Espectrometría de Masas y Análisis de Biomarcadores

4.
Espectrometra de masas y anlisis

de biomarcadores
M. CARMEN MARTN GMEZ 1*,
MILAGROS BALLESTEROS GONZLEZ 2
Seccin Departamental de Qumica Analtica. Facultad de Farmacia.

Universidad Complutense. Madrid.
Departamento de Qumica Analtica e Ingeniera Qumica. Facultad de Farmacia.
Universidad de Alcal. Madrid.
RESUMEN
El descubrimiento, validacin y determinacin de biomarcadores
constituye un objetivo de gran proyeccin debido al potencial que estn
*
Informacin de contacto:
Doctora M. Carmen Martn Gmez.
Seccin Departamental de Qumica Analtica, Facultad de Farmacia. Universidad
Complutense. Madrid.
Telfono: + 34 91 394 17 56. Fax: + 34 91 394 17 54.
e-mail: carmenmg@farm.ucm.es
Abreviaturas: MS, Espectrometra de masas; BM, Biomarcador; m/z, masa/carga;
EI, Ionizacin por impacto de electrones; CI, Ionizacin qumica; PI, Fotoionizacin;
MPI, Ionizacin multifotnica; ESI, Ionizacin por electrospray; LC, Cromatografa de
lquidos (o lquida) HPLC; CE, Electroforesis capilar; LDI, Ionizacin por desorcin
lser; MALDI, Ionizacin por desorcin lser asistida por una matriz; TOF, Analizador
de tiempo de vuelo; MALDI-TOF, Sistema de ionizacin MALDI con un analizador de
tiempo de vuelo; SELDI, Ionizacin por lser inducida en superficie; FAB, Bombardeo
con tomos acelerados; DART, Ionizacin por anlisis directo en tiempo real; IT, Analizador de trampa de iones; LIT, Analizador de trampa de iones lineal; FT-ICR, Analizador de resonancia inica en ciclotrn con transformada de Fourier; Q, Analizador de
cuadrupolo; MS/MS, Espectrometra de masas en tndem; CID, Disociacin inducida por
colisin; SID, Disociacin inducida en superficie; ECD, Disociacin por captura de electrones; ETD, Disociacin por transferencia electrnica; Q-TOF, Analizador de cuadrupo-
113
M. CARMEN MARTN GMEZ y MILAGROS BALLESTEROS GONZLEZ
demostrando para el diagnstico, confirmacin y prevencin de numerosas patologas, pero es necesario disponer de tcnicas analticas que
tengan las prestaciones adecuadas para obtener la informacin necesaria. En este sentido, la espectrometra de masas se revela como una de
las ms tiles. Los parmetros obtenidos con esta tcnica permiten correlacionarlos con aspectos biolgicos relacionados con ciertas enfermedades, patologas metablicas o con la identificacin y estructura de
protenas y pptidos. En este trabajo se ofrece una visin actual de la
espectrometra de masas como una tcnica de eleccin para el estudio
de biomarcadores en el mbito clnico. Se presenta un resumen de los
aspectos bsicos de la tcnica, incidiendo en algunos de los elementos
de los equipos ms utilizados en el mbito de las biomolculas, destacando aplicaciones de la espectrometra de masas para la determinacin
de protenas que pueden utilizarse como biomarcadores, as como las
distintas metodologas ms utilizadas. Todo ello permite demostrar el
enorme potencial de esta tcnica.
Palabras clave: Espectrmetros de masa. Tndem. Acoplamiento.
Clnica. Bioanlisis.
lo-Analizador de tiempo de vuelo; Q-LIT, Analizador de cuadrupolo-Analizador de trampa de iones lineal; TOF-TOF, Analizador de tiempo de vuelo-Analizador de tiempo de
vuelo; Q-Q-Q, Triple cuadrupolo; Q-Q-LIT, Cuadrupolo-cuadrupolo-trampa de iones
lineal; SRM, Control selectivo de reaccin; GC, Cromatografa de gases; HPLC, Cromatografa lquida de alta resolucin; MALDI-TOF-TOF, Maldi/analizador tiempo de
vuelo-Analizador de tiempo de vuelo; GC/MS, Cromatografa de gases/espectrometra
de masas; GG-GC-TOF-MS, Cromatografa de gases bidimensional acoplada a MS con
TOF; APCI, Ionizacin qumica a presin atmosfrica; LC/MS, Cromatografa lquida-Espectometra de lquidos acoplada con espectrometra de masas; LC-ESI-MS, Cromatografa de lquidos-Electrospray-Espectometra de masas; RPLC, Cromatografa de
lquidos en fase inversa; MS2 y MSn, Espectros de orden 2 de orden n; MDLC, Cromatografa de lquidos multidimensional; UPLC, Cromatografa lquida de ultra resolucin; LC/MS/MS, Cromatografa lquida/Espectometra de masas en tndem; LC-ESIMS/MS, Cromatografa lquida -Electrospray-Espectometra de masas en tndem; HPLC/
ESI-MS, Cromatografa lquida-Electrospray-Espectometra de masas; IMS, Espectrometra de movilidad inica; 2DGE, Electroforesis bidimensional en gel; SIM, Control selectivo de iones.
114
ESPECTROMETRA
DE MASAS Y ANLISIS DE BIOMARCADORES
ABSTRACT
Mass spectrometry and analysis of biomarkers
Biomarkers discovery, followed by its validation and characterization, is one of the main objectives within the scientific community.
Clinical biomarkers have demonstrated their benefits not only for the
diagnosis of several pathologies, but also as a screening tool for disease
prevention. In this scenario, technologies yielding appropriate results
become a must, being mass spectrometry among the ones with better
capabilities. Mass spectrometry patterns have resulted in the identification allowed for the determination of peptides and proteins, and the
elucidation of their structures; also, they been correlated with several
disease mechanisms and metabolic pathologies. This review describes
the current position of mass spectrometry as first-line technique for the
study of clinical biomarkers. A small description of the basics behind
mass spectrometry is presented, describing the basic elements of the
equipments used in the biomolecules field. Finally, a special focus on its
application for protein identification describes how mass spectrometry
can be used for biomarkers discovery. In summary, this review describes the potential of mass spectrometry.
Keywords: Mass spectrometer. Tandem. Hyphenated. Clinical. Bioassay.
1.
INTRODUCCIN
La espectrometra de masas (MS) es una tcnica consolidada, que

durante la pasada dcada ha tenido un gran avance en el mbito biolgico
y se est imponiendo en los laboratorios analticos biosanitarios de investigacin o de diagnstico. Ello se debe fundamentalmente al desarrollo de
diferentes metodologas, especialmente la combinacin de tcnicas analticas de separacin, como los mtodos cromatogrficos o la electroforesis, con la espectrometra de masas en sus diferentes modalidades. Las
cualidades de esta tcnica son: su alta especificidad analtica, el amplio
intervalo de aplicabilidad con buena practicabilidad al trabajar con molculas grandes o pequeas, posibilidad de obtener informacin cualitativa
y cuantitativa en una nica prueba as como su flexibilidad que permite
115
disear procedimientos analticos en relativamente poco tiempo, permite

la automatizacin y miniaturizacin del equipo, existiendo ya espectrmetros del tamao de un telfono mvil (1). Si bien presenta limitaciones, es una tcnica imprescindible en mbitos como la Protemica y
ser en un futuro prximo, tcnica de rutina para cualquier laboratorio de
anlisis clnicos.
Con el objetivo de definir, entre otros trminos, un biomarcador (BM)
el US National Institute of Health (NIH) patrocin un grupo de trabajo
acordndose la siguiente definicin (2): Un biomarcador es una caracterstica que se puede medir objetivamente y que se puede evaluar como
un indicador de procesos biolgicos normales, procesos patognicos o
respuestas farmacolgicas a un agente teraputico.
Conviene resaltar las palabras medir objetivamente, lo que nos dirige al anlisis, por lo que la importancia de su determinacin se debe a
que se ha revelado trascendental en aspectos como la deteccin de enfermedades, el establecimiento de la dosis correcta de un frmaco o el
control y seguimiento de una respuesta teraputica individual, identificacin de dianas teraputicas as como agente importante en el descubrimiento de nuevos medicamentos.
Los BM se pueden dividir fundamentalmente en dos tipos: i) marcadores para diagnstico, prognosis o para informacin del estado fisiolgico pero no ligados a la respuesta de un frmaco, ii) marcadores para
determinar el efecto o la respuesta fisiolgica de un frmaco en el laboratorio.
Los fluidos biolgicos contienen un elevado nmero de sustancias,
entre ellas protenas y pptidos, que pueden estar modificndose en
funcin del tiempo o en distintas circunstancias, por lo que el reto para
la bsqueda de un biomarcador consiste en aislarlo de la matriz compleja en la que se encuentra, as como establecer sus caractersticas y diferenciar el biomarcador en estado de salud o enfermedad. La bsqueda
de una molcula que pueda utilizarse como biomarcador consiste en
buscar compuestos, como protenas, que muestren diferentes caractersticas (abundancia, alguna modificacin, etc.) entre un control en estado
de salud y el espcimen enfermo. Actualmente algunos biomarcadores
se utilizan rutinariamente en clnica para el diagnstico de enfermedades
que se determinan en suero u orina mediante tcnicas como la espectro116
ESPECTROMETRA
fotometra ultravioleta-visible, fluorescencia, fotometra de llama o mtodos inmunoanalticos. Estas tcnicas, siempre que es posible, se incorporan en procesos analticos con mtodos automatizados para trabajar
con autoanalizadores, utilizando en la etapa de preparacin de la muestra reactivos o kits aprobados por la autoridad competente. En la investigacin de nuevos BM hay que analizar cientos de sueros, orinas o
tejidos humanos. Se utilizan especmenes animales para poderlo comprobar en el animal, como por ejemplo ratones modelo para cncer de
mama, y posteriormente confirmar los resultados en humanos.
Recientemente se ha reconocido y aceptado la utilidad de los biomarcadores en el descubrimiento y desarrollo de nuevos frmacos (3-5).
La correcta utilizacin de los biomarcadores en las etapas preclnicas y
clnicas, reduce el tiempo de llegada de un frmaco al mercado y permite eliminar compuestos no adecuados antes de pasar a la Fase III de los
ensayos clnicos lo que disminuye el coste econmico. Se aplican para
la determinacin de su eficacia as como para la estratificacin de la
poblacin mediante estudios farmacocinticos y farmacodinmicos, comprobando la seguridad del medicamento por lo que la validacin de
nuevos biomarcadores en el descubrimiento de frmacos, es un campo
del mayor inters sanitario.
La determinacin ideal de un biomarcador debe ser rpida, fcil de
realizar incluyendo parmetros de calidad como la mxima sensibilidad
y especificidad. Su interpretacin debe conseguir detectar la enfermedad,
medir e identificar su progreso as como permitir la monitorizacin de la
respuesta teraputica. Es deseable que la determinacin del biomarcador
se pueda realizar en un espcimen de fcil obtencin e incluso se pueda
monitorizar a travs de un mtodo no invasivo. Es beneficioso que el
mtodo se pueda aplicar a un nmero elevado de muestras, con un coste
razonable y utilizando equipos instrumentales accesibles a laboratorios de
tipo medio. Todo lo anterior no siempre es factible.
La bibliografa especializada sobre el tema es extensa y de ella se
deduce que la espectrometra de masas es la tcnica de eleccin para la
bsqueda e identificacin de biomarcadores en el mbito clnico, por lo
que en este trabajo se pretende dar una visin actual de la espectrometra
de masas en la bsqueda e identificacin de biomarcadores en el campo
clnico, presentando un resumen de los aspectos bsicos de la tcnica,
incidiendo en algunos de los elementos de los equipos ms utilizados en
117
el estudio de biomolculas y destacando los aspectos ms relevantes de

la espectrometra de masas para la determinacin de protenas que puedan utilizarse como BM, as como las metodologas ms utilizadas, todo
ello permitir demostrar el enorme potencial de esta tcnica.
2.
ESPECTROMETRA DE MASAS
La espectrometra de masas es una tcnica analtica en la que los

tomos o molculas de una muestra son ionizados, con mayor frecuencia positivamente, separados por su relacin masa/carga (m/z) y posteriormente detectados y registrados.
La importancia y proyeccin de la MS es debida a su potencial analtico. Las ventajas de esta tcnica se pueden resumir en los siguientes aspectos: proporciona una insuperable especificidad en la determinacin del peso molecular debido a la posibilidad de medir exactamente
su masa molecular as como obtener informacin a partir de los fragmentos inicos de un analito. Su sensibilidad es muy elevada y en teora, la
MS permite detectar una nica molcula. Se ha demostrado la deteccin de molculas en cantidades de attomoles (1018 moles) y femtomoles
(1015 moles). Es muy verstil, ya que permite determinar la estructura de
tipos de compuestos muy diversos. Es aplicable a los elementos y a todo
tipo de muestras, voltiles, no voltiles, polares y apolares, slidos, lquidos y gases. En combinacin con tcnicas de separacin de alta resolucin, es la ms cualificada para analizar muestras complejas reales.
El anlisis por espectrometra de masas se realiza en cuatro etapas
bsicas:
118
1.
Introduccin de la muestra.
2.
Ionizacin de la muestra, en la que se transforman los tomos

o molculas en especies inicas en fase gaseosa, con la consiguiente prdida de electrones o protones.
3.
Separacin y el anlisis de los iones moleculares y de los fragmentos cargados producidos segn su relacin m/z.
4.
Finalmente, se obtiene el espectro de masas, en el que se presenta la abundancia relativa de los iones y fragmentos separados respecto a la relacin masa/carga.
ESPECTROMETRA
Los espectrmetros de masas se componen de unos elementos bsicos como son: un sistema de introduccin de la muestra - sistema de
ionizacin - analizador de masas - detector - sistema de vaco - sistema
de adquisicin y tratamiento de los datos. En la Figura 1 se presenta un
esquema de los componentes bsicos y en Tabla 1.I se resumen los
componentes de los diferentes equipos instrumentales.
FIGURA 1.
Esquema de un espectrmetro de masas.
TABLA 1.
I.
COMPONENTES DE LOS ESPECTRMETROS
1.
Sistemas de introduccin de la muestra:
1.
1.
1.1.
1.2.
2.
Sistemas de ionizacin:
1.
2.1.
Sistemas de ionizacin en fase gaseosa:
1.
1.
1.
2.1.
2.1.
2.1.
2.1.a. EI: Ionizacin por impacto de electrones.

2.1.b. CI: Ionizacin qumica.
2.1.c. PI: Fotoionizacin.
Sistemas directos e indirectos.

Sistemas en espectrmetros acoplados a tcnicas de separacin (LC, GC, CE...).
119

2.
2.2.
Sistemas o fuentes de desorcin:
1.
1.
2.1.
2.1.
2.2.a. ESI: Ionizacin por electrospray.

2.2.b. LDI: Ionizacin por desorcin lser:
1.
1.
2.1.
2.1.
2.2.b.1. MALDI: Ionizacin por desorcin lser asistida por una matriz.
2.2.b.2. SELDI: Ionizacin por lser inducida en superficie.
1.
1.
2.1.
2.1.
2.2.c. FAB: Bombardeo con tomos acelerados.

2.2.d. DART Ionizacin por anlisis directo en tiempo real.
3.
Analizadores:
3.
3.
3.
3.
3.
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.
4.
Detectores:
3.
3.
4.1.
4.2.
II.
MODALIDADES Y OPERACIONES EN ESPECTROMETRA DE MASAS
TOF: De tiempo de vuelo.

IT: Trampa de iones.
FT-ICR: Resonancia inica ciclotrnica de iones, con transformada de Fourier.
Orbitrap.
Q: Cuadrupolo.
Fotomultiplicadores.
Copa de Faraday.
II. a) Espectrometra de masas en tndem.

II. b) Acoplamiento de la espectrometra de masas con tcnicas de separacin
II. b) (hyphenated methods).
El espectro resultante es un grfico que representa la abundancia

relativa de los iones producidos (% de abundancia relativa de los iones
producidos) respecto de su relacin masa/carga (m/z). La seal correspondiente a un in aparece en forma de varios picos que corresponden
a la distribucin estadstica de los distintos istopos del in. La informacin obtenida por espectrometra de masas es esencialmente cualitativa, como es la determinacin de masa molecular o la informacin
sobre la estructura a partir de los fragmentos obtenidos, pero tambin
se pueden realizar anlisis cuantitativos utilizando patrones internos o
externos con lmites de deteccin desde picomoles a femtomoles. El in
molecular (M+) brinda la informacin ms valiosa en el espectro de
masas. Su masa y composicin elemental indican las fronteras dentro
de las cuales se tienen que encontrar los fragmentos estructurales que se
detecten en el espectro de masas.
Las caractersticas de los espectrmetros de masas en trminos de
poder de resolucin, sensibilidad y exactitud en la medida de la masa,
120
ESPECTROMETRA
dependen del tipo de instrumento, del mtodo de ionizacin y de su

capacidad para aplicar el barrido de potencial. Ningn instrumento proporciona simultneamente las mejores prestaciones y su comparacin es
un aspecto controvertido, porque depende del tipo de aplicacin de la
muestra a analizar.
En todo caso, hay que tener en cuenta que existen diferencias considerables entre las prestaciones obtenidas con un instrumento que trabaja en condiciones ptimas (generalmente las que proporciona la casa
comercial) o cuando lo hace en rutina.
2.1.
Sistemas de introduccin de la muestra
Los espectrmetros de masas ms modernos estn equipados con

diversos sistemas de entrada capaces de adaptarse a las distintas muestras. Pueden ser: sistemas de entrada indirectos en los cuales la muestra
se volatiliza externamente y se introduce en la regin de ionizacin.
Sistemas por sonda directa utilizados para la introduccin directa de
lquidos y slidos no voltiles, permiten trabajar con pequeas cantidades de muestras. Sistemas especiales para la introduccin de muestras
en espectrmetros acoplados a tcnicas de separacin como cromatografa de lquidos o electroforesis capilar.
2.2.
Sistemas de ionizacin
La ionizacin de un analito es una etapa crucial en el anlisis de

cualquier compuesto por MS y lo corrobora el hecho de que los trabajos
relacionados con dos metodologas para obtencin de iones en muestras
complejas (MALDI y ESI) hayan sido merecedores de dos premios
Nobel.
Existe una amplia variedad de mtodos, pero ninguno de ellos es
universal. La eleccin del tipo de ionizacin viene determinada por
la naturaleza de la muestra y la clase de informacin que se desea
obtener. El aspecto de los espectros de masas obtenidos para diferentes
especies moleculares depende en gran medida del sistema de ionizacin
utilizado.
121
Los sistemas de ionizacin o fuentes de ionizacin tienen diferente

fundamento y pueden ser: de ionizacin en fase gaseosa o de ionizacin
por desorcin, en el primer caso, la muestra se volatiliza y posteriormente se ioniza, estas fuentes se utilizan para compuestos trmicamente estables y de pesos moleculares menores de aproximadamente 103 daltons. En
el segundo caso, ionizacin por desorcin, la muestra se transforma directamente en iones gaseosos, estos sistemas son aplicables a muestras no
voltiles y trmicamente inestables. Asimismo, son vlidas para molculas que tienen pesos moleculares mayores de 105 daltons. Estas ltimas
son las de mayor aplicacin en el mbito de los biomarcadores, objeto del
presente estudio, por lo que se les dedicar mayor atencin.
Hay sistemas de ionizacin en los que se comunica a las molculas
suficiente energa como para que alcancen un estado altamente excitado;
la posterior relajacin implica la rotura de determinadas uniones, producindose fragmentos de iones con una relacin m/z menor que la del in
molecular. Otros sistemas de ionizacin aportan la energa suficiente
como para que la molcula se ionice sin que se produzca apenas fragmentacin, obtenindose un espectro de masas ms sencillo en el que
aparece fundamentalmente un pico que corresponde al in molecular.
2.2.1.
Sistemas de ionizacin en fase gaseosa
2.2.1.a. EI: Ionizacin por impacto de electrones

Es un proceso en el que la muestra, previamente vaporizada, se
somete a un bombardeo mediante electrones acelerados que chocan con
las molculas provocando su ionizacin. La elevada energa cintica de
los electrones acelerados y su pequea masa proporcionan a las molculas con las que impactan, una energa que provoca una elevada fragmentacin dando lugar a un gran nmero de iones positivos que pueden
tener mayor o menor masa que la del in molecular.
2.2.1.b. CI: Ionizacin qumica
Las molculas de la muestra en fase gaseosa se ionizan al colisionar
con los iones producidos al bombardear un gas reactivo con electrones.
122
ESPECTROMETRA
Es clave el gas elegido para provocar la ionizacin del analito y hay que
considerar la diferente afinidad hacia los protones, tanto del gas elegido
como del analito. La ionizacin qumica permite obtener informacin
sobre la masa molecular de compuestos con un lmite de masas de 1.000
daltons pero, como sucede con la ionizacin por impacto de electrones,
los compuestos no voltiles, no se pueden analizar con este mtodo, ni
tampoco muchos compuestos con grupos funcionales polares. Otra limitacin, es la falta de informacin estructural de los espectros de masas
obtenidos por ionizacin qumica.
Existen otras modalidades de ionizacin qumica interesantes como
son la ionizacin qumica con intercambio de carga, que presenta como
ventaja el conseguir una mayor fragmentacin que con la CI. La ionizacin qumica con iones negativos se utiliza para generar iones negativos de compuestos voltiles.
2.2.1.c. PI: Fotoionizacin
Sistema de ionizacin para molculas pequeas. Se produce la ionizacin cuando una molcula en estado gaseoso es irradiada con un haz
de fotones de energa conocida, utilizando un haz de radiacin procedente de una lmpara ultravioleta, una lmpara de deuterio o un lser
excmero. Una condicin bsica para poder utilizar la fotoionizacin, es
que la molcula del analito tiene que estar en fase gaseosa, las muestras
slidas deben someterse a un proceso de desorcin o vaporizacin previo a la PI. La fotoionizacin es un sistema de elevada sensibilidad, se
puede utilizar una radiacin determinada y conocida, lo cual produce
una ionizacin controlada de la forma que se desea. Se pueden utilizar
fuentes lser de fotones de distintas longitudes de onda, que se emplean
para una ionizacin en distintas etapas que se conoce como ionizacin
multifotnica (MPI).
2.2.2.
Sistemas o fuentes de desorcin
En la ionizacin por desorcin, la muestra se transforma directamente en iones gaseosos; su aplicacin es para muestras no voltiles y
trmicamente inestables.
123
Se ha comentado que son las fuentes de mayor aplicacin en el

mbito de los biomarcadores y para molculas biolgicas en general, lo
que determina su inters.
2.2.2.a. ESI: Ionizacin por electrospray
El desarrollo de ESI dio lugar a que John Fenn obtuviera el premio
Nobel en Qumica en 2002 for the development of soft desorption
ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules (electrospray).
Es una ionizacin a presin atmosfrica que se aplica a un amplio
grupo de muestras y especialmente se utiliza para la caracterizacin de
biomolculas. En la ionizacin por electrospray, la muestra disuelta en
un disolvente adecuado pasa a travs de un capilar metlico, en cuya
punta se aplica un potencial de 3 a 4 KV y una presin de 1 atmsfera.
Se produce una fina niebla de gotas de elevada carga y la evaporacin
del solvente hace que aumente la densidad de carga, producindose la
desorcin en fase gaseosa Figura 2.
El anlisis por ESI, se puede hacer provocando una ionizacin positiva o negativa. Se selecciona la polaridad de los iones que se desea
analizar mediante el voltaje del capilar. Permite la obtencin del in
FIGURA 2.
124
Esquema de un sistema de ionizacin ESI: electrospray.
ESPECTROMETRA
molecular, y si se desea obtener una fragmentacin, se puede inducir

aumentando el voltaje en la punta del cono del capilar. Este proceso se
utiliza con frecuencia en espectrometra de masas en tndem. La ESI de
especies polimricas, proporciona espectros que contienen una serie
de mltiples iones cargados del siguiente tipo: [M+ nH]n+ y [MnH]n. En
muchos casos, se pueden determinar masas moleculares de macromolculas con una precisin de 0,005%.
La ionizacin por electrospray constituye la mejor interfaz cuando
se acopla la cromatografa de lquidos (LC) o la electroforesis capilar
(CE) con MS.
NanoESI: Ionizacin por nanoelectrospray. Es una versin miniaturizada de un sistema de ionizacin por electrospray convencional que
permite operar con un flujo del orden de microlitros.
Existen algunas diferencias desde el punto de vista prctico. En un
nanoESI se utiliza un capilar recubierto de oro de un dimetro de 1 a
3 m, frente a los 100 m que tienen los capilares utilizados en un ESI
convencional. En segundo lugar, el voltaje aplicado para que se produzca la ionizacin de la muestra es mucho ms bajo, entre 500 y 800 V.
Otra diferencia es que no es necesario un sistema de bombeo externo
para mantener un flujo constante. La velocidad de desorcin de los iones
en las pequeas gotas es mucho mayor que en las gotas grandes, por eso
en el sistema de nanoESI, se incrementa la sensibilidad en varios rdenes de magnitud con respecto al sistema ESI convencional.
2.2.2.b.
Ionizacin por desorcin con lser
En las primeras aplicaciones se utiliz un haz de radiacin lser para

irradiar la muestra y producir los iones. En este modo directo de ionizacin, denominado ionizacin por desorcin con lser (LDI: lser desortion/ionization) era difcilmente controlable la cantidad de energa
transferida, provocando una degradacin de la muestra por un exceso
de calentamiento, adems no todos los compuestos son capaces de absorber a la longitud de onda del lser y en consecuencia, no se produca
la ionizacin.
125
2.2.2.b.1.
2.2.2.b.1.
MALDI: Ionizacin por desorcin con lser asistida

por una matriz
El desarrollo de este sistema de desorcin se realiz por dos grupos

de investigacin siendo merecedor del Premio Nobel en 2002 Koichi
Tanaka, compartido con John Fenn. Ha significado una revolucin para
el estudio de biopolmeros, ya que ha permitido el anlisis de protenas
y otras biomolculas cuyas masas exceden los 200 Kdalton, con una
sensibilidad de varios rdenes de magnitud.
El sistema MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization) se
realiza mediante una radiacin lser y con el concurso de una matriz
adecuada. Se opera mezclando una disolucin de la muestra con una
sustancia matriz que se encuentra en mucha mayor proporcin que la
muestra (10.000:1); la mezcla se deposita en un dispositivo portamuestras especialmente diseado para este sistema de ionizacin. Tras la
evaporacin del disolvente, los cristales de la mezcla muestra-matriz se
irradian con un haz lser de elevada potencia (106 Wcm2) y de pulsos
cortos durante algunos nanosegundos que desorben e ionizan las molculas de la muestra y la matriz, mantenindolas en fase gaseosa (Figura 3). La clave del xito del MALDI, se debe a que la matriz es capaz
de absorber gran cantidad de energa a la longitud de onda del lser y
FIGURA 3. Esquema de un sistema de ionizacin MALDI: desorcin con lser, asistida por
una matriz.
126
ESPECTROMETRA
posteriormente sufre una relajacin, cediendo la energa emitida a las

molculas de la muestra de una forma controlada, de manera que permite la desorcin de las molculas quedando como iones intactos en
fase gaseosa. Se utilizan diferentes tipos de matrices dependiendo de las
aplicaciones y de la naturaleza del analito: matrices orgnicas slidas y
lquidas, lquidos inicos y materiales inorgnicos.
La matriz utilizada en el sistema MALDI, juega un papel muy importante en el proceso de ionizacin de la muestra y tiene dos misiones, la
primera es absorber el fotn de energa procedente del haz lser, la segunda acta como un disolvente del analito reduciendo las fuerzas intermoleculares y disminuyendo la agregacin de molculas de analito al
mnimo. Los iones generados mediante MALDI son mayoritariamente
molculas protonadas con una sola carga, tambin se forman iones oligomricos protonados con doble y triple carga. Adems, se forman aductos
de las molculas de la muestra con Na+ y K+, especialmente en muestras
de origen biolgico. Se pueden formar iones con carga negativa.
Una matriz debe tener las siguientes caractersticas: fuerte absorcin
de radiacin a la longitud de onda del lser. Buena capacidad de mezcla
con el analito, para que se formen unos microcristales bien definidos.
Una baja temperatura de sublimacin que permita la formacin de forma
instantnea de un conjunto matriz-muestra durante la duracin del pulso
de lser. Participacin en algn tipo de reaccin fotoqumica, que permita que las molculas de la muestra puedan protonarse o desprotonarse
con una elevada eficacia.
Un aspecto crtico que hay que considerar es la preparacin de la
muestra, tratando de evitar la posibilidad de que se produzca una disgregacin entre las molculas del analito y la matriz durante el proceso de
cocristalizacin, lo que conlleva que la preparacin no sea homognea,
dando lugar a una seal inadecuada en el analizador.
El mecanismo por el que se produce la ionizacin MALDI no es
todava bien conocido. Se proponen tres mecanismos para explicarlo (6), el primero corresponde a un modelo de ionizacin fotoqumico,
el segundo a un modelo de ionizacin cluster y el tercero propone un
modelo de transferencia pseudoprotnica. En el modelo de ionizacin
fotoqumica, los iones de la matriz se producen por un proceso de ionizacin multifotnica y colisin, los iones de las biomolculas, a su vez,
se producen por la protonacin o desprotonacin entre los iones de la
127
matriz y las biomolculas durante un proceso de colisin en fase gaseosa. En el modelo que propone una ionizacin cluster (asociaciones
entre iones de muestra y molculas del disolvente) se considera que la
radiacin lser provoca la desorcin de los cluster, lo que hace que se
produzcan los iones de las biomolculas por desolvatacin de las molculas de la matriz. En el modelo que propone una pseudotransferencia
de protones, los iones de biomolculas se produciran durante un proceso de cocristalizacin de la matriz, tras la absorcin de la radiacin
lser. Actualmente se sigue investigando sobre el mecanismo de ionizacin para mejorar el anlisis de biomolculas por MS.
Dado que el haz de radiacin lser es pulsante, el sistema MALDI es
muy adecuado para utilizar un analizador de tiempo de vuelo (TOF) y a
este equipo se le denomina MALDI-TOF. Se comentar posteriormente.
2.2.2.b.2.
2.2.2.b.2.
SELDI: Ionizacin por desorcin con lser inducida

en superficie
SELDI (surface enhanced laser desorption ionization) es una modalidad de desorcin que supone una alternativa al MALDI. Un analito o un
grupo de analitos se fijan sobre la superficie de los pocillos situados en
un chip en los que se ha dispuesto una fase slida. Se pueden fijar por
adsorcin, reparto, interacciones electrostticas o afinidad; posteriormente la superficie slida se cubre con una sustancia que acta de matriz y se
somete a un proceso igual que en MALDI. En los pocillos se pueden
inmovilizar anticuerpos, receptores de DNA u otras sustancias que muestren gran afinidad para determinados pptidos de la muestra.
Mientras el SELDI-MS se utiliza para el anlisis de protenas de
elevado peso molecular, MALDI-MS se aplica a protenas y pptidos de
menor peso molecular.
2.2.2.c.
FAB: Bombardeo con tomos acelerados
Este sistema de ionizacin es til para el estudio de especies polares

de elevado peso molecular. La muestra disuelta en un lquido inerte,
polar y relativamente poco voltil, como por ejemplo glicerol que acta
128
ESPECTROMETRA
como matriz, se bombardea con un haz de tomos o iones de elevada

energa (varios KeV). Los iones positivos y negativos del analito son
expulsados de la superficie de la muestra por un proceso de desorcin;
este tratamiento reduce la fragmentacin. Aunque la matriz ms utilizada es el glicerol, se pueden usar trietanolamina, dietanolamina o 3-nitrobencil alcohol entre otros.
2.2.2.d.
DART: Ionizacin por anlisis directo en tiempo real
Es una nueva tcnica de ionizacin a presin atmosfrica en la que

un haz formado por iones de tomos de helio, producidos mediante
descarga elctrica, se enfoca hacia la muestra. Las especies ionizadas
de la muestra se analizan en el espectrmetro a presin atmosfrica, el
proceso por el que produce la ionizacin positiva, se debe a una transferencia de protones.
Sirve para slidos, lquidos y gases, colocando la muestra entre el
sistema DART y el analizador sin necesidad de un pretratamiento o uso
de disolventes. Este sistema de ionizacin se puede utilizar para compuestos orgnicos y biomolculas entre otros.
2.3.
Analizadores
El analizador de masas constituye el corazn de un espectrmetro de

masas, su funcionamiento y prestaciones dependen en gran medida de
su diseo. El analizador tiene dos misiones fundamentales: separar los
iones en funcin de su relacin m/z y enfocar los iones separados hacia
un determinado punto. El movimiento de las partculas cargadas permite
distinguir unas de otras en funcin de la energa cintica de cada in, de
la velocidad o del momento de fuerzas. Los distintos analizadores aprovechan alguna o varias de estas propiedades para separar los iones de
distintas masas.
Existen diferentes tipos de analizadores, los ms utilizados son los de
sector magntico, de cuadrupolo, de trampa de iones, trampa de iones
lineal, de tiempo de vuelo, de resonancia inica en ciclotrn o analizadores Orbitrap. Su eleccin se realiza en funcin de su resolucin, del inter129
valo de masas que permite separar, de la exactitud de las masas que es

capaz de separar, del intervalo dinmico lineal, de la velocidad de barrido, de la sensibilidad, de la eficacia y de su adaptabilidad, entendindola
como la posibilidad de poder utilizar distintos modos de ionizacin.
En muchas ocasiones no es posible disponer de un analizador que d
respuesta a las expectativas analticas requeridas para muestras complejas, en ese caso, hay que recurrir al acoplamiento de dos analizadores
para conseguir los resultados requeridos.
Los analizadores ms utilizados para el anlisis de biomolculas
son:
2.3.1.
TOF: Analizador de tiempo de vuelo
Es uno de los analizadores ms sencillos, pero actualmente tiene una

gran presencia en los laboratorios. El principio de los espectrmetros de
tiempo de vuelo (time of flight) se basa en la relacin entre la masa y
la velocidad de los iones. Se mide el tiempo que necesitan los iones
acelerados para recorrer una distancia (L), que depende de las caractersticas del instrumento, sin que los iones estn sometidos a un campo
elctrico y/o magntico (Figura 4).
Las prestaciones del TOF son especialmente interesantes, sobre todo
en cunto a la resolucin y la exactitud en la determinacin de la masa
ya que se consiguen valores inferiores a partes por milln.
Se han incorporado algunos elementos en el instrumento como son
unos espejos electrostticos denominados reflectrn para aumentar la
resolucin y mejorar la separacin de los haces de iones.
Los equipos MALDI-TOF son muy utilizados para el anlisis de
biomolculas, siendo sus principales ventajas:
Anlisis muy rpidos, algunos instrumentos que se encuentran
en el mercado pueden procesar cien muestras en menos de diez
minutos.
Permite la determinacin de masas en un amplio intervalo, se
pueden medir desde pptidos de pequea masa hasta protenas
mayores de 100.000 Dalton (Da).
130
ESPECTROMETRA
FIGURA 4.
Esquemas de diversos analizadores.
Se obtienen espectros de masas sencillos, debido a que la mayora de los iones tienen una carga nica, slo un pequeo porcentaje es de doble carga y rara vez se observan iones de triple
carga.
Posibilidad de obtener una imagen espacial molecular o incluso
de un tejido, debido a que el haz de radiacin lser se puede
enfocar en un pocillo muy estrecho (5 m). Tambin depende de
las lentes focalizadoras utilizadas en el equipo MALDI-TOF.
Una sensibilidad muy elevada que puede llegar a detectar cantidades del orden de atomoles de pptidos de pequeo tamao.
131
Las limitaciones del MALDI-TOF tambin existen y se pueden resumir en las siguientes:
Baja reproducibilidad debido a la dificultad para controlar el
proceso de cristalizacin y la produccin de iones debido a la
fuerte influencia del lser.
Una relativamente baja resolucin para la determinacin de las
masas, debido a que la energa de las biomolculas se dispersa
durante el proceso de desorcin, as como, a la posible unin a
la matriz y a la posible fragmentacin de la biomolcula.
2.3.2.
IT: Analizador de trampa de iones
Es un analizador de masas muy ampliamente utilizado. Consta de un

electrodo que constituye un anillo central y dos electrodos colectores, la
separacin de los iones se produce almacenando los iones en el espacio
central y manipulando su movimiento en el tiempo, en lugar de hacerlo
en el espacio. El campo se crea aplicando un sistema de radiofrecuencias al anillo central. Los iones del analito procedentes de la fuente de
ionizacin penetran a travs de una rejilla en el electrodo colector y
segn su m/z y el campo aplicado, circulan en una rbita estable o se
desestabilizan pasando al detector (Figura 4).
Los instrumentos de IT se caracterizan por tener una elevada sensibilidad y obtener una rpida adquisicin de datos, sin embargo, los
analizadores IT tienen una resolucin limitada y una relativamente baja
capacidad de atrapar iones, ello ha conducido al desarrollo del analizador de trampa de iones lineal (LIT) con elevada capacidad de atrapamiento de iones lo que ha mejorado el rango dinmico y la sensibilidad
de esa tcnica. El LIT ha desplazado al cuadrupolo clsico. Actualmente
los instrumentos LIT, disponen de elementos que les permiten mejorar
la resolucin.
2.3.3.
2.3.3.
FT-ICR: Analizador de resonancia inica en ciclotrn

con transformada de Fourier
Es un analizador que dispone de una celda de trampa de iones como

elemento principal, estas celdas estn diseadas aprovechando el fen132
ESPECTROMETRA
meno de resonancia inica en ciclotrn. El desarrollo y comercializacin

de los espectrmetros de resonancia inica en ciclotrn con transformada de Fourier, con una fuente de ionizacin externa, representa un hito
importante en cuanto a su poder de resolucin y a la exactitud de la
masa determinada.
Se pueden obtener medidas por debajo de g/L. La elevada resolucin de este analizador, no slo es a causa de la mejor calidad de los
datos, sino que permite obtener mayor nmero de picos, por lo que se
pueden obtener ms seales que con otros analizadores de menor poder
de resolucin.
El desarrollo de instrumentos hbridos (acoplados) FT-ICR con un
LIT externo, proporciona mayor robustez al equipo.
2.3.4.
Analizador Orbitrap
Recientemente, se ha comercializado un nuevo tipo de analizador

denominado Orbitrap, es el primer analizador que aparece en el mercado en tres dcadas y est basado en un nuevo principio fsico: la
separacin de los iones en un campo elctrico oscilante. Este instrumento, presenta unas prestaciones similares a un espectrmetro FT-ICR, en
trminos de resolucin y exactitud de la masa, pero sin necesidad de
incorporar un magneto superconductor de elevado coste.
2.3.5.
Q: Analizador de cuadrupolo
El analizador de cuadrpolo, muy utilizado en espectrometra de

masas en tndem, consiste en cuatro barras paralelas, separadas entre
ellas, a las que se aplica un potencial de corriente continua, sobre el que
se superpone un potencial de radiofrecuencia Figura 4. Los iones atraviesan el interior de las barras y el campo creado en ellas acta a modo
de filtro, determinando qu iones alcanzarn el detector. Slo algunos
iones alcanzarn el detector dependiendo del campo de radiofrecuencia
aplicado as como de su relacin m/z. El analizador de cuadrupolo es
uno de los ms extendidos, por su relativa sencillez y ser muy adecuado
para ser acoplado a interfases de cualquier tipo, incluida la ESI, para el
133
anlisis de protenas y biomolculas, as como por su bajo coste. Sus

limitaciones se concretan en su intervalo de trabajo, en la imposibilidad
de realizar anlisis de alta resolucin, y en la dificultad para la determinacin exacta de las masas.
2.4.
Detectores
Los detectores proporcionan informacin sobre el flujo de iones o la

abundancia de iones que salen del analizador de masas. Convierten el
chorro de iones en una seal elctrica que puede ser amplificada, almacenada y presentada mediante el sistema de tratamiento de datos de
forma que se pueda interpretar. Sus caractersticas ms importantes son
sensibilidad, exactitud, resolucin, tiempo de respuesta, estabilidad,
amplio intervalo dinmico y un nivel de ruido bajo. Se utilizan detectores del tipo de fotomultiplicadores, Copa de Faraday y otros.
Debido a la cantidad de informacin que se genera y a los cuantiosos parmetros que se pueden modificar en cada experiencia, se necesita
un sistema informtico para el control del equipo, as como para la
adquisicin, almacenado y presentacin de espectros. Se incluyen software para la interpretacin de espectros e identificacin de compuestos
mediante la utilizacin, en lnea, de bibliotecas de espectros. Tambin
permiten el anlisis cuantitativo.
3.
3.
MODALIDADES Y OPERACIONES EN ESPECTROMETRA

DE MASAS
La identificacin de compuestos en mezclas complejas as como la

determinacin de sus estructuras no es posible, en general, utilizando un
nico espectrmetro por lo que son necesarios otros equipos de mejores
prestaciones analticas para incrementar el nivel de informacin y esto
se consigue acoplando varios espectrmetros que pueden ser de las
mismas caractersticas, o diferentes, lo que permite aprovechar las ventajas de cada uno de ellos. Es conocido que el factor limitante en muchos anlisis es la necesidad de conseguir buenas separaciones previas
en muestras complejas, por lo que otro enfoque analtico es la combinacin de diferentes tcnicas y mtodos de separacin con la espectrometra de masas, lo que aporta innumerables posibilidades (Tabla 1.II).
134
ESPECTROMETRA
3.1.
MS/MS: Espectrometra de masas en tndem
Se denomina espectrometra de masas en tndem (MS/MS) al acoplamiento de dos espectrmetros de masas unidos por una cmara que
en general, fragmenta las molculas. Existen dos categoras principales
de espectrmetros que permiten realizar experimentos MS/MS: espectrmetros en tndem en el espacio y en el tiempo. La definicin anterior
slo es apropiada para MS en tndem en el espacio, que es el que se va
a comentar. Su esquema se presenta en la Figura 5.
FIGURA 5. Esquema de espectrmetros de masas en tndem (MS/MS). CC: Cmara de

colisin; D: Detector.
Se considera una de las herramientas ms tiles para identificar

compuestos en mezclas y determinar la estructura de sustancias desconocidas se utiliza especialmente en protemica o para eliminar interferencias en mtodos cuantitativos.
El primer espectrmetro sirve para seleccionar un in determinado
entre los iones producidos en el sistema de ionizacin. Este analizador
genera el espectro de masas de la sustancia y selecciona, de todos los
iones que le llegan, el in correspondiente a un valor de m/z, que se
denomina In Precursor. Seguidamente este in precursor se introduce
en una cmara de colisin, en la que se bombea un gas. Los iones
moleculares son acelerados por un potencial elctrico hasta obtener una
energa cintica alta y en la cmara colisionan con las molculas del gas
(helio, nitrgeno o argn). En la colisin parte de la energa cintica se
transforma en energa interna y se fragmenta el in precursor en pequeos fragmentos neutros y otros iones, estos fragmentos del in precursor, denominados Iones Producto (el trmino iones hijos actualmente no es aceptado por la IUPAC) entran en el segundo espectrmetro de
masas donde son analizados para dar un nuevo espectro de masas. Este
135
proceso se puede repetir para diferentes iones precursores dentro de una

misma sustancia.
El proceso de fragmentacin es esencial cuando se trabaja con sistemas MALDI y ESI pues en general los iones precursores son estables
y al ser fuentes de ionizacin suaves, no se dispone de patrones de
fragmentacin adecuados por lo que no hay la informacin suficiente
para una correcta elucidacin estructural.
Entre los mtodos que existen con este fin, el ms utilizado en
protemica es la disociacin inducida por colisin (CID: collision-induced dissociation) que corresponde al proceso expuesto anteriormente.
Otros mtodos diferentes son: disociacin inducida en superficie (SID:
surface-induced dissociation) en la que la activacin del in se debe a
las colisiones de los iones precursores sobre una superficie. Actualmente, para estudios concretos se est incorporando la fragmentacin mediante radiacin lser o con electrones libres. En particular la disociacin por captura de electrones (ECD: electron capture dissociation)
y la disociacin por transferencia electrnica (ETD: electron transfer
dissociation) han sido implementados sobre equipos FT-ICR y LIT respectivamente. La informacin es complementaria a la fragmentacin
obtenida por CID.
El sistema ms sencillo incluye dos analizadores pero en principio,
no existe lmite en el nmero de equipos acoplados. Se han construido sistemas que incluyen hasta cuatro analizadores de masas. En la
medida en que aumenta el nmero de los mismos crecen las capacidades
experimentales, tambin la complejidad y por supuesto, el coste del
instrumento.
La espectrometra de masas en tndem se usa rutinariamente para la
identificacin de protenas y los equipos ms utilizados han sido Q-TOF
y Q-LIT siendo ESI el sistema de ionizacin para la secuenciacin de
protenas. Desde que se implantaron los analizadores TOF-TOF y orbitrap se utiliza MALDI como sistema de ionizacin y se aplica habitualmente utilizando la metodologa del in producto para determinar la
secuencia de aminocidos de un pptido especfico. El primer analizador
se utiliza para seleccionar un precursor especfico. Este in se fragmenta
en la cmara CID y los iones resultantes se analizan mediante el segundo analizador. Se repite el proceso con diferentes precursores. Este modo
de actuacin, es general para cualquier equipo MS/MS (Figura 6).
136
ESPECTROMETRA
FIGURA 6.
Esquema del anlisis de un pptido.
Para detectar conjuntos de pptidos que contienen un determinado

grupo funcional se requieren instrumentos ms especficos y la utilizacin de otra metodologa relacionada con el in precursor, en la que se
utiliza el segundo analizador para transferir al detector slo un fragmento (o in determinado). El primer espectrmetro se utiliza para detectar
todos los iones precursores capaces de generar este fragmento. Estas
metodologas se pueden realizar eficazmente en un triple cuadrupolo
(Q-Q-Q) o cuadrupolo-trampa de iones (Q-Q-L-I-T). Por ejemplo, se
pueden detectar en mezclas complejas, la fosforilacin y la glicosilacin
mediante la generacin de iones caractersticos y especficos en la cmara de colisin, que pueden ser posteriormente detectados.
Los dispositivos de triple cuadrupolo, tambin permiten anlisis
cuantitativos mediante el mtodo SRM: Control selectivo de reaccin
(selected reaction monitoring), con una sensibilidad muy elevada. Si los
analitos son conocidos, se pueden detectar y cuantificar con un alto
grado de sensibilidad y selectividad. La elevada selectividad, es conse137
cuencia de la monitorizacin del par de iones precursores o fragmentos

caractersticos de un nico pptido, dado que el primer analizador de
masas, slo deja pasar una poblacin pequea de iones lo que minimiza
el fondo qumico.
3.2.
3.2.
Acoplamiento de la espectrometra de masas con tcnicas

de separacin (hyphenated methods)
Valcrcel (7) define el acoplamiento o hibridacin instrumental como

la combinacin a travs de una interface de dos tcnicas analticas
independientes, que genera una informacin nica e integral de la composicin de la muestra y se caracteriza por ser ms completa que la
informacin alcanzada independientemente por cada tcnica.
Los requisitos que deben cumplir las tcnicas para acoplarse, son (8):
compatibilidad; independencia entre los mtodos; ortogonalidad, que en
este caso significa que los mtodos acoplados deben basar sus respectivas separaciones en mecanismos de separacin tan distintos como sea
posible; que sean complementarias, para obtener una mejor informacin
analtica y permitir una adquisicin de datos que simplifique su interpretacin.
En separaciones de mezclas complejas el papel de la cromatografa
de gases (GC), de lquidos en su modalidad HPLC y la electroforesis
capilar (CE) es innegable. Del mismo modo, es indiscutible la capacidad
de la MS como tcnica para proporcionar informacin que permite la
identificacin de numerosos compuestos. Ambas tcnicas presentan sus
limitaciones como cualquier tcnica utilizada, sin embargo, el acoplamiento en lnea de una tcnica de separacin con MS resulta muy til
al conseguir una metodologa analtica en dos dimensiones, en la que se
realiza simultneamente la separacin y la identificacin. El acoplamiento en lnea requiere una interfaz que pueda introducir los componentes separados con la primera tcnica, en el sistema de ionizacin del
espectrmetro sin afectar a su resolucin ni tampoco a su forma de
operar. La cromatografa y la espectrometra de masas cumplen los requisitos, pero el reto es mantener el vaco requerido en el espectrmetro
al mismo tiempo que se est introduciendo el lquido o gas, con los
analitos procedente del cromatgrafo. No sirven todos los espectrme138
ESPECTROMETRA
tros, sino solamente los que pueden realizar barridos de potencial a gran
velocidad y tolerar altas presiones (ejemplo: TOF; LIT o Q). Se presenta
un esquema de estos equipos en la Figura 7.
FIGURA 7.
Esquema de un equipo de LC acoplado con un espectrmetro de masas.
En la determinacin de biomarcadores se utiliza fundamentalmente

el acoplamiento de las tcnicas cromatogrficas con MS. Aunque la
electroforesis en gel es muy utilizada, como tcnica de separacin previa, en este caso no se considera sistema acoplado, al no estar en lnea.
En el acoplamiento con cromatografa de gases (GC-MS) se adoptan
diversas posibilidades que van a depender del tipo de columna empleada ya que condiciona el flujo del gas portador. Si las columnas tienen
dimetros superiores a 0,3 mm hay que recurrir a interfaces como divisor de flujo sin embargo, se estn sustituyendo por la utilizacin de las
columnas capilares que debido al pequeo flujo del gas, se introducen
debidamente termostatizadas hasta la cmara de ionizacion y un sistema
de bombeo del espectrmetro elimina el gas portador. Sirve para molculas pequeas voltiles y trmicamente estables. Se ha utilizado un
equipo de cromatografa de gases bidimensional acoplado a MS con un
analizador TOF (GG-GC-TOF-MS) para analizar en el plasma glucosa,
cidos 2-hidroxibutrico, linoleico y palmtico con el fin de hallar potenciales biomarcadores para la diabetes (9).
139
La cromatografa de lquidos trabaja a alta presin, temperatura

ambiente o muy prxima, con un caudal de la fase mvil relativamente
alto, mientras que MS opera a alto vaco y temperatura elevada, esto
hace ms complicado el acoplamiento. Se ha resuelto con interfaces que
consiguen una ionizacin suave de la muestra, sin pretender eliminar
por completo la fase mvil. Se emplean de diferentes tipos como la
ionizacin qumica a presin atmosfrica APCI (atmospheric pressure
chemical ionization) o ionizacin por nebulizacin trmica (termospray)
aunque la de mejores resultados al estudiar medios biolgicos es el
electrospray (ESI).
El electrospray es la interfaz ms adecuada para acoplar la cromatografa de lquidos con MS (LC/MS) ya que permite analizar, con gran
sensibilidad, numerosos compuestos no voltiles y trmolbiles, cuyo
intervalo de pesos moleculares es muy amplio y la ionizacin se realiza
a presin atmosfrica. En cromatografa se puede trabajar en fase inversa y con diferentes solventes, el equipo resultante LC/ESI-MS es de
gran aceptacin en estudios de protenas y protemica as como en
mtodos cuantitativos.
Cuando la ionizacin es mediante ESI, se puede trabajar con muestras en flujo continuo, pero si es con MALDI generalmente se realiza
utilizando gotas o cantidades discretas de muestra. Recientemente se ha
desarrollado un mtodo que permite realizar separaciones LC y utilizar
MALDI-MS, en este caso el lquido eluido de la columna se deposita en
una placa MALDI pero en un sistema automatizado continuo.
Para resolver mezclas complejas se combina la cromatografa de lquidos con la espectrometra de masas (LC/MS), o masas en tndem (LC/
MS/MS), utilizando diferentes sistemas de ionizacin y analizadores
como trampa de iones lineal (LIT), cuadrupolar, Orbitrap y resonancia ciclotrnica de iones con transformada de Fourier (FT-ICR). Este ltimo
puede generar espectros de distinto orden: MS2 y MSn de gran calidad
pero tarda ms tiempo. Los espectrmetros de trampa de iones son muy
convenientes para obtener MSn pero requieren llegar a un compromiso
entre la exactitud de la masa y resolucin. Los instrumentos MALDI/
TOF-TOF generalmente slo pueden obtener espectros MS2 pero la energa de colisin puede ser tan alta como la obtenida con CID y trampa de
iones. La cromatografa HPLC en fase inversa realiza las separaciones
con una resolucin alta y es adecuada para trabajar con ESI.
140
ESPECTROMETRA
Una metodologa de separacin de gran utilidad en separaciones de

muestras muy complejas, se fundamenta en acoplar dos tcnicas de
separacin y este sistema se conoce como tcnicas multidimensionales
de separacin.
i) Un caso sencillo es el bidimensional que consiste en acoplar dos
mtodos de separacin basados en diferentes mecanismos de retencin,
conectando la segunda columna a la salida de la primera y funcionando
en lnea. La primera columna separa total o parcialmente los componentes de la mezcla y la segunda recibe los compuestos ya separados que
pueden ser puros o si la separacin no ha sido total, mezclas ms sencillas para su separacin. Los requisitos, vistos previamente, de compatibilidad, independencia, ortogonalidad y complementariedad se han de
cumplir en estas separaciones.
La capacidad de pico se define como el mximo nmero de picos
que pueden ser separados, con una resolucin convenida en una determinada longitud de columna (8). En un sistema multidimensional, la
capacidad de pico (n2D) del conjunto corresponde al producto de la capacidad de los picos en cada dimensin: n2D = n1 n2 pero hay que tener
en cuenta que en la prctica es menor que el terico debido a las limitaciones que se producen por el ensanchamiento del pico, causado por el
equipo o el volumen muerto de la columna.
En realidad, no existen modos de separacin absolutamente independientes por lo que hay una gran variedad de combinaciones de sistemas multidimensionales para incrementar el poder de separacin y
optimizar la capacidad de pico. Para ello se utilizan distintas tcnicas
cromatogrficas y diferentes dimensiones de los elementos de los equipos tales como la longitud de la columna, su dimetro, etc., pero realmente son los aspectos prcticos relacionados con la interfaz entre el
sistema cromatogrfico y el espectrmetro de masas los que limitan la
utilidad de muchas combinaciones. Algunos de los factores limitantes
pueden ser el tiempo requerido para el anlisis, el tipo de buffer utilizado para la separacin justo antes del acoplamiento con el MS y la
integracin de las dos dimensiones.
En estos sistemas, la ltima etapa de la separacin es habitualmente
una cromatografa en fase inversa (RPLC), con lo que se consigue una
elevada resolucin, una eficaz eliminacin de sales de la muestra y una
141
buena compatibilidad de la fase mvil entre el sistema de ionizacin por

ESI y el analizador de masas. En la mayora de los estudios de protemica, se utilizan columnas capilares, dado que la respuesta de ESI,
depende de la concentracin.
ii) Como se estudian estructuras biolgicas cada vez ms complejas por espectrometra de masas en tndem (MS/MS) se necesitan mtodos de separacin de mayor poder de resolucin, debido a ello, el
desarrollo de la cromatografa de lquidos multidimensional (MDLC)
para estudios en protemica, ha experimentado un gran crecimiento en
los ltimos aos. La MDLC combina dos o ms tipos de cromatografa
de lquidos con el objetivo de incrementar el poder de resolucin y
conseguir una mejor separacin de los pptidos antes de que entren en
el espectrmetro de masas. Este ltimo aspecto es importante, debido
a que el proceso de MS en tndem permite una adquisicin de datos
que proporciona un mejor conocimiento de las protenas de la mezcla.
Un aumento de la resolucin tambin se refleja en un mayor rango
dinmico.
Una separacin de alta resolucin, combinada con la MS tiene varias
funciones como son: conseguir ms pptidos mejor separados que difieran en cuanto a su carga, o a su hidrofobicidad. Minimizar la supresin
de iones, aumentar la eficacia de la ionizacin as como simplificar la
complejidad de los iones de los pptidos que entran en el espectrmetro
de masas y disminuir el efecto de distorsin de la seal debido a grandes
tamaos de muestra (undersampling). Estos aspectos son importantes,
debido a que el proceso de MS en tndem, permite la adquisicin de datos
para un mejor conocimiento de las protenas de la mezcla.
Se estn realizando esfuerzos para mejorar la separacin cromatogrfica en fase inversa utilizando sistemas de alta presin como Cromatografa lquida de ultra resolucin (UPLC: Ultra Performance Liquid
Chromatography) que utilizan partculas de menos de 2 m. Estas partculas de un dimetro tan pequeo, mejoran la resolucin porque
se minimiza la difusin del analito al atravesar la columna. El mayor
problema, se debe a la elevada presin por retroceso que se crea en la
columna cuando la velocidad lineal de la fase mvil es ptima. Esta
presin de la columna, es inversamente proporcional al cubo del dimetro de la partcula de relleno y por tanto un dimetro muy pequeo de
partcula permite exceder la mxima presin permitida en un sistema
142
ESPECTROMETRA
convencional de HPLC. Los equipos pueden trabajar con unos valores

de presin de hasta 1.000 atmsferas.
4.
DETERMINACIN DE BIOMARCADORES EN CLNICA
La aplicacin de la MS en clnica comenz en los aos sesenta del

siglo pasado y est ampliamente reflejada en la bibliografa (10-13), esta
tcnica se ha aplicado a todos los fluidos biolgicos, pero los ms utilizados son el plasma y la orina aunque en muchos casos se requiere una
derivatizacin. Las primeras aplicaciones se restringan al anlisis de
pequeas molculas mediante GC-MS necesitando una etapa de preparacin de la muestra muy laboriosa y no se lograba analizar molculas
de alto peso molecular o de polaridad elevada. Actualmente, mediante
MS se ha resuelto el anlisis de muy diferentes molculas y es posible
determinar protenas intactas y pptidos, lo que se debe fundamentalmente a la gran expansin de la tcnica que se est produciendo en los
ltimos aos y a avances instrumentales tales como nuevas fuentes de
ionizacin y sistemas para el acoplamiento de tcnicas. Tambin han
sido decisivas las mejoras que facilitan el trabajo como son la disminucin del tamao de los equipos y la simplificacin de su manejo, al no
necesitarse tcnicos tan especializados. Todos estos aspectos se vern
superados en un futuro prximo.
La utilizacin e importancia de los BM en clnica se basa en la
posibilidad de su determinacin cualitativa y cuantitativa mediante diversas tcnicas analticas, as como la ulterior interpretacin y evaluacin de los resultados obtenidos. Se presenta un importante desafo en
la bsqueda, identificacin y validacin de biomarcadores especficos
para enfermedades.
En una reflexin analtica previa, se debe considerar que los potenciales BM que se determinarn en clnica incluyen un amplio espectro
de compuestos bioqumicos que pueden ser aminocidos, lpidos, esteroides, pptidos, protenas, cidos nucleicos, oligonucletidos, DNA y
RNA. Estos compuestos presentan pesos moleculares muy heterogneos, desde unos 500 Da como los aminocidos, hasta las molculas con
elevados pesos moleculares como protenas y algunos pptidos. Adems, las sustancias muestran diferentes propiedades fisicoqumicas como
143
polaridad, solubilidad, carga y en general son hidroflicas. En muchos

casos las concentraciones de los BM son muy bajas y hay que analizarlos en presencia de otras sustancias cuya concentracin es muy elevada.
Un ejemplo es la mioglobina que es un BM del infarto de miocardio,
cuyos valores de referencia en varones de cincuenta aos se encuentran
entre 22 y 58 g/L y su determinacin se realiza en presencia de albmina cuya concentracin es de 32 a 45 g/L, esta diferencia de concentracin hace necesario un proceso de separacin previo a su deteccin.
En muchos casos los laboratorios clnicos no disponen de estndares al
no existir en el mercado, ni tampoco materiales de referencia certificados, de gran importancia e inters especialmente para la puesta a punto
y validacin de los mtodos analticos. Estos aspectos sern los desafos
que el analista deber solventar para identificar y valorar correctamente
el biomarcador.
4.1.
Diagnstico clnico
En los anlisis clnicos, la informacin se obtiene de cada muestra

individual por lo que las caractersticas deseables del mtodo deben permitir que esta informacin sea la mxima posible, que la preparacin
de la muestra, la velocidad de muestreo, el anlisis y la interpretacin de
resultados se desarrolle de tal forma que permita analizar rutinariamente cientos de muestras a ser posible, de forma automatizable y finalmente
que el analista lo pueda realizar de forma reproducible siendo crucial, en
todos los casos, el factor tiempo.
La GC/MS en qumica clnica est limitada a muestras con la volatilidad y el tamao adecuado por lo que los anlisis GC/MS estn restringidos a compuestos derivatizables como cidos grasos, cidos orgnicos, aminocidos, monosacridos, prostaglandinas, cidos biliares y
esteroides.
El nmero y el tipo compuestos que se analizan por MS vara desde
metales, como hierro y selenio a metabolitos como la fenilalanina, tambin glucosa, pptidos y protenas como insulina, hemoglobina, y oligonucletidos (fragmentos de DNA y RNA).
Los BM pueden ser compuestos de origen endgeno producidos por
el metabolismo o metabolitos debidos a la degradacin de un medica144
ESPECTROMETRA
mento; los metabolitos utilizados como BM son molculas de bajo peso

molecular. Los genes defectuosos pueden producir protenas anormales
con la actividad enzimtica alterada, lo que puede tener consecuencias
metablicas adversas provocando alteraciones celulares u otras enfermedades, la concentracin anormal de metabolitos puede ser un indicativo
de una enfermedad concreta.
La MS es una tcnica vlida para el diagnstico de trastornos metablicos y se ha utilizado en la determinacin de un conjunto de alteraciones llamadas acidemias orgnicas (14), cuya forma ms comn es
la acidemia propinica neonatal, trastorno del metabolismo originado
por un dficit enzimtico de la propionil CoA carboxilasa, enzima mitocondrial dependiente de la biotina que cataliza el paso de propionil
CoA a metilmalonil CoA. Se manifiesta ya en las primeras semanas de
vida apareciendo sntomas de intoxicacin como son rechazo del alimento, vmitos, prdida de peso y disfuncin neurolgica con letargia,
convulsiones, e incluso coma y muerte. La principal caracterstica de
dicho dficit es la presencia de elevadas concentraciones de propionato
y otros cidos orgnicos en sangre y orina. Para diagnosticar este trastorno, en la etapa de la preparacin de la muestra se extraen los cidos
orgnicos y se derivatizan mediante trimetilsililacin analizndose posteriormente mediante GC/MS (15).
Otra aplicacin interesante de esta tcnica corresponde a los mtodos de screening o cribado especialmente en programas de prevencin
de enfermedades.
Los mtodos de screening son un tipo de anlisis cualitativo, utilizados en laboratorios que trabajan rutinariamente con un nmero elevado
de muestras y se basan en respuestas binarias (positivo/negativo, presencia/ausencia del analito, etc.). En los mtodos de cribado, se utilizan
distintas metodologas como tinciones inmunohistoqumicas, microchips
de DNA, chips de protenas, etc. No obstante, todas estas tcnicas estn
limitadas, bien por una insuficiente sensibilidad y especificidad de los
ensayos, ya que tienen que detectar un nico componente que es el que
acta como biomarcador, bien por una insuficiente correlacin cuantitativa entre el gen y los niveles de protena obtenidos, o por el estrecho
margen en la interpretacin analtica para obtener un perfil protemico cualitativo/cuantitativo comprensible, o por la falta o insuficiente especificidad y reproducibilidad de los chips de protenas. En 1990 la in145
troduccin de la MS en tndem revolucion los metodos de screening al

permitir analizar, en una nica experiencia, mltiples analitos as como
la deteccin de distintas enfermedades de forma simultnea.
En la actualidad se est aplicando el cribado neonatal para estudiar
trastornos metablicos, lo que permite el conocimiento real de la prevalencia de muchas enfermedades (16-18) que hasta ahora se detectaban
a partir de las manifestaciones clnicas y para tener un mayor conocimiento de las causas y tratamiento de las enfermedades genticas. Se
utilizan tcnicas acopladas como LC/MS o LC/MS/MS y en un nico
proceso analtico se identifican los analitos Como ejemplo en un estudio
en la regin de Murcia, realizado en el Laboratorio de Metabolopatas
del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca se han analizado 24.937
recin nacidos mediante MS/MS encontrndose una incidencia de alteracin metablica: 1:3500 r.n. (19).
Para mejorar el valor predictivo de estos mtodos de cribado es
necesario el desarrollo de nuevas tecnologas que se pueden aplicar al
cribado neonatal. Tampoco est resuelto qu tipo de estrategias posteriores o de segundo nivel se deben tomar cuando se obtienen valores
positivos en el cribado. Se deben tener en cuenta varias consideraciones,
la primera es que en un solo ensayo se trabaja con muchos analitos, por
lo que la probabilidad de que alguno de ellos est fuera del intervalo de
los valores de referencia es grande, lo que hace que haya demasiados
resultados positivos, ello supone un exceso de trabajo y costes de confirmacin de resultados en el laboratorio; otro aspecto importante es la
generacin de inquietud en las familias de los nios con resultados
positivos por lo que para mejorar el valor predictivo de las pruebas de
cribado se est trabajando en el establecimiento de los analitos de mayor
importancia en el diagnstico de enfermedades, as como en el establecimiento de lmites de corte (cut-off) y algoritmos de diagnstico adecuados para disminuir el nmero de falsos positivos. Otra particularidad
es que cada laboratorio debe establecer sus propios valores de referencia
y lmites, referidos a la poblacin normal objeto de cribado, pero este
tipo de enfermedades tiene una prevalencia baja en la poblacin y se
necesita mucho tiempo para tener el nmero de casos necesarios para
establecer estos valores.
En China se ha realizado un cribado selectivo durante el embarazo
para detectar disfunciones del metabolismo y aciduria metilmalnica
146
ESPECTROMETRA
secundaria, y poder establecer la causa de las anomalas congnitas del

tubo neural, malformacin congnita muy comn en el norte del pas. Se
han utilizado muestras de orina, un pretratamiento con ureasa y la determinacin de los niveles de metilmalonato mediante GC/MS (20).
Se utilizan asimismo mtodos de cribado para estudios sobre el abuso de alcohol utilizando LC-MS/MS. El alcoholismo es uno de los principales problemas sanitarios cifrndose en ms de tres millones el nmero de alcohlicos, lo que conlleva un gasto sanitario que supera los
5.000 millones de euros al ao (21). El alcohol tiene dos metabolitos etilglucurnido (EtG) y etilsulfato (EtS) que son los primeros candidatos
para su determinacin en orina. Estos marcadores pueden detectarse
en las 36 horas siguientes a la ingestin del alcohol mediante MS. Para
la determinacin de EtS mediante LC- ESI- MS/MS se seleccion como
precursor el in [M-H] de m/z 125 y sus iones producto de m/z 97
([HSO4]) y 80 (SO3), se detectaron mediante el mtodo SRM: control
selectivo de reaccin (22). La deteccin simultnea de los dos marcadores permite realizar un diagnstico del consumo de alcohol que puede ser
utilizado en programas de prevencin. Un mbito que utiliza una metodologa similar (GC/MS) y se puede incluir en diagnstico clnico es el
anlisis de drogas de abuso en orina como cocana, cannabinoides, anfetaminas u otras sustancias en las que se determinan sus metabolitos como
biomarcadores.
La necesidad e importancia de validar los mtodos de anlisis es
conocida y si bien el concepto de validacin no depende de que sean
cuantitativos o cualitativos, en la prctica algunos parmetros de calidad
que los caracterizan son diferentes. En los mtodos cualitativos, aunque
hay parmetros que mantienen el mismo nombre que en los mtodos
cuantitativos, como especificidad, sensibilidad y lmite de deteccin, su
significado puede ser ligeramente diferente, adems hay otros parmetros
de calidad caractersticos de estos mtodos, como son la proporcin de
falsos positivos y falsos negativos as como el lmite de corte (cut-off)
cuyo significado puede encontrarse en la abundante bibliografa existente. Finalmente como seala Ros (23) la fiabilidad de la informacin analtica es uno de los principales objetivos del analista y los mtodos de
screening son un tipo de anlisis cualitativo cada vez ms utilizado en los
laboratorios, ya que son la base para adoptar decisiones rpidas en muchos aspectos de la vida real. La importancia de dichas decisiones para
147
resolver problemas requiere un nivel apropiado de calidad de la informacin cualitativa usada para estos fines. La fiabilidad de los resultados est
asociada a esta calidad de la informacin por lo que se hace necesario el
desarrollo de las herramientas metrolgicas y quimiomtricas para evaluar la fiabilidad de la informacin cualitativa que proporcionan.
4.2.
Protenas
La identificacin y caracterizacin de las protenas es crucial en

biologa y hasta hace unos aos era difcil por la falta de mtodos
analticos rpidos y sensibles lo que limitaba los estudios relacionados
con la biologa molecular o la genmica. Se utilizaban tcnicas fisicoqumicas o enzimticas detectando los productos de reaccin por espectrofotometra UV o fluorimetra, pero no resolvan satisfactoriamente el
problema analtico. En los aos noventa la incorporacin de la MS
permiti ir perfeccionando la informacin y en nuestros das, esta tcnica tiene un papel trascendental en la identificacin y caracterizacin
de protenas siendo actualmente la tcnica de eleccin para el anlisis de
protenas complejas.
Las tcnicas de separacin cromatogrficas y electroforticas, en
combinacin con la MS, son las herramientas fundamentales que actualmente se utilizan en la investigacin de protenas, o en protemica, as
como en otros campos relacionados con las micas.
Las protenas sirven como biomarcadores de enfermedades especficas. Una protena anormal puede ser consecuencia de un gen defectuoso y puede tener implicaciones clnicas si la composicin alterada de los
aminocidos afecta a su actividad. Un ejemplo es la amiloidosis familiar, enfermedad hereditaria y degenerativa, que tiene su origen en un
defecto gentico transmitido con carcter autosmico dominante y produce mutaciones en la composicin de la protena transtirretina (prealbmina), esta protena normalmente transporta tiroxina y retinol. Se han
descrito ms de 50 mutaciones del gen de la transtirretina con este tipo
de amiloidosis, la mayor parte de las cuales causan depsito amiloide
primariamente en corazn y nervios perifricos; suele presentarse como
neuropata perifrica si bien se describen mutaciones que se expresan
inicialmente como cardiopatas, la deteccin e identificacin de la trans148
ESPECTROMETRA
tirretina permite un diagnstico definitivo de la enfermedad. Se ha utilizado LC/ESI- MS (24) para identificar mutantes de transtirretina y las
diferentes fracciones se analizan mediante LC/MALDI-MS para determinar el lugar de la mutacin.
Las llamadas enfermedades congnitas del metabolismo son consecuencia de alteraciones bioqumicas de origen gnico en la estructura o
funcin de una protena, la MS se ha aplicado para la determinacin de
enfermedades raras causadas por una deficiencia de un enzima especfico, por ejemplo en el diagnstico de glucogenosis. Las glucogenosis son
una serie de enfermedades congnitas producidas por alteraciones de los
enzimas que participan en el metabolismo del glucgeno. Se caracterizan
por acumulacin del glucgeno en el rgano afectado, esta acumulacin
es una respuesta fisiolgica al aumento de concentracin de glucosa en
sangre, que ocurre despus de la ingestin de alimentos. Tradicionalmente se ha considerado que la glucgeno sintasa (GS) cataliza la etapa clave
de la sntesis de glucogno y la actividad GS est altamente regulada
mediante la fosforilacin en mltiples residuos y por efectos alostricos,
principalmente glucosa-6-fosfato aunque avances recientes han demostrado que se deben considerar otros factores (25). En los estudios para
entender los diferentes tipos de glucognesis, as como los procesos implicados, la MS es tcnica de rutina como se ha demostrado en la glucogenosis tipo I debida a una deficiencia de la glucosa-6-fosfatasa. Para el
diagnstico de la glucogenosis tipo II o enfermedad de Pompe, causada
por una disfuncin de la enzima -(1-4)-glucosidasa, se ha encontrado un
biomarcador en orina que es un tetrasacrido de glucosa, Glca1-6Glca14 Glcal-4 Glc (Glc4). Se ha demostrado que su nivel en orina esta aumentado en pacientes con esta enfermedad, especialmente en nios y jvenes
ms que en adultos. Su determinacin se realiza mediante espectrometra
de masas en tndem (MS/MS) con una ionizacin por ESI (26, 27) o
mediante GC-MS y MALDI-TOF MS (28).
La hemoglobina (Hb) es una protena que contiene Fe siendo responsable del transporte y almacenamiento de oxgeno. En adultos el tipo de
Hb ms comn es un tetrmero llamado HbA que contiene dos cadenas y dos cadenas de polipptidos asociadas con el grupo hemo. En
las hemoglobinopatas la estructura de uno de los cuatro tipos de cadenas
es anormal lo que se debe casi siempre a la sustitucin de un nico aminocido. Para caracterizar las variantes de la hemoglobina se ha utilizado
149
una modalidad de la espectrometra de masas como la IMS: espectrometra de movilidad inica (ion mobility spectrometry) que consiste en someter a las molculas ionizadas a un campo elctrico homogneo
en una corriente gaseosa. Los iones se desplazan, a una velocidad que ser
funcin del campo elctrico y tambin de su interaccin con el gas, por
lo que la velocidad depender de su masa, de su tamao y de su forma.
Los espectrmetros IMS permiten detectar e identificar concentraciones
muy bajas de sustancias. La anemia drepanoctica es una hemoglobinopata causada por un tipo anormal de hemoglobina, llamada hemoglobina S (HbS: sickle hemoglobin) que distorsiona la forma de los glbulos
rojos y presentan forma de disco. La hemoglobina HbS se diferencia en
que el acido glutmico del aminocido en la sexta posicin sobre la cadena b ha sido sustituido por valina. Para determinar las diferencias conformacionales en la estructura cuaternaria de la hemoglobina se ha utilizado la IMS acoplada con Q-TOF (29).
Se ha estudiado, en un interesante trabajo (30) el potencial de la
espectrometra de masas para el estudio de protenas que contienen hierro, como son la hemoglobina, la transferrina, la ferritina o la mioglobina. Estas protenas estn implicadas en numerosos procesos biolgicos
y algunas son consideradas como biomarcadores del metabolismo del
hierro. Se estima que las distintas estrategias analticas tendrn aplicacin para la caracterizacin cualitativa y cuantitativa de protenas con
hierro, as como la validacin de nuevos mtodos analticos en un mbito
en el que la pureza de las especies es especialmente demandada. Otra
faceta es la caracterizacin de estas protenas como nuevos biomarcadores asociados a enfermedades.
Recientemente, se han utilizado los espectros de masas para el diagnstico de enfermedades. Se ha hecho un seguimiento de cncer de ovario y otros tipos de cncer a travs de la identificacin de los espectros de
masas de protenas utilizando la bioinformtica. Se han identificado biomarcadores no especficos con sus secuencias, sin embargo esta propuesta todava no ha sido aceptada de forma generalizada por la clase mdica
debido a la elevada fluctuacin que aparece en los espectros para muestras de distintas fuentes y sometidas a diferentes formas de preparacin
antes de ser analizadas. Previsiblemente, en un futuro prximo cuando la
preparacin de las muestras y los protocolos experimentales estn estandarizados por organismos internacionales y los espectros tengan la repro150
ESPECTROMETRA
ducibilidad exigida, esta metodologa tendr un enorme potencial para el

diagnstico rpido de mltiples enfermedades.
La protemica (35) es el conjunto de tcnicas y estrategias utilizadas para el estudio del proteoma, es decir el conjunto de todas las protenas originadas por el genoma, bajo los diversos patrones de expresin
gnica a protenas, modificacin, degradacin proteica y desarrollo de
su funcin, todo ello dentro de cada tipo de clula, momento celular,
condiciones particulares in vivo, etc.
Es una disciplina que ha despertado enormes expectativas en la investigacin de biomarcadores por su potencial para la identificacin de molculas especficas que permitan diagnosticar, clasificar o predecir enfermedades as como para definir nuevas dianas teraputicas. La aplicacin
en clnica de la MS, como tecnologa utilizada en protemica es reciente
y limitada fundamentalmente a laboratorios especializados, sin embargo
la bibliografa es ingente y sigue un aumento exponencial (31-34).
Las tecnologas que se aplican en protemica van encaminadas a
separar, identificar y caracterizar un gran conjunto de protenas con la
pretensin de lograr la informacin sobre la abundancia de las mismas,
su localizacin, modificacin e interaccin entre diferentes protenas. Este
anlisis del proteoma es fundamental, pues los datos obtenidos a partir de
las pruebas genmicas son insuficientes al ser el genoma un sistema esttico y fundamentalmente idntico en cada organismo, mientras que el
proteoma es sumamente dinmico y su anlisis proporciona una visin
ms detallada de lo que sucede en la clula posibilitando caracterizar las
protenas presentes en la clula, tejido o lquido biolgico, asimismo se
pueden identificar protenas expresadas de forma diferente cuando los
estados fisiolgicos correspondan a salud o enfermedad y tambin reconocer un grupo de protenas implicadas en una funcin especfica.
Los estudios en protemica difieren en sus objetivos, unos son descriptivos como la identificacin de protenas en una muestra y la caracterizacin de sus modificaciones postraduccionales; en otros casos son
mtodos para medidas cuantitativas de protenas o para estudios de
variaciones cuantitativas de protenas en diferentes muestras.
Generalmente las metodologas utilizadas en diagnstico o en investigacin son diferentes y sin embargo no hay una ninguna razn para
ello, ya que se han desarrollado en cada mbito de trabajo particular.
151
La MS permite analizar protenas intactas as como fragmentos proteolticos, o pptidos obtenidos por digestin enzimtica. Los mtodos
de MS para protenas intactas son interesantes en clnica al no ser complicada la preparacin de la muestra, son rpidos y se puede trabajar con
alta velocidad de muestreo, sin embargo, en general los espectrmetros
son menos sensibles cuando se trabaja con molculas de gran tamao
como son las protenas, que cuando se trabaja con pptidos a causa de
la divisin de la seal y de la dilucin debido a las modificaciones
proteicas y a la formacin de aductos.
No existen mtodos o instrumentos que sean capaces de identificar
y cuantificar los componentes de una muestra compleja de protenas en
una nica operacin. Los mtodos analticos directos, para el anlisis de
protenas, tales como SELDI-TOF slo sern capaces de detectar diferencias en protenas muy abundantes a menos que, previamente al anlisis, se utilice una etapa de enriquecimiento de la muestra.
En general, cualquier anlisis consta de tres etapas: (i) Las muestras
de protenas se aslan de su espcimen biolgico y a veces se fraccionan.
Esta muestra es digerida enzimticamente y posteriormente la mezcla
de pptidos resultante se fracciona mediante tcnicas de separacin.
(ii) Los pptidos se someten a anlisis cualitativos y cuantitativos mediante espectrometra de masas. (iii) El conjunto de datos y resultados
generados son analizados con la ayuda de equipos informticos con un
software adecuado para deducir la secuencia de aminocidos y si es
posible, la cantidad de protenas en la mezcla. La identidad del pptido
se asigna mediante el espectro MS/MS y la bsqueda en una base de
datos correspondiente. Se recomienda realizar pruebas estadsticas de la
bsqueda para garantizar la identificacin.
Las tcnicas de prefraccionamiento que se utilizan como paso previo a la caracterizacin de las protenas en el caso de mezclas muy
complejas, son la electroforesis y los mtodos cromatogrficos. Se usa
la electroforesis en gel mono o bidimensional (2DGE), con digestin
en el propio gel de las bandas especficas, seguida por LC-MS-MS. La
electroforesis en gel proporciona informacin sobre el peso molecular
y el punto isoelctrico de las protenas. Las limitaciones de este mtodo
se deben a su laboriosa realizacin, con una velocidad de muestreo
pequea, hay prdida de protenas durante la separacin, as como baja
recuperacin de las protenas grandes. Aunque el sistema bidimensional,
152
ESPECTROMETRA
proporciona un excelente poder de resolucin para protenas, es difcil

automatizar el proceso, es laborioso y sobre todo, tiene un intervalo
dinmico limitado y no se puede aplicar a ciertos tipos de muestras. No
obstante la 2DGE, es todava muy til en algunos aspectos como son la
diferenciacin de isoformas de algunas protenas.
Otra posibilidad es utilizar la cromatografa de afinidad, de intercambio inico y procesos de interaccin hidrofbica, posteriormente se
recogen las diferentes fracciones y se analizan mediante LC-MS. La
cromatografa de intercambio inico retiene a los pptidos mediante
interacciones electrostticas y posteriormente son eluidos con un buffer
adecuado. El acoplamiento de la cromatografa de intercambio inico
utilizando LC en fase inversa, proporciona buenos resultados.
En protemica para identificacin y caracterizacin de protenas se
utilizan dos metodologas bsicas que son los mtodos bottom-up o de
abajo hacia arriba y los mtodos top-down o de arriba hacia abajo.
4.2.1.
4.2.1.1.
Mtodos bottom-up y mtodos top-down

Mtodos bottom-up o de abajo hacia arriba
Se obtiene una informacin a nivel peptdico, en relacin a su masa

o su secuencia para identificar una protena. Esta metodologa puede
considerarse consolidada y se utiliza de forma habitual, especialmente
en investigacin. En el mercado ya existen equipos en lnea y totalmente automatizados que utilizan bottom-up. Se aplica a protenas
purificadas o a mezclas de protenas. Su limitacin es que solo permite identificar un pequeo porcentaje del total de los pptidos de una
protena.
Consiste en la digestin enzimtica de la muestra de protenas mediante tripsina o a veces digestin qumica, obtenindose pptidos pequeos. Los productos resultantes tras la digestin de los pptidos (digeridos
de protenas) son separados y analizados por espectrometra de masas en
tndem MS-MS.
Para separar mezclas complejas se acopla la cromatografa de lquidos con la espectrometra de masas LC-MS o masas en tndem LC-MS153
MS. Cuando se separan las protenas por HPLC monodimensional un

criterio para estimar la separacin de los pptidos es determinar la capacidad de pico que se ha definido como el mximo nmero de picos que
pueden ser separados, con una resolucin convenida y con una columna
de una determinada longitud (8). Depende de las condiciones experimentales, por lo que vara con el tipo de columna utilizada y aunque estas pueden optimizarse para incrementar la capacidad de pico, solamente pueden
resolverse mezclas simples de pptidos. Si se trabaja con muestras muy
complejas, que pueden contener 1.000 protenas y ms de 50.000 pptidos, se requieren potentes tcnicas de separacin como la cromatografa
lquida multidimensional (MDLC) que se ha comentado previamente.
Como se necesita informacin sobre estructuras biolgicas cada vez
ms complicadas, se ha desarrollado una metodologa que se denomina
shotgun proteomics (protemica aleatoria), que se ejecuta en un equipo
hbrido (acoplado) y consiste en realizar el proceso de separacin mediante cromatografa multidimensional y posteriormente, analizar los
compuestos, ya separados, mediante la espectrometra de masas en tndem LC-MS-MS. Este sistema se ha revelado particularmente efectivo,
debido a que los datos obtenidos pueden usarse directamente para identificar pptidos y en consecuencia determinar qu protenas (digeridas o
no) hay en la mezcla (36, 37).
La estrategia shotgun une la metodologa de separacin cromatogrfica y la MS como sistema detector. Los recientes avances de MS en
tndem, juegan un papel importante en la deteccin y secuenciacin de
pptidos, por ejemplo: el reciente desarrollo de analizadores de trampa
de iones lineales (LIT), al ser muy sensibles y permitir un barrido rpido, consiguen obtener diez espectros en 1-2 segundos, esta velocidad de
barrido proporciona picos ms estrechos, lo que supone una elevada
eficacia en la separacin.
4.2.2.2.
Mtodos top-down o de arriba hacia abajo
En la actualidad en el campo de la protemica, adems del protocolo

bottom-up, se practica el protocolo top-down efectundose el anlisis sobre la protena intacta, sin la etapa de la digestin proteoltica y
por tanto su fragmentacin se realiza dentro del espectrmetro de masas.
En este caso, para determinar la masa de la protena intacta, 2 Da, se
154
ESPECTROMETRA
utiliza un espectrmetro de alta resolucin seguida de una bsqueda

en una base de datos. La identidad de la protena puede ser posteriormente confirmada mediante la obtencin, por espectrometra de masas
en tndem de iones fragmentos de una secuencia especfica de la protena intacta. Tambin proporciona informacin sobre modificaciones
postraduccionales. Este mtodo se utiliza para protenas de pequeo
tamao.
En MS/MS la cmara de fragmentacin CID no suele ser eficiente
para una protena de peso molecular alto, adems puede ser difcil determinar los iones producidos cuando se desconocen simultneamente la
carga y la masa, sobre todo si la carga es alta. La mejor eleccin para
mtodos top-down son los espectrmetros FT-ICR que proporcionan
unas medidas exactas de la masa con resolucin alta. Tambin se ha
utilizado el espectrmetro Orbitrap con prestaciones similares. Los estudios top-down se realizan slo en equipos con ionizacin por electrospray ESI del tipo ESI-FT-ICR con excitacin mediante ECD (electron capture dissociation) e IRMPD (infrared multiphoton dissociation).
La principal ventaja de ECD es la preservacin de las caractersticas de
las modificaciones postraduccionales.
Las dos principales cualidades de top-down son: ser clave para el
estudio de modificaciones postraduccionales y por otra parte eliminar la
digestin de las protenas. Sin embargo, presenta varias limitaciones
como son: trabajar exclusivamente con protenas altamente purificadas;
no poder analizar fcilmente y de modo rutinario las protenas de alto
peso molecular. Aunque ya se han superado los 50.000 Da todava es
difcil el anlisis en lnea, debido a la baja eficiencia de ECD y ETD
(electron transfer dissociation). La instrumentacin es muy cara y necesita un importante desarrollo de la bioinformtica para poder utilizarse
la metodologa top-down de forma generalizada.
4.2.2.3.
4.2.3.3.
Identificacin de las protenas con los mtodos bottom-up

y top-down
Se utilizan dos mtodos:

a) Mapeo peptdico (peptide mapping) que consiste en comparar
los pptidos obtenidos mediante una bsqueda en una base de datos para
155
identificar la huella peptdica de masas (peptide mass fingerprint). La

protena patrn tambin ha sido sometida a una digestin para generar un
conjunto de fragmentos que son nicos y caractersticos de esa protena.
El peso molecular de cada fragmento se calcula exactamente ( 0,5 Da)
utilizando MALDI-MS o ESI-MS. Para comparar el patrn y el problema
se establece la correlacin entre estas masas con las masas tericas de los
pptidos. Como mnimo para considerar identificada una protena se requiere que se identifiquen cuatro o cinco pptidos.
b) Otro mtodo de identificacin es la etiqueta de secuencia peptdica (Peptide sequence tag) en este caso la identificacin se basa en
correlacionar los patrones de fragmentacin de las muestras problemas,
obtenidos mediante la espectrometra de masas en tndem (MS/MS) con
las secuencias de los aminocidos que se encuentran en las bases de
datos para una de las protenas. Los patrones de fragmentacin de los
pptidos se comparan con patrones tericos obtenidos por ordenador en
las bases de datos. El uso de patrones de fragmentacin permite discriminar mejor que la huella peptdica de masas.
En el mercado existen diferentes equipos o plataformas para estos
estudios aunque ninguna de ellas permite un estudio completo de un
proteoma en una muestra biolgica, por lo que debern utilizarse mtodos complementarios para obtener la informacin requerida. Una de
estas plataformas se denomina MudPIT (peptide sequence tags with
multidimensional protein identification technology) basada en la metodologa shotgun.
4.3.
Mtodos cuantitativos
El objetivo de los mtodos cuantitativos mediante espectrometra de

masas es proporcionar una determinacin exacta y fiable de la cantidad
de un analito problema en una muestra real. Esta tcnica es adecuada y
presenta numerosas ventajas en el anlisis cuantitativo, especialmente si
se utiliza acoplada con mtodos de separacin de alta resolucin.
Para que sea factible la determinacin cuantitativa de los biomarcadores es necesario obtener medidas muy exactas de pequeas variaciones en la intensidad de la seal analtica que proporciona el biomarcador, ya que se encuentra a bajos niveles de concentracin y en matrices
156
ESPECTROMETRA
muy complejas por lo que se requiere trabajar con el nmero de muestras necesario para minimizar la posible divergencia de los resultados
debidos a la manipulacin de la muestra y a la influencia del mtodo
analtico. Es importante sealar que cuando se trabaja con mtodos analticos cuantitativos hay que validarlos en las condiciones rutinarias en
las que se va a trabajar con ellos, ello conlleva una serie de estudios para
determinar los parmetros de calidad como precisin, exactitud, lmite
de cuantificacin, intervalo lineal, especificidad y robustez.
En protemica, los mtodos cuantitativos se utilizan para identificar
las protenas que se expresan de manera diferencial en una muestra
biolgica. La expresin diferencial de las protenas es causada por una
enfermedad, stress debido a factores externos como medicamentos, toxinas o manipulaciones experimentales. La protemica cuantitativa puede
ayudar a identificar los biomarcadores de una enfermedad concreta y
permitir su diagnstico temprano, ayudando a la prevencin de la enfermedad o a su valoracin clnica (38-40).
La cuantificacin por electroforesis en gel bidimensional es considerada la tcnica estndar para la cuantificacin protemica y su versin
ms actual es la electroforesis en gel bidimensional con posterior anlisis del electroferograma obtenido. Las protenas separadas se visualizan con un colorante que tie las protenas, en las muestras control y en
la problema. Posteriormente las bandas de las protenas se detectan
mediante un barrido del gel con radiaciones de longitudes de onda
adecuadas.
Para cuantificar biomarcadores por CL-MS, la calibracin se realiza con los mtodos de estndar externo o interno y por adicin estndar.
Hay diversas metodologas pero se exponen solamente los mtodos SIM
y SRM.
4.3.1.
SIM: control selectivo de iones (selected ion monitoring)
Este trmino describe la forma de operar del espectrmetro de masas

en la cual, no se registra el espectro de masas completo sino nicamente
se registran las intensidades de una serie de iones especficos. Se realiza
haciendo pasar la muestra a travs de una columna cromatogrfica, o de
electroforesis capilar, acoplada al espectrmetro de masas. Se realiza un
157
barrido en un intervalo muy pequeo de masas, generalmente una unidad, por lo que slo son detectados los compuestos inicos con la masa
comprendida en ese intervalo, que son los que aparecen en el espectro.
El espectro SIM es una grfica de la intensidad relativa de la corriente
de iones en funcin del tiempo y se denomina cromatograma de masas
(Figura 8). En general se trabaja cclicamente con tres o cuatro valores
de m/z mediante un cambio rpido de un valor a otro y los espectros se
componen de varios picos.
FIGURA 8. a) Espectro de masas general. b) SIM: Control selectivo de iones. Cromatograma

de masas: El espectrmetro realiza un barrido en un intervalo muy pequeo de masas y
aparecen los iones correspondientes a esas masas. c) SRM: Control selectivo de reaccin. Se
selecciona en el espectrmetro un nico in de masa m/z.
158
ESPECTROMETRA
Para eliminar interferencias, cuando la seal de inters a un valor

m/z, es producida por ms de un compuesto, se puede trabajar con MS
en tndem. Este mtodo se puede aplicar a muestras complejas, como
suero o plasma, en el que muchos compuestos tienen la misma masa y
en particular, si se utiliza electrospray como sistema de ionizacin al
ser an ms probable que existan varios iones que presenten la misma
m/z. Las reas de los picos son proporcionales a las concentraciones, lo
que permite utilizarlas en anlisis cuantitativo.
4.3.2. SRM: control selectivo de reaccin (selected reaction
4.3.2. monitoring)
Es la forma de trabajar ms utilizada en las determinaciones cuantitativas por espectrometra de masas. En este mtodo aparece un solo
pico en el espectro debido a un nico in lo que lo hace ideal para
cuantificacin. Este pico puede ser monitorizado y cuantificado en
matrices complejas.
Conceptualmente significa trabajar con espectrometra de masas
en tndem MS/MS pero seleccionando una nica masa (m/z) del espectro, que corresponde a un fragmento inico del compuesto problema
(Figura 8).
Su forma de operar se basa en obtener en el primer espectrmetro
de masas varios fragmentos y entre ellos, el in precursor del analito
problema MS1. Este in precursor al introducirse en el segundo espectrmetro y en la cmara de ionizacin CID (collision-induced dissociation) se fragmenta en iones en fase gaseosa.
Para seleccionar el in precursor es conveniente que la reaccin elegida para la cuantificacin sea especfica del analito; que proporcione una
seal detectable en un intervalo y poder disponer de un estndar interno
marcado isotpicamente, del mismo compuesto. En las determinaciones
cuantitativas solamente se trabaja con el pico (m/z) correspondiente a este
in y esto lo hace ventajoso frente a SIM pues realmente hay una unin
trazable entre el analito y el in determinado. Su limitacin es que su
sensibilidad es menor que en SIM y el coste del equipo es mayor.
En protemica para cuantificar biomarcadores utilizando espectrometra de masas hay dos metodologas basadas en la utilizacin, o no,
159
de marcadores. Los metodos ms utilizados son con marcadores y corresponden a ICAT (Isotope-Coded Affinity Tags), iTRAQ (isobaric tags
for relative and absolute quantitation), SILAQ (stable isotope labeling
with aminoacid in cell culture). A modo de ejemplo se expone uno de
ellos.
El primer mtodo para cuantificar protenas es ICAT y se emplea
con espectrometra de masas en tndem. Se aplica en el estudio del
perfil de expresin diferencial de protenas entre dos muestras diferentes. Cada una de las dos muestras se marca con un reactivo de ICAT
diferente. Se presenta un esquema en la Figura 9. El reactivo ICAT
consiste en tres componentes funcionales: un marcador de afinidad como
biotina, para facilitar la purificacin mediante cromatografa de afinidad, un enlazante (linker) que puede contener istopos estables y un
grupo reactivo con especificidad hacia los grupos tioles.
FIGURA 9.
160
Esquema del mtodo ICAT.
ESPECTROMETRA
Puede ser ICAT ligero D0 (hidrgeno) o con ICAT pesado D8 (deuterio) y difieren en la masa (8 Da) debido a la composicin de istopos.
Posteriormente las dos muestras marcadas se mezclan y se digieren con
tripsina. Se procede a la separacin de los pptidos marcados con ICAT,
en una columna de afinidad y a su anlisis mediante MS. La intensidad
relativa de los pptidos de cada muestra, indica la abundancia de la
protena en las muestras. La fragmentacin del pptido mediante MS/
MS permite determinar la secuencia de aminocidos y conduce a la
identificacin de la protena.
Los valores cuantitativos se establecen comparando la intensidad
D0/D8. Sus ventajas son que permite realizar, en el mismo anlisis, la
identificacin de las protenas y la comparacin de los niveles de expresin; por otra parte evita la electroforesis para cuantificar las protenas.
Sus limitaciones son su baja sensibilidad para protenas poco abundantes y que se utiliza solamente para protenas que contienen cistena, sin
embargo esta se encuentra presente en la mayora de ellas. Otras limitaciones son su prctica larga, laboriosa y de elevado coste.
4.4.
Miniaturizacin: Microfludica y espectrometra de masas
En los procesos analticos hay una clara tendencia dirigida hacia la

simplificacin, la automatizacin y la miniaturizacin. La miniaturizacin, es un mbito analtico que lleva implcito el consiguiente desarrollo
en la instrumentacin esto sucede porque permite trabajar con cantidades
de muestra muy pequeas, y en sucesivas operaciones, a una escala no
factible para el analista. Se pueden aplicar principios operacionales innovadores, que son irrealizables cuando se trabaja a nivel de macroescala.
El objetivo final de los sistemas miniaturizados est representado por los
-TAS (micrototal analysis system) tambin llamados lab-on-a-chip
(41). Puede afectar a todo el proceso o solamente a parte de l. El desarrollo de microestructuras y de la microfludica est modificando fundamentalmente las tcnicas electroqumicas pero tambin afecta a otras
como la cromatografa o la electroforesis.
La espectrometra de masas no poda ser ajena a esta tendencia y en
los ltimos aos la miniaturizacin est resolviendo demandas de alta
sensibilidad y posibilidad de acoplamiento entre distintas tcnicas (42).
161
El acoplamiento de un microchip o dispositivos microfludicos con la

MS, presenta ventajas para ambos. Por una parte las caractersticas, ya
expuestas, de la MS y por otra parte el uso de la microfludica como
fase preanaltica, proporcionan nuevas posibilidades desde el punto de
vista analtico. El desarrollo de las estrategias que combinan microfludica con MS, puede llegar a lograr una deteccin de protenas ms
rpida y sensible que un sistema de MS en tndem.
El trabajo con dispositivos microfluidicos es un rea de investigacin relativamente nueva. La microfludica funciona de acuerdo con
principios bien establecidos que se caracterizan por algunas particularidades que los distingue de la instrumentacin utilizada a escala normal
como son: todas las etapas analticas del proceso se realizan en un
sistema integrado, anlisis muy rpidos de muestras en pequesimas
cantidades, anlisis multiplex (realizacin simultnea de diversos anlisis en una sola etapa), automatizacin y procesos con alta velocidad de
muestreo (high-throughput). Los expertos coinciden en que, las claves
para las futuras plataformas high-throughput, son la miniaturizacin, los
anlisis en paralelo, la automatizacin y los equipos integrados. Estos
aspectos, son los que hay que considerar al trabajar con microfludica,
microelectrnica y nanotecnologa. Los objetivos crticos son, conseguir
una elevada velocidad de muestreo, datos de la mayor calidad posible y
todo ello al menor coste por unidad. Hay que tener en cuenta que lo que
los investigadores pretenden es conseguir el anlisis de clulas aisladas
as como de molculas nicas.
Los dispositivos para microfludica incluyen una variedad de elementos que permiten realizar operaciones como son el bombeo, la dispensacin de muestras, purificado de la muestra, mezclado, separacin,
las reacciones qumicas y la deteccin. Estos dispositivos trabajan con
muestras del orden de microlitros, llegndose a volmenes de nanolitros
y picolitros.
La introduccin de la muestra, la separacin, el marcado y la deteccin, se realizan en algunos minutos o incluso en segundos. Una ventaja
de la miniaturizacin, es que muchas de las configuraciones de los elementos ms innovadoras, slo son factibles si se desarrollan en formato
micro. La posibilidad de utilizarlas como multiplex es un beneficio
aadido. Cuanto ms pequeo es el dispositivo, la relacin superficie
respecto a volumen aumenta, por lo que los fenmenos superficiales,
162
ESPECTROMETRA
que afectan a la calidad analtica, son especialmente relevantes en el

mbito de la microescala.
Se han acoplado elementos para microfludica con sistemas de ionizacin ESI y MALDI. En el mercado ya hay dispositivos para la cuantificacin y expresin diferencial de pptidos con esta tecnologa y se
ha conseguido incluir en un chip, de tamao menor a una tarjeta de
crdito, una nanocolumna (75 mm) y precolumna para preconcentracin
de la muestra; una punta emisora para la formacin del nanospray e
ionizacin de la muestra as como las conexiones microfludicas necesarias (43). En la bibliografa estn descritos numerosas estrategias con
esta tecnologa. Se ha evaluado la aplicabilidad en protemica de estos
dispositivos acoplados, o con deteccin de MS en el anlisis de diversas
muestras y se ha demostrado que se obtienen resultados similares a los
obtenidos con una instrumentacin convencional, siendo capaces de
detectar componentes peptdicos a nivel de fentomoles y atomoles. Este
aspecto resulta especialmente interesante dado que la cantidad de muestra en protemica es muy limitada y los componentes que actan como
biomarcadores se encuentran habitualmente presentes a nivel de ultratrazas, por lo que es crtico seleccionar procedimientos analticos que garanticen la mnima prdida de muestra. Los dispositivos miniaturizados
pueden reducir sustancialmente este problema as como evitar la contaminacin. Los equipos tienen una superficie de contacto con la muestra
mnima, previniendo as las prdidas por adsorcin en la superficie del
instrumento. Estos equipos, al tener un formato multiplex, permiten no
slo anlisis de screening y high-throughput, sino tambin el procesado
en paralelo, de un conjunto de muestras sin que haya contaminacin
como consecuencia de las operaciones previas.
Los dispositivos microfludicos son especialmente tiles para descubrir nuevos biomarcadores, sobre todo cuando lo que interesa es obtener
un mapa de todos los componentes peptdico/proteicos de un fluido
biolgico o de un tejido al no ser necesario conocer todo el perfil de la
muestra, la clave est en analizar subfracciones de la muestra que sean
relevantes y se encuentren, en un nmero suficiente, formando parte de
los componentes del biomarcador.
163
5.
CONCLUSIONES Y CONSIDERACIONES FINALES
Este trabajo presenta una recopilacin de la espectrometra de masas

y se demuestra que en la actualidad, es una tcnica imprescindible para
resolver problemas analticos en el campo clnico, y en particular en estudios de biomarcadores.
En la identificacin de marcadores, especialmente protenas, los
sistemas de ionizacin ms utilizados son MALDI y ESI. Se utilizan con
distintos analizadores que se acoplan de forma diferente segn el problema analtico a resolver pero en general: MALDI se acopla con TOF
y ESI se acopla con Q-Q-Q o LIT.
La espectrometra de masas en tndem MS/MS se acopla con analizadores del tipo Q-Q-Q, TOF-TOF; Q-TOF y Q-LIT. Se combina con
tcnicas de separacin multidimensionales como MDLC. El acoplamiento con las tcnicas de separacin, puede ser con MS o con MS/MS.
Las estrategias, bottom-up y top-down, presentan diferentes campos
de aplicacin y aunque ambas tienen sus limitaciones, seguirn coexistiendo hasta que aparezca alguna innovacin importante. Las caractersticas de la miniaturizacin permiten vislumbrar un prometedor futuro y
un amplio campo de aplicacin para el descubrimiento y validacin de
biomarcadores.
Los cientficos continan haciendo grandes esfuerzos para mejorar
las prestaciones de esta tcnica, especialmente en el desarrollo de nuevas sistemas de ionizacin, interfaces para el acoplamiento de diferentes
tcnicas y en el campo de la miniaturizacin, por lo que la informacin
analtica progresar notablemente. No obstante, persisten muchos problemas no resueltos y es conocido que mucha informacin en protemica est muy cuestionada (44, 45) especialmente por la falta de reproducibilidad en los datos.
Es justo reconocer que los retos analticos son difciles: trabajar con
muestras complejas en separaciones de compuestos muy similares, la
identificacin y cuantificacin de los mismos cuando su concentracin
es mnima y la cantidad de muestra escasa, demostrar pequeas diferencias del mismo compuesto en distintas circunstancias o ser capaces de
realizarlo en las matrices biolgicas, son indicativos de la dificultad que
implica.
164
ESPECTROMETRA
No obstante, debido a los equipos sofisticados, en muchos casos se

olvida que se utiliza un procedimiento analtico, por lo que conviene
recordar que para evitar errores se requiere calidad analtica y no slo
instrumental. Hay que considerar todos los parmetros de calidad de los
mtodos analticos, como el diseo previo del mtodo y la mejora de la
reproducibilidad en el tratamiento de la muestra para obtener replicados.
La validacin del mtodo es crtica; si una metodologa no puede ser
validada, el estudio necesita volverse a disear. Fundamentalmente se
requiere exactitud y reproducibilidad del mtodo, as como mejor resolucin o rango dinmico. No hay que olvidar las pruebas estadsticas
para el manejo de datos y la correcta interpretacin de los resultados lo
que permite llegar a conclusiones verdaderas. Todo ello con equipos
verstiles, de fcil manejo que permitan trabajar con cantidades mnimas, coste accesible y en el mnimo tiempo posible son los desafos que
tienen los cientficos que trabajan en este mbito.
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Espectrometría de Masas y Análisis de Biomarcadores

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4.

Espectrometra de masas y anlisis

Seccin Departamental de Qumica Analtica. Facultad de Farmacia.

M. CARMEN MARTN GMEZ y MILAGROS BALLESTEROS GONZLEZ

DE MASAS Y ANLISIS DE BIOMARCADORES

La espectrometra de masas (MS) es una tcnica consolidada, que

M. CARMEN MARTN GMEZ y MILAGROS BALLESTEROS GONZLEZ

disear procedimientos analticos en relativamente poco tiempo, permite

DE MASAS Y ANLISIS DE BIOMARCADORES

M. CARMEN MARTN GMEZ y MILAGROS BALLESTEROS GONZLEZ

el estudio de biomolculas y destacando los aspectos ms relevantes de

La espectrometra de masas es una tcnica analtica en la que los

Ionizacin de la muestra, en la que se transforman los tomos

DE MASAS Y ANLISIS DE BIOMARCADORES

Esquema de un espectrmetro de masas.

COMPONENTES DE LOS ESPECTRMETROS

Sistemas de introduccin de la muestra:

Sistemas de ionizacin en fase gaseosa:

2.1.a. EI: Ionizacin por impacto de electrones.

Sistemas directos e indirectos.

M. CARMEN MARTN GMEZ y MILAGROS BALLESTEROS GONZLEZ

Sistemas o fuentes de desorcin:

2.2.a. ESI: Ionizacin por electrospray.

2.2.c. FAB: Bombardeo con tomos acelerados.

MODALIDADES Y OPERACIONES EN ESPECTROMETRA DE MASAS

TOF: De tiempo de vuelo.

II. a) Espectrometra de masas en tndem.

El espectro resultante es un grfico que representa la abundancia

DE MASAS Y ANLISIS DE BIOMARCADORES

dependen del tipo de instrumento, del mtodo de ionizacin y de su

Sistemas de introduccin de la muestra

Los espectrmetros de masas ms modernos estn equipados con

La ionizacin de un analito es una etapa crucial en el anlisis de

M. CARMEN MARTN GMEZ y MILAGROS BALLESTEROS GONZLEZ

Los sistemas de ionizacin o fuentes de ionizacin tienen diferente

Sistemas de ionizacin en fase gaseosa

2.2.1.a. EI: Ionizacin por impacto de electrones

DE MASAS Y ANLISIS DE BIOMARCADORES

Sistemas o fuentes de desorcin

M. CARMEN MARTN GMEZ y MILAGROS BALLESTEROS GONZLEZ

Se ha comentado que son las fuentes de mayor aplicacin en el

Esquema de un sistema de ionizacin ESI: electrospray.

DE MASAS Y ANLISIS DE BIOMARCADORES

molecular, y si se desea obtener una fragmentacin, se puede inducir

Ionizacin por desorcin con lser

En las primeras aplicaciones se utiliz un haz de radiacin lser para

M. CARMEN MARTN GMEZ y MILAGROS BALLESTEROS GONZLEZ

MALDI: Ionizacin por desorcin con lser asistida

El desarrollo de este sistema de desorcin se realiz por dos grupos

DE MASAS Y ANLISIS DE BIOMARCADORES

posteriormente sufre una relajacin, cediendo la energa emitida a las

M. CARMEN MARTN GMEZ y MILAGROS BALLESTEROS GONZLEZ

SELDI: Ionizacin por desorcin con lser inducida

FAB: Bombardeo con tomos acelerados

Este sistema de ionizacin es til para el estudio de especies polares

DE MASAS Y ANLISIS DE BIOMARCADORES

como matriz, se bombardea con un haz de tomos o iones de elevada

DART: Ionizacin por anlisis directo en tiempo real

Es una nueva tcnica de ionizacin a presin atmosfrica en la que

El analizador de masas constituye el corazn de un espectrmetro de

M. CARMEN MARTN GMEZ y MILAGROS BALLESTEROS GONZLEZ

valo de masas que permite separar, de la exactitud de las masas que es

TOF: Analizador de tiempo de vuelo