1. Introduo
A tcnica de western blotting (Towbin et al. 1979; Burnette 1981; Towbin and Gordon
1984) tambm pode ser denominada protein immunoblot e consiste na deteco de
protenas especficas em amostras de lisados celulares ou de tecidos. Os passos para a
elaborao dessa tcnica pode ser resumida em cinco etapas: (1) extrao e quantificao
das protenas; (2) fracionamento das protenas da amostra em um gel de poliacrilamida; (3)
transferncias dessas protenas para uma membrana; (4) incubao da membrana com um
anticorpo para detectar a protena especfica a ser analisada; e (5) revelao dessa
membrana para anlise dos dados.
3. Fracionamento de protenas
Para separar as protenas de uma amostra homognea, a tcnica mais utilizada a
eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Inicialmente prepara-se o gel de
SDS-poliacrilamida, que ser uma matriz inerte atravs da qual as protenas podero
migrar. O gel preparado pela polimerizao de monmeros de acrilamida e o tamanho dos
poros do gel pode ser ajustado variando a concentrao da acrilamida adicionada para
retardar a migrao da sua protena de interesse. As protenas podem possuir cargas
positivas ou negativas, dependendo das cargas dos aminocidos que as compem.
utilizado, ento, o SDS (sodium dodecyl sulfate), um poderoso detergente carregado
negativamente, que se liga nas regies hidrofbicas das molculas de protenas
mascarando a carga intrnseca, e permitindo que as protenas migrem em direo ao polo
positivo em um campo eltrico. Alm disso, o SDS quebra as ligaes no covalentes das
protenas, fazendo com que elas voltem a sua estrutura primria, liberadas da associao
com outros monmeros ou outras protenas e molculas de lipdeos. Alm disso, usa-se,
geralmente, um agente redutor tal como o -mercaptoetanol, que quebra as ligaes
dissulfito (S-S) dos resduos de cistena que promovem a ligao de protenas a outros
monmeros, outras protenas ou mesmo a estrutura terciria da mesma protena, mantendo
assim, as protenas separadas e linearizadas (Figura 1a). A partir dessas condies,
protenas de um mesmo tamanho tendem a correr em um gel de poliacrilamida, na
presena de um campo eltrico com as mesmas velocidades, uma vez que (1) suas
estruturas nativas encontram-se completamente desnaturadas devido ao SDS e ao mercaptoetanol fazendo com que suas formas sejam as mesmas e, (2) elas se ligam na
mesma quantidade de SDS e portanto tem a mesma quantidade de cargas negativas
(Figura 1b, c).
detecta protenas de at 300ng. A Figura 2 representa protenas coradas com CoomassieBlue e com Nitrato de Prata.
Metodologia
1. Extrao e Quantificao de protenas
1.1. Protocolo de extrao de protenas totais
2. GEL SDS-PAGE
2.1. Preparo dos gis
2.3. Corrida
- Colocar o cassete na cuba e preencher com o tampo de corrida.
- Correr em 100 Volts at a amostra percorrer todo o gel de empilhamento
- Passar para 150 Volts para correr pelo gel de migrao durante aproximadamente
60min (o tempo de migrao relativo podendo variar de acordo com a concentrao do gel
de migrao e tamanho da banda de interesse).
3. Western
3.1. Montagem do Sandwich
- Cortar a Membrana de Nitrocelulose nas dimenses do gel. Cortar 6 papis
Whatmann do mesmo tamanho (gerar a fora de capilaridade).
- Umedecer a superfcie da plataforma inferior do Aparelho Transferidor com o
Tampo de Transferncia.
- Encharcar 3 papis Whatmann em Tampo de Transferncia e acomod-los sobre
a superfcie do Aparelho Transferidor.
- Hidratar a membrana em Tampo de Transferncia durante 2 minutos e coloc-la
sobre os papis Whatmann. Rolar levemente uma pipeta de vidro sobre o pr-sandwich
para eliminar possveis bolhas.
- Desmontar a cuba de eletroforese e desacoplar as placas de vidro; com o auxlio
de uma esptula, separar as duas placas de vidro para retirar o gel. Molhar as pontas dos
dedos com o Tampo de Transferncia e transferir o gel para o sandwich depositando-o
sobre a membrana. Colocar os 3 papis Whatmann umedecidos sobre o gel e eliminar as
bolhas.
- Umedecer a superfcie da plataforma superior do Transferidor e fechar o aparelho.
3.2. Transferncia
- Aplicar uma corrente constante segundo as recomendaes do equipamento
usado.
- Aps esse tempo, remover os papis Whatmann sem mover o gel e verificar se a
transferncia funcionou erguendo o canto do gel onde foi carregado o Marcador de Peso
Molecular.
- Caso as bandas do Marcador de Peso Molecular no tenham sido transferidas para
a membrana, remontar o sandwich e continuar a transferncia por um perodo maior.
- Caso tenha transferido, as bandas do Marcador sero bem visualizadas na
membrana. Transferir a membrana para um recipiente contendo gua destilada.
- Enxaguar o excesso de sal e adicionar a Soluo Vermelha de Ponceau. Deixar
agir durante 15 segundos e recuperar a soluo. Enxaguar vrias vezes com gua destilada
at que as amostras em cada canaleta sejam visualizadas.
- Enxaguar uma ltima vez com Tampo de Lavagem at que o Ponceau tenha
desaparecido completamente.
3.3. Bloqueio
- Descartar a soluo do Tampo de Lavagem e adicionar um volume de Tampo de
Bloqueio suficiente para deixar o gel imerso.
- Deixar a membrana bloqueando sob leve agitao (orbital) durante 30 minutos a 1
hora. O tempo de bloqueio depende da especificidade de cada anticorpo primrio. Em todos
os casos, 1 hora pode ser o tempo inicial para testar anticorpos novos.
3.4. Incubao com o Anticorpo Primrio
- Descartar a soluo do Tampo de Bloqueio e enxaguar rapidamente a membrana
com gua destilada para remover o excesso de leite.
- Adicionar 10 ml da Soluo do Anticorpo Primrio. (200mg de BSA + 10mL de
tampo de lavagem + Anticorpo). O Anticorpo primrio deve ser diludo segundo as
recomendaes do fabricante, porm pode ser necessrio padronizar esta diluio.
- Vedar o recipiente com veda-filme e incubar a membrana overnight sob leve
agitao orbital a 4oC. (Obs: pode incubar por um tempo menor, devendo ser ajustado
conforme o anticorpo).
Material Suplementar
Proliferation Signaling Pathway
https://www.youtube.com/watch?v=WjD43V_rKxU
Cell Cycle and Mitosis
https://www.youtube.com/watch?v=JcZQkmooyPk
Mitosis and Cell Division
https://www.youtube.com/watch?v=P4KCaGkh8v0
What is Cancer?
https://www.youtube.com/watch?v=LEpTTolebqo
How Cells Divide and How Chemotherapy Works
https://www.youtube.com/watch?v=VRhz3DhjG5M
Aurora Kinases
https://www.youtube.com/watch?v=Qn7lKYHjE_Y
ABCAM Western Blot Video Protocol
https://www.youtube.com/watch?v=ikVsaRaFAYU