NMP PARA LA DETERMINACION DE

COLIFORMES Y ESCHERICHIA COLI EN

ALIMENTOS
Seccin Microbiologa
de Alimentos
1.

PRT-712.02-004

Fecha emisin:
23-08-2002
Revisin: 9
Fecha revisin:
20-01-2012
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OBJETIVO

Estimar la densidad de bacterias del grupo coliformes, como indicador sanitario.

2.

CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

Aplicar este procedimiento a todas las muestras de alimentos en las cuales se presume que tienen
baja contaminacin microbiana y a las cuales segn reglamento sanitario o a peticin del
interesado se requiere este anlisis.
3.

FUNDAMENTO

Los mtodos utilizados en la determinacin de E. coli, coliformes totales y coliformes fecales

como microorganismos indicadores de la calidad sanitaria de agua o como indicador de las
condiciones sanitarias en el procesamiento de alimentos, se basan en la fermentacin de la
lactosa. El mtodo de nmero ms probable NMP, es un mtodo estadstico, compuesto por una
etapa presuntiva y una confirmativa. El ensayo consiste en sembrar diluciones seriadas de la
muestra en medios lquidos, basndose en la combinacin de tubos positivos se puede estimar el
nmero de microorganismos presentes por gramo de alimento, con el uso de la tabla estadstica
aportada por la referencia.
4.

REFERENCIAS

4.1

Bacteriological Analytical Manual online. September 2002. Captulo 4 puntos C, D, E y F

4.2

Bacteriological Analytical Manual online, apndice 2 Most Probable Number from Serial
Dilutions, Tabla N1, Robert Blodgett, Octubre 2010.

5.

TERMINOLOGA

5.1

Grupo coliformes: El grupo coliformes incluye bacilos gram negativos, aerbios y

anaerbios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando cido y gas
dentro de 48 hrs. a 35C. Este grupo incluye a los gneros: Escherichia, Citrobacter,
Klebsiella y Enterobacter.

5.2

Grupo coliformes fecales: Coliformes fecales se definen como bacilos gram negativos
aerbios y anaerbios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando
cido y gas dentro de 24 hrs. a 45,5 0,2C para anlisis de alimentos.

5.3

Escherichia coli: E. coli es una bacteria cuyo hbitat es el intestino del hombre y animales
y debido a esto se ha usado como ndice de contaminacin fecal. Dentro del grupo
coliformes, es el microorganismo de mayor significado sanitario. Su recuperacin se hace
de acuerdo a la metodologa establecida para la enumeracin de coliformes.

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6.

MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1

Equipos

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Incubadora a 35 1C
Bao de agua termorregulado a 45,5 0,2 C con agitacin y con cubierta
6.2

Materiales
Sensor de temperatura calibrado a 35 0,5C
Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL
Placas Petri de 100 mm de dimetro
Botellas de dilucin con capacidad para 100 mL, de vidrio borosilicato con tapas
hermticas
Tubos de fermentacin de 18 x 180 mm y 16 x 160 mm
Asa de 3 mm de dimetro
Propipeta

6.3

Medios de cultivo y reactivos

Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST)
Caldo Bilis Verde Brillante 2% (BVB)
Caldo EC
Agar Rojo Neutro Cristal Violeta (RNCV)
Agar Levine Eosina Azul de Metileno (LEAM)
Caldo Triptona
Caldo RM-VP
Caldo citrato Koser
Agua de Dilucin Buffer Fosfato
Agua Peptonada 0,1%
Reactivo Kovacs
Rectivos solucin de Naftol y solucin KOH al 40 %

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Reactivos Tincin de Gram

Indicador Rojo de Metilo
Agar TSI
Agar LIA
Agar MIO
6.4

Cepas Control
Control positivo: cepa de Escherichia coli ATCC 25922
Control negativo: cepa de Staphylococcus aureus. ATCC 6538
Control negativo (coliformes fecales): cepa de Enterobacter aerogenes ATCC 13048

7.

DESARROLLO

7.1

TEST PRESUNTIVO PARA COLIFORMES

7.1.1 Preparar la muestra y diluciones, segn PRT-712.02-002 Procedimiento Procesamiento

de las muestras de alimentos y agua para anlisis microbiolgico, tem 7.4.2.1. Derivar
al laboratorio segn PRT -712.02-001 Procedimiento Recepcin de las muestras para
anlisis microbiolgico.
7.1.2 Una vez recibida la dilucin 1:10 en el laboratorio, agitar en Vortex por 7 segundos,
pipetear 10 mL de la dilucin inicial y agregar 90 mL de diluyente y as sucesivamente
para realizar las diluciones 1:100 y 1:1000. Inocular 9 tubos de caldo LST (3 diluciones
y 3 tubos por dilucin). Dejar descansar el borde de la pipeta contra el tubo y drenar por 2
a 3 segundos.
3 tubos con 1 mL de la dilucin 1:10, preparada en 7.1.1.
3 tubos con 1 mL de la dilucin 1:100
3 tubos con 1 mL de la dilucin 1:1000
7.1.3 Agitar suavemente la gradilla para mezclar la muestra con el medio de cultivo. El tiempo
entre la preparacin de la muestra y su inoculacin en un medio no debe ser superior a 15
minutos.
7.1.4 Incubar a 35 1C por 24 horas y observar la formacin de gas, si existen tubos que no
presentan formacin de gas, incubar nuevamente hasta completar 48 h. y observar la
formacin de gas, en los tubos de fermentacin. Si se detecta que el equipo no ha
funcionado dentro del rango de temperatura indicado, el anlisis debe ser invalidado y se

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debe iniciar procedimiento de gestin control de trabajo no conforme, segn el PRG700.00-006.

7.1.5 Se deben incluir cultivos control en la incubadora, se usa Escherichia coli como control
positivo y Staphylococcus aureus como control negativo. Se debe inocular siempre el
control negativo antes del positivo. Incluir tubos sin inocular para realizar control de
esterilidad de medios de cultivo y placas Petri abiertas y cerradas para control de
ambiente.
7.1.6

En la eventualidad de que los controles no se comportasen de manera normal, es decir, si

la cepa de E. coli no se presenta con formacin de gas, la cepa de S. aureus presentase
formacin de gas o el control de esterilidad presentase desarrollo, se debe invalidar el
resultado e iniciar procedimiento de control de trabajo no conforme, segn el PRG700.00-006.

7.1.7 La presencia de gas o efervescencia significa un Test Presuntivo positivo para coliformes
y se registra como positivo, cualquiera sea la cantidad de gas producido. Ausencia de gas
a las 48 horas significa un Test Presuntivo negativo para coliformes.
7.1.8 Anotar los resultados del test presuntivo en el registro RG-712.00-072, de los cultivos
control en el registro RG-712.00-004, de la esterilidad de los medios en el registro RG712.00-006 y los controles ambiente en el registro RG-712.00-009.
7.2

TEST CONFIRMATIVO PARA COLIFORMES

7.2.1 Todos los tubos que resulten positivos a las 24 o 48 horas en el Test Presuntivo se
transfieren a caldo BVB para confirmar coliformes.
7.2.2 Mezclar por agitacin el tubo del test presuntivo y transferir un inculo con un asa de 3
mm. de dimetro, si se ha formado una pelcula en la superficie del medio se debe evitar
tomar sta en el inoculo, a tubos de fermentacin conteniendo caldo BVB. Se debe tener
la precaucin de enfriar el asa para asegurar que se transfiere un inculo de cultivo viable.
7.2.3 Incubar los tubos con caldo BVB a 35C por 48 +/- 2 hrs.
7.2.4 Se deben incluir cultivos control en la incubadora, se usa Escherichia coli como control
positivo y Staphylococcus aureus como control negativo. Se debe inocular siempre el
control negativo antes del positivo.
7.2.5 Al trmino del perodo de incubacin se observa la formacin de gas o efervescencia en
los tubos de fermentacin de caldo BVB. Si los controles positivo y negativo no se
comportasen como tal o si se detecta que el equipo no ha funcionado dentro del rango de
temperatura indicado repetir el anlisis desde el punto 7.2.2.

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7.2.6 La presencia de gas en los tubos de fermentacin de caldo BVB significa test
confirmativo positivo para coliformes, ausencia de gas constituye un test negativo para
coliformes.
7.2.7 Anotar los resultados del test confirmativo en el registro RG 712.00-072 y de los cultivos
control en el registro RG-712.00-004 y RG-712.00-006.
7.3

METODO CALDO EC PARA COLIFORMES FECALES Y CONFIRMACIN

PARA Escherichia coli

7.3.1 Todos los tubos que resulten positivos a las 24 o 48 horas en el Test Presuntivo se
transfieren a caldo EC para confirmar coliformes fecales. y consecutivamente E. coli.
7.3.2 Mezclar por agitacin el tubo del test presuntivo y transferir un inculo con un asa de 3
mm. de dimetro o con aplicador de madera, a tubos de fermentacin conteniendo caldo
EC. Se debe tener la precaucin de enfriar el asa para asegurar que se transfiere un
inculo de cultivo viable.
7.3.3 Los tubos con caldo EC se incuban en un bao de agua con cubierta a 45.5 0,2 C por
24 horas +/- 2 horas, examinar si se produce produccin de gas, si la produccin de gas es
negativa incubar nuevamente hasta completar 48 +/- 2 horas. El nivel de agua del bao
debe sobrepasar el nivel de caldo dentro de los tubos.
7.3.4 Se deben incluir cultivos control en el bao de agua, se usa como control positivo una
cepa de Escherichia coli y como control negativo una cepa de Enterobacter aerogenes.
Se debe inocular siempre el control negativo antes del positivo. Incubar tambin medios
de cultivo sin inocular para controlar la esterilidad de los medios empleados.
7.3.5 Al trmino del perodo de incubacin se observa la formacin de gas o efervescencia en
los tubos de fermentacin de caldo EC. Si los controles positivo y negativo no se
comportasen como tal o si se detecta que el equipo no ha funcionado dentro del rango de
temperatura indicado, repetir el anlisis desde el punto 7.2.2.
7.3.6 La presencia de gas o efervescencia en los tubos de fermentacin de caldo EC significa
un test confirmativo positivo para coliformes fecales; la no formacin de gas significa test
negativo para coliformes fecales.
7.3.7 Anotar los resultados del test confirmativo en el registro RG-712.00-072, de los cultivos
control en el registro RG-712.00-005 y de la esterilidad de los medios en el registro RG712.00-006.

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CONFIRMATIVO PARA E.coli

7.4.1 De cada tubo de caldo E.C. que presente formacin de gas, transferir un inculo a una
placa de agar LEAM para obtener colonias aisladas.
7.4.2 Incubar las placas invertidas 18 a 24 horas a 35C.
7.4.3 Al trmino del perodo de incubacin observar las colonias sospechosas, con centro
oscuro con o sin brillo metlico en el caso de usar Agar LEAM.

7.4.4 Anotar los resultados en el registro RG-712.00-072.

7.4.5 De cada placa de agar transferir 5 colonias aisladas a un tubo de agar nutritivo o agar
standard, incubar por 18 a 24 horas a 35C para realizar pruebas: morfolgicas mediante
Tincin de Gram segn IT-712.00-066 y bioqumica utilizando las reacciones IMViC
(Indol, Rojo Metilo, Vogues Prokauer y Citrato). Repetir la inoculacin en caldo LST
para confirmar la produccin de gas. Alternativamente se puede realizar un API 20 E o
VITEK. Agregar TSI, LIA y MIO. Si una de las 5 colonias es identificada como positiva
para E. coli, se considera el tubo EC como positivo y no es necesario realizar pruebas a la
dems colonias.
7.5

INTERPRETACIN
Todos los cultivos que fermenten la lactosa con produccin de gas dentro de 48 hrs. a
35C, aparezcan como bacilos Gram negativos no esporulados y cuyo test IMVIC sea + +
- - (biotipo 1) o - + - - (biotipo 2), son considerados E. coli.

7.6

CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS COLIFORMES TOTALES

7.6.1 La combinacin de tubos positivos y/o negativos en los tests confirmativos de caldo
BVB, es referida a la Tabla N 2 (BAM on line, apndice 2, tabla N1) y se expresa
como: NMP de coliformes/g o ml. De muestra
7.6.2. Si en vez de las porciones de muestra 0,1-0,01-0,001, se utiliza 0,01-0,001-0,0001, se lee
el resultado de la tabla y se multiplica por 10.

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7.6.3. Cuando se utilizan ms de 3 series de diluciones decimales, se considera el resultado de 3

series, eligiendo la dilucin ms alta que da resultados positivos en los 3 tubos ensayados
y las dos diluciones siguientes. Utilizando el resultado de estas 3 series, leer en la Tabla
de N.M.P. y multiplicar por 10, 100, 1000, etc. Segn las porciones de muestra
consideradas.
7.7

CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS Escherichia coli

7.7.1 Calcular el NMP de E. coli, basndose en el nmero de tubos de caldo EC, en que se
confirm la presencia de E. coli en 3 diluciones sucesivas y anotar los resultados en el
registro RG-712.00-072.
Tabla N 1: Ejemplos de determinacin de NMP en series de 3 tubos
Ejemplo
Cantidad muestra
(g. o mL. )
0,1
0,01
0,001
0,0001
0,00001
a
b
c
d
e

3/3
3/3
0/3
3/3
3/3

3/3
3/3
0/3
3/3
3/3

2/3
3/3
1/3
2/3
3/3

0/3
2/3
0/3
1/3
3/3

Nmero de tubos positivos / Nmero de tubos inoculados

0/3
0/3
0/3
1/3
3/3

Lectura

NMP

3
3
0
3
3

930
9300
30
2100
>110000

2
2
1
2
3

0
0
0
2
3

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Tabla N 2. Para serie de 3 tubos con 0.1, 0.01, y 0.001 g. NMP por gramo con un
95% de confianza. ((BAM on line, apndice 2, tabla N1)
Tubos
NMP/g Lim. Conf.
Tubos Positivos NMP/g Lim. Conf.
Positivos
0.10 0.01
0.001
Bajo
Alto 0.10 0.01 0.001
Bajo Alto
0
0
0
<3.0
-9.5
2
2
0
21
4.5
42
0
0
1
3.0
0.15
9.6
2
2
1
28
8.7
94
0
1
0
3.0
0.15
11
2
2
2
35
8.7
94
0
1
1
6.1
1.2
18
2
3
0
29
8.7
94
0
2
0
6.2
1.2
18
2
3
1
36
8.7
94
0
3
0
9.4
3.6
38
3
0
0
23
4.6
94
1
0
0
3.6
0.17
18
3
0
1
38
8.7
110
1
0
1
7.2
1.3
18
3
0
2
64
17
180
1
0
2
11
3.6
38
3
1
0
43
9
180
1
1
0
7.4
1.3
20
3
1
1
75
17
200
1
1
1
11
3.6
38
3
1
2
120
37
420
1
2
0
11
3.6
42
3
1
3
160
40
420
1
2
1
15
4.5
42
3
2
0
93
18
420
1
3
0
16
4.5
42
3
2
1
150
37
420
2
0
0
9.2
1.4
38
3
2
2
210
40
430
2
0
1
14
3.6
42
3
2
3
290
90
1,000
2
0
2
20
4.5
42
3
3
0
240
42
1,000
2
1
0
15
3.7
42
3
3
1
460
90
2,000
2
1
1
20
4.5
42
3
3
2
1100
180
4,100
2
1
2
27
8.7
94
3
3
3
>1100
420
--

8.
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5

9.

REGISTROS
Registro cepas control de incubadora
Registro cepas control baos de agua para anlisis de coliformes fecales
Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el anlisis de
coliformes, coliformes fecales y E. coli.
Registro control de ambiente
Registro de resultados de anlisis de coliformes, E. coli y Salmonella en muestras de
alimento.
ANEXOS

No Aplica