PRCTICA N1 Y 2 MICROBIOLOGA

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
SIGNATURA DE MICROBIOLOGA MDICA
PRCTICA N 1
MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO
I. OBJETIVO
1. Conocer e identificar correctamente las partes pticas y mecnicas del microscopio compuesto.
2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservacin del microscopio.
II. MATERIALES

Microscopios
Pipeta Pasteur
Lminas portaobjetos
Plumn indeleble
Laminillas cubreobjetos
Papel lente
Lminas coloreadas
Tela de felpa (25 cm)
Suero fisiolgico
Fibra de pelo y lana

PARTE MECANICA
Tubo portalentes y cremallera
Condensador
Tornillos macro y micromtrico
Brazo y Pie
Revlver
Charnela
Platina
PARTE OPTICA
Ocular
Lentes de condensador
Objetivos
Diafragma
Espejo

10

IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO

1. Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revlver y la platina.
2. Sistema de Iluminacin: comprende el foco, condensador y diafragma.
3. Sistema de Ajuste: comprende el macromtrico, micromtrico y cremallera
4. Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x, 15 x, y los objetivos de 4x, 10,
20x, 40, y 100x.

10

PRCTICA N1 Y 2 MICROBIOLOGA

10

PRCTICA N1 Y 2 MICROBIOLOGA

PRCTICA N1 Y 2 MICROBIOLOGA
PRACTICA N 2
METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES. DIFERENCIALES
Y ESPECIALES.
INTRODUCCION
La mayor parte de los colorantes usados en Microbiologa son de tres tipos:
A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromforo) es el anin llamados colorantes
cidos Ej. Eosinato de sodio Eosina.
B) Aquellos cuyo cromforo es el catin llamados colorantes bsicos Ej. Cloruro azul de metileno.
C) Los colorantes neutros, compuestos por bsicos y cidos Ej. Hematoxilina (bsico) Eosina
(cido).
En los trabajos bacteriolgicos generalmente se usan colorantes bsicos como el azul de metileno,
cristal de violeta, fucsina bsica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los colorantes
derivados de la anilina.
Las coloraciones pueden ser segn el nmero de colorantes que utilizan:
A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de
lactofenol
B) Diferenciales: cuando utilizan ms de un colorante como la coloracin de Gram, y Ziehl Neelsen.
C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares
como la coloracin de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora) etc.
A. COLORACIONES SIMPLES
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfologa de los
microorganismos.
MATERIAL

Muestra con mezcla bacteriana

Lminas portaobjetos
Laminillas cubreobjeto
Asa bacteriolgica de Kolle en aro
Colorante Azul de metileno
Colorante Tinta China
Colorante Azul de lactofenol
Mechero de Bunsen
Varillas para coloracin
Aceite de cedro
Xylol
Papel lente
Microscopio de luz con objetivo de inmersin

10

COLORACIN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:

1. Colocar una gota de tinta china sobre la lmina portaobjetos
2. Agregar una gota de la mezcla bacteriana

PRCTICA N1 Y 2 MICROBIOLOGA
3. Cubrir la preparacin con una laminilla cubreobjeto
4. Observar con lente de menor y mayor aumento.
RESULTADO: Observar la capsula en los microorganismos sin teir resaltan sobre un fondo
oscuro. Como la capsula de la levadura Cryptococcus
COLORACIN AZUL DE LACTOFENOL:
1 Colocar una gota del colorante sobre la lmina portaobjetos
2 Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante
3 Cubrir con una laminilla cubreobjeto
4 Observar con lente de menor y mayor aumento
RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul celeste
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje la morfologa de los microorganismos observados
B. COLORACIONES DIFERENCIALES
Son aquellas coloraciones que utilizan ms de un colorante y, generalmente el segundo colorante
es llamado colorante de contraste. Entre los ms usados tenemos la coloracin de Gram y la de
Ziehl Neelsen o tambin llamado cido- alcohol resistente
COLORACION DE GRAM
Es una coloracin diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram
negativas, segn la estructura y composicin de la pared celular. En las Gram negativas, el
peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no estn entrelazadas; en las Gram positivas la
mayora presenta muchas capas de peptidoglucano.
Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff
PROCEDIMIENTO
1. Dividir la lmina en 3 partes: 1/3 para rotular el N de muestra y 2/3 para la preparacin del frotis.
2. Con el asa bacteriolgica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el
centro de la lmina portaobjeto, extendindola en espiral del centro a la periferia, para obtener una
preparacin en capa fina.
3. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la
llama dbil del mechero de Bunsen.
4. Colocar la lmina portaobjetos con la preparacin sobre la varilla de coloracin.
5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, luego agregar 1- 2 gotas de la solucin de
bicarbonato de sodio, dejar actuar por 2 minutos.
6. Lavar con agua corriente (evitar la cada del chorro de agua directamente sobre el frotis)
7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos, lavar luego con agua.
8. Decolorar el frotis con una solucin de alcohol- acetona (inclinar la lmina y decolorar hasta que
no arrastre colorante) mximo por 10 segundos. Luego lavar con agua.
9. Cubrir con el colorante de contraste fucsina bsica durante 30 segundos. Luego lavar con agua.
10. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama dbil del mechero de Bunsen
11. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin.
RESULTADOS
Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color
rosado.
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo realizado en prcticas.

10

PREGUNTAS
QU ES COLORANTE?
Un colorante es una sustancia que es capaz de teir las fibras vegetales y animales. Los
colorantes se han usado desde los tiempos ms remotos, emplendose para ello diversas materias

PRCTICA N1 Y 2 MICROBIOLOGA
procedentes de vegetales (crcuma, ndigo natural, etc.) y de animales (cochinilla, moluscos, etc.)
as como distintos minerales.
En qumica, se llama colorante a la sustancia capaz de absorber determinadas longitudes, son
sustancias que se fijan en otras sustancias y las dotan de color de manera estable ante factores
fsicos/qumicos como por ejemplo: luz, lavados, gentes oxidantes, etc.
Para que un colorante funcione en su estructura qumica ha de tener unos determinados grupos
funcionales denominados cromforo, ("ceder color") que son los que hacen que la molcula
absorba en la regin visible del espectro electromagntico. Un auxocromo ("aumentar color") es un
grupo funcional que por s solo no da color a la molcula, pero que si se encuentra conjugado con
un grupo cromforo aumenta la intensidad del color.
Se da este nombre a sustancias coloreadas, las cuales son capaces de teir las fibras vegetales y
animales. Para que un colorante sea til debe ser capaz de unirse fuertemente a la fibra y por
lavado no debe perder su color. Adems debe ser relativamente estable qumicamente y soportar
bien la accin de la luz.
Denominaciones de los colorantes:
denominacin genrica
denominacin qumica
cdigo del "Colour Index 1924 (1 edicin)
cdigo del "Colour Index 1956 (2 edicin)
cdigo del Schultz
QU TIPOS DE COLORANTE CONOCE?
Clasificacin de los colorantes
Colorantes Sustantivos: Son colorantes que pueden teir directamente las fibras de
algodn.
Colorantes Mordientes: El mordiente es un producto que se adiciona a la fibra y es
absorbido por ella, pudiendo consecutivamente atraer el colorante. Este trmino se usa
principalmente para los colorantes que se adicionan usando xidos metlicos como
mordiente. Especialmente se emplean como mordientes los xidos de aluminio y cromo
por formar precipitados insolubles.
Colorantes a la Tina: Son sustancias insolubles que se pueden reducir a materiales alquilsolubles. El colorante se aplica en su forma reducida y se re-oxida en presencia de la fibra.
Colorantes Directos: Se absorbe directamente por las fibras en soluciones acuosas. Hay
colorantes cidos y bsicos de este tipo. Estos dos tipos de colorantes se emplean
especialmente en el teido de lanas y en poliamidas sintticas.
1. Los colorantes bsicos son sales amnicas o complejos formados por cloruro de cinc o
aminas. Algunos colorantes bsicos, de elevado peso molecular, son absorbidos por el
algodn y el rayn.
2. Los colorantes cidos son sales de los cidos sulfricos o carboxlicos que se precipitan
sobra la fibra.
La familia de los colorantes cidos se llama as, porque en la constitucin qumica del colorante se
encuentran molculas de grupos cidos. Son colorantes solubles en agua y se aplican
generalmente en fibras de lana, nylon y fibras acrlicas. Otros usos importantes son el teido de la
piel y papel.

10

Tipos de colorantes:
cidos:
o En disolucin se cargan negativamente por eso se unen a estructuras cargadas
positivamente y no las clulas, que tienen carga negativa.

PRCTICA N1 Y 2 MICROBIOLOGA

o Sales de Na. K, Ca, in amonio, eosina, rojo congo, rosa bengala, fucsina cida...
Bsicos:
o En disolucin se cargan positivamente unindose a estructuras con carga negativa
como las clulas.
o Cloruros, sulfatos, azul de metileno, cristal violeta, verde malaquita, fucsina
fenicada o carbol-fucsina

Colorantes naturales. Los colorantes naturales son bsicamente histolgicos, encontrndose

entre los empleados con mayor frecuencia, los siguientes:
ndigo: Se obtiene de diversas especie de plantas del genero indigfera que contiene
indican, el cual se fermenta para producir el colorante.
Carmn: Se produce, mediante el tratamiento con alumbre y otras sales metlicas a
hembras del insecto cochinilla "Coccus castis".
Orcena y Tornasol: Se obtiene mediante el procesamiento industrial de lquenes de los
gneros: Le canora tinctoria y Rosella tinctoria.
Hematoxilina: Este colorante se extrae con ter de la madera de un rbol oriundo de
Mxico y de algunos pases suramericanos denominados Hematoxilium campechianum.
Colorantes sintticos. Se obtiene de la anilina, o es ms exactamente del alquitrn de hulla
siendo todos derivados del benceno.
Clasificacin
Los colorantes se clasifican, teniendo en cuenta si la propiedad tintorial se encuentra en el anin o
el catin de su estructura qumica. Sobre esta base se pueden dividir en tres grupos: bsicos,
cidos y neutros.
Colorantes bsicos: La accin colorante est a cargo del catin, mientras que el anin no
tiene esa propiedad, por ejemplo: - cloruro de azul de metileno+.
Colorante cido: Sucede todo lo contrario, la sustancia colorante est a cargo del anin,
mientras que el catin no tiene propiedad, por ejemplo: eosinato- de sodio+
Colorantes neutros: Estn formados simultneamente por soluciones acuosas de
colorantes cido y bsicos, donde el precipitado resultante, soluble exclusivamente en
alcohol, constituye el colorante neutro, que tiene la propiedad tintorial de sus componentes
cidos y bsicos, por ejemplo: la giemsa.
CON QU FINALIDAD SE HACE LA FIJACIN?
El tejido obtenido se coloca en una sustancia fijadora para evitar los cambios post-mortem y para
lograr conservar ("fijar") la forma original del tejido. Unos de los fijadores ms usado es el formol al
10% (formaldehido).En el caso de que se utilice el microscopio electrnico, se
usa glutaraldehdo (para protenas) u osmio (para lpidos).
CUL ES EL FUNDAMENTO DE LA COLORACIN GRAM?
Coloracin de Gram.
En 1884, el dans Hans Chistian Gram, ide un mtodo de coloracin, que es en la actualidad, el
ms empleado en los laboratorios de bacteriologa, mediante el cual, la bacteria sometida a esta
tincin, en dependencia de la composicin qumica de la especie, queda teida de color violeta o
de color rojo.

10

Principios. A pesar de que esta tcnica de coloracin se ha venido empleando desde hace ms de
un siglo, an no se ha podido determinar con exactitud la base molecular de la reaccin, existiendo
controversias al respecto. El criterio ms generalizado es que la violeta y el lugol forman un
complejo que reacciona con los componentes bioqumicos de la pared celular deshidratada,
fijndose en esta. Teniendo en cuenta que la composicin qumica de la pared, no es igual en
todos los gneros, la reaccin resultante ser obviamente diferente, lo que da lugar, que mientras
algunos gneros retienen firmemente el colorante al resultar el complejo impenetrable para el
decolorante, en otros gneros la barrera que se produce es ms permeable, lo que permite al
solvente penetrar y extraer el complejo violeta-lugol, dejando a la bacteria nuevamente incolora.

PRCTICA N1 Y 2 MICROBIOLOGA

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado

en bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su
nombre al bacterilogo dans Christian Gram(1853-1938), que desarroll la tcnica en 1884. Se
utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana, como para poder realizar una
primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose bacterias gram positivas a las
que se visualizan de color morado, y bacterias gram negativas a las que se visualizan de color
rosa, rojo o grosella.
Fundamento tcnico En el primer paso de la coloracin, cuando los microorganismos presentes
en el frotis son expuestos a la accin colorante de la violeta de genciana, todos los gneros que se
encuentran en el frotis se tien de color violeta. Al adicionar el lugol, no se produce ningn cambio
de color, ya que el lugol no es un colorante, sino un mordiente, que se adiciona con el objetivo de
formar un complejo violeta-lugol, para fijar el color en la bacteria. Al adicionar el decolorante
(alcohol etilicio o alcohol acetona) algunos gneros no son afectados por estos solventes,
reteniendo por consiguiente el color violeta aplicado inicialmente, en tanto que otros son
decolorados quedando la bacteria nuevamente incolora. Al echar finalmente la solucin de
safranina (que es de color rojo ) las especies que no fueron decoloradas, mantienen la coloracin
violeta ya que la safrania es un colorante ms dbil que la violeta y su adicin no influye
significativamente en cambio de color, en tanto que los gneros que fueron decolorados por el
alcohol, se tien con la safrina, adquiriendo un color de 199.
Metodologa
Recoger muestras.
Hacer el extendido con un palillo de madera.
Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.
Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado tres veces
aproximadamente).
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar un minuto.
Enjuagar con agua no directamente sobre la muestra
Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente.
Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos segn la concentracin del
reactivo (parte crtica de la coloracin). (las gram - se decoloran, las gram + no)
Enjuagar con agua.
Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar un minuto. Este tinte
dejar de color rosado-rojizo las bacterias gram negativas.
luego lavar levemente con agua
Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersin.
Explicacin
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto gram positivas
como gram negativas) a travs de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por
I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para
solubilizar el yodo, y actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I 2 entra en las clulas y forma un complejo
insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la
misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos gram positivos no se decoloran,
mientras que los gram negativos s lo hacen.

10

Para poner de manifiesto las clulas gram negativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la

PRCTICA N1 Y 2 MICROBIOLOGA
coloracin de contraste las clulas gram negativas son rojas, mientras que las gram positivas
permanecen violetas.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de
contraste que pone de manifiesto las bacterias gram negativas. Al trmino del protocolo, las gram
positivas se vern azul-violceas y las gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de
contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina).
Esta importante coloracin diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este
mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con solucin de uno de los colorantes de
violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de
violeta de metilo y se aade luego una solucin de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que
la anterior; despus se lava el portaobjetos con alcohol hasta que ste no arrastre ms colorante.
Sigue a tal tratamiento una coloracin de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo
Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita.
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un
decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y
toman el segundo.
Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloracin y
retienen la segunda, de gramnegativos. Basndonos pues, en la reaccin gram, podemos clasificar
a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que
mejores resultados dan en la coloracin gram. Los representantes ms usados de este grupo son
violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido
al compuesto tetrametil-p-rosanilina.
El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero de grupos metilo en la
molcula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono ms oscuro es la hexametil-prosanilina (violeta cristal), y el tinte ms ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los
nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al nmero de grupos metilo
contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene
seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teir por el mtodo de
Gram.
La facultad de las clulas para tomar la coloracin gram no es propia de toda sustancia viviente,
sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que las clulas de plantas y
animales superiores no conservan la primera coloracin; los mohos se tien con cierta
irregularidad; los grnulos de micelios propenden retener el colorante. La reaccin de Gram no es
infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quiz por otras
causas.
CUL ES LA INTERPRETACIN DE LAS CRUCES EN EL EXAMEN DE BK?
INFORME DE RESULTADOS.
Negativo:
no
se
observan
BAAR
en
100
campos
observados.
Positivo +: se observan menos de un bacilo por campo en promedio en 100 campos observados.
Positivo ++: se observan de 1 a 10 bacilos por campo en promedio en 50 campos observados.
Positivo +++: Se observan ms de 10 bacilos por campo en promedio en 20 campos observados.
Es necesario encontrar como mnimo 4 BAAR en la Bac para reportarlo positiva, si se encuentran
de 1 a 3 bacilos esta es la conducta a seguir:
1. Ampliar la lectura a 200 campos.

10

2. Si lo anterior no modifica la lectura repetir la Bac.

PRCTICA N1 Y 2 MICROBIOLOGA

3. Si se encuentra la misma cantidad de bacilos (1 a 3) se reporta como negativo poniendo una

nota en el diario de trabajo sobre lo observado.

QU ES EL TRMINO PAUCIBACILAR?

10

Es una infeccin con bajo nivel de bacilos en la expectoracin