Microorganismos Productores de Celulasas Aislados de Camélidos

Sudamericanos para la producción de etanol

RESUMEN

La celulosa presente en los restos vegetales, subproductos agrícolas e

industriales, es un sustrato valioso para la producción de bioetanol. Sin

embargo, la conversión del material celulósico es costoso debido a la baja

eficiencia de transformación de este polisacárido a residuos más sencillos para

ser utilizados eficientemente en la producción del bioetanol. La búsqueda de

nuevas fuentes para la obtención de microorganismos capaces de utilizar

eficientemente la celulosa es prioritario; de este modo, la hidrólisis enzimática

y la fermentación de la celulosa para la obtención de etanol se convertiría en

una actividad económicamente viable y con alta rentabilidad. Para ello, Los

camélidos sudamericanos como la llama, alpaca, vicuña, adaptados a consumir

pasturas con alto contenido celulósico y lignolítico, propio de los ambientes

interandinos, constituyen una fuente potencial de microorganismos celulolíticos

y lignolíticos. En este proyecto se aislará microorganismos celulolíticos

procedentes de la llama, alpaca y vicuña utilizando medios de cultivo

específicos. Los microorganismos aislados serán caracterizados por pruebas

bacteriológicas tradicionales y moleculares basadas en la secuenciación de los

genes ribosómicos 16S. Se espera obtener nuevos microorganismos

celulolíticos como agentes transformadores de la celulosa a residuos más

simples para que sean aprovechados eficientemente en la producción de

etanol.
Marco teórico y Antecedentes

Bioetanol

Biocombustible es el término con el cual se denomina a cualquier tipo de

combustible que derive de la biomasa. Es una fuente renovable de energía, a

diferencia de otros recursos naturales como el petróleo, carbón y los

combustibles nucleares. Dentro de este marco, el bioetanol es un combustible

líquido obtenido a partir de plantas que contienen almidón (maíz, trigo y

mandioca), plantas azucareras

(remolacha y caña) y restos de la

agricultura1,2 (cáscara de trigo, arroz,

cebada, etc).

El bioetanol se utiliza en vehículos

como sustitutivo de la gasolina, bien

como único combustible o en mezclas

que, por razones de miscibilidad entre

ambos productos, no deben sobrepasar

el 5-10% en volumen de etanol en climas fríos y templados, pudiendo llegar a

un 20% en zonas más cálidas. El empleo del etanol como único combustible

debe realizarse en motores específicamente diseñados para el biocombustible.

Dependiendo del método de producción y de la fuente de obtención, es

generalmente aceptado que el bioetanol da una reducción del 70% de CO 2, lo

que significa que 3.5% menos de CO2 en una mezcla al 5%.

Producción de Bioetanol

El bioetanol es producido por fermentación, seguido de destilación y finalmente

de deshidratación. Se obtiene a partir de:

 Almidón o granos de azúcar

 Celulosa siguiendo hidrólisis enzimática

 Celulosa siguiendo hidrólisis química3

Nivel de Factores
Biocombustible Sustrato Microorganismo
producción Limitantes
1. Bacillus 1. Baja
almidón,
lichenformis Billones productividad
granos de
2. S. cerevisiae, litros/año 2. Alto costo del
azúcar
Zymomonas sustrato
1. Trichoderma
1. Bajo
Desechos reesei , 2. S. Producción a
E rendimeinto
celulósicos cerevisiae escala
T 2. Baja tasa de
(a) 3. Recombinant comercial;
A producción
Hidrólisis E.coli ideal para
N 3.Pretratamiento
enzimática 4. Clostridium, cosecha
O necesario
Fusarium
L
Producción a
escala 1. Bajo
Hidrólisis S. cerevisiae, commercial; rendimiento
ácida Zymomonas ideal para 2. Alto costo de
materials de ácidos
desecho
Limitaciones en la
(A partir
Clostridium Desarrollo transferencia de
de síntesis
ljungdalii preliminar masa en el
de gas
bioreactor.

Tabla 1. Producción de etanol según el tipo de sustrato

Producción de Bioetanol a partir de celulosa

La producción de bioetanol se ve favorecida si se emplea a la celulosa como

sustrato4 debido a que esta es uno de los compuestos orgánicos que se

encuentra en mayor proporción en el mundo, obtenidos de desechos de

cosechas y terrenos madereros.

Durante la producción de etanol por hidrólisis enzimática, la celulosa es

convertida primero en glucosa y en otros azúcares fermentables, los que son

convertidos en alcohol usando levaduras. El proceso está basado en los

siguientes tres microorganismos:

 Trichoderma reisei (hongo aeróbico productor de celulasa que convierte

celulosa en glucosa)

 S. cerevisiae fermenta hexosas para producir alcohol

 E.coli recombinate para convertir pentosas en hexosas.

Entonces, la conversión de celulosa en etanol requiere los siguientes pasos:

 Pretratamiento

 Producción de celulasa

 Hidrólisis de celulosa

 Fermentación de hexosas

 Fermentación de pentosas.

Las hexosas son obtenidas de la hidrólisis de celulosa en forma de glucosa y

celobiosa; la digestión de la hemicelulosa da como resultado pentosas.

La biomasa celulósica debe ser pretratada5,6 convenientemente, por ejemplo,

con una breve exposición a altas temperaturas con ácido o con una

descompresión explosiva para hacer que la celulosa este disponible para la

digestión por la celulasa.

Debido a lo poco eficiente del proceso de conversión de material celulósico

(Chen et l., 1994), los costos que representa romper la rígida celulosa para

posteriormente fermentarla y destilarla son elevados. Es por eso que el

bioetanol no es competitivo basado en costos comparado con el petróleo, pero

está siendo usado gracias a los subsidios.

Entonces, las áreas para el mejoramiento adicional, para reducir los costos de

producción son:

 Pretratamiento

 Conversión biológica

La conversión biológica puede ser mejorada por los siguientes logros:

 Haciendo más eficientes a los productores de etanol como las levaduras

y Z. mobilis para aumentar la capacidad de aprovechamiento del

sustrato.

 Incrementando la habilidad de la producción de etanol o encontrando

microorganismos que tengan la habilidad de utilizar celulosa y

hemicelulosa, empleando enzimas celulolíticas.

Las enzimas celulolíticas han sido estudiadas en hongos mesófilos, tales como

Trichoderma reesei7, el cual es usado en la actualidad. Sin embargo su

actividad hidrolítica es afectada por factores físicos y químicos que limitan su

aplicación. Por ello existe la necesidad de aislar cepas8 con mejores

rendimientos en la cantidad de enzimas liberadas al medio extracelular y que

mantengan la cantidad intrínseca de dichas enzimas, además que expresen

una elevada estabilidad de su actividad a diversos rangos de pH, solventes

orgánicos, detergentes iónicos y principalmente la de mantener su actividad

enzimática a diversas temperaturas de reacción.

La celulosa es uno de los compuestos orgánicos que se encuentra en mayor

proporción en el mundo obtenidos de desechos de cosechas y terrenos

madereros, está ampliamente disponible y además representa una fuente de

mucho valor renovable accesible a todas las naciones desarrolladas o en vías

de desarrollo (Haliwel y Haliwel, 1985).

Dado que la composición de la celulosa es muy rica en azúcar, resultaría muy

útil producir bioetanol a partir de la fermentación de celulosa, principal

componente estructural de los materiales vegetales.

- Esa es la razón por la cual es necesario encontrar microorganismos

capaces de utilizar eficientemente la celulosa. Entonces, la hidrólisis

enzimática y la fermentación de celulosa para obtener etanol se

convertiría en una actividad económicamente viable y con alta

rentabilidad.

I) MARCO TEÓRICO

Los camélidos sudamericanos son mamíferos herbívoros que habitan a 4 500

msnm aproximadamemte, a una temperatura media anual de 8ºC. Entre ellos,

la alpaca (Lama pacas) es un recurso genético de gran importancia social,

económica, cultural y científica para el Perú (Wheeter, 1993).

La producción de camélidos sudamericanos se caracteriza por ser de

pastoreo extensivo y por utilizar pasturas con alto contenido de paredes

celulares y por lo tanto poco digestibles. Los rumiantes se alimentan con dietas

a base de materiales vegetales compuestos principalmente de celulosa,

hemicelulosa y lignina.
Los forrajes presentan en su naturaleza física y química, una barrera para su

digestión completa en el rumen. La celulosa comprende de 40% a 50% de la

materia seca y la hemicelulosa de un 20 a 30% de las plantas vasculares 9.

Tabla 2. Composición química de algunos alimentos.

La dieta elevada en fibra

tiene efecto positivo

sobre la población de

hongos del rumen. La

celulosa y hemixelulosa

unidos con pectina y

parte del ácido

poligalacturónico se
Fig. 1 Estructura del forraje
consideran componentes

estructurales que se encuentran en mayor cantidad en las paredes celulares

del forraje 10.

Las pruebas comparativas de digestibilidad in vivo han sido conducidas entre

alpacas y ovinos, así como entre llamas y ovinos. Las digestibilidades en estas

pruebas, en que el alimento suministrado tenía menos de 7,5% de proteína

cruda, fueron mayores y favorables a la alpaca

Tabla 3. Comparación de los coeficientes de digestión (%) entre alpacas y

ovinos en función del nivel de proteína en los alimentos estudiados

Los estudios sobre la composición botánica de la dieta en los CSA señalan que

la alpaca es una especie altamente adaptable, ya que varía su selección de

plantas de acuerdo con la disponibilidad del forraje. Así, cuando la

disponibilidad de gramíneas es alta y la disponibilidad de herbáceas y plantas

parecidas a las gramíneas es limitada, las gramíneas representan la mayor

parte de la dieta. Por otro lado, cuando la disponibilidad de las herbáceas es

alta, las herbáceas son importantes contribuyentes para su dieta.

Fig. 2. Pastoreo de alpacas

Tabla 4. Composición botánica de la dieta (%) por grupo de planta de las dietas

de la alpaca y ovino durante el período de seca y lluvia en un pastizal de

Festuca dolichophylla.

Los herbíboros no pueden sintetizar enzimas que degradan las paredes

celulares de las plantas, dependencia de microorganismos que realizan estas

funciones. (Patterson , 1989).

En el rumen, las condiciones ambientales se encuentran la temperatura que se

mantiene 38-41 ºC, potencial redox -250y -450 mV, reflejándose un medio

fuertemente reducido y ausencia de oxígeno, mantiene un pH entre 5.8 a 6.8.

la composición del gas del rumen es variable pero contiene valores

comprendidos entre 65% de CO2 y un 35% de metano (lin et al., 1985)

La alpaca está provista de mecanismos tamponantes más eficientes que el

ovino. El ovino y la alpaca, a similares concentraciones de ácidos grasos libres,

poseen diferentes valores de pH, siendo el pH de los ovinos más bajo que el de

las alpacas. Este factor permitiría a los camélidos sudamericanos tener una

mayor producción bacterial debido a que las condiciones ácidas incrementan

los requerimientos energéticos de mantenimiento de las bacterias presentes en

el estómago, y además, las bacterias celulolíticas son más sensitivas y tienen

una menor producción a bajos pH 11.

El grado de colonización depende de cada especie microbiana (Mc Allister et

al., 1994) Algunas especies celuloliticas se adhieren íntimamente a la pared

celular de la planta (Fibrobacter succinogenes) otros desarrollan su papel

digestivo en la superficie de la pred celular (Ruminoccocus). Los hongos

ruminales producen hifas los cuales atacan sus substratos y penetran

estructuras resistentes de las plantas. (Bonhome, 1990).

Los hongos que habitan en el rumen son capaces de degradar eficazmente la

celulosa y otros polisacáridos estructurales como hemicelulosa, lignina y

pectina12. Las bacterias y los hongos celulolíticos actúan produciendo

disacáridos y glucosa.

Akin et al (1983) demostraron que la presencia de hongos en el rumen

contribuyen significativamente en el consumo voluntario y la digestión del

alimento fibroso en ovinos.

Los hongos del rumen tienen acceso a los polisacáridos no disponibles por

bacterias celuloliticas,13 lo que significa que pueden penetrar las paredes

celulares de la planta por acción mecánica o enzimática o por una

combinación de ambas. (Kolattukudy, 1985)

Las bacterias celulolíticas rompen la molécula de celulosa, de peso molecular

elevado, en celobiosa y glucosa libre.

Fig. 3 Degradación de celulosa

Degradación de la pared celular

Los hongos producen enzimas hidrolíticas que actúan sobre disacáridos,

oligosacáridos y polisacáridos (Bomeman et al., 1989; Gordon y Philips, 1989;

Barichievich y Calza, 1990).

La digestión de lignocelulosa se relaciona con la producción de estearasas

fungales que fraccionan la lignina de la hemcelulosa cosiderándose como los

responsables de la digestión ariiba del 70% de lignocelulosa de forrajes (Akin

et al., 1990; Bomeman et al., 1990, 1992).

Degradación de celulosa

La celulosa es uno de los componentes más abundantes de la biomasa vegetal

que es degradada por una serie de microorganismos 14 mediante la acción de

enzimas no asociadas en complejos o mediante la formación de un complejo

denominado celulosoma, como es el caso de los clostridios y las bacterias del

rumen. (Murashima et al., 2002; Lynd et al., 2002). Son pocos los hongos que

producen celulasa capaces de degradar la celulosa cristalina, entre ellos se

tiene al género Trichoderma spp y los hongos del rumen.

Características de la fermentación

Las celulasas extracelulares de origen microbiano tienen gran importancia para

la conversión de componentes de celulosa y de componentes de lignocelulosa

hacia azúcares fermentables. Además la actividad específica de las celulasas

sobre celulosa puede dar origen a la producción de glucosa y fermentar a

etanol (Calza, 1990; Wood y Wilson, 1995; Dijkerman et al., 1996).

II) OBJETIVOS

Objetivo general

Obtención de microorganismos con actividad celulolítica aislados de camélidos

sudamericanos para la producción de bioetanol

Objetivo específico

- Aislar los microorganismos en medios específicos a partir de heces de

llama, vicuña, alpaca.

 - Caracterizar los microorganismos mediante pruebas bacteriológicas

tradicionales y moleculares basados en la secuenciación de los genes

ribosómicos 16S.

Determinar el rango de sustratos de las cepas con mayor actividad celulolítica.

III) METODOLOGÍA

Obtención de la muestra

Se utilizarán excremento de alpacas, llamas y vicuñas machos adultos sanos

con un peso aproximado de 55 Kg.

Aislamiento

Tomar 1g de excremento y realizar diluciones seriadas con solución salina,

hasta obtener valores de bacterias viables. Sembrar mediante diseminación

con la espátula de Drigalski en el agar Czapek modificado, previo cambio de la

sacarosa por carboximentil celulosa o celulosa microcristalina al 1%. Incubar

los cultivos en condiciones anaerobias a 37ºC durante 7 días. Se comprobará

la pureza de las cepas aisladas mediante resiembras, las que no excederán de

3, en el medio de cultivo Czapek modificado.

Caracterización

Realización de estudios macroscópicos y microscópicos de las colonias, y de

pruebas bioquímicas y fisiológicas, tales como la prueba de oxidasa, utilización

de sacarosa, lactosa, hidrólisis de almidón, degradación de celulosa

microcristalina y carboximetil celulosa al 1% 15.

Caracterización genotípica a través de la secuenciación de los genes

ribosómicos 16S de las cepas aisladas.

Determinación de la actividad celulolítica

- Determinación cualitativa

Seleccionar las cepas que produzcan mayor cantidad de celulasa, para ello

realizar una tinción con la solución rojo de Congo (0.5%) por 5 minutos y

decolorar con NaCl 1 M.16 La actividad de la enzima se observa por la

presencia de un halo claro alrededor del crecimiento. Sembrar las cepas

seleccionadas en medio Czapeck con papel filtro (0.5%) como única fuente de

carbono. Las cepas con mayor actividad se evaluó su producción en medio

Czapeck con diferentes fuentes de carbono (algodón celulosa y papel filtro).

- Determinación cuantitativa

Inocular 40 x 106 esporas por 100 ml de medio mínimo de Crawford y Mc Coy

(1972) más CMC y lactosa al 1% como inductores y Tween 80 al 0.2%.

Incubar las cepas a baño maría con agitación constante a 37 ºC. Extraer las

muestras a las 72 horas para la determinación de la actividad enzimática de

las celulasas, de proteínas solubles y de biomasa celular15.

Resultados esperados

Se espera encontrar gran diversidad de microorganismos con alta capacidad

celulolítica para la obtención de monosacáridos de fácil uso en la producción de

etanol.

El uso de estos microorganismos en procesos fermentativos generarian nuevas

fuentes de trabajo, ayudaría a proteger el medio ambiente y se revaloraría la

biodiversidad microbiana.
 BIBLIOGRAFÍA

1. Chen Y. et al. Potential of agricultural residues and hay for bioethanol

production. Appl Biochem Biotechnol. 2007 Sep;142(3):276-90

2. Chen Y. et al. Ensiling agricultural residues for bioethanol production. Appl

Biochem Biotechnol. 2007 Oct;143(1):80-92

3. Sassner P. et al. Steam pretreatment of H(2)SO(4)-impregnated Salix for the

production of bioethanol. Bioresour Technol. 2008 Jan;99(1):137-45. Epub 2007

Jan 12

4. Lawford HG, Rousseau JD. Cellulosic fuel ethanol: alternative fermentation

process designs with wild-type and recombinant Zymomonas mobilis. Appl

Biochem Biotechnol. 2003 Spring;105 -108:457-69.

5. Galbe M, Zacchi G. Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient

bioethanol production. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007;108:41-65.

6. Kristensen JB et al. Cell-wall structural changes in wheat straw pretreated

for bioethanol production. Biotechnol Biofuels. 2008 Apr 16;1(1):5

7. Lynd, L. R.; P. J. Weimer, W. H. van Zyly I. S. Pretorius. 2002. Microbial

cellulose utilization:fundamentals and biotechnology. Microb. Mol. Bio. Rev.

66:506-577.

8. Eijsink VG. Et al. Vaaje-Kolstad G et al. Towards new enzymes for biofuels:

lessons from chitinase research. Trends Biotechnol. 2008 May;26(5):228-35.

Epub 2008 Mar 25

9. Wilson , J.R.. Cell wall characteristics in relation to forage digestion by

rumiants J. Agric. Sci. (Camb). 1994, 122-173-182

10. Wilson, J.R. Oragnization of forage plan tissues. In Forage Cell Wall

Structure an digestibility (EdsH. G. Jung D.R. Buxton, R.D. Haltfield & J.

Ralph),Madison: American Society of Agronomy 1993. pp I-32.

11. Olazábal Loaiza Juan P., Franco Febres Francisco, García Vera Wilber,

Pezo Carreón Danilo, San Martín H Felipe. Manual del Técnico Alpaquero

Lima: ITDG LA, 2005. 105 p.

12. Morgavi, D. P., Saturada,. Mizokami, M. Tomita,. Y and Onodera, R. Effects

of rumial protozoo on cellulose degradation and the growth o fan anaerobic

ruminal fungus, piomyces sp, strain OTSI, in vitro. Appl. Environ. Microbiol.

1994.60:3718-3723.

13. Wood, T. M.. Fungal cellulases. In Biosynthesis and Niodegradation of

Cellulose ( ed. C. H. Haigler & P. J. Weimer) 1991499-53. Marcel Dekker: New

York

14. Schell DJ et al. A bioethanol process development unit: initial operating

experiences and results with a corn fiber feedstock. Bioresour Technol. 2004

Jan;91(2):179-88.

15. Ramirez Pablo, Coba Juana María. Degradación enzimática de celulosa por

actinomicetos termófilos: aislamiento, caracterización y determinación de la

actividad celulolítica. Rev. Peru. Biol. (2003).10(1): 67-77

16. Aislamiento Identificación y Selección de Cepas Productoras de Celulasas.

XI Encuentro Científico Internacional de verano ECI 2004v