DETERMINACIN CUALITATIVA DE ADN GENMICO TOTAL EN

MUESTRAS DE TEJIDO ANIMAL

Ana Y. Daz Montes, Estebana M. Manga Martnez, Mara J. Martnez Viloria,
Daniela I. Mercado Oviedo, La S. Ramos Peralta.
Universidad de sucre, Facultad Ciencias de la salud, Programa de Medicina.
Resumen: El ADN (cido Desoxirribonucleico) es una macromolcula compuesta por
cuatro unidades llamadas nucletidos las cuales se encargan de guardar y transmitir de
generacin en generacin toda la informacin necesaria para el desarrollo de todas las
funciones biolgicas de un organismo. Para este laboratorio se realiz una extraccin de
ADN y se utiliz tejido heptico del pollo como muestra. Luego de haber realizado todo el
proceso, y de tener una muestra de ADN se procedi a hacer una electroforesis, la cual
arroj unos resultados que fueron estudiados. Al final de todo este trabajo se puede decir
que se obtuvo un conocimiento bastante amplio respecto a la extraccin de ADN y se
desarroll cierta habilidad en la manipulacin de los instrumentos utilizados para llevar a
cabo este laboratorio.

INTRODUCCIN
El ADN (cido Desoxirribonucleico) Es
una cadena de mltiples unidades
repetitivas compuesta por nucletidos
unidos entre s por enlaces fosfodiester
[1].Esta molcula es la que se encarga
de guardar y transmitir de generacin en
generacin toda la informacin necesaria
para el desarrollo de todas las funciones
biolgicas de un organismo. El ADN es
nuestra huella gentica y tiene un gran
uso en la sociedad actual, en especial en
las ciencias biomdicas; es por eso que
la extraccin del ADN es de suma
importancia para la realizacin de
diferentes procesos como lo es el estudio
y as mismo la deteccin de bacterias y
virus en el medio ambiente, as como el
diagnstico de enfermedades y sus
trastornos. [2]
El objetivo de este laboratorio fue
determinar la presencia de material
gentico (ADN) en la muestra utilizada, la
cual fue una fraccin de hgado de pollo.
Y as mismo desarrollar habilidades para
la manipulacin de los implementos
utilizados en la extraccin de ADN, por
otro lado se estudi tambin la funcin
que cumplan cada uno de los diferentes

reactivos utilizados para el proceso de

extraccin de ADN.

METODOLOGIA
Para llevar a cabo esta prctica de
laboratorio primeramente se tomaron
10gr de tejido animal (hgado de pollo)
que luego se cort en varias unidades
pequeas con ayuda del bistur, seguido
de esto se depositaron estos cortes del
tejido en un mortero donde se le adiciono
20 ml de agua destilada para
ser
macerados
hasta
disolverse,
seguidamente se coloc una gasa sobre
un beacker limpio para filtrar el macerado
anteriormente hecho, luego de esto se le
adicion un volumen igual de NaCl 2M al
volumen de sobrenadante despus se
agreg 1ml de shampoo y
se
homogenizo la solucin dejndolo
reposar por 10 min, terminado el tiempo
de espera se separ la solucin en
cuatro tubos eppendorf y se centrifug a
12.000 rpm por un lazo de tiempo de
5min seguido de estos 5 min se tom el
sobrenadante de cada tubo con la ayuda
de una pipeta micromtrica y se transfiri
a un tubo de ensayo donde se le aadi
lentamente etanol absoluto frio por las
paredes del tubo inclinado, despus de
esto se recuper el ADN para transferirlo

a un nuevo tuvo
eppendorf y
nuevamente se llev al centrifugado a
12.000 rpm durante 5 min descartndose
la capa sobrenadante, posterior a esto se
sec la muestra a temperatura ambiente
suspendi con 1ml de agua destilada.
Finalmente se sembr la muestra en un
pozo en gel de agarosa y adicionalmente
un marcador de peso molecular.

RESULTADOS
De
las
prcticas
anteriormente
se
siguientes resultados:

de
laboratorio
obtuvieron
los

procedi a medir cada una de estas , para

luego sacar una medida aproximada del
tamao de cada porcin .

Tabla 2: Luego de obtener los resultados de

las medidas de las bandas dadas, se toman
el poso 2 y 4 que contienen ADN para sacar
las medidas exactas del tamao de cada una
de las bandas.

Electroforesis
4

f(x) = - 0.27x +
4.03(Electroforesis)
Electroforesis
Linear

2
0
2

Figura 2: se muestra la posicin exacta que

ocupa cada porcin de ADN en las muestras
presentadas.

Figura 1: Resultados obtenidos en el

sembrado de ADN ; Se muestra que ninguno
de los posos que fueron utilizados por los
grupos de estudiantes , contenan ADN , por
lo que se us el poso 2 y 4 ( muestras de
dengue sembradas anteriormente por el
grupo de investigacin de la universidad) ,
que si present contenido de ADN.

Tabla 1: Se toma como referencia las bp

establecidas
que
est
directamente
relacionada con determinadas bandas del
marcador de peso molecular en donde se

DISCUSIN
En los experimentos realizados para este
laboratorio, no se lograron los resultados
deseados, ya que el fin de dicha prctica
era la determinacin cualitativa de ADN
genmico total, y para esto era necesaria
la extraccin de ADN, seguido de una
electroforesis, al realizar este ltimo
procedimiento para la observacin del
ADN, no se obtuvo la imagen esperada,
esto pudo haber ocurrido por diferentes
causas como lo es, la falta del hgado de
pollo en la realizacin de la prctica ,otra
causa pudo ser que el Shampoo utilizado
no era el ms adecuado, puesto que el
ms indicado para esta extraccin de
ADN es el Shampoo marca H&S, ya
que este posee el componente necesario
para el rompimiento de la membrana
celular y seguidamente la membrana
nuclear, para as poder liberar el material

gentico de la muestra heptica. Adems

de eso otra de las posibles causas es
que presuntamente no se utiliz la
cantidad de solucin de NaCl necesaria,
cuya funcin en la extraccin de ADN es
la de precipitar el compuesto a estudiar,
esta solucin de NaCl se divide en iones
positivos que son los del Na e iones
negativos que son los Cl, funcionando
como un neutralizador de ADN, Puesto
que los iones de Na, son positivos,
actan directamente con las altas cargas
negativas de este cido nucleico
logrando as que el ADN se precipite en
alcohol. Sin la solucin de NaCl, el ADN
permanece cargado negativamente y se
concentrara en la solucin acuosa de la
solucin. Por ltimo, otra posible causa
podra ser que no se aplic la suficiente
cantidad de etanol en la muestra, esta
acta como purificador de los cidos
nucleicos en la sal residual.

CONCLUSIN
Despus de haber realizado cada uno de
los procedimientos planteados para este
laboratorio, se obtuvo un conocimiento
amplio acerca de la extraccin de ADN,
aunque los resultados obtenidos no
hayan sido los esperados para esta
prctica, a su vez
se desarrollaron
ciertas destrezas en la manipulacin de
los instrumentos utilizados para este
proceso, se conoci tambin el uso que
tienen cada uno de los reactivos que
fueron necesarios para la realizacin de
este laboratorio.

ANEXOS

1.

Desarrollo del cuestionario

Las
aplicaciones
del
ADN
recombinante en la medicina son muchas
como: la produccin de protenas como
la somatostatina, la insulina, la hormona
del
crecimiento
humana
y
los
interferones, es de gran importancia
prctica. Por ejemplo, en el pasado, la
hormona del crecimiento humana para el

tratamiento del enanismo hipofisario se

extraa de hipfisis obtenidas durante las
autopsias y estaba disponible slo en
cantidades
limitadas.
Un
avance
especialmente interesante es el uso de
maz y soja transgnicos para producir
anticuerpos monoclonales para uso
mdico. Tambin puede ser posible
utilizar plantas desarrolladas mediante
ingeniera
gentica
para
producir
vacunas orales y Los mtodos de
aislamiento y clonacin de genes
especficos desarrollados originalmente
como una herramienta de investigacin
se estn utilizando actualmente para
tratar enfermedades genticas mediante
transferencia
de
alelos
normales
humanos en un proceso denominado
terapia gnica, aunque cabe sealar
ventajas y desventajas de esta
tecnologa en la medicina:
Ventajas:
-Se ha conseguido
especficos
-cortar
ADN
predeterminadas

aislar
en

genes
regiones

-unir diversos fragmentos de ADN sin

importar secuencia ni origen,
-hacer mutaciones en sitios especficos
-insertar en el genoma de un organismo
fragmentos de ADN de otra especie
-clonar organismos transgnicos
-secuenciar genomas completos
Desventajas:
-Existen riesgos de transferir toxinas de
una forma de vida a otra
- crear nuevas toxinas o de transferir
compuestos alergnicos de una especie
a otra, lo que podra dar lugar a
reacciones alrgicas imprevistas.
-Existe el riesgo de que bacterias y virus
modificados escapen de los laboratorios

de alta seguridad e infecten a la

poblacin humana o animal.

negativa neta y luego las de mayor

carga negativa neta.

2. Los mtodos de extraccin de

cidos nucleicos ms utilizados en la
biologa molecular son los siguientes:

Cromatografa de adsorcin. Se
basa en la adsorcin y desorcin de
los cidos nucleicos en presencia de
sales caotrpicas. Bajo condiciones
nativas, los cidos nucleicos estn
recubiertos de una capa hidratante
de molculas de agua que mantienen
la solubilidad del DNA en soluciones
acuosas. Con la adicin de iones
caotrpicos a los cidos nucleicos, se
destruye esta ordenada estructura de
molculas de agua de la capa
hidratante, por lo que las sales
caotrpicas
crean
un
entorno
hidrofbico alrededor del DNA.

Cromatografa de penetrabilidad.
El componente bsico es una
columna empaquetada con una
matriz en
gel especial, que son
partculas de un polmero orgnico de
estructura
tridimensional,
que
originan una red de poros hidroflicos
equilibrados con un tampn acu oso.
La tcnica consiste en que las
molculas de gran tamao no
penetran por los poros del polmero,
por lo que migran mucha ms rpida
mente que las de menor tamao que
s es capaces de penetrar por los
poros de la matriz.

Cromatografa de intercambio
inico. Es el mtodo ms utilizado
para la separacin de cidos
nucleicos. El mecanismo bsico es el
intercambio reversible de los iones en
solucin con los grupos funcionales
unidos covalentemente a una fase
estacionaria insoluble llamada resina.
Por ejemplo, un cido nucleico con
carga negativa a pH 7, 0 se unir a
un intercambiador inico con grupos
cargados positivamente, pero eludir
de la columna al cambiar al pH del
tampn (tampn de elucin) ya que
los iones del tampn de elucin
interaccionan
con
los
grupos
cargados del cido nucleico o del
intercambiador
inico,
respectivamente; primero eludirn de
la columna las molculas cargadas
positivamente que no se unen a la
fase estacionaria y posteriormente, al
aadir el tampn de elucin, eludirn
las molculas con poca carga

Ultrafiltracin. En esta tecnologa, la

muestra se carga directamente sobre
la membrana de ultrafiltracin y
mediante vaco o centrifugacin, se
eliminan todos los contaminantes
mientras que la muestra con los
cidos
nucleicos
permanecen
retenidos en la superficie de la
membrana. Despus de un paso de
lavado opcional, se recuperan los
cidos nucleicos aadiendo agua o
un tampn adecuado.

Bolas magnticas. Con esta

tecnologa, los cidos nucleicos se
unen
selectivamente
a
bolas
paramagnticas en presencia de
sales caotrpicas mientras que el
resto de los contaminantes son
eliminados de la muestra. Los cidos
nucleicos purificados se eluyen de la
solucin
con
las
bolas
paramagnticas bajo condiciones de
baja salinidad y estn listos para ser
usados en posteriores aplicaciones.
No especficos. Detectan todos los
DNA de doble cadena (dsDNA)

producidos durante la reaccin de

amplificacin (ya sea producto
especfico, producto inespecfico o
dmeros de primeros). Es el mtodo
estndar y consiste en aadir un
agente intercalantes de la doble
cadena o un fluorforo que emite
fluorescencia cuando se une a sta.
El ms utilizado es el SYBR Green I
que se excita a 497nm y emite a
520nm.
Especficos. Estos sistemas de
deteccin son capaces de distinguir
entre la secuencia de inters y los
dmeros
de
primeros
o
las
amplificaciones inespecficas. Todos
ellos se basan en la utilizacin de
quenchers y sondas marcadas con un
amplio rango de fluorforos con
diferentes espectros de excitacin y
emisin
3. El material gentico recuperado
luego de la segunda centrifugacin
hecha en esta prctica, no contena
RNA, ya que este cido nucleico fue
el que quedo en la superficie de esta
ltima centrifugacin, es decir, que
estaba contenido en la capa
sobrenadante,
la cual fue
descartada, con el motivo de
recuperar
solo
el
cido
desoxirribonucleico (DNA) que fue el
que se precipito y era el deseado.
4. El principio de accin de los
agentes
intercalantes
en
la
electroforesis en gel de agarosa es
que cuando se expone estas
sustancias a luz ultravioleta, emiten
una luz roja-anaranjada, que se
intensifica unas 20 veces despus de
haberse unido a una cadena de ADN.
Este efecto es debido al aumento de
la hidrofobia del medio, y no a la
rigidificacin del anillo bencnico, no

estando ste entre pares de bases

del ADN. Como el bromuro de etidio
se intercala en el ADN.
Los agentes intercalantes encajan
entre las bases a lo largo del ADN.
Las molculas intercaladas de los
agentes afectan la estructura del
ADN, previniendo las polimerasas y
otras protenas que se unen al ADN
de funcionar apropiadamente. El
resultado es la prevencin la sntesis
del ADN, la inhibicin de la
transcripcin y la induccin de
mutaciones
5. Para la visualizacin de protenas
se utiliza la electroforesis proteica
este es un mtodo de separacin de
protenas mediante la aplicacin de
un campo elctrico. Se divide en
diferentes tipos:
Electroforesis de zona: generalmente
la carga de la protena depende del
PH, esta electroforesis se hace a PH
alcalinos, en el que la mayora de
protenas presentan una carga
negativa. Tambin se puede trabajar
a PHs cidos (no muy bajos) ya que
las protenas podran precipitarse.
Isoelectroenfoque: en esta tcnica se
separan las protenas en funcin de
su punto isoelctrico (pl), el cual
depende
de
la
composicin
aminoacidica de la protena, luego se
da origen a un gradiente de PH por
medio de anfolitos que tienen como
funcin estabilizar el PH a lo largo del
gel, as cada protena migrara hasta
alcanzar su pl, punto en el cual se
precipitaran.
Separacin por tamao en tamiz
molecular: consiste en tratar a las
protenas con sodio dodecil sulfato

(SDS) para que tengan

carga
negativa y as puedan migrar hacia el
nodo. La separacin Se hace en
medios de soporte en el que se ha
creado un tamiz molecular, el cual
hace que las protenas pequeas
corran mucho ms que las grandes.
Estos
tipos
de
anlisis
electroforticos tienen aplicaciones
en investigacin y en clnica, tanto
humana como animal. Adems son
tcnicas empleadas para el anlisis
de
protenas
alimentarias,
ltimamente se han empleado para
realizar genotipado y la deteccin de
organismos
modificados
genticamente.

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