UNIVERSIDAD TCNICA DE MACHALA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y DE LA SALUD

CARRERA DE BIOQUMICA Y FARMACIA
LABORATORIO DE TOXICOLOGA

Alumno: Vicente Orellana

Profesor: Bioq. Farm. Carlos Garca MSc.
Curso: 5to Bioqumica y Farmacia
Paralelo: A
10
ESTUDIO DE LA FRAGMENTACIN DEL ADN EN
PERSONAL DE
LABORATORIO DE INVESTIGACIN EXPUESTO A
AGENTES
MUTGENICOS QUMICOS EN LA CIUDAD DE QUITO
RESUMEN
En el Ecuador las personas que trabajan en laboratorios de
investigacin se encuentran expuesto a una gran cantidad de
sustancias txicas, las cuales pueden causar trastornos genticos y
cromosmicos .Sin embargo, an no se conoce los perjuicios que
pueden estar ocasionando en el ADN debido al continuo contacto con
compuestos qumicos. La finalidad del presente trabajo fue
determinar la fragmentacin del ADN en personas voluntarias que
trabajan en laboratorios de investigacin de la ciudad de Quito que se
encuentran expuestos a compuestos qumicos, tambin se tom en
cuenta la relacin con factores de riesgo tales como: compuesto
qumico, tiempo de exposicin y equipo de proteccin personal. Para
el estudio se tomaron muestras de sangre circulante de 30 individuos
expuestos ocupacionalmente y 10 individuos control, se realiz la
tcnica de
Ensayo Cometa y mediante registro visual se observaron 200
nucleoides por persona, clasificando el nivel de fragmentacin en:
nula, baja, media, alta y total.
Los resultados indican que la exposicin a agentes mutagnicos
qumicos est relacionada con la fragmentacin del ADN, exhibiendo
una diferencia significativa en los niveles nulo (p=0,000), bajo
(p=0,002) y medio (p=0,012), entre el grupo expuesto y el control.
A pesar de no existir diferencias significativas con respecto al tipo de
compuesto qumico, los individuos que presentan niveles de
fragmentacin altos, se encontraron expuestos a solventes orgnicos
y tienen un tiempo exposicin mayor a 6 aos.

INTRODUCCIN
La molcula de ADN tiene el control de todas las actividades y
funciones celulares, y es donde se rene toda la informacin gentica,
por ello la integridad de sta molcula es un aspecto importante para
la salud y el buen funcionamiento del organismo. A pesar de esto el
material gentico puede ser fragmentado por numerosos agentes
txicos o procesos que pueden producir alteraciones en el ADN.
El dao celular que producen estos agentes al encontrarse en altas
cantidades, afecta a distintas molculas como protenas, lpidos y
ADN, este dao se conoce como estrs oxidativo que puede dar lugar
a alteraciones genticas sean procesos carcinognicos o mutaciones.
Una de las tcnicas ms utilizadas que localiza el dao en el ADN es
la electroforesis de clulas individuales, basada en la migracin del
ADN en gel de agarosa en condiciones alcalinas, que al ser observada
en el microscopio, por fluorescencia o tincin, la clula presenta la
apariencia de un cometa, con una cabeza, regin nuclear y cola,
formada por fragmentos nucleares que se han movido en direccin
del nodo; sta tcnica se conoce como ensayo cometa.

MUTGENOS

Los agentes mutgenos son sustancias que producen alteraciones en

el material gentico. Estas mutaciones pueden afectan a la
replicacin y transcripcin del ADN, la acumulacin de estas
mutaciones pueden llevar al cncer.
Diferentes agentes mutgenicos actan sobre el ADN de manera
distinta, alterando el control de la actividad celular, lo que produce un
funcionamiento inadecuado de la clula, sta alteracin adopta tres
formas: rupturas cromosmicas, cambios en la composicin qumica
del ADN y adicin o supresin de cromosomas.
Los agentes mutagnicos se clasifican en: BIOLGICOS que incluyen
parsitos, bacterias, hongos, vegetales, virus, FSICOS como
radiaciones ultra violeta e ionizantes y QUMICOS, como el gas
mostaza y el 5-bromouracilo. Se ha analizado que la mayora de los
tumores producidos por agentes mutgenicos estn asociados entre
un 90-95% de los casos a agentes qumicos, entre un 1-5% a agentes
fsicos (radiaciones) y entre un 1-2% a agentes de tipo biolgico o
virus.

Fragmentacin del ADN

El dao en el ADN es un evento comn en la vida celular, siendo el

responsable de cambios en la molcula del ADN que conducen a
alteraciones en la replicacin y transcripcin.

La mayora de los daos al ADN afectan a la base primaria de la doble

hlice provocando modificaciones en las bases, introduciendo nuevos
enlaces qumicos.
Estos daos son consecuencia de procesos celulares endgenos o
producidos por mecanismos exgenos. Si el dao en el ADN no es
reparado puede llevar a envejecimiento, muerte celular o a una
proliferacin excesiva que conduce a la formacin de un tumor, masa
o neoplasia.

FUNDAMENTO DEL ENSAYO COMETA

Tcnica que se basa en una electroforesis en gel de clulas
individuales que permite la cuantificacin el dao en el ADN celular
de una forma sensible y rpida.
El fundamento de esta tcnica para detectar daos en el ADN que se
producen por un rompimiento simple o doble en la cadena se basa en
la fragilidad que tienen los sitios afectados; al ser sometidos a un pH
superior a trece y su comportamiento bajo electroforesis. Los
fragmentos de ADN, que son producto de la accin de la sustancia a
probar, son afectados por un pH alcalino, se mueven a una velocidad
diferente del resto del material nuclear, hacia el nodo formando la
cola del cometa, entre ms larga sea esta porcin mayor ser el
dao causado al ADN.
Para comprender el principio de esta tcnica se sabe que el ADN
ocurre como lazos atados en una matriz y est muy empaquetado en
virtud de su organizacin en nucleosomas. El momento que la clula
es sometida a detergentes durante la lisis, se permeabiliza las
membranas y las protenas nucleares son extradas por la alta
concentracin de sales, a partir de ese momento el ADN queda
totalmente libre y desprotegido, pero superenrollados, constituyendo
lo que se conoce como un nucleoide. Sin embargo, si el ADN ha
sufrido rupturas, la estructura del nucleoide cambia totalmente
formando el denominado cometa, ya que las rupturas relajan el
superenrollamiento de la molcula, y los lazos en lugar de quedar
firmemente enlazados a la matriz nuclear quedan en libres para
extenderse durante la electroforesis.
.La neutralizacin que sigue a la electroforesis alcalina permite el
apareamiento de las dos cadenas de ADN que conforman la cabeza
del cometa, siendo diferente en la cola donde los fragmentos rotos
permanecen libres, esto se ha demostrado al teir con naranja de

acridina. Al observar los nucleoides al microscopio, si el ADN est

intacto se observar una esfera fluorescente que corresponde al ADN
superenrollados, pero si el ADN ha sufrido fragmentaciones se
observar un nucleoide en forma de cometa, donde la cabeza
corresponde al ADN intacto y la cola al ADN fragmentado que ha
migrado hacia el nodo.
Este ensayo se ha empleado en estudios de monitoreo en individuos
expuestos a pesticidas, derivados del petrleo, qumicos utilizados en
la industria, anestsicos y drogas antineoplsicas.

METODOLOGA
Para analizae los efectos de la exposicin a agentes mutgenicos
qumicos, se determinaron dos grupos: individuos laboralmente
expuestos a mutgenos (GEm) e individuos no expuestos (GNc). Cada
individuo firm un consentimiento informado en el que se incluye
informacin del trabajo de investigacin, as como la donacin de una
muestra de sangre inicial y de ser necesario una segunda muestra
por ser una va de fcil extraccin sencilla y estar de acuerdo en
formar parte del estudio a realizarse con la garanta de ser informado
sobre los resultados obtenidos.
Adems, cada individuo (GEm y GNc) llen una ficha informativa en la
cual se seala edad, sexo, ocupacin, hbitos y antecedentes clnicos
familiares; as como tambin el tipo de agente mutgenico qumico al
que ha estado expuesto, clasificndolos en inorgnicos y orgnicos.
El mtodo empleado para la determinacin del dao en el ADN fue la
tcnica Ensayo Cometa-alcalino, que tiene la capacidad de detectar
fragmentaciones provocadas por la exposicin a agentes txicos a
travs de nucleoides observados bajo el microscopio; 200 nucleoides
fueron analizados al azar por individuo, 100 por placa, cada uno de
los nucleoides fueron agrupados en primera instancia por anlisis
visual, y asignndoles un rango y se los clasific por nivel de dao en
5 categoras: nulo <20,00m, bajo 20,00 a 44,99 m, medio 45,00 a
69,99 m, alto 70,00 a 94,99 m y total >95,00 m.

CLASIFICACION DE COMETAS

Categora nulo, no hay fragmentacin (<20,00 m); categora bajo (20,0044,99); categora medio (45,00-69,99); categora alto (70,00-94,99);
categora total (>95,00)

MUESTRAS BIOLGICAS
Se tomaron muestras de sangre de individuos voluntarios que
trabajan en 6 en centros de investigacin de la ciudad de Quito y de
individuos voluntarios no expuestos a mutgenos qumicos.
El grupo control fue conformado por individuos de edad y sexo
semejante al grupo expuesto, habitantes de la misma zona geogrfica
y sin exposicin a algn agente mutgenico qumico.
La extraccin de sangre fue de 5 ml de sangre por cada individuo en
tubos de vidrio vacutainers heparinizados, los cuales se colocaron en
un contenedor fro. El traslado del material biolgico fue
inmediatamento desde el lugar de toma de muestra hacia el
laboratorio del Instituto de Investigaciones Biomdicas de la
Universidad de las Amricas (UDLA).
A cada muestra se le seal con un cdigo, anteponiendo las letras
E para los individuos expuestos y C para los individuos controles

no expuestos, manteniendo en el anonimato a los sujetos en estudio.

Cada
muestra
de
sangre
fue
procesada
por
duplicado
inmediatamente despus de su recoleccin, tomando 5 l de sangre
por placa para la realizacin del Ensayo Cometa.

ENSAYO COMETA
Para el proceso de Ensayo Cometa se utiliz 5l de sangre la que se
coloc sobre una placa con 80l de LMP agarosa, se coloc un
cubreobjetos y se lleva a 4 C durante 8 minutos, pasado este tiempo
las placas se las retiro de la refrigeracin, se retir el cubreobjetos
con cuidado y se coloc 85l de LMP agarosa, se cubri y llev a 4C
por 8 minutos para solidificarse.
Para seguir con la fase de lisis, las muestras se colocaron bajo luz
roja, se retira el cubreobjetos y se las sumergi en solucin de lisis
por 1 hora a 4C en la oscuridad, despus de la hora las placas se
sacaron y se lavaron con tampn de electroforesis
Previo a la corrida las placas se colocan por 20 minutos en tampn de
electroforesis en una cmara de electroforesis horizontal, transcurrido
el tiempo se conectaron los electrodos a la fuentes de poder a 300
mA con un voltaje de 22-25 V durante 20 minutos ms. Concluido
este paso, las placas se deshidratan para fijarlas y conservarlas hasta
dos semanas despus, o teirlas con bromuro de etidio (30- 50 l) para
ser observadas en mximo cinco das.
Se analiz cada una de las muestras en microscopio de fluorescencia
utilizando el objetivo 40X. Se contabilizo 200 nucleoides, no tomndose en
cuenta los nucleoides en el borde de la placa, slo los del centro de la placa
debido a que no se usa cmara de electroforesis con buffer recirculante.

RESULTADOS
FACTORES DE RIESGO
Se examinaron 30 individuos voluntarios 16 hombres y 14 mujeres de
edad promedio 35 7 que han trabajado aos en diferentes
laboratorios de investigacin dentro la ciudad de Quito y que han
estado en contacto con agentes mutgenicos qumicos (GEm); los
individuos realizan sus labores en las reas de qumica, gentica y
control de calidad de plaguicidas; adems se incluyeron 10 individuos
voluntarios 5 hombres y 5 mujeres cuya edad promedio fue de 37 7
aos, considerados como controles ya que ellos no estan expuestos a
compuestos qumicos (GNc).

COMPUESTOS
EXPUESTOS

QUMICOS

LOS

QUE

SE

ENCUENTRAN

De los individuos utilizados en el estudio 16 estuvieron en contacto

con cidos inorgnicos, cido ntrico perteneciente a los
carcinognicos de categora III), cido sulfrico, clorhdrico y
sulfhdrico que no pertenecen a ningn grupo mutagnico ni
carcinognico; 8 de los individuos estuvieron en contacto con
hidrocarburos aromticos como benceno, tolueno y xileno, siendo el
benceno un compuesto carcinognico; 4 individuos estuvieron en
contacto con bromuro de etidio considerado mutagnico y
posiblemente carcinognico; 5 individuos estuvieron expuestos a
metales como cadmio, nquel y plomo compuestos considerados
cancergenos; 1 individuo expuesto a cromato de potasio y 3 a
dicromato de potasio, compuestos qumicos que son considerados
carcinognicos

TIEMPO DE EXPOSICIN
Las personas que trabajan en los laboratorios se ha expuesto a
qumicos un promedio de 36 horas a la semana, con jornadas de 8
horas diarias.
Se pudo encontrar individuos con 12 meses hasta 33 aos de trabajo
en laboratorio.

EQUIPO DE PROTECCIN PERSONAL (EPP)

Debido a la exposicin por contacto a la piel e inhalacin, para este
trabajo investigativo consideramos que el mandil, guantes y
mascarilla son elementos bsicos para trabajar con agentes
mutgenicos qumicos.
En los laboratorios visitados se observ que 17 individuos usan los
tres quipos de proteccin bsicos, los otros individuos al menos usan
un elemento de proteccin

FRAGMENTACIN EN EL ADN DETECTADO POR EL

ENSAYO COMETA Y SU RELACIN CON FACTORES DE
RIESGO

Los individuos expuestos a agentes mutgenicos qumicos (GEm)

tienen mayor fragmentacin con respecto al grupo control (GNc). El
grupo control presenta un promedio de 190 nucleoides mientras que
el GEm present un nivel de dao nulo con un promedio de 165
nucleoides.
En la observacin en niveles de fragmentacin bajo, medio y alto, el
grupo expuesto presenta mayor nmero de nucleoides en estos
niveles comparado con el grupo control. En el nivel de dao bajo se
pudo observar que el GEm present un promedio de 25 nucleoides y
el GNc alcanza solamente un promedio de 6 nucleoides; el nivel de
dao medio en el GEm tiene un promedio de 8 nucleoides y el grupo
control de 3 nucleoides; el nivel de dao alto en el GEm presenta un
promedio de 2 nucleoides mientras que el GNc present un promedio
de 1 nucleoide.
Finalmente en el nivel de dao total se observ cometas, solo en dos
individuos del grupo expuesto. El nmero de nucleoides en los
diferentes niveles se pueden visualizar en l.

A pesar que no existi diferencias muy distintas entre factores de

riesgo y factores predisponentes con la fragmentacin del ADN se
pudo observar que los individuos E4, E10, E24 y E27 presentan una
cifra considerable en la categora de nivel de dao alto y total.

Los individuos E3, E5, E15, E29 y E30 no utilizaron guantes y

mascarilla, elementos considerados necesarios en este estudio para
estar en contacto con compuestos qumicos, los individuos E3 y E5 se
expusieron a cido ntrico y a disolventes orgnicos como el benceno
y dicromato de potasio; el individuo E15 estuvo expuesto a plomo,
cido ntrico y dicromato de potasio; por ltimo, los individuos E29 y
E30 estuvieron expuestos a bromuro de etidio.
Los individuos E11, E13, E23 y E28 estuvieron expuestos a rayos X,
alcanzando niveles de dao medio-alto, adems estuvieron expuestos
a bromuro de etidio, cido ntrico y cromato de potasio y presentan
un promedio de 6 aos de exposicin a estos compuestos qumicos. El
individuo E9 estuvo expuesto a acetonitrilo y plaguicidas, el individuo
E22 estuvo expuesto a acetonitrilo y cido actico ambos con un
promedio de tiempo de exposicin de 3 aos. Los individuos E2, E6,
E16 y E17 presentaron consumo de tabaco y alcohol y estuvieron
expuestos a cido ntrico, plaguicidas, cromato de potasio y metales,
excepto el individuo E17.

CONCLUSIONES
El personal de laboratorios de investigacin se encuentra
principalmente expuesto a cido ntrico, benceno, cromato y
dicromato de potasio, bromuro de etidio y plomo, los cuales estn
entre los compuestos considerados mutagnicos y carcinognicos
segn el CIIC.
El equipo de proteccin personal no influy en la fragmentacin de la
molcula del ADN, aunque 13 de los 30 individuos no utilizaban la
indumentaria bsica para el trabajo en laboratorio.
El tiempo de exposicin a mutgenos qumicos no influy en la
fragmentacin el ADN, a pesar que el personal de laboratorio se
encuentra laborando en promedio 36 horas semanales.
Se encontraron diferencias altamente significativas entre el grupo
expuesto y el grupo control, lo que evidencia que la exposicin a
mutgenos qumicos podra estar relacionada con la fragmentacin
del ADN.
Los factores que predisponen la fragmentacin del ADN del personal
expuesto a mutgenos qumicos no estuvieron relacionados con
niveles de dao en el ADN.

Bibliografa
1. JEREZ AMB. [UNIVERSIDAD POLITCNICA SALESIANA].; 2015 [cited 2016
enero sabado. Available from:
http://dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456789/9410/1/UPS-QT07131.pdf.