Resumen:
Como paso preliminar para el desarrollo de tcnicas moleculares que permitan el conocimiento del
genoma de hongos fitopatgenos, en la presente prctica de laboratorio se desarrollo el protocolo de
extraccin y visualizacin del ADN de fusarium sp., enfatizando en las reacciones que ocurren a lo
largo de los procesos de extraccin. Para lisar el micelio se utilizo ruptura mecnica combinada con el
buffer de extraccin (Tris, EDTA, SDS y Na2SO3), la purificacin del ADN se realizo aadiendo
fenol:cloroform, isopropanol y etanol; el anlisis de la calidad y cantidad de ADN se hizo mediante
electroforesis en gel de agarosa a 0,7%, TBE 0,5X y BrEt. En este estudio se obtuvo ADN de alto peso
molecular en la mayora de las muestras. La comparacin de los mtodos de extraccin demostr las
diferencias entre las bacterias, hongos y plantas, estas diferencias se ven reflejadas en sus respectivos
protocolos de extraccin y purificacin de ADN.
INTRODUCCIN
los
sistemas
ms
grandes
de
deja
en
la
escena
del
crimen,
es
til
aplicaciones,
tales
en
muchas
la
medicina
como
en
que
el
mundo
identifica
coincidencias biolgicas.
Para
hacer
uso
de
esta
tcnica
es
segn
su
tamao
mediante
si
son
todas
diferentes,
enzimtica
dos
restriccin:
(ENZ)
que
contiene
Electroforesis y visualizacin:
FORMATO CONTROL DE ELECTROFORESIS
Electroforesis No. 2
Fecha: Julio/06/2012
% de Agarosa: 1%
37C en bao.
Voltaje: 120v
BrEt: 2 l
Electroforesis y visualizacin
Para la preparacin del gel, se agreg en
un erlenmeyer 40ml de TBE 0.5X y agarosa
al 1% (0,4 g), llevndolo a plancha de
calentamiento hasta la disolucin completa
de la agarosa; cuando la temperatura
disminuyo a aproximadamente a 65 0C se
agreg 2 l de BrEt, la mezcla se verti en
la cubeta y posteriormente se coloc el
peine para la formacin de los fosos. Una
vez el gel gelifico se lleva a la cmara
cubrindolo totalmente con TBE 0.5X Fig. 2
Muestra
Marcador
Escena del crimen
Sospechoso 1
Sospechoso 2
Sospechoso 3
Sospechoso 4
Sospechoso 5
C
A
B
D
F
E
Fig. 3 Electroforesis: A) Calentamiento de agarosa0,7% + TBE 0,5X, B) adicin de 2l de BrEt, C)
vertimiento del gel en la cubeta, D) extraccin de topes y peine, E) corrida electrofortica a 117V
durante 40 min.
Fig. 2
9416
M EC S1 S2 S3 S4 S5
referencia
2027
el
pb
teniendo
marcador
como
molecular
Comentarios:
En todos los carriles del gel se
observaron bandas bien definidas.
El tamao de banda promedio fue
observado
aproximadamente
entre
celular.
dificultan
el
proceso
de
Segn
Valdez
Kahl
(2000)
la
contaminacin
con
estos
compuestos
molecular
aparece
como
una
banda
peso molecular.
10
todos
los
carriles
que
contenan
presentes en el micelio.
logro
la
liberacin
de
cantidades
Lactarius.
Comparacin
de
protocolos
de
genmico bacteriano:
pirrolidona
disolver
alta pureza.
(PVP)
lpidos,
son
utilizados
remover
para
polifenoles,
y membrana
plasmtica:
clulas
individuales
no
contienen
estas
deben
ser
fragmentos
molidas
antes
de
en
sales
es
la
eliminacin
de
pequeos
continuar
(Karp,
2010).
combinacin
de la accin de ambos
compuestos,
el
fenol
acta
2005).
Extraccin
precipitacin
de
ADN
(concentracin):
buffer
de
extraccin
protocolo
no
se
permite
utiliz
obtener
ARNasas
ni
dinero.
CONCLUSIN
La presente practica logr su objetivo
degradacin
parcial
de
las
bandas
Para
poder
conocer
el
tamao
ADN.
BIBLIOGRAFA
grapevine
Zurisadai,
identificacin
de
2006.
especies
Seleccin
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CUESTIONARIO
Tipos de electroforesis que existen y sus aplicaciones:
1) Inmunoelectrofresis
Es una combinacin de una electroforesis en geles de agarosa seguida de una
inmunodifusin. En la primera parte, se realiza una aplicacin puntual de la muestra, por lo
que al final las distintas protenas estarn distribuidas a lo largo del gel segn el eje de
migracin. Acabada la electroforesis, y sin efectuar la tincin, se practica en el gel un canal
(trinchera) paralelo a la direccin de migracin con un bistur de doble hoja en el que se
deposita un antisuero que contenga anticuerpos especficos frente a una o varias de las
protenas separadas en la electroforesis. Los geles se mantienen a temperatura de (20-22C)
durante 24-48 horas. Los anticuerpos y las protenas se difunden, y si se encuentran en la
proporcin adecuada, producen complejos antgeno-anticuerpo insolubles que precipitan y
aparecen en el gel como bandas elipsoidales.
Formatos de la PAGE
Existen 3 formas diferentes de realizar electroforesis en geles de poliacrilamida: lmina
vertical, varilla cilndrica y lmina horizontal.
PAGE no desnaturalizante.
Se desarrolla en condiciones en las que no se altera la conformacin nativa de las protenas
separadas, por lo que finalizada la electroforesis, pueden realizarse estudios de funcionalidad
de dichas protenas separadas (actividad enzimtica, capacidad de unin de anticuerpos,
unin a receptores, etc.). El tampn presente en los reservorios es diferente al que impregna
el gel, el cual tampoco es homogneo, ya que, en realidad, hay dos geles diferentes en uno
solo: una zona de resolucin (donde tiene lugar la separacin de las protenas) que se
polimeriza sin colocar el peine y otra pequea zona de concentracin de 1-3 cm, que se
polimeriza sobre la anterior, que contiene los pocillos de aplicacin de la muestra y cuya
finalidad es concentrar la muestra en la zona de contacto con la zona de resolucin
PAGE desnaturalizante:
En presencia de algunos compuestos qumicos, las protenas pierden su estructura nativa;
tales compuestos, llamados agentes desnaturalizantes, producen el desplegamiento de la
protena que queda, as, sin la organizacin tridimensional caracterstica de su funcionalidad
biolgica. En la electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE), como su propio nombre indica,
se utilizan agentes desnaturalizantes de protenas, como pueden ser: detergentes (p.e. SDS),
catropos (p.e. urea) y agentes reductores (2- mercaptoetanol, DTT). Para la visualizacin
de las protenas se utilizan diferentes mtodos de tincin, siendo el ms habitual el azul de
coomassie, la separacin es funcin del tamao (masa molecular), lo que permite determinar
el peso molecular de las protenas. Para ello se compara la movilidad electrofortica de la
protena de peso molecular desconocido con el de protenas de referencia de peso molecular
conocido.
Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas pues las
concentra en regiones ms estrechas, adems de incrementar el rango de pesos moleculares
que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentracin fija.
Electrofresis capilar
La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las tcnicas electroforeticas
convencionales, pero utiliza condiciones y tecnologa distinta que permiten obtener una serie
de ventajas al respecto. Esta separacin de pptidos es realizada sobre un capilar de silica
fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por
aire. El capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de polimina para
darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventaja, a travs de ella que permite el pasaje de
la luz UV de tal manera que la visualizacin es on-line. Con esta tcnica descrita es posible
separar cationes, aniones, protenas, macromolculas y sustancias no cargadas en forma
simultnea.
Enfoque isoelctrico
Es un tipo particular de electroforesis en la que los compuestos anfteros se separan segn
su punto isoelctrico (pI; pH al cual la carga neta de la protena es nula) en un gradiente
continuo de pH.
La carga neta de una protena est en funcin del pH: pH>pI Carga nula negativa
pH=pI Carga neta nula
pH<pI Carga nula positiva
En este mtodo el efecto de la difusin es mnimo y por ello posee una enorme resolucin,
pudiendo llegar a separar protenas que difieran en 0.001 unidades de pI. Se emplean
compuestos anfteros de bajo peso molecular llamados anfolitos portadores, que son
pequeas poliaminas (alrededor de 750 kDa) con abundantes grupos cidos y bsicos, con un
pI que abarca desde 2.5 hasta 11.0, con gran capacidad de tamponacin cerca de su pI y con
una gran solubilidad y conductividad.
Puede llevarse a cabo en condiciones que mantengan la estructura nativa de las protenas o
en condiciones desnaturalizantes, incorporando, adems de los anfolitos, urea (8M) o
detergentes ni inicos o anfteros (pero nunca detergentes inicos como el SDS).
Electrofresis bidimensional
Es una sucesin de dos electroforesis distintas (o en distintas condiciones) realizadas sobre
una misma muestra. En la primera de ellas (primera dimensin) se separan los componentes
de la muestra segn un criterio (carga, tamao o pI), y en la segunda (segunda dimensin)
segn un parmetro distinto del anterior.
condiciones no