:
a. Muestras:
Alimentos crudos y procesados: Carne de pollo o de res, en trozos o molida,
carne de pescado, embutidos y hamburguesas. etc.
Materiales: Cuchillos, bolsas plsticas (con cierre hermtico), papel toalla,
recipientes de plstico, etc.
b. Materiales y Equipos:
(*) El material y los medios indicados se entregar en forma proporcional al nmero de mesa de trabajo,
calculados tomando en cuenta el total de alumnos agrupados de la siguiente forma: 5 alumnos por mesa
de trabajo y teniendo como mximo 10.
Material
Placas petri
Esptulas chicas y planas
Matraz de 250 ml
Matraz de 125 ml
Tubos de ensayo 16 x150 mm
Gradillas p / tubos 16 x 150 mm
Pipetas graduadas x 1 ml
30
Cant. (*)
(60) 6 x mesa
(10) 1 x mesa
S / Vol. de agar
(10) 1 x mesa
(20) 2 x mesa
5
(50) 5 x mesa
Observacin
Estriles (3 placas por c / medio)
Estriles
Estriles (contiene agar fundido)
Estriles (contiene el diluyente)
Estriles (contiene el diluyente )
Estriles ( puede ser de 5 ml)
5
5
1
Mecheros
Propipetas de jebe
Piceta con desinfectante
Equipos Instrumentos
Incubadora
Balanzas mecnicas
Con alcohol
1
5
c.- MEDIOS DE CULTIVO Y/O REACTIVOS

Denominacin
Agar Ogy (o Agar Saboraud)
Agar Plate Count (o A. nutritivo)
Diluyente: Soluc. 5% de tween 20 en
agua triptonada al 0.1%
Cantidad (*)
20 ml x placa (3 x mesa)
En matraz x 125 ml
En tubo 16 x150 ml
Observacin
Medio fundido para plaquear
90 ml x matraz (1 Mat. x mesa)
9 ml / tubo 16 x 150 mm (2 x mesa)
NOTA: Las placas conteniendo los medios de cultivo sembrados se entregaran por
separado (Incubacin a 25C y 37C).
11.4.- Procedimiento
A.- Preparacin y conservacin de la muestra:
Pesar 30 g de la muestra libre de la piel, o envoltorio de acuerdo al tipo de
producto, reducirlo a trozos pequeos.
La muestra debe guardarse en bolsas hermticas con cierre (cerrarlos por
completo, para evitar la prdida de humedad).
Efectuar los anlisis antes de las 24h de muestreado y conservar en refrigeracin
antes de su anlisis. Las muestras de alimentos naturales y procesados, se deben
seleccionar y conservar en recipientes apropiados, bolsa bien cerrada o sellada y
siguiendo las indicaciones del profesor.
B.- Preparacin de las diluciones de la muestra:
De la muestra inicial (carne molida, embutido o hamburguesa) pesar 10 g y
pasarla a un matraz que contiene 90 ml de agua peptonada al 0.1% con Tween 20
al 5% y disolver hasta obtener una suspensin.
Considerar la concentracin de sta como 0.1 10-1.
Luego tomamos del matraz (dilucin 10 -1 ) con pipeta estril 1ml de la dilucin y
vertemos en el Tubo 1 que contiene 9 ml de diluyente estril y mezclar. Esta sera
dilucin de concentracin 10 -2.
Seguidamente tomamos 1ml del Tubo 1 con otra pipeta estril y vertemos al
Tubo 2 y mezclar. Esta sera dilucin 10 -3.
Seleccionar las tres diluciones convenientes para la siembra.
C.- Recuento de microorganismos mesfilos aerobios viables.
De cada dilucin: 10-1,10-2, y 10-3 Tomar 1 ml y sembrar por el mtodo de
incorporacin en correspondientes placas vacas estriles, luego agregar 15 a 20
ml de medio de cultivo Agar Plate Count o Agar nutritivo fundido, mezclar y dejar
enfriar hasta solidificacin completa.
Llevar a incubacin a 37C por 24 a 48 horas.
D.- Recuento de hongos
De las mismas diluciones: 10 -1,10-2, y 10-3 tomar 1 ml (Utilizando la misma pipeta
del mtodo anterior) sembrar por mtodo de incorporacin en correspondientes
placas vacas estriles, luego agregar 15 a 20 ml de medio de cultivo Agar
Sabouraud o Agar OGY fundido, mezclar y dejar enfriar hasta solidificacin
completa.
Llevar a incubacin a 25C por 5 a 7 das.
E.- Lectura e interpretacin
31
11.5.-
Leer las placas anotando la cantidad de UFC y las caractersticas de las colonias
formadas para identificar la presencia de microorganismos contaminantes:
Bacterias y Hongos, respectivamente.
Resultados
Realizar la determinacin de la calidad de los alimentos crnicos, anotando la presencia o
no de Bacterias y Hongos en las muestras procesadas por Ud. Observar y registrar los
resultados, esquematizar y establecer sus conclusiones.
11.6.- Cuestionario
Cules son los mtodos microbiolgicos aplicados en esta prctica, para determinar la
calidad de los alimentos crnicos?.
Qu medios de cultivo se han empleado para realizar las determinaciones de control

de la calidad de alimentos crnicos que Ud. ha muestreado?
11.7.- Fuentes de informacin
Martnez Hernndez A. Fundamentos de Nutricin y Diettica; 1ra.Edicin; Ao

2011; Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires Argentina.
Vidal Garca, E. Manual Prctico de Nutricin; 1ra. Edicin; Ao 2009,
Madrid Vicente, A. Nuevo Manual de Industrias Alimentarias; 4ta.Edicin; Ao 2010.

Editorial MVA Editores: Madrid Vicente, Antonio Editor. Madrid - Espaa.
XII PRCTICA N 12
DETERMINACION DE PATOGENOS EN ALIMENTOS
12.1.- Marco terico:
Los productos crnicos y derivados procesados estn expuestos a la presencia de bacterias
patgenas, que incluso resisten las bajas temperaturas. Por ello es necesario aplicar
mtodos y procedimientos que eviten la contaminacin, y as prevenir el desarrollo de
muchas enfermedades toxicas e infecciosas en el hombre.
12.2.- Competencia:
Investiga la contaminacin patgena de los alimentos.
Mtodo:
Determinacin de la presencia de patgenos en alimentos crnicos por mtodos analticos
adaptados de los recomendados por la AOAC Norteamericana.
a.- Muestras:
Materiales: Cuchillos, bolsas plsticas, papel toalla, recipientes de plstico, etc.
b.- Materiales y Equipos:
32
Material
Cantidad
(30) 3 x mesa
Observacin
Estriles (contiene caldo brilla )
Tubos de Durham
Placas petri
Matraz de 250 ml
(30) 3 x mesa
(30) 3 x mesa
(10) 1 x mesa
s/Vol. de agar
Estriles (contenido en el caldo brilla )

Estriles
Estriles
Estriles (contiene Agar Manitol Sal )
Matraz de 125 ml
Gradillas p / tubos 20 x200 mm
Propipetas de jebe
Mecheros de vidrio
Equipos Instrumentos
Incubadora
Balanzas mecnicas
(10) 1 x mesa
(30) 3 x mesa
5
5
(30) 3 x mesa
(30) 3 x mesa
5
1
Estriles (contiene caldo peptonado)

Estriles (contiene caldo peptonado)
Estriles
Estriles
Con alcohol
Para limpieza de la mesa de trabajo
1
5
D.- MEDIOS DE CULTIVO Y/O REACTIVOS

Reactivo
Agar manitol salado
Caldo Brilla
Caldo peptonado
Cantidad
20 ml x tubo 20 x 200 (3 xmesa)
En matraz 125 ml
En tubo 16 x 150 mm
Observacin
Cada tubo c/ tubo de Durham
90 ml x matraz (1 matraz x mesa)
9 ml x tubo 16 x 150 (3 x mesa)
A.- Preparacin y conservacin de la muestra:
Pesar 30 g de la muestra libre de la piel, o envoltorio de acuerdo al tipo de
producto, reducirlo a trozos pequeos.
La muestra debe guardarse en bolsas hermticas con cierre (cerrarlos por
completo, para evitar la prdida de humedad).
Efectuar los anlisis antes de las 24 h de muestreado y conservar en refrigeracin
antes de su anlisis. Las muestras de alimentos naturales y procesados, se deben
seleccionar y conservar en recipientes apropiados, bolsa bien cerrada o sellada y
siguiendo las indicaciones del profesor.
B.- Preparacin de las diluciones de la muestra:
De la muestra inicial (carne molida, embutido o hamburguesa) pesar 10 g y
pasarla a un matraz que contiene 90 ml de caldo peptonado y disolver hasta
obtener una suspensin.
Considerar la concentracin de sta como 0.1 10-1.
Luego tomamos del matraz (dilucin 10 -1) con pipeta estril 1ml de la dilucin y
vertemos en el Tubo 1 que contiene 9 ml de diluyente estril y mezclar. Esta sera
dilucin de concentracin 10 - 2.
Tubo 2 y mezclar. Esta sera dilucin 10 -3.
Finalmente, tomamos 1ml del Tubo 2 con otra pipeta estril y vertemos al Tubo 3
y mezclar. Esta sera dilucin 10 -4.
Seleccionar las tres ltimas diluciones para la siembra.
C.- Determinacin de la Presencia - Ausencia de Coliformes totales.
De cada dilucin: 10-2, 10-3 y 10-4 tomar 1 ml con pipetas individuales y verter al
tubo con caldo Brilla (triplicado) que contiene tubo de Durham correspondientes,
empezando por la dilucin de mayor concentracin, tapar y marcar cada tubo.
D.- Determinacin de la Presencia de Staphylococcus aureus.
De las diluciones: 10-2,10-3 y 10-4, tomar 1 ml y sembrar por mtodo de
incorporacin en correspondientes placas vacas estriles, luego agregar 15 a 20
33
ml de medio de cultivo Agar Manitol salado fundido, mezclar por rotacin y dejar
enfriar hasta solidificacin completa.
E.- Lectura e interpretacin
Leer los tubos y determinar la presencia de coliformes totales.
formadas para determinar la presencia y cantidad total de UFC de Staphylococcus
aureus.
12.5.- Resultados
Realizar la determinacin de patgenos en los alimentos crnicos, anotando la presencia
de coliformes totales y la cantidad total de UFC de Staphylococcus aureus en las muestras
procesadas por Ud.. Observar y registrar los resultados, esquematizar y establecer sus
conclusiones.
12.6.- Cuestionario
Cules son los mtodos microbiolgicos aplicados en esta prctica, para determinar la
presencia y cantidad de patgenos en los alimentos crnicos?.
de la calidad de alimentos crnicos que Ud. ha muestreado?
12.7.- Referencia Bibliogrfica
Madrid Vicente, A. Nuevo Manual de Industrias Alimentarias; 4ta.Edicin; Ao 2010.

Editorial MVA Editores: Madrid Vicente, Antonio Editor. Madrid - Espaa.
XIII. PRCTICA N 13
CONTROL DE MANIPULADORES DE ALIMENTOS Y DE LA HIGIENE DE
SUPERFICIES.
13.1.- Marco Terico:
En la industria alimentaria se debe controlar la calidad del alimento de manera integral y con
ello garantizar la higiene tanto del propio alimento, como del personal, los equipos,
utensilios, el rea y superficies de trabajo. Esto permite reducir los factores de riesgo de
contaminacin microbiana y de otra naturaleza.
13.2.- Competencias:
Ensaya los mtodos de control de limpieza en los manipuladores de alimentos y en las
superficies de trabajo.
Mtodo:
Control microbiolgico de manipuladores de alimentos y de la higiene de superficies
aplicando mtodos adaptados de los recomendados por la AOAC.
a.- Muestras:
Materiales: cuchillos, bolsas plsticas, papel toalla, recipientes de plstico, etc.

b.- Materiales y Equipos:
34
Material
Placas petri
Gradillas p/ tubos 16 x 150 mm
Mecheros
Hisopos largos de madera
Propipetas de jebe
Equipos - Instrumentos
Incubadora
Cantidad (*)
(30) 3 x mesa
(10) 1 x mesa
5
(10) 1 x mesa
5
(30) 3 x mesa
5
1
Observacin
1 placa de cada medio
Estriles (conteniendo Agua peptonada )
Estriles
Con alcohol
Estriles
D.- MEDIOS DE CULTIVO Y/O REACTIVOS

Reactivo
Agar Ogy
Agar Nutritivo
Agar Mac Conkey
Agua triptonada: solucin al 5% de tween
20 / agua peptonada 0.1%
Cantidad (*)
20 ml x placa (1 placa x mesa)
10 ml x tubo de 16 x150 (1 x mesa)
Observacin
Plaqueado
Plaqueado
Plaqueado
NOTA: Las placas conteniendo los medios de cultivo sembrados se entregaran

por separado (Incubacin a 25C y 37C).
A.- Control higinico de los manipuladores de alimentos:
El personal debe estar correctamente aseado y con la indumentaria apropiada.
Seleccionar la zona a muestrear: manos, puos, gorros, mandil. etc.

B.- Procedimientos de toma de muestra:
Tomar un hisopo estril y humedecerlo en agua peptonada con tween 20 al 5%
eliminar el exceso de medio diluyente
Hisopar la superficie seleccionada con los sentidos que indican los esquemas A, B,
C.:
Colocar el hisopo en el tubo con agua peptonada estril, dejar en reposo por 20
minutos.
Sembrar en Agar Mac Conkey, Agar Nutritivo y Agar Ogy, respectivamente: Tomar
el hisopo del tubo con agua peptonada y eliminar el exceso de agua en las paredes
del tubo.
Sembrar en uno de los medios por el mtodo de extensin, y eliminar el hisopo
(previa incineracin).
Repetir el procedimiento de siembra para cada medio con hisopo nuevo estril.
Incubar las placas con Agar Nutritivo y Agar Mac Conkey a 37C por 24 a 48 horas
y las placas con Agar Ogy a 25C por 5 - 7 das
35
C.- Control higinico de superficies de trabajo:
El rea de trabajo debe estar correctamente aseada y de acuerdo al procedimiento
establecido.
Seleccionar las zonas a muestrear en la superficie de la mesa de trabajo.
Aplicar el mismo procedimiento anterior para la toma de muestra, siembra e
incubacin,
D.- Lectura e interpretacin
formadas para determinar la presencia de grmenes contaminantes (bacterias y/o
hongos).
13.5.- Resultados
Realizar la determinacin de patgenos durante el control de la indumentaria de los
manipuladores de alimentos y de la higiene de superficies de trabajo, anotando la cantidad
total de UFC segn el mtodo de recuento directo y las caractersticas de las mismas.
Observar y registrar los resultados, esquematizar y establecer sus conclusiones.
13.6.- Cuestionario
Cules son los mtodos microbiolgicos aplicados en esta prctica, para determinar
la presencia y cantidad de patgenos en la indumentaria de los manipuladores de
alimentos y en las superficies de trabajo?.

de los manipuladores de alimentos y en las superficies de trabajo que Ud. ha
muestreado?.
13.7.- Fuentes de Informacin.
Madrid Vicente, A. Nuevo Manual de Industrias Alimentarias; 4ta.Edicin; Ao 2010. Editorial MVA
Editores: Madrid Vicente, Antonio Editor. Madrid - Espaa .
XIV. PRCTICA N 14
CONTROL MICROBIOLOGICO DE MEDICAMENTOS
RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS.
14.1. Marco terico:
Los medicamentos deben poseer una pureza microbiolgica adecuada a su uso previsto.
Los recuentos de microorganismos aerobios mesfilos viables en los medicamentos no
estriles deben estar dentro de lmites mximos permisibles.
14.2. Competencias:
Determina la contaminacin microbiana de productos farmacuticos y superficies de
trabajo.
Mtodo: Preparacin de la muestra segn mtodo descrito por USP 30. Recuento de los
microorganismos aerobios totales y de hongos.
14.3. Materiales y equipos
A. Muestras: Productos farmacuticos lquidos en solucin o productos naturales, asa de
siembra, pabilo, bolsas plsticas, plumn marcador, algodn y papel kraft (por mesa de
trabajo).
B. Materiales y Equipos:
Material
Placas petri
Matraz de 250 ml
Matraz de 125 ml
Tubo de ensayo 16 x150 mm
36
Cantidad
(60) 6 x mesa
Segn Volumen
(10) 1 x mesa
(20) 2 x mesa
5
Observacin
Estriles
Estriles (conteniendo los agares )
Estriles (conteniendo el diluyente)
Estriles (conteniendo el diluyente )
Propipetas de jebe
Pipetas graduadas x 1ml
Probeta graduada x 10 ml
Mecheros
Equipos
Incubadora
Balanzas mecnicas
(20) 2 x mesa
5
(20) 2 x mesa
(10) 1 x mesa
5
1
Estriles
Estriles
Estriles
Con alcohol
1
5
1 x mesa de trabajo
C. Reactivos
Para la entrega de los medios de cultivo y materiales se considerar un aproximado
de 5 alumnos por mesa de trabajo y mximo 10 mesas de trabajo.
Denominacin
Alcohol etlico 70
Agar tripticasa soya
Cantidad (*)
50 ml
Fundido
Agar Sabouraud
Fundido
Observacin
20 ml x placa ( 3 placas x mesa ) en matraces
x 250 ml
20 ml x placa ( 3 placas x mesa ) en matraces
x 250 ml
Volumen 90 ml x matraz. 1 matraz x mesa
Volumen 9 ml x tubo 16 x 150 mm ( 2 tubos x
mesa)
Diluyente: Solucin al 5%
En matraz x 125 ml
de tween 20 en agua
En tubo 16 x 150 mm
tamponada al 0.1% estril
(*) Para
Importante.- Al finalizar la prctica, las placas conteniendo los medios de cultivo sembrados, se
entregarn al Laboratorio por separado segn temperatura de incubacin. Los alumnos asistirn a
verificar las placas y tubos, solo en los horarios establecidos por el Laboratorio. La presentacin es
obligatoria con: mandil, guantes y mascarilla.
14.4. Procedimiento
Obtencin de la muestra
Desinfectar el envase del producto a analizar, usar alcohol etlico de 70 y algodn. Abrir el
recipiente en forma asptica con ayuda del mechero, en caso de usar otros materiales
estos deben estar esterilizados.
Preparacin de la muestra
Diluir 10 ml de la muestra en 90 ml del agua tamponada (Para muestras con alto contenido
de lpidos cuenta con Tween 20 al 5%). Preparar diluciones seriadas 10 -1; 10-2, 10-3.
Preparacin de las diluciones:
La solucin preparada anteriormente ser considerada como la dilucin 10 -1 y seguir
de acuerdo al esquema siguiente:
Dilucin
10-1
Matraz con la muestra
Cada tubo de 16 x 150 mm debe contener 9 ml

del diluyente con tween 20 al 5%
1ml
1
ml
102
Tubo
1
10-3
Tubo
2
Interpretacin del esquema:
37
-
El matraz que contiene el diluyente con la muestra disuelta en l, sera la dilucin

10- 1.
Luego tomamos del matraz (dilucin 10 - 1) con pipeta estril 1ml de la dilucin y
vertemos en el Tubo 1 (esta seria nuestra dilucin 10 - 2).
Tubo 2 (esta sera nuestra dilucin 10 - 3).
Seleccionar tres diluciones convenientes para la siembra.
Recuento de microorganismos en placa.-
10-1
10-2
10-3
1
1
m
m
L
L
L
Las placas deben estar vacas
y
estriles.
El
mtodo
L de siembra debe ser por incorporacin. Tomar
L
-3
1 ml del tubo que contiene la mayor dilucin ( 10
L ) y proceder a verterlo en la placa. Aadir 15 L
20 ml de AGAR TRIPTICASA
SOYA a aproximadamente 46C - 48C. Mezclar por rotacin.
L
Realizar el mismo procedimiento
para las siguientes
diluciones (10 -2 y 10-1 respectivamente)
L
empleando la misma pipeta
y empezando por la de mayor dilucin (10 -3; 10-2 y 10-1
L
respectivamente) Incubar a 37C por 24 - 48 h.
L
1
m
L
L
L
L
Interpretacin: Contar el nmero de colonias crecidas en la placa de mayor dilucin y multiplica

por la inversa del valor de dilucin. Reportar como UFC/ ml.
Recuento de mohos y levadura
10-1
10-2
10-3
1
1
m
m
L
L
L
L
L
L
L
L
L
Las placas deben estar vacas y estriles.
L El mtodo de-3siembra debe ser por incorporacin
L que contiene la mayor
Tomar 1 ml del tubo
L dilucin (10 ) y proceder a verterlo en la placa
.Aadir 15 - 20 mlL de AGAR SABOURAUD a aproximadamente 46C - 48C. Mezclar por
rotacin. Realizar el mismo procedimiento para las siguientes diluciones (10 -2 y 10-1
L
respectivamente) empleando la misma pipeta y empezando por la de mayor dilucin (10-3;
-2
-1
L
10 y 10 respectivamente)
Incubar a 25C por 5 -7 das.
1
m
Interpretacin: Contar el nmero de colonias crecidas en la placa de mayor dilucin y

multiplicar por la inversa del valor de dilucin. Reportar como UFC/ml.
14.5. Resultados
Observar las caractersticas de las colonias.
38
Realizar el conteo y los clculos.

Anotar los resultados.
14.6.- Cuestionario
Cules son los microorganismos aerobios mesfilos viables?
Cul es la composicin y fundamento del agar tripticasa soya?
Cul es la composicin y fundamento del agar Sabouraud?
14.7.- Referencia Bibliogrfica
Secretaria de la Junta Directiva de la Convencin de la USP o del NF. 2007. USP 30
Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica. NF 25 Formulario Nacional. 30a ed. The
United States Pharmacopeial Convention
XV. PRCTICA N 15
CONTROL MICROBIOLGICO DE MEDICAMENTOS II.
INVESTIGACIN DE PATGENOS
15.1.- Marco Terico:
Los medicamentos deben poseer una pureza microbiolgica adecuada a su uso previsto.
Los microrganismos patgenos deben estar ausentes en los medicamentos.
15.2.- Competencia:
Conoce los procedimientos bsicos de investigacin de patgenos considerando el estudio
de los agentes indicadores de contaminacin.
Mtodo: Mtodo adaptado de la USP XXX de investigacin de patgenos e indicadores
de contaminacin (Sthaphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli).
15.3. Materiales y equipos:
a. Muestras: Productos medicamentosos y/o naturales, algodn, asa de siembra, pabilo,
bolsas plsticas, plumn marcador y papel kraft (por mesa de trabajo).
b. Materiales y Equipos:
Material
Probeta x 10 ml
Matraz de 125 ml
Cant (*)
(10) 1 x mesa
(10) 1 x mesa
(20) 2 x mesa
Detalle
Estriles
Estriles
1 conteniendo caldo tripticasa soya
1 conteniendo caldo lactosado
Placas petri estriles
(30) 3 x mesa
1 placa de cada medio
39
Observacin
Un da antes
(Los alumnos debern venir
un da antes de su prctica
para el enriquecimiento de
sus muestras)
Da de la prctica
(Se entregaran los
matraces del da anterior)
Mango de siembra
Mecheros de vidrio
Mango de siembra
Equipos
Incubadora
Balanzas mecnicas
5
5
5
5
1
1
5
Uso en la primera parte
C. Reactivos
Para la entrega de los medios de cultivo y materiales se considerar un aproximado
de 5 alumnos por mesa de trabajo y mximo 10 mesas de trabajo.
Denominacin
Cant. (*)
Observacin
Alcohol etlico 70
50 ml
Caldo Tripticasa Soya
Un dia antes de la prtica
Caldo Lactosado
Agar Manitol Salado
20 ml x placa ( 1 placa x mesa ) - Plaqueado
Da de la prctica
(Se entregaran los matraces
Agar Mac Conkey
20 ml x placa (1 placa x mesa ) - Plaqueado
del da anterior)
Agar Cetrimide
20 ml x placa ( 1 placa x mesa ) - Plaqueado
(*) Pa
r
Importante.- Al finalizar la prctica, las placas conteniendo los medios de cultivo sembrados, se
entregarn al Laboratorio. Los alumnos asistirn a verificar las placas y tubos, solo en los horarios
establecidos por el Laboratorio. La presentacin es obligatoria con: mandil, guantes y mascarilla.
15.4. Procedimiento
15.4.1. Acondicionamiento del rea de trabajo y del personal
Efectuar la limpieza y desinfeccin de la zona de trabajo con desinfectante. El personal
debe contar con guardapolvo, guantes, mascarillas y gorro.
El procedimiento incluye nicamente la fase de aislamiento e identificacin de colonias en
medios de cultivo selectivos, no se realizan procedimientos de diferenciacin bioqumica
(medios diferenciales).
15.4.2. Obtencin de la muestra
Desinfectar el envase del producto a analizar, usar alcohol etlico de 70 y algodn. Abrir
el recipiente en forma asptica con ayuda del mechero, en caso de usar otros materiales
estos deben estar esterilizados.
15.4.3. Mtodo operatorio
A) Un da antes de la prctica
Realizar el enriquecimiento un da antes de la prctica.
Investigacin de Patgenos I. Staphylococcus aureus y Pseudomonas
aeruginosa
Enriquecimiento de la muestra.
Sembrar 10 g o 10 ml de MP en 90 ml de caldo tripticasa soya e incubar a 37
por 24 h.
Investigacin de Patgenos II. E. coli
Enriquecimiento de la muestra
Sembrar 10 g o 10 ml de MP en 90 ml de caldo lactosado e incubar a 37 por 24
h.
B) Da de la prctica
Se entregaran los matraces del da anterior para que se realice la siembra en las
placas.
40
Caldo Tripticasa Soya
1. Siembra en medio selectivo para Pseudomona
Siembra por extensin en superficie (agotamiento) en agar cetrimide. Incubar a
37 por 24 h.
2. Siembra en medio selectivo para estafilococos.
Siembra por agotamiento en superficie en agar Manitol Salado. Incubar a 37
por 24 h.
Caldo Lactosado
a) Siembra en medio selectivo para E.coli.
Repicar a partir del caldo lactosado a agar Mac Conkey incubar a 37 por x 24
h.
C) Lectura de placas con medios
Se proceder tambin a realizar la lectura de las placas con medios sembrados el da
anterior.
15.5. Resultados
Observar si hay crecimiento de colonias y sus caractersticas.
Anotar los resultados.
15.6. Cuestionario
Cul es la composicin y fundamento del caldo tripticasa soya?
Cul es la composicin y fundamento del caldo lactosado?
Cul es la composicin y fundamento del agar manitol salado?
Cul es la composicin y fundamento del agar cetrimide?
Cul es la composicin y fundamento del agar Mac Conkey?
15.7. Referencia Bibliogrfica
Secretaria de la Junta Directiva de la Convencin de la USP o del NF. 2007. USP 30
Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica. NF 25 Formulario Nacional. 30a ed. The
United States Pharmacopeial Convention.
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UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA

Maneja y equipos y materiales en el usa Laboratorio.

1. Con qu propsito se envuelve totalmente el material a esterilizar?

Medios especiales: Medios de enriquecimiento, medios enriquecidos, medios de conservacin

Preparacin de medios de cultivo:

Probetas de 1000 mL y frascos de 250, 500, 1000 mL

2. Qu sustancia es la encargada de solidificar los medios de cultivo slido? De dnde se

- Caractersticas morfolgicas de las colonias en cuanto a: elevacin, forma, borde, superficie,

Realizar diversas tcnicas de siembra para su cultivo y aislamiento

Describe sus observaciones usando la terminologa tcnica apropiada

3.3 Materiales y equipos

Describe el mtodo de siembra por incorporacin y seala en que casos se emplea

3.7 Fuentes de informacion

Coloracin cido Resistente:

Prepara un frotis a partir del cultivo proporcionado.

Prepara frotices de cultivos de E. coli y S. aureus.

3. Coloracin cido Resistente:

- Cubre el frotis proporcionado con fucsina fenicada al 5% (carbolfucsina) y dejarlo

del portaobjeto. Seguir calentando hasta que se observe el desprendimiento de

Haga un frotis fino y fije a la llama.

- Deja secar el frotis.

4.7 Fuentes de informacin

Jawetz, .;Melnlick y Adelberg. Brooks Geo F, Butel Janet S

Microbiologa Mdica.23 ed.

Agurto Saenz,Toms-Ramos Gobea. Juan Carlos Sena, Chumbes Fernando Microbiologa

5.1. Marco terico

Manipula e identifica los microorganismos en funcin a su comportamiento bioqumico.

- Placas con agar nutritivo con 1% de almidn

1. Accin sobre los hidratos de carbono

2. Accin sobre las protenas

- Incuba a 37C por 24 horas.

3. Pruebas bioqumicas diferenciales

6.1 Marco terico

Elabora un listado de productos farmacuticos cuya fabricacin sea resultado de procesos

6.3 Materiales y equipos

- Cultivos de la prctica anterior sembrados en los distintos medios

Lmpara de luz ultravioleta

Frasco con 30 mL de caldo nutritivo

Accin del calor hmedo

Accin de la radiacin ultravioleta

6.7 Fuentes de informacin

Aplica mtodos para evaluar la actividad antimicrobiana in -vitro

Frasco con 100 mL de caldo Mueller Hinton

Biologa de los Microorganismos 10 ed.

PRINCIPALES GRUPOS BACTERIANOS DE IMPORTANCIA MEDICA ( I )

Ensaya los mtodos de identificacin diagnstica in Vitro de especies representativas del

- Placas con agar DNA

Ensaya los mtodos de identificacin diagnstica in Vitro en el laboratorio de especies

9.3 Materiales y mtodos

Placas con agar: Mc Conkey, SS, EMB, TSI, Citrato de Simmons

- Lminas porta y cubreobjetos

Reaccin de la Citocromo Oxidasa

los resultados obtenidos, identificando en cada caso la

10. 1 Marco terico

Placas petri con colonias de hongos aislados del medio ambiente.

- Retira cada vez la lmina de cultivo y observa y si es necesario, aade ms agua al

- Observa la germinacin de las esporas, el crecimiento y ramificacin del micelio, la

aparicin de hifas diferenciadas y el desarrollo de las estructuras de reproduccin.

Levinson, W. E.; Jawetz, E.: Microbiologa e Inmunologa. Editorial El Manual Moderno.

c.- MEDIOS DE CULTIVO Y/O REACTIVOS

Qu medios de cultivo se han empleado para realizar las determinaciones de control

Martnez Hernndez A. Fundamentos de Nutricin y Diettica; 1ra.Edicin; Ao

Vidal Garca, E. Manual Prctico de Nutricin; 1ra. Edicin; Ao 2009,

Madrid Vicente, A. Nuevo Manual de Industrias Alimentarias; 4ta.Edicin; Ao 2010.