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Western Blot

1. Introduo
A tcnica de western blotting (Towbin et al. 1979; Burnette 1981; Towbin and Gordon
1984) tambm pode ser denominada protein immunoblot e consiste na deteco de
protenas especficas em amostras de lisados celulares ou de tecidos. Os passos para a
elaborao dessa tcnica pode ser resumida em cinco etapas: (1) extrao e quantificao
das protenas; (2) fracionamento das protenas da amostra em um gel de poliacrilamida; (3)
transferncias dessas protenas para uma membrana; (4) incubao da membrana com um
anticorpo para detectar a protena especfica a ser analisada; e (5) revelao dessa
membrana para anlise dos dados.

2. Extrao e quantificao de protenas


Para realizao dos experimentos de western blotting necessrio, inicialmente,
realizar a extrao e a quantificao das protenas. Diversos mtodos espectroscpicos so
utilizados para quantificar protenas em uma soluo. O ensaio de Bradford o mais
utilizado e apresenta diversas vantagens em relao aos demais, como rapidez, no exige
aquecimento e alta sensibilidade para baixas concentraes de protenas. O mtodo de
Bradford se baseia na mudana de cor do corante Coomassie Blue G-250 em soluo cida
(cor avermelhada) para cor azulada na presena de protenas. As interaes hidrofbicas e
inicas estabilizam o complexo protena-corante. Para quantificar a concentrao de
protenas na amostra deve-se fazer uma curva de padronizao com concentraes
conhecidas de uma protena (comumente se utiliza soroalbumina bovina, BSA) versus
absorbncia em 595 nm (comprimento de onda que o complexo protena-corante absorve).
A partir dessa curva obtm-se a equao de ajuste linear na qual possvel substituir os
valores mdios de absorbncias das amostras, obtendo-se assim os valores da
concentrao das protenas. importante ressaltar, que para uma maior confiabilidade dos
resultados, o coeficiente de correlao linear deve ser maior que 0,98.

3. Fracionamento de protenas
Para separar as protenas de uma amostra homognea, a tcnica mais utilizada a
eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Inicialmente prepara-se o gel de
SDS-poliacrilamida, que ser uma matriz inerte atravs da qual as protenas podero
migrar. O gel preparado pela polimerizao de monmeros de acrilamida e o tamanho dos
poros do gel pode ser ajustado variando a concentrao da acrilamida adicionada para
retardar a migrao da sua protena de interesse. As protenas podem possuir cargas
positivas ou negativas, dependendo das cargas dos aminocidos que as compem.
utilizado, ento, o SDS (sodium dodecyl sulfate), um poderoso detergente carregado
negativamente, que se liga nas regies hidrofbicas das molculas de protenas
mascarando a carga intrnseca, e permitindo que as protenas migrem em direo ao polo

positivo em um campo eltrico. Alm disso, o SDS quebra as ligaes no covalentes das
protenas, fazendo com que elas voltem a sua estrutura primria, liberadas da associao
com outros monmeros ou outras protenas e molculas de lipdeos. Alm disso, usa-se,
geralmente, um agente redutor tal como o -mercaptoetanol, que quebra as ligaes
dissulfito (S-S) dos resduos de cistena que promovem a ligao de protenas a outros
monmeros, outras protenas ou mesmo a estrutura terciria da mesma protena, mantendo
assim, as protenas separadas e linearizadas (Figura 1a). A partir dessas condies,
protenas de um mesmo tamanho tendem a correr em um gel de poliacrilamida, na
presena de um campo eltrico com as mesmas velocidades, uma vez que (1) suas
estruturas nativas encontram-se completamente desnaturadas devido ao SDS e ao mercaptoetanol fazendo com que suas formas sejam as mesmas e, (2) elas se ligam na
mesma quantidade de SDS e portanto tem a mesma quantidade de cargas negativas
(Figura 1b, c).

A tcnica de SDS-PAGE largamente utilizada, pois capaz de separar todos os


tipos de protenas, mesmo aquelas que so normalmente insolveis em gua (como por
exemplo muitas protenas de membranas). Alm disso, como as protenas so separadas
por tamanho, possvel estimar o peso molecular e a composio das subunidades da
protena. Essas protenas podem ser visualizadas diretamente no SDS-PAGE por colorao
direta do gel, por corantes como o Comassie-Blue ou por tratamentos com nitrato de prata.
O nitrato de prata um dos mtodos mais sensveis de deteco, que permite a
visualizao de protenas de at 10ng, enquanto que a colorao por Coomassie-Blue

detecta protenas de at 300ng. A Figura 2 representa protenas coradas com CoomassieBlue e com Nitrato de Prata.

4) Transferncia para membrana


Embora seja essencialmente uma tcnica analtica, o SDS-PAGE somente no
permite a anlise de protenas individuais e separadas. Para que isso seja possvel
necessrio utilizar anticorpos especficos para a protena desejada, mas antes, preciso
que essas protenas estejam em um suporte slido, como membranas de nitrocelulose,
PVDF ou de catinicas de nylon. Essa transferncia das protenas do gel para a membrana
inicialmente era feita por meio da capilaridade, mas atualmente usa-se a transferncia
eletrofortica que muito mais rpida e eficiente (Figura 3).

Existem trs tipos de membranas usadas para western blotting: de nitrocelulose,


nylon ou PVDF (polyvinylidene fluoride). Diferentes protenas podem se ligar com eficincias
diferentes nessas membranas, e particulares eptopos antignicos podem ser melhor
preservados em um tipo em relao a outro. Os detalhes de cada tipo de membrana podem
ser visualizados na Tabela 2.

Depois de terminado o tempo de aplicao da corrente eltrica, usa-se um corante


denominado Ponceau S para confirmar a transferncia das protenas para a membrana, e
verificar se essa transferncia ocorreu de maneira igual para todas as amostras. Em caso
afirmativo, pode ser dada continuidade ao experimento de western blotting.

5) Deteco da protena especfica


Para visualizar uma protena de interesse utilizado um anticorpo especfico que vai
reagir com um eptopo da protena, formando um complexo anticorpo-antgeno. Esse
anticorpo denominado anticorpo primrio, pode ser policlonal (reconhece mais de um
eptopo) ou monoclonal (reconhece apenas um eptopo da protena de interesse) e
produzido geralmente em camundongo ou em coelho. Alm disso, esse anticorpo no
possui nenhum tipo de radiomarcao, ou conjugao com alguma enzima. A incubao da
membrana com o anticorpo primrio geralmente ocorre overnight a 4C e, depois disso, a
membrana lavada intensamente com tampo de lavagem para retirar todo o anticorpo que
no est especificamente ligado protena de interesse.
Depois da lavagem, a membrana incubada com um anticorpo secundrio. Esse
anticorpo um anti-IgG, ou seja, um anticorpo que reconhece um anticorpo. Por exemplo,
se foi utilizado um anticorpo primrio anti uma protena de interesse, produzido em
camundongo, ser utilizado um anticorpo secundrio anti-IgG de camundongo, que
reconhecer qualquer anticorpo produzido em camundongo. Esse anticorpo secundrio
possui alguma modificao que permitir a visualizao da protena de interesse. As
principais modificaes utilizadas atualmente so (Figura 4):

a) Conjugao do anticorpo com uma enzima: tais como peroxidade ou fosfatase


alcalina. Neste caso, no momento da revelao da membrana, adiciona-se um substrato
dessa enzima. Nos locais onde essa enzima est presente (apenas nos locais onde tem o
anticorpo primrio, ou seja, na protena especfica), ocorrer a reao e a formao do
produto dessa reao. utilizado um filme, e aparecer a marcao nas regies em que
ocorreu essa reao, permitindo localizar a protena de interesse.

b) Associao do anticorpo com um fluorforo: que ser posteriormente excitado


com um laser de comprimento de onda especfico para esse fluorforo, e ento as regies
onde o anticorpo se ligou sero evidenciadas.

Metodologia
1. Extrao e Quantificao de protenas
1.1. Protocolo de extrao de protenas totais

1. Coletar clulas a 3.000 g, 5 min, 37C;


2. Ressuspender pellet de clulas em tampo de lise composto por 20 mM HEPES
pH 7.9, 20% glicerol, 200 mM KCl, 0.5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.5 mM DTT, 1% coquetel
de inibidor de protease;
3. Sonicar as clulas ressuspendidas 3 vezes no nvel 3, com tempos de pulso de
10s, separados por 1 minuto de intervalo;
4. Centrifugar lisado a 15.000 g, por 10 min, a 4C. Retirar o sobrenadante (extrato
total de protenas).

1.2. Protocolo de quantificao de protenas totais pelo mtodo de Bradford.


O ensaio de Bradford ser realizado em placa de ELISA de 96 poos, consistindo
num volume final de 200 ul para cada poo da placa.
1. Prepara soluo estoque de BSA 10 mg/ml. Diluir 10 vezes a soluo para efetuar
as diluies para preparar a curva de calibrao.
2. Preparar curva padro com as seguintes concentraes de BSA: 0,125 ug/ml;
0,25 ug/ml; 0,5 ug/ml; 0,75 ug/ml; e 1,0 ug/ml. Diluir BSA em tampo de extrao de
protenas. Aplicar 5ul de amostra de protena na placa.
3. Aps aplicar as amostras de protena na placa, em triplicata, adicionar 195 ul de
reagente Bradford. Lembrar-se de aplicar o branco, no caso o tampo de extrao de
protenas (seguir mesma mistura que as protenas: 5 ul de tampo + 195 ul de reagente
Bradford).
4. Incubar as amostras, sob leve agitao, por 5 minutos.
5. Efetuar leitura da absorbncia no comprimento de onda de 595 nm em
espectrofotmetro.
6. Construir curva de padronizao, com as concentraes de BSA na abscissa e as
absorbncias mdias na ordenada. Plotar no Excel, obtendo equao de ajuste linear.
7. Medir a absorbncia da amostra do extrato total de protena (mdia das triplicatas)
e estimar o valor da concentrao de protenas na amostra (varivel x) substituindo o valor
da absorbncia na equao linear resultante da curva padro (varivel y).

2. GEL SDS-PAGE
2.1. Preparo dos gis

- Vortexar o tubo contendo o gel, e depositar a soluo at 5,5 cm.


- Aps depositar o gel de migrao, adicionar isopropanol utilizando pipeta at
completar altura de aproximadamente 0,5 cm acima da marcao.
- Deixar polimerizar por aproximadamente 15 minutos
- Eliminar o isopropanol lavando com gua destilada e secar com papel Watmann.
- Adicionar TEMED/PSA no gel de empilhamento e por em cima do gel de migrao.
- Colocar o pente referente ao tamanho do espaador e polimerizar por 15 minutos.
- Retirar o pente e transferir as placas para o suporte branco com a face da placa
menor voltada para o interior do suporte. Marcar a base dos pocinhos com caneta.
- Introduzir o cassete montado dentro do rack e em seguida fechar as abas.
- Lavar os pocinhos com tampo de corrida (tampo de corrida 1X e SDS 1%).

2.2. Preparo das Amostras


- Pr-aquecer o Sample Buffer 5x em banho-maria 37C
- Tomar uma alquota de 475 l de tampo e adicionar 25 l de 2-Mercaptoetanol.
- Diluir o tampo com a amostra na proporo 1:4, e aquecer por 3-5 min a 95C
- Carregar as amostras e o marcador de peso molecular no gel.

2.3. Corrida
- Colocar o cassete na cuba e preencher com o tampo de corrida.
- Correr em 100 Volts at a amostra percorrer todo o gel de empilhamento

- Passar para 150 Volts para correr pelo gel de migrao durante aproximadamente
60min (o tempo de migrao relativo podendo variar de acordo com a concentrao do gel
de migrao e tamanho da banda de interesse).

3. Western
3.1. Montagem do Sandwich
- Cortar a Membrana de Nitrocelulose nas dimenses do gel. Cortar 6 papis
Whatmann do mesmo tamanho (gerar a fora de capilaridade).
- Umedecer a superfcie da plataforma inferior do Aparelho Transferidor com o
Tampo de Transferncia.
- Encharcar 3 papis Whatmann em Tampo de Transferncia e acomod-los sobre
a superfcie do Aparelho Transferidor.
- Hidratar a membrana em Tampo de Transferncia durante 2 minutos e coloc-la
sobre os papis Whatmann. Rolar levemente uma pipeta de vidro sobre o pr-sandwich
para eliminar possveis bolhas.
- Desmontar a cuba de eletroforese e desacoplar as placas de vidro; com o auxlio
de uma esptula, separar as duas placas de vidro para retirar o gel. Molhar as pontas dos
dedos com o Tampo de Transferncia e transferir o gel para o sandwich depositando-o
sobre a membrana. Colocar os 3 papis Whatmann umedecidos sobre o gel e eliminar as
bolhas.
- Umedecer a superfcie da plataforma superior do Transferidor e fechar o aparelho.

3.2. Transferncia
- Aplicar uma corrente constante segundo as recomendaes do equipamento
usado.
- Aps esse tempo, remover os papis Whatmann sem mover o gel e verificar se a
transferncia funcionou erguendo o canto do gel onde foi carregado o Marcador de Peso
Molecular.
- Caso as bandas do Marcador de Peso Molecular no tenham sido transferidas para
a membrana, remontar o sandwich e continuar a transferncia por um perodo maior.
- Caso tenha transferido, as bandas do Marcador sero bem visualizadas na
membrana. Transferir a membrana para um recipiente contendo gua destilada.
- Enxaguar o excesso de sal e adicionar a Soluo Vermelha de Ponceau. Deixar
agir durante 15 segundos e recuperar a soluo. Enxaguar vrias vezes com gua destilada
at que as amostras em cada canaleta sejam visualizadas.

- Enxaguar uma ltima vez com Tampo de Lavagem at que o Ponceau tenha
desaparecido completamente.

3.3. Bloqueio
- Descartar a soluo do Tampo de Lavagem e adicionar um volume de Tampo de
Bloqueio suficiente para deixar o gel imerso.
- Deixar a membrana bloqueando sob leve agitao (orbital) durante 30 minutos a 1
hora. O tempo de bloqueio depende da especificidade de cada anticorpo primrio. Em todos
os casos, 1 hora pode ser o tempo inicial para testar anticorpos novos.
3.4. Incubao com o Anticorpo Primrio
- Descartar a soluo do Tampo de Bloqueio e enxaguar rapidamente a membrana
com gua destilada para remover o excesso de leite.
- Adicionar 10 ml da Soluo do Anticorpo Primrio. (200mg de BSA + 10mL de
tampo de lavagem + Anticorpo). O Anticorpo primrio deve ser diludo segundo as
recomendaes do fabricante, porm pode ser necessrio padronizar esta diluio.
- Vedar o recipiente com veda-filme e incubar a membrana overnight sob leve
agitao orbital a 4oC. (Obs: pode incubar por um tempo menor, devendo ser ajustado
conforme o anticorpo).

3.5. Incubao com o Anticorpo Secundrio


- Recuperar a Soluo do Anticorpo Primrio e lavar a membrana com
aproximadamente 30 ml de Tampo de Lavagem de acordo com os tempos: 2 X rpido, 2 X
15 min, 2 X 5 min.
- Adicionar 10mL da Soluo do Anticorpo Secundrio. Se esse anticorpo for de
quim
de Tampo de Bloqueio.
- Descartar a Soluo do Anticorpo Secundrio e lavar a membrana com
aproximadamente 30 ml de Tampo de Lavagem de acordo com os tempos definidos
abaixo: 2 X rpido, 2 X 15 min, 2 X 5 min.
- Preparar a membrana para revelao.
3.6. Revelao
- Scanear a membrana no aparelho Odyssey (Licor) no comprimento de onda que
excitar o fluorforo associado ao anticorpo secundrio utilizado no experimento (700 ou
800nm).

Material Suplementar
Proliferation Signaling Pathway
https://www.youtube.com/watch?v=WjD43V_rKxU
Cell Cycle and Mitosis
https://www.youtube.com/watch?v=JcZQkmooyPk
Mitosis and Cell Division
https://www.youtube.com/watch?v=P4KCaGkh8v0
What is Cancer?
https://www.youtube.com/watch?v=LEpTTolebqo
How Cells Divide and How Chemotherapy Works
https://www.youtube.com/watch?v=VRhz3DhjG5M
Aurora Kinases
https://www.youtube.com/watch?v=Qn7lKYHjE_Y
ABCAM Western Blot Video Protocol
https://www.youtube.com/watch?v=ikVsaRaFAYU

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