Gentica

e
Melhoramento de Plantas
Universidade de vora
2005

 Estrutura dos cidos nucleicos

cido Desoxirribonucleico (DNA)
cido Ribonucleico (RNA)
Dos genes s protenas (eucariotas): transcrio e traduo
Engenharia Gentica de Plantas
Identificao de genes de interesse
Extraco de RNA total e purificao de mRNA
Isolamento e clonagem de genes de interesse
Desenho de primers degenerados
Desenho de primers especficos para isolamento das
extremidades (5 e 3 de um gene)
Construo de Vectores de Clonagem
Avaliao de colnias recombinantes com enzimas de restrio

DNA: cido DesoxirriboNucleico

Constitudo por uma sequncia de

apenas quatro nucletidos.

Os diferentes nucletidos
apresentam uma estrutura comum:
Um grupo fosfato ligado por uma
ligao fosfoester a uma pentose
(desoxirribose), a qual se liga a uma
base azotada resultando num
desoxirribonucletido.
As bases azotadas podem ser purinas
(adenina e guanina) ou pirimidinas
(citosina e timina).
Os desoxirrinucletidos ligam-se entre
si por ligaes fosfodiester originando
uma cadeia simples.

Duas cadeias simples ligam-se

entre si devido
complementaridade das suas
bases azotadas (A=T, G=C),
atravs de ligaes por pontes de
hidrognio, originando uma
cadeia dupla.
James Watson and Francis Crick
(1953):
Estrutura em dupla hlice
com orientao das duas cadeias
antiparalela.

RNA: cido RiboNucleico

Constitudo por uma sequncia de

apenas quatro nucletidos.

Os diferentes nucletidos
apresentam uma estrutura comum:
Um grupo fosfato ligado por uma
ligao fosfoester a uma pentose
(ribose), a qual se liga a uma base
azotada resultando num
desoxirribonucletido.
As bases azotadas podem ser purinas
(adenina e guanina) ou pirimidinas
(citosina e uracilo).

Apresenta uma estrutura em cadeia

simples.

Os ribonucletidos ligam-se entre si por

ligaes fosfodiester originando uma
cadeia simples.

Estrutura de um gene:

Promotor: Regio do DNA qual se liga a enzima RNA polymerase antes de iniciar a
transcrio do DNA em RNA.
Determina: regio de incio da transcrio; a cadeia de DNA que servir como template; nmero de
transcritos; frequncia da transcrio.

Gene: Segmento de DNA constitudo por um conjunto de intres e exes que ser transcrito em
mRNA, codificando os exes a sntese proteica.
Terminador: Regio terminal que bloqueia a enzima RNA polimerase e induz a sua dissociao.

5 Promoter

UTR Exon1

Intron1

Exon2 UTR Terminator 3

GENE
Transcription
Poly A

 Transcrio (decorre no ncleo):

sntese de uma cadeia de RNA mensageiro (mRNA) pela enzima RNA
polimerase que decorre de 5 para 3 tendo como modelo apenas uma
das cadeias de DNA. A nova cadeia resultante ser complementar
cadeia de DNA que lhe serviu de molde apresentando uracilo em vez
de timina:

 Modificaes ps-transcrio:
5 capping: ligao de uma molcula de 7-metilguanilato
extremidade 5 do mRNA durante a transcrio, tendo como
objectivo a proteco da nova cadeia.

 Clivagem da extremidade 3 e adio de uma cauda Poly (A)

Ainda no ncleo o mRNA
transcrito primrio sofre a
clivagem da extremidade 3 e
posterior adio de uma cauda
poly(A).
A dimenso da cauda poly(A)
varia entre 100 a 250
adeninas.
No citoplasma a dimenso da
cauda diminui.
A funon da cauda poly(A)
no ainda bem conhecida.

 Splicing:
clivagem dos intres no inteior da
cadeia de mRNA e simultnea
ligao dos exes,
correspondendo ltima fase do
processamento das molculas de
mRNA no ncleo.

Genoma
Total conjunto de genes
de um organismo

Transcritoma
Conjunto de sequncias
transcritas (mRNA)

Proteoma
Conjunto de proteinas
codificado pelo genoma

Cdigo gentico:
envolve o reconhecimento de tripletos
(conjunto de trs nucletidos) do
mRNA denominados codes pelos
complementares anticodes do tRNA.
Codo de iniciao: AUG (Met)
Codes stop: UAA; UAG; UGA
O cdigo gentico universal e
degenerado (61 codes codificam para
a sntese de apenas 20 aa):
vrios codes = 1 aa
1 codo vrios aa

Incio da traduo:
o
reconhecimento do
codo de iniciao
(mRNA) AUG pelo
anticodo (tRNA)
UAC transportando
o aminocido inicial
Meteonina.
O ribossoma
(rRNA+proteina)
movendo-se ao
longo da cadeia de
mRNA (de trs em
trs nucleotidos)
cataliza a sntese
proteica.

Final da traduo:
o
reconhecimento do
codo de terminao
(mRNA) UAG pelo
anticodo (tRNA)
AUC com a
consequente
separao das duas
subunidades que
constituem o
ribossoma.

Melhoramento gentico:
Consiste na adio ou subtraco de um ou mais genes de um
organismo, introduzindo ou silenciado uma determinada caracterstica.
Vantagem:
Ultrapassar a barreira da espcie: um gene que codifica uma
caracterstica numa determinada espcie pode ser introduzido numa
outra espcie mesmo que filogenticamente muito afastada recorrendo a
tcnicas de biologia molecular.
Interesse:
Criar plantas tolerantes ou resistentes a determinadas condies de stress
bitico e/ou abitico.

Exemplo:
Introduo de Resistncia ao Fungo Uncinula necator (Odio) em
Videira (Vitis vinifera)
O fungo em questo possui parede de quitina pelo que as protenas com
capacidade de a hidrolizar quitinases podem conferir planta
potencialidade para resistir a esse stress bitico.

1 PASSO:
Pesquisar na bibliografia a existncia de espcies vegetais resistentes a este fungo.
Ex.: Vitis rupestris
2 PASSO:
Pesquisar na base de dados se o gene est descrito para a espcie classificada como
resistente. Caso no esteja, ser objectivo isolar este gene na espcie
resistente para introduzir na espcie sensvel (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

3 PASSO: Isolamento de RNA total do organismo do qual se pretende isolar o gene

(espcie resistente V. rupestris) e purificao de mRNA.
mRNA
4 PASSO: Transcrio Reversa
5 PASSO: Desenho de primers degenerados permitindo-nos amplificar uma
sequncia correspondente ao gene que se pretende isolar. Para tal
seleccionam-se na base de dados as sequncias ORF (Open Reading
Frame) de vrias espcies, ou seja, a regio estritamente necessria para a
codificao da sntese da protena. A ORF inicia-se com a sequncia
Kozak (CCGCCATGGG) e finaliza com um dos codes stop,
correspondendo sempre maior sequncia encontrada;
6 PASSO: Alinhamento das diferentes sequencias de um mesmo gene codificando a
mesma protena em diferentes espcies e desenho de um primer
degenerado (sequencia de 20 a 30 oligonucletidos) forward
(extremidade 5) e outro reverse (extremidade 3);
7 PASSO: Amplificao de uma sequncia de cDNA por PCR utilizando os primers
degenerados.

 Extraco de RNA total (Protocolo do Hot Borate)

A integridade do RNA avaliada em gel de agarose onde
devem ser visveis duas bandas mais fortes correspondentes
ao RNA ribossomal (28S e 18S);
Pode ocorrer contaminao com DNA;
O trabalho com RNA requer mais cuidados, uma vez que este
mais instvel que o DNA;
A grande desvantagem de trabalhar com o RNA ser a de no
existir forma de o amplificar.

28S

18S

Purificao do mRNA
DNA

mRNA

Permite isolar genes que se estejam a expressar

(constitutivos ou de expresso diferencial, que s se expressem
sob uma determinada condio de stress);
A incapacidade de o amplificar levou ao desenvolvimento de
tcnicas (Transcrio Reversa)
Reversa que permitiram converter este
novamente em DNA (DNA complementar ou cDNA).
cDNA

Transcrio Reversa
Enzimas denominadas Transcriptases Reversas, descobertas por Temin e
Baltimore (1960) em retrovrus, catalizam a sntese de cDNA a partir de
RNA.O cDNA mais estvel e apresenta a vantagem de poder ser
amplificado por tcnica de PCR.

Transcrio Reversa
mRNA template

AAAAAAA () Poly(A)
VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G) VIAL 8

AAAAAAA () Poly(A)
VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G)

AAAAAAA () Poly(A)

Degradao da cadeia
de mRNA com RNase

VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G)

VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G)

Amplificao por PCR

GTCGACATCGATACGCGTGGTC

VIAL 9

VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G)

Pefw

PeRev
AAAAAAAAAAAAAAAGTCGACATCGATACGCGTGGTC

A transcrio (reversa) do cDNA tem a vantagem de permitir posterior amplificao de um gene de interesse
limpo de intres. O conhecimento da sequncia das extremidades do cDNA permite a posterior amplificao
das extremidades de um gene. Para tal dever utilizar-se um primer especfico que emparelhe com uma das
extremidades e um outro primer que emparelhe com uma zona especfica da nossa sequncia.

Primer: Sequncia de oligonucletidos (16-24 nucletidos) complementar a uma

regio do DNA que ao emparelhar permite o funcionamento da enzima Taq
polimerase e consequente formao de uma nova cadeia de DNA
complementar existente.

Forward (5)

Reverse (3)

AGGCTA()
AGGCTA()

GGCAAT()
CCGTTA()

Fw

Rv

5 AGGCTA()

5 ()ATTGCC
Reverse complement

Os primers devem ser desenhados tendo em conta os seguintes pontos:

a) primer Forward prximo da extremidade 5 com a sequncia igual da
cadeia modelo; Reverse prximo da extremidade 3 com a sequncia complementar
da cadeia modelo, sendo a sua sequncia colocada em reverse devido a efeitos de
encomenda;
b) cada primer no dever exceder os 25 nucletidos;
c) o nmero de nucletidos de um primer depende da sua temperatura de
emparelhamento, determinada da seguinte forma: [2x(A+T)]+[4x(G+C)];
d) a extremidade 3 de cada primer dever ser mais rica em G e/ou C.

 Polymerase chain reaction (PCR)

Amplificao exponencial de uma sequncia especfica de DNA, determinada
pelo emparelhamento dos primers.
Condies necessrias para a reaco:
a) sequncia de DNA que servir de template
b) um par de primers (forward e reverse)
c) DNA polimerase (Taq DNA polimerase: Thermus aquaticus)
d) dNTPs (C, T, G, A)
c) tampo de PCR com MgCl2
Programa de PCR:
1: Desnaturao: temperatura de 90-95C
2: Emparelhamento: temperatura varia com primers
3: Temperatura de sntese: temperatura 60-72C

Mix de PCR:
1. cDNA .. 1l
2. PCR Buffer (10x) .... 5l
3. MgCl (50mM) .. 2l
4. dNTPs (10mM) ... 1l
5. Primer forward (10mM) .. 1l
6. Primer reverse (10mM) 1l
7. H2O Milli-Q estril . 38.5l
8. Taq DNA polimerase .. 0.5l
50l

Programa de PCR:

35 ciclos

330 pb

800 pb
Rv

MM

1000 pb

Fw

PCR 1

500 pb
A utilizao de primers degenerados permitenos amplificar fragmentos especficos da
espcie em estudo ( 500pb);

1500pb

600pb
500pb

100pb

Por vezes ocorre a amplificao de outros

fragmentos denominados inespecficos dado o
emparelhamento inespecfico do primer (se
existir uma pequena sequncia na extremidade
3 do primer, sobretudo G ou C, que
emparelhem com alguma zona complementar
no templete, ocorrer igualmente sntese de
DNA).

 Sequenciao do fragmento amplificado

Na reaco de sequenciao (PCR com apenas 1 primer) o fragmento vai ser
amplificado com nucletidos marcados que o sequenciador vai reconhecer, sendo o
resultado da leitura dado por uma cor diferente para cada nucletido;
A leitura do fragmento de DNA amplificado permite determinar se este
corresponde de facto a um fragmento do gene que se pretende isolar.

 Isolamento das extremidades 5 e 3 do gene

Desenho de primers especficos
5(330pb)GGGATACTGCTACCTCAGGGAACAAGGCAGCCCCGGAGCTTACTGTGTTCC
CAGCCCCGGAGCTTACTGTGTTCC
TAGTGCACAGTGGCCTTGTGCCGCTGGTAGGAAATACTATGGCCGAGGCCCCATACAGATTTCCTACAACTACAACT
ATGGGCAAGCTGGGAAAGCCATAGGGGTAGACCTGGTAAACAACCCTGATCTAGTAGCAACAGATGCAGTCATATC
ATTCAAGACAGCCTTCTGGTTCTGGATGACACCCCAGTCACCCAAGCCTTCCTGCC
CCCCAGTCACCCAAGCCTTCCTGCCATAATGTCATCACAGGAGG
ATGGACCCCATCAGGTGCAGATAGGTCAGCAGGGCGGCTTCCCGGTTTTGGTGTTATCACAAACATCATCAATGGAG
GTGTTGAATGTGGGAAAGGGGTAGTTCCTCAGGTCCAGGACCGCATAGGTTTCTATAAGAGGTACTGTGATATACTT
AGGGTTAGCTATGGCAATAACCTGGACTGCAACAACCAAAGGCCTTTCGGGTCTGGCC(800pb)...3

Ta=(4x15)+(2x9)-10=78-10= 68
Ta=(4x17)+(2x8)-10=84-10= 74

500pb

cDNA

5
3

GGG
5PCR primer

CCC

Rv
Fw
700pb

Poly(A)
AAAAAA

Poly(T)

 Clonagem do Gene Completo

A enzima Taq DNA polimerase possui a capacidade adicional de terminal
transferase (para alm de DNA polimerase), ou seja, adiciona ao final da
cadeia amplificada uma base de adenina (A).
Esta capacidade permite a ligao do fragmento amplificado a um vector de
clonagem linearizado possuindo extremidades de timina (T).

5AATGGGGTTGTGGGCATTGGTAGCTTTCTGTCTGTTGTCATTAATACTGGTTGGCTCAGCAGAGCAATGTGGAGGGCAAGCTGG
GGGTAGAGTTTGCCCAGGGGGGGCATGCTGCAGCAAGTTTGGTTGGTGTGGCAACACTGCTGATTACTGTGGCAGTGGCTGCCA
AAGCCAGTGCAGTTCCACTGGTGACATTGGCCAGCTTATTACCAGGTCCATGTTCAATGATATGCTTAAGCATAGAAATGAGGGG
AGTTGCCCTGGCAAGGGCTTCTACACCTATGACGCTTTCATAGCTGCTGCTAAGGCCTTTCCTGGCTTTGGAACAACTGGTGATAC
CACTACTCGTAAAAGGGAAATCGCAGCCTTCTTGGCTCAAACTTCTCATGAAACCACTGGGGGGTGGGCTAGTGCACCTGATGGC
CCATACGCTTGGGGATACTGCTACCTCAGGGAACAAGGCAGCCCCGGAGCTTACTGTGTTCCTAGTGCACAGTGGCCTTGTGCCG
CTGGTAGGAAATACTATGGCCGAGGCCCCATACAGATTTCCTACAACTACAACTATGGGCAAGCTGGGAAAGCCATAGGGGTAG
ACCTGGTAAACAACCCTGATCTAGTAGCAACAGATGCAGTCATATCATTCAAGACAGCCTTCTGGTTCTGGATGACACCCCAGTC
ACCCAAGCCTTCCTGCCATAATGTCATCACAGGAGGATGGACCCCATCAGGTGCAGATAGGTCAGCAGGGCGGCTTCCCGGTTTT
GGTGTTATCACAAACATCATCAATGGAGGTGTTGAATGTGGGAAAGGGGTAGTTCCTCAGGTCCAGGACCGCATAGGTTTCTATA
AGAGGTACTGTGATATACTTAGGGTTAGCTATGGCAATAACCTGGACTGCAACAACCAAAGGCCTTTCGGGTCTGGCCTCCTGCT
GGACACCATCTAAA3

 Vector de Clonagem

Gene LacZ
Ampicilina
Permite a seleco de
bactrias transformadas.
Apenas as bactrias
transformadas, ou seja,
que possuam o vector
plasmdico no seu interior
apresentam resistncia a
este antibitico.

MCS

Origem de replicao
Responsvel pela iniciao da
sntese proteica.

Responsvel pela sntese do

fragmento da enzima galactosidase que por
complementao com o fragmento
sintetizado pelo cromossoma
bacteriano produz actividade da
enzima.
No meio da sequncia deste gene
conhecida uma zona com vrios
locais de restrio identificados
(Multiple Cloning Site).

Qual a importncia desta regio?

 Vector de Clonagem: Qual a importncia da MCS?

Os locais de restrio identificados nesta regio so nicos no vector, o que
significa que as enzimas de restrio especficas deste locais apenas cortaro o
vector uma nica vez.
As extremidades que se geram no vector aps digesto com uma determinada
enzima de restrio so compatveis com as extremidades geradas num fragmento
digerido com a mesma enzima, permitindo assim a integrao desse fragmento no
vector.
Estando a regio MCS inserida no meio da sequncia do gene LacZ (responsvel
pela sntese da enzima -galactosidase e consequente expresso azul das colnias
bacterianas) a interrupo do gene por insero de um fragmento, leva inibio da
expresso do gene. As bactrias que possuam plasmdio com um fragmento
inserido na regio MCS (transformadas recombinantes) possuem colorao branca.

 Transformao de bactrias
Introduo de um vector plasmdico, integrando o gene de interesse,
em bactrias desprovidas de qualquer DNA desta natureza (bactrias
competentes).
O objectivo desta tcnica consiste obter milhares de cpias do vector
introduzido na bactria e assim do gene inserido neste.

 Screening de bactrias recombinantes com enzimas de restrio

O screening de bactrias recombinantes portadoras do fragmento de interesse pode ser efectuados de
duas formas:
1. Por PCR utilizando os primers especficos do gene ou do vector;
2. Por digesto com enzimas de restrio que flanqueiem o local de insero do gene.
Neste caso necessrio a incubao prvia das colnias seleccionadas em LB lquido para posterior
extraco do DNA plasmdico (protocolo da aula). Somente aps esta extraco que se poder
efectuar a digesto do DNA utilizando enzimas de restrio especficas da zona MCS (podendo ser
apenas uma enzima com dois locais de restrio, um na zona 5 do fragmento e outro na zona 3 ou
duas enzimas diferentes).
Mix Digesto:
1. DNA plasmdico extraido . 10l
2. Buffer (10x) .. 2l
3. Enzima 5 . 0.3l
4. Enzima 3 . 0.3l
5. H2O Milli-Q estril .. 7.4l
20l

Incubar 2-3h a xC (a temperatura ptima

varia com as enzimas, sendo na maior parte dos
caso 37C)

 Screening de bactrias recombinantes com enzimas de restrio

1.

MM

A reaco de digesto no foi completa,

pois observam-se no gel bandas
correspondentes a formas circulares e
superenroladas;

2.

Apenas as colnias 2 e 4 apresentam o

fragmento de interesse (1000 pb);

3.

A colnia 1 apresenta um fragmento

clonado de peso inferior ao desejado;

4.

A colnia 3 apesar de apresentar uma

banda correspondente a um fragmento
de 1000 pb, apresenta uma outra banda
correspondente a um fragmento de peso
inferior a 100 pb. Como o vector no
possui mais locais de restrio para as
enzimas utilizadas, as duas bandas
correspondero a um fragmento de peso
total de 1050pb que possui um local de
restrio para uma das enzimas
utilizadas a 50 pb de uma extremidade.

cl.1

cl.2

cl.3

cl.4

Polissacridos
DNA circular com nicks
DNA linear
1500 pb

DNA circular superenrolado

600 pb

Fragmento linear digerido

100 pb

SacI

5
(0pb)

KpnI

3
(1000pb)

 Alguns Mecanismos de Transferncia de genes de

interesse
Construo de Vectores de Expresso

Agrobacterium
Bombardeamento de Partculas
Mecanismos de seleco de transgnicos
Melhoramento Clssico vs. Biotecnologia
Melhoramento gentico: potencialidades, benefcios e
riscos

Construo de Vector de Expresso

Um vector de expresso corresponde a um vector plasmdico integrando uma sequncia
denominada cassete de expresso- sequncia de DNA linear que inclui para alm dos genes,
um promotor e um terminador que controlam a expresso de cada gene em particular. Na
cassete de expresso podem existir:
a) apenas o gene de interesse (ex.: chitinase), no existindo forma de seleco;
b) o gene de interesse e o gene de seleco (resistncia a antibitico ou herbicida);
c) o gene de interesse, o gene de seleco e um gene reprter:
- -glucuronidase (GUS);
- Green Fluorescent Proteins (GFP).

CHITINASE
Vitis rupestris

GUS

pHKTL1
(12.020 Kb)

Agrobacterium tumefaciens
uma bactria que existe naturalmente
no solo infectando um grande nmero
de dicotiledneas.
Penetra nas razes atravs de feridas
provocando uma reaco no tecido que
se traduz numa multiplicao anormal
das clulas dando origem a tumores.

Os tumores resultam da transferncia, integrao e expresso nas clulas da planta de

um segmento especfico do DNA bacteriano designado de T-DNA (DNA transferido).
Esta capacidade faz da bactria A. tumefaciens um instrumento natural de engenharia
gentica.

O T-DNA constitui parte do plasmdio Ti (tumour inducing) que ocorre naturalmente nas
clulas de A. tumefaciens e responsvel pela capacidade infecciosa da bactria.

A forma de explorar a capacidade do A.

tumefaciens consiste em:
alterar a zona de DNA que
transferida (T-DNA), eliminando os genes
tumorais e o gene para a opina (aminocido
modificado utilizado como fonte de carbono e
azoto pela bactria), substituindo-os pelo gene ou
genes que se pretendem introduzir;
as sequncias dos limites so os
nicos elementos que necessrio manter (LE e
LD) permitindo a transferncia da sequncia do
T-DNA para as clulas do hospedeiro.
Mapa gentico do plasmdio Ti.

Devido s grandes dificuldades em manipular grandes molculas de DNA como o

plasmdeo Ti, foram desenvolvidos vectores em que toda a manipulao feita
recorrendo Escherichia coli.

Esquema do plasmdeo Ti utilizado para transformao de

clulas vegetais mediada por A. tumefaciens.

Etapas da Transformao Gentica mediada por Agrobacterium:

1. O vector plasmdico Ti retirado da
bactria e manipulado por alterao a
regio T-DNA. Esta manipulao
envolve enzimas de restrio especficas
que permitem a digesto do vector em
zonas conhecidas;

3. Transformao da estirpe de bactria

Agrobacterium com o vector Ti
recombinante, originando bactrias
recombinantes;

Genomicc DNA

Genomic DNA

Ti plasmid

2. A digesto do vector permite a

insero nessas zonas dos genes de
interesse (flanqueados por um promotor
e um terminador): vector recombinante;

Vitis
rupestris
cells
Vitis
rupestris
cells
Plant
cell

Agrobacterium

(carries the gene of

interest)
interest

Restriction
enzyme A

Restriction
enzyme A

+
Empty
plasmid

Gene of
interest : chitinase

Ti plasmid with the gene of interest

4. Infeco (co-cultura que decorre em mdia

2 dias) do hospedeiro com transferncia do
vector Ti para as clulas desse (o material
vegetal utilizado depende do sistema de
regenerao seguido);
5. Transferncia da regio T-DNA (suporta os
genes de interesse) do vector Ti da bactria
para o genoma do hospedeiro;
6. Integrao do T-DNA no genoma da planta:
clulas transformadas;

Agrobacteriumtumefaciens
Ti plasmid with the newgene
cells
DNA

+
Agrobacterium

Plant cell
The new
gene

7. Multiplicao da regio T-DNA integrada

no genoma da planta originando uma nova
planta integrando esse(s) gene(s): planta
transgnica.
8. Expresso dos genes introduzidos no
hospedeiro quando sob a condio de stress
que se tentou combater.

Transformation

Transgenic plant

Cell division

Seleco de Plantas Transgnicas

Calli embriognicos transformados

A anlise histoqumica com

X-Gluc permite verificar a
eficincia da transformao.
A rea azul corresponde a
zonas onde ocorreu a
integrao do gene GUS e
sua expresso com sntese da
proteina -glucoronidase.

A regenerao de plantas
(embriognese somtica) a partir de
zonas integrando o genes GUS origina
plantas transformadas. A anlise
histoqumica realizada em plantas
permite detectar por expresso da
colorao azul as plantas que integram
este gene reprter.

Limitaes da Tcnica
9 Apesar de ser utilizado com sucesso na transformao de muitas dicotiledneas,

apresenta como grande limitao: a reduzida capacidade na transformao de

monocotiledneas.
9 Na tentativa de incrementar esta capacidade de transformao testaram-se diferentes
estirpes de Agrobacterium, condies fisiolgicas da bactria e hospedeiro, bem como
tcnicas de co-cultura (Godwin et al., 1992), no se conseguindo ainda assim
resultados favorveis.
9 A transformao de monocotiledneas requer um sistema alternativo de
transformao gentica, como por exemplo o bombardemanto de particulas ou a fuso
de protoplastos.
9 A integrao de genes pelo Agrobacterium d-se unicamente ao nvel do DNA
genmico do hospedeiro. Caso se pretenda introduzir informao noutro qualquer
organelo celular, ter de se recorrer a outras tcnicas, como por exemplo o
bombardeamento de partculas.

Bombardeamento de Partculas, Gen Gun ou Biolstica

Mtodologia que permite transformar geneticamente plantas de espcies que o
Agrobacterium no infecta (como por exemplo o arroz, o milho, a cevada, etc.).
A tcnica basea-se em:
projectar a uma presso elevada (variando esta com o material vegetal em causa, para
calli de videira utilizada uma presso entre 1100 e 1550 psi) partculas de ouro ou
tungstnio de dimetro varivel (1.00m) com o DNA (vector plasmdico com a
cassete de expresso ou apenas a cassete de expresso) agregado.
A fora mecnica gerada por uma velocidade elevada permite que sejam quebradas barreiras
biolgicas, podendo ocorrer integrao do DNA estranho no genoma das clulas
bombardeadas (DNA nuclear). Para alm deste, esta tcnica possibilita a integrao ao
nvel do genoma dos cloroplastos (Ye et al., 1990; Daniell, 1993) e das mitocondrias.
A aplicao desta tcnica requer:
- uma preparao prvia muito cuidada;
- DNA circular ou linear de boa qualidade;
- existncia de um protocolo de regenerao optimizado.

O aparelho utilizado:

Cmara de Bombardeamento

Suporte do disco de ruptura (1)

Estrutura onde se colocam os

macrocarriers, respectivos
suportes e stopping screen (2)
Suporte do material Vegetal (3)

O disco de ruptura determina a presso qual sero projectadas as

partculas com o DNA agregado.
Existem diferentes discos de acordo com a presso que suportam: um
disco de 1550psi significa que suporta presses inferiores a esta e que
ao atingir este valor rompe, permitindo que as partculas sejam
projectadas sob o material vegetal.
(1)
Disco de ruptura

Suporte do disco de ruptura

(2)
Suportes do Macrocarrier
Tampa

Macrocarrier

Stopping Screen

(3)

O material vegetal utilizado no bombardeamento de partculas depende do sistema de

regenerao utilizado para a espcie vegetal que se pretende transformar, podendo ser
calli, embries, discos foliares, etc.

Anlise histoqumica 2 dias aps o bombardeamento permite determinar o sucesso da

transformao. O nmero de pontos azuis corresponde aos pontos em que ocorreu integrao do
gene GUS e sua expresso.

As primeiras clulas do material vegetal a serem bombardeadas so normalmente destrudas, no

entanto, junto a essas existe uma rea de clulas envolvente em que as partculas penetraram sem
as destruir. Algumas destas clulas vo sobreviver agresso provocada pela ferida das partculas
e incorporar no genoma o DNA transportado. Aps a incorporao do(s) gene(s) no genoma da
planta, as clulas podem express-lo com a consequente produo da protena por ele codificada.

Vantagens relativamente ao Agrobacterium:

9 Possvel utilizao em dicotiledneas e monocotiledneas;
9 Inexistncia de falsos positivos, correspondentes a plantas no
transformadas mas que possuindo a bactria utilizada como vector da
transformao, manifestam a presena do gene;
9 Necessidade de apenas um antibitico para seleco das plantas
transformadas. A utilizao de A. tumefaciens requer a utilizao de
dois antibiticos, um para eliminar a bactria e um outro para a
seleco das plantas transformadas.

Limitaes da tcnica:
9 Elevada destruio celular: as camadas celulares mais externas so denominadas de
zona de morte por serem destrudas devido ao impacto ou fragmentao das
partculas ou rajada de ar produzida (Birch and Franks, 1991);
9 Baixa estabilidade dos transformante: apesar de ocorrer integrao de um gene no
genoma de uma clula que poder regenerar uma planta, esta integrao no estvel,
apenas 1-5% das clulas expressam integrao estvel (Finer and McMullen, 1990);
9 Limitado na dimenso das construes genticas: quanto maior o vector de expresso
menor a possibilidade de sucesso;
9 Permite repeties: existe a possibilidade de integrar vrias vezes o mesmo gene no
genoma da clula vegetal, dando origem a repeties e consequente expresso
diferencial do mesmo gene;
9 Desconhecimento do efeito que a velocidade das partculas pode causar, bem como
da composio das mesmas, partculas de tungstnio podem oxidar resultando txicas
para as clulas.

Seleco de tecidos geneticamente transformados

Aps transformao, mediada por Agrobacterium ou Bombardeamento de Partculas,
o material vegetal ser transferido para meio de cultura suplementado com antibitico ou
herbicida (depende do marcador de seleco utilizado. Ex.: se na cassete de expresso se
integrou o gene que confere resistncia ao antibitico higromicina, o agente de seleco
adicionado ao meio de cultura ser este antibitico).
Apenas as clulas expressando o gene de seleco conseguem sobreviver ao agente
utilizado originando plantas resistentes a esse. Assume-se que estas plantas, por possurem o
gene de seleco possuem tambm o gene de interesse (ambos os genes foram integrados na
cassete de expresso utilizada).

A integrao dos genes no genoma das

plantas requer a extraco de DNA
cromossomal das plantas
putativamente transgnicas e sua
anlise por PCR.

Na reaco de amplificao so utilizados

primers especficos que permitem amplificar
um fragmento do gene de interesse, ou
qualquer zona presente na cassete de
expresso (zona dos promotores,
terminadores, gene de seleco, reprter ou
de interesse).
O resultado do PCR observado por
electroforese, onde a separao dos
fragmentos de DNA ocorre de acordo com o
seu peso molecular, atravs de uma corrente
elctrica, migrando do plo negativo para o
positivo.

Hygromycin
(HPTII)

-glucuronidase
(GUS)

A obteno de resistncia a determinadas condies de stress bitico ou abitico

possvel utilizando mtodos tradicionais ou convencionais.
cruzamento entre espcies sensveis (Vitis vinifera) e
espcies resistentes a esse stress (V. rupestris) originando hbridos, alguns dos quais
possuindo a caracterstica desejada. No entanto, este mtodo muito moroso e no est
isento de forte controvrsia, j que os hbridos assim obtidos podem colocar em causa a
tipicidade do produto final.
A biotecnologia, atravs dos seus mtodos de propagao e transformao gentica,
apresenta grande potencial para o melhoramento de diversas espcies vegetais.
Esta metodologia apresenta, relativamente aos mtodos de melhoramento
convencionais, as seguintes vantagens:
- melhoramento de grande preciso, em que apenas o gene pretendido
introduzido no genoma da planta;
- reduo do tempo de obteno da nova variedade;
- inexistncia de barreiras quanto provenincia do gene responsvel pela
caracterstica que se pretende introduzir, podendo ter origem em qualquer outra planta.