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Tema 6

Cuantificacin de protenas
Procedimiento de estudio de protenas
Seleccin de fuente
Fraccionamiento de clulas
Centrifugacin

Cromatografa
Cromatografa en capa fina
Cromatografa en columna
Cromatografa de intercambio inico
Cromatografa de exclusin molecular o filtracin en gel

Cromatografa de afinidad

Electroforesis
Electroforesis en acetato de celulosa
Electroforesis en geles de acrilamida (SDS-PAGE)

Procedimiento estudio de protenas


Seleccin de la fuente

1) Aislamiento de las protenas

Disgregacin del tejido


Ruptura celular

2) Purificacin

Cromatografa
Electroforesis

3) Determinacin de su
actividad

3) Determinacin de la
estructura primaria
3) Determinacin de sus
niveles de expresin

Seleccin de la fuente

Tejido
Disgregacin del tejido: (Colagenasa, quelantes del Ca++....... )
Separacin de las clulas

Cultivos celulares
Cultivos primarios
Lneas celulares

Fraccionamiento de las clulas


Qumicos

Mecnicos

Lisis osmtica

Homogenizacin

Detergentes

Sonicacin

Disolventes orgnicos
(acetona, etanol, TCA)

Congelacin

Separacin componentes celulares por CENTRIFUGACIN

Homogenado se somete a altas velocidades de giro

Separacin por tamao y densidad

Las molculas mayores se depositan antes

Estabilizacin de las protenas:


pH
Degradacin proteolitica
Temperatura

Fraccionamiento celular por CENTRIFUGACIN

Homogenado
1000g x 10 min
c. enteras, ncleos
y citoesqueleto

Separacin en funcin del tamao

20.000g x 20 min
mitocondrias,
lisosomas
y peroxisomas
80.000g x 1h
microsomas y
pequeas vesculas
150.000g x 3h
ribosomas, virus y
grandes macromolculas

Aumento de la velocidad de
centrifugacin

Separacin y purificacin de protenas

Se basa en la diferente:
Solubilidad

CROMATOGRAFA

Tamao
Carga elctrica

Densidad
Afinidad por otras molculas

ELECTROFORESIS

Cromatografa

Papel (capa fina): Aminocidos y Azcares


Cromatografa
Columna: Aminocidos y Protenas
Cromatografa sobre papel
(Cromatografa de reparto)

Cromatografa

CROMATOGRAFA EN COLUMNA
Las diferentes protenas se retrasan segn sus interacciones con la matriz, de
acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamao o unin a grupos qumicos
Muestra
aplicada

El solvente se aplica
contnuamente a la
boca de la columna

Matriz
slida
Molculas fraccionadas
eludas y recogidas

Tapn
poroso
Tubo de
ensayo
tiempo

http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html

Cromatografa
TRES CLASES DE CROMATOGRAFA EN COLUMNA
A) Intercambio inico:

B) Filtracin en gel:

en base a la carga

Flujo de solvente

C) de Afinidad:
en base a interaccin

en base al tamao

Flujo de solvente

Flujo de solvente
Partcula
cargada
positivamente
Molcula
cargada
negativamente
unida
Molcula
cargada
positivamente
libre

Partculas
porosas
Molcula
pequea
retrasada
Molcula grande
no retrasada

Partcula con
sustrato unido
covalentemente
Molcula de
enzima unida
Otras protenas
pasan de largo

http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html

Cromatografa de intercambio inico


Las protenas se separan segn
su carga a un pH determinado
(Ej: intercambio catinico)

Protenas
cargadas
positivamente se unen
a la matriz cargada
negativamente

Protenas
cargadas
negativamente pasan
sin unirse

Cromatografa de filtracin en gel o exclusin molecular


Las protenas se separan segn su tamao

Matriz de polmeros
de carbohidratos
Molculas pequeas
entran
entre
los
espacios
acuosos
dentro de la matriz
Molculas grandes no
entran dentro de los
espacios de la matriz

Cromatografa de afinidad
Las protenas se separan en funcin de la especificidad de unin a un ligando

Molculas que unen


glucosa se unen a
residuos de glucosa
(G) de la matriz

Adicin de glucosa
(G)

Molculas se liberan
tras la adicin de
glucosa
Enzima - Sustrato
Antgeno - Anticuerpo
Hormona - Receptor

Electroforesis

Papel, acetato de celulosa


Electroforesis
Gel: protenas (SDS-PAGE) y ac. nucleicos

Electroforesis en acetato de celulosa


Protenas plasmticas
Albmina

45-55% total
5-8%
Globulinas: a1
a2

8-13%

11-17%

15-25 %

Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

Formacin de un gel de
poliacrilamida

Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

Dodecil sulfato sdico

Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

Marcadores de peso molecular

Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

Protenas teidas con


Azul de Comassie
tras SDS-PAGE

Determinacin de las
masas moleculares

Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)


Protenas presentes en los sucesivos estadios de purificacin de una enzima
Carril 1: extracto de partida
Resto de carriles: protenas obtenidas despus
de fraccionamiento cromatogrfico
de la muestra del carril anterior

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