CUANTIFICACIN DE PROTENAS

Objetivo del trabajo prctico: determinar la concentracin proteica de una muestra

desconocida para lo cual se necesitar construir una curva de calibracin con un
patrn de concentracin conocida.
La determinacin de protenas que se realizar en el Trabajo Prctico se har por el
mtodo de Lowry.
Mtodo de Lowry: (1951) es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las
protenas.
Bajo condiciones alcalinas el Cu++ forma un complejo con los enlaces peptdicos de las
protenas y se reduce a Cu+. El Cu+ as como los grupos R de Tirosina, Triptofano y
Cisteina reaccionan con el reactivo de Folin. Este reactivo reacciona primero
produciendo un producto inestable que se reduce lentamente a azul de
molibdeno/tungsteno esta reaccin ocurre en medio cido.
Comentarios: aquellos agentes que acidifican las soluciones (por ejemplo: cidos
fuertes o buffers), los quelantes de Cu (por ej. EDTA) o los reductores de Cu (por ej.:
mercaptoetanol, ditiotreitol, fenoles) sern interferentes de la reaccin. Las protenas
producirn distintas intensidades de color dependiendo primariamente de su contenido
de Tyr y Trp.

Mtodo de Bradford: (Bradford, M. Anal. Biochem., 72:248, 1976), el mismo est

basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en
respuesta a diferentes concentraciones de protenas. Este compuesto interacciona con
aminocidos bsicos (especialmente arginina) y aromticos. Esta unin del colorante
con las protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante desde
465 a 595 nm. Por lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad del Azul Brillante de
Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La
forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la protena.

Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595465nm).

Estructura qumica del colorante Coomassie brilliant blue G-250.

Algunas ventajas y/o desventajas del Mtodo

La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y
aromticos.
El complejo colorante-protena tiene un alto coeficiente de extincin lo cual es
imprescindible para aumentar la sensibilidad en la medicin de protenas.
La unin colorante-protena es un proceso muy rpido (2min) y el complejo
permanece estable durante un tiempo relativamente largo, una hora. Haciendo
de este un proceso muy rpido, y que no requiere un tiempo crtico para el
ensayo.
Se pueden utilizar un gran nmero de muestras (muy reproducible) y es
adaptable a la automatizacin.
Las interferencias o no existen o son mnimas por cationes tanto sodio como
potasio y carbohidratos como la sacarosa. Otras sustancias que interfieren en
el ensayo son los agentes fuertemente alcalinos (fcilmente solucionable con la
utilizacin de buffers). Los nicos componentes encontrados que dan una
excesiva interferencia en el color del ensayo, son altas concentraciones de
detergentes como el SDS, Triton X-100, etc.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
En el trabajo prctico usted realizar una curva de calibracin con alguno de los
mtodos anteriores y con el mismo determinar la concentracin proteica de una
muestra problema.

A- MTODO DE LOWRY
Preparacin de reactivos
Reactivo A = Na2CO3 2% P/V en NaOH 0.1N.
Reactivo B = CuSO 4 0.5% P/V en tartrato de sodio y potasio 1% P/V.
Reactivo C = 50 ml de A + 1 ml de B.
Reactivo D = Folin diluido al medio con H2O bidestilada (HCl 0.2N)
Solucin stock de seroalbumina bovina (BSA)

Se prepara un patrn stock de BSA pesando la misma y se lleva a volumen con agua,
hasta obtener una concentracin final de 1,0 mg/ml.

Curva de calibracin: Completar la siguiente tabla antes de comenzar con el trabajo

experimental para la curva de calibracin:
Tubos

Cantidad de l de sol. Stock de BSA

protena (g)

l de
H2O

l de
solucin C

l de
solucin D

1, 2

1000

100

3, 4

25

1000

100

5, 6

30

1000

100

7, 8

45

1000

100

9,10

50

1000

100

Procedimiento experimental
1) A 200 l de muestra agregar 1 ml de solucin C.
2) Mezclar bien e incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
3) Agregar 100 l de solucin D. Homogeneizar inmediata y vigorosamente en
vortex.
4) Incubar 30 minutos a Temperatura ambiente, cargar 1000l de cada tubo en
cubetas y leer Absorbacia a 700 nm.
Utilizar el mismo procedimiento para la determinacin de protenas en la
muestra problema.
B-MTODO DE BRADFORD
Preparacin del colorante
Azul Brillante de Coomasie G-250 (100mg) es disuelto en 50 ml de etanol 95%. A esta
disolucin se le aade 100ml de cido fosfrico 85% p/v. La solucin resultante se
diluye llevndola hasta un litro de volumen final. La concentracin en la disolucin final
es 0,01% p/v de azul, 4,7% p/v de etanol y 8,5 % p/v de cido fosfrico.
Solucin stock de BSA
Se utilizar la misma que en el Mtodo de Lowry.
Curva de calibracin
El rango lineal para este mtodo en microplaca es 0.05 mg/ml a 0.5 mg/ml
A-Calcule el volumen a utilizar del Solucin stock BSA para obtener el siguiente rango
de concentraciones: 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.5 mg/ml. Complete la siguiente tabla de
referencia con lo calculado.
Tubos
Concentracin
Final (mg/ml)
Volumen de stock
sol. BSA
Volumen de H2O
Volumen final (l)

1, 2
0.0

3, 4
0.2

5, 6
0.3

7, 8
0.5

10

10

10

10