Purificacion step
Cell-free extract
ConA-Sepharo se
Mono Q
Mono P
Total
Protein
Total
activity
Specific
Activity
Yield
Purification
factor
mg
unitsa
unitsa/mg
Fold
227.5
5.6
0.67
0.36
56.00
43.75
25.95
14.70
0.246
7.81
38.73
40.83
100
78.1
46.34
26.25
1
31.75
157.44
165.97
10
11
12
13
14
15
16
Funcin biolgica
Antigenicidad
Contenido en carbohidrato
Grupos sulfhidrilos libres
Capacidad de ligar metales
Tipo de cromatografa
Filtracin por gel
Cromatografa de intercambio inico.
Cromatoenfocado
Cromatografa de interaccin
hidrofbica
Cromatografa en fase reversa
Cromatografa de afinidad
Inmunoadsorcin
Cromatografa con lectinas
inmobilizadas
Cromatografa covalente
Cromatografa de quelatos metlicos
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CROMATOGRAFIA
Separacin diferencial de los componentes de una muestra entre una fase
mvil y una fase estacionaria.
La fase mvil es el solvente en que se introduce la muestra y con el que se
eluyen las protenas (puede ser el mismo o variar durante la corrida).
La fase estacionaria comprende las partculas, en general esfricas, con que
se llena la columna. Estas partculas estn formadas por una matriz y, en
la mayora de los casos, molculas de menor o mayor tamao con las que se
la derivatiza, para adaptarla a los diferentes procedimientos
cromatogrficos.
La matriz es el sustrato slido de la fase estacionaria. Las ms comunes son
celulosa, dextrano, agarosa, poliacrilamida y silica.
Deben tener buena estabilidad mecnica y qumica, alta capacidad, tamao
y forma adecuada de poros, superficie inerte para minimizar las
interacciones no especficas, y tamao de partcula adecuado al flujo de
solvente deseado y a la presin operativa.
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TIPOS DE CROMATOGRAFIA
Segn la presin a que se opera la corrida, se pueden considerar tres tipos:
1.
2.
3.
Corridas a alta presin (HPLC, high-pressure - o high-performance liquid chromatography). Presiones mayores de 50 bar. Requiere
matrices de rigidez alta, partculas pequeas y columnas y tuberas de
material altamente resistente a la presin, como el acero inoxidable o
el titanio.
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LPLC
Tamao de partcula ()
100
Flujo (ml.cm-2.h-1)
10 - 30
<5
> 50
Hasta 24
1-3
Volumen de muestra
ml - litro
l - ml
Etapa de purificacin
Variable
En general tarda
Buena
Excelente
Resolucin
Dificultades
HPLC
10
100 - 300
Largo tiempo,
cmara fra
Posible desnaturalizacin
por presin.
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30
Nombre
Abreviatura
Aninico fuerte
- CH2N+(CH3)3
- C2H4N+(C2H5)3
Trimetilaminometil
Trietilaminoetil
TAM TEAE -
Aninico dbil
- C2H4N+H3
- C2H4N+(C2H5)2
Aminoetil
AE -
Dietilaminoetil
DEAE -
Sulfo
S-
Sulfometil
SM -
Carboxi metil
CM -
Catinico fuerte
- SO3- CH2 SO3Catinico dbil
- CH2 - COO-
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CROMATOENFOCADO
El cromatoenfocado puede ser considerado como una extensin del
isoelectroenfocado (IEF) y la cromatografa de intercambio inico.
En IEF las protenas se separan por electroforesis en un gradiente de pH; se
aplica en electroforesis bidimensional.
En cromatografa de intercambio inico se puede eluir con un gradiente de
pH, que se forma fuera de la columna.
En cromatoenfocado, el gradiente se forma dentro de la columna, mezclando
una matriz de intercambio aninico pre-ajustada a un valor de pH, con un
buffer de pH ms bajo.
La protena al descender en la columna encontrar valores crecientes de pH;
cuando llegue a su pI se volver electronegativa, y se unir a la matriz
positivamente cargada.
Como el buffer sigue corriendo, la protena se
separar y unir sucesivamente, hasta eluirse en una banda muy definida
(enfocada) al pH correspondiente a su pI.
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CROMATOGRAFIA COVALENTE
A pH 8, reaccionan la mayor parte de las protenas que contienen Cys-SH; a pH 4,
slo las que tienen Cys residuos con un pKa muy bajo, como la papana.
La columna se regenera con 2,2-dipiridildisulfuro. La piridin-2-tiona absorbe a 343 nm
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CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
Se basa en que todas las protenas tienen sitios de unin para algn ligando, ya
sea una molcula pequea (p.ej.: un anlogo del sustrato de una enzima, una
hormona para un receptor) u otra protena (p-ej.: la Concanavalina A para unir
glicoprotenas de alta manosa, o anticuerpos especficos para ligar sus antgenos).
El ligando elegido para la protena que se desea purificar debe inmovilizarse
sobre una matriz adecuada.
La especificidad del ligando puede ser absoluta (p.ej.: avidina para carboxilasas
con biotina) o relativa (p.ej.: Cibacron Blue para dehidrogenasas NAD o NADPdependientes). La afinidad de la protena por el ligando debe ser moderada (KL
entre 10-4 y 10-8 M) para permitir una buena unin y una disociacin ulterior del
complejo en condiciones no desnaturalizantes.
Para desarrollar el material para cromatografa de afinidad, primero hay que
activar la matriz (p.ej.: agarosa con BrCN) y luego fijarle el ligando. El material
debera ser lo suficientemente estable como para permitir su reutilizacin.
Se pueden expresar protenas recombinantes como fusiones que permiten aplicar
cromatografa de afinidad (glutation S-transferasa y GSH-Sepharosa; maltosebinding protein (MBP) y maltosa-agarosa).
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CRUZIPAINA
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Purificacion step
Cell-free extract
ConA-Sepharose
Mono Q
Mono P
Total
Protein
Total
activity
Specific
Activity
Yield
Purification
factor
mg
unitsa
unitsa/mg
Fold
227.5
5.6
0.67
0.36
56.00
43.75
25.95
14.70
0.246
7.81
38.73
40.83
100
78.1
46.34
26.25
1
31.75
157.44
165.97
54
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PROTEINAS INTEGRALES
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60
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65
66
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