Variacin somaclonal

INTRODUCCION
Un hecho ampliamente reportado en los laboratorios de cultivo de tejidos y
micropropagacin vegetal, es que muchas plantas obtenidas in vitro
presentan diferencias fenotpicas, morfolgicas o bioqumicas en
comparacin con el fenotipo de las plantas donadoras de los explantes.
El cultivo in vitro per se puede ser muy estresante para las clulas vegetales
e involucra procesos mutagnicos durante el establecimiento del explante,
la induccin de callo, la formacin de embriones y la regeneracin de
plantas. Por esta va es posible obtener variacin, de origen nuclear y/o
citoplasmtica, que podra ser utilizada para el mejoramiento vegetal. Pero
en caso de conservacin de germoplasma y micropropagacion esto resulta
un problema, porque en estas tcnicas se requiere mantener la estabilidad
gentica (no exista cambios en el material gentico).
Ante Esto es necesario saber sobre los mecanismos que dan origen a la
variacin somaclonal, cuyo conocimiento permitir principalmente evitar o
aumentar el nivel de variabilidad de plantas, de acuerdo al objetivo que no
hemos planteado (evitarlo si se quiere mantener la estabilidad gentica
como en la micropropagacion, o aumentar la variabilidad como en el caso
de mejoramiento de plantas.
Este proceso, denominado variacin somaclonal por Larkin y Scowcroft
(1981), implica cambios en las plantas regeneradas que son transmitidos a
la progenie.
Larkin y Scowcroft (1981), distinguieron claramente dos tipos de causas: la
variacin epigentica transitoria, debida probablemente a las condiciones
de estrs generadas por las condiciones propias del cultivo de tejidos y
clulas in vitro, y las variaciones genticas verdaderas, producto de
mutaciones azarosas. En cualquier caso, el fenmeno se conoce como
variacin somaclonal. Las variaciones epigenticas, debido a su naturaleza,
son inestables y se revierten con una alta frecuencia en las lneas celulares,
sin que haya consecuencias fenotpicas en las plantas regeneradas
(Snchez-Chiang & Jimnez 2009). Por el contrario, la variacin somaclonal
de origen gentico s se transmite y expresa en la descendencia de las
plantas regeneradas.
Los primeros casos de variacin somaclonal fueron registrados en plantas
de reproduccin agmica como la caa de az- car y la papa, pero el
fenmeno ha sido ob- 84 CARDONE, Susana; OLMOS, Sofa; ECHENIQUE,
Viviana servado en monocotiledneas como trigo, maz, avena, arroz, pasto
miel (Paspalum dilatatum) y pasto llorn (Eragrostis curvula) y en
dicotiledneas como tabaco, tomate, zanahoria y col, entre muchas otras
especies.
Existen trabajos cientficos en los cuales demuestran que la variacin
somaclonal se presenta durante el proceso de cultivo de tejidos en vitrio.

Los cuales dan a conocer variacin somaclonal en propagacin mediante

meristemas, o en regeneracin via callos, aunque con respecto al primero
se reconoce muy ocacionalmente mientras que en regeneracin via callos
(clulas no diferenciadas) los reportes son muy nemerosos, en los que se an
observado cambios en la estructuras de cromosomas, poliploidia y
aneuploidia.
MECANISMOS POR LO QUE OCURRE LA VARIACIN SOMACLONAL
Variacion pre-existente
Sustenta la idea que la variacin somaclonal se originaria a partir
de la variacin pre-existente en las clulas del explante al momento
del cultivo. Esto indicara que el cultivo en si solo activara el
mecanismo de expresin de esta variacin en las plantas
regeneradas. Ej. En un trabajo se aislaron mutantes resistentes a
herbicidas a partir de regiones de hojas de plantas jvenes,
irradiadas y aspergadas con herbicida, que no fueron afectadas. Se
obtuvieron algunos regenerantes que se consrevan la resistencia al
herbicida.
Existe controversia debido que algunos autores consideran que la
variacin se produce en el transcurso del cultivo mas no es una
variacin pre-existente.
Alteraciones en el cariotipo
Existe un gran numero de reportes corcernientes a la variacin en el numero
de cromosomas en las clulas somaticas, donde la poliploidia es la
anormalidad cromosmica mas frecuente observada, seguida de la
aneuploidia, y en menor frecuencia la mixaploidia. Se observo en plantas de
cebada regeneradas de cultivo de anteras, donde se formo clulas
haploides, diploides, triploides, tetraploides y aneuploides, sino tambin
rutura de cromosomas, caa de azcar, papa, arroz, sorgo, mani y trigo.
Con respecto a esto existe una gran controversia si es que en realida
alteraciones en el cariotipo son causa de variacin gentica, debido q
cuando los cromosomas ya se han duplicado, la adicion o perdida de uno de
ellos usualmente no es letal. Estos cambios en el numero de cromosomas
estn mas asociados con la reduccin de la fertilidad..
Reordenamintos cromosmicos
Translocaciones reciprocas, delecciones, inversiones, translocaciones no
homologas y fragmentos acntricos.
Mecanismos que originan los reordenamirnos cromosmicos.
a. Replicacion tradia de la heterocromatina
El hecho de que la variacin somaclonal est asociada con las regiones
heterocromticas, puede deberse a que stas presentan una replicacin
tarda en la fase S (Turner 2001), que puede pro- piciar fallas en los
mecanismos de regulacin de la transicin entre las fases S y M del ciclo
celular (Lee & Phillips 1988)resultando aberraciones cromosmicas. Sin

embargo, aunque varias investigaciones sugieren que genomas con mayor

contenido de heterocro- matina generan ms variantes somaclonales que
aquellos con un contenido menor; otras han demostrado una relacin
inversa entre el contenido de heterocromatina y la variacin somaclonal
(Karp 1995).
Se a documentado mucho en el maz.
b. Desequilibrio en los depsitos intracelulares de nucletidos
Como todos ustedes saben no que el desoxiribonucleotido (dNTP) tiene una
importante influencia sobre varios componentes del metabolismo del ADN.
Ej. Biosintesis de precursores, replicacin, reparacin, recombinacin.
Entonces el desequilibrio de lso depsitos intracelulares de nucletidos
puede tener serias consecuencias genticas como mutaciones, aberraciones
cromosmicas estructurales, aneuploidia, intercambio de cromatinas
hermanas.
Recombinacin somtica
Lee y Phillip incuye a la recombinacin somatica como un posible origen del
reordenamiento de cromosomas en cultivo de tejidos.
Ocurre especialmente si los intercambios fueron asimtricos o entre
cromosomas no homologos. Sin embargo existe muy poca evidencia que
sustente la importancia de la recombinacin somatica en la generacin de
variacin somoclanal.
Elementos genticos tranponibles.
Son elementos de ADN que pueden moverse alrededor o insertarse en locus
particulares del cromosoma.
El hallazgo de elementos transponibles en cultivo de tejidos de maz, sugiri
una posible relacin entre la variacin somaclonal y estos elementos
mviles (Lee & Phillips 1988).
Los retrotransposones, al igual que los elemen- tos transponibles, pueden
generar alteraciones en las secuencias de ADN insertndose dentro o
prximos a los genes y subsecuente excision. Ms an, los
retrotransposones inducen mu- taciones que son relativamente estables
dado que ellos se transponen va replicacin, rete- niendo la secuencia en el
sitio de insercin. Estas mutaciones pueden ser causa de inacti- vacin
gnica o alteraciones en los patrones de expresin de los genes, o de la
estructura de las protenas que codifican (Kumar & Bennetzen 1999).
Un ejemplo notable de un mutsnte inducido en cultivos de tejidos. Que
parece estar asociado a con la actividad del tramposon, es un mutante de
alfalfa con color de flor inestable.
Amplificacion y disminucin de genes
Paraecen ser fenmenos de ocurrencia comn en cultivo in vitrio de larga
duracin, como resultado de la seleccin secuencial dentro de una poblacin

celular sometida a concentraciones graduales de un producto relacionado

con la expresin del mismo gen.
Ej. Suspensiones celulares de alfalfa, seleccionadas por su resitencia a ifosfinotricina, un inhibidor de ka glkutamina sintasa (GS), fueron
caracterizadas por una amplificacin de 4-11 veces mas de un gen GS y un
8 veces mas de elevacin en los niveles de ARNm.
Lo mismo se observo en plantas selccionadas de petunia tolerantes a Nglicina que es un inhibidor de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSP) sintasa
resulto una amplificacin de 20 veces del gen EPSP.
Pero sobre estos casos existen dudas sobre la estabilidad gentica de los
fenotipos obtenidos, debido a que estas variaciones se transmitieran
mediante herencia epigenetica.
Metilaciones del ADN.
En organismos eucariotas el ADN es frecuentemente modificado por
metilacin de residuos de citosina en 5-metilcitosina. Se ha observado que
en las plantas superiores la metilacin del ADN, arriba del 30%. La
metilacin del ADN ocurre normalmente y que actua como regulador de la
expresin de genes, controlador de los elementos de transposicin y de
defensa contra la presencia de ADFN forneo.
Pero cuando existe un incremento en la metilacin usualmente es
correlacionada con la perdida de la actividad gnica, tambin puede ocurrir
cuando la 5-metilcitosina es desaminada, entonces la 5-metilcitosina se
convierte en timina.
Existen varios trabajos que reportan que existen protenas que pueden
ligarse a a alguna secuencia metilada. Por ello es que la metilacin del ADN
puede alterar la estructura de la cromatina e indirectamente afectar la
expresin de muchos genes.
La demetilacion del ADN puede activar a genes que normalmente son
silenciosos o inactivos.
Existe tambin una relacin entre metilacin y los transposones, Ej, una
hiptesis sugiere que los tranposones cuando estn ijnactivados ellos
tambin estn metilados, pero cuandos estos estn activos, ellos no se
encuentran metilados. Esto se observo en 2 experimentos que implicaban a
los transposones Ac.
Presencia de Especies reactivas de oxgeno (ROS)
Las ROS son otra causa de variacin somaclo- nal, ya que su influencia
sobre el ciclo celular puede resultar en la generacin de mutacio- nes por el
dao oxidativo que ejercen sobre el ADN nuclear y organelar, a travs de un
poten- cial redox celular alterado (Cassells & Curry 2001). Son sustancias
que se originan como subproductos de las rutas metablicas norma- les de
la planta, especialmente en las reaccio- nes fotosintticas y de respiracin.
El sistema de transporte de electrones de la fotosntesis tiene el potencial
para producir especies acti- vas como el singlete de oxgeno y el radical superxido. Esta ltima molcula puede a su vez generar perxido de

hidrgeno (Arora et al. 2002). Aunque el radical superxido y el pe- rxido

de hidrgeno son relativamente poco peligrosos, en presencia de iones de
hierro o iones de cobre producen el radical hidroxilo, muy reactivo sobre los
sustratos orgnicos (Arora et al. 2002). En presencia de estos mis- mos
iones, las ROS tambin pueden generar molculas altamente mutagnicas,
tales como los radicales peroxil y alcoxil (Cassells & Cu- rry 2001). Bajo
condiciones fisiolgicas normales, los efectos y potenciales daos de estas
especies qumicas son controlados por sistemas en- dgenos que involucran
enzimas y diferentes sustancias antioxidantes que mantienen la
homeostasis de la clula vegetal. Sin embargo, los niveles de ROS se
incrementan bajo con- diciones de estrs. Las prcticas de corte del
explante al inicio del cultivo in vitro y en los subcultivos posteriores pueden
por s mismas generar estrs oxidativo, de la misma forma en que lo hacen
el hipoclorito y/o las sales de mercurio que se utilizan en la esterilizacin de
los tejidos (Cassells & Curry 2001). El dao oxidativo en el cultivo de tejidos
pue- de expresarse como hipermetilacin o hipo- metilacin del ADN,
cambios en el comple- mento cromosmico incluyendo poliploidas y
aneuploidas, rompimiento de las hebras cromosmicas, rearreglos
cromosmicos y deleciones y substitucin de bases nucleotdi- cas (Cassells
& Curry 2001).
Cambios en l ADN de organelos
FACTORES RELACIONADOS
SOMACLONAL

CON

LA

APARICIN

DE

VARIACIN

Genotipo: En general se asume que la frecuencia de cambios depender de

variaciones preexistentes en el genotipo y de las interacciones que surgen
entre el genotipo y el proceso de cultivo. El nivel de ploida es otro factor a
tener en cuenta, las variedades diploides muestran estabilidad, mientras
que las tetraploides tienden a generar aneuploidas durante el cultivo de
tejidos. La explicacin ms razonable es que los poliploides, con ms de dos
juegos completos de cromosomas, estn tamponados, y por lo tanto
toleran la ganancia o prdida de cromosomas, pudiendo as cumplir con los
requisitos impuestos por la regeneracin. En los diploides, la prdida o la
alteracin de cromosomas que llevan genes vitales impedir la regeneracin
de las plantas, llegando con xito a esta etapa slo aquellos explantes que
tengan su complemento cromosmico completo.
Tipo de Explanto: La variacin tambin puede ser una consecuencia de
quimerismo en el explanto original. Las quimeras son mosaicos genticos.
Esto significa que dentro de una misma planta existen clulas con diferente
constitucin gentica, lo cual se debe a una serie de cambios producidos
durante el desarrollo en el ADN nuclear de ciertos tipos celulares. Si estos
tejidos se utilizan como explantos y sus clulas son inducidas a dividirse y
rediferenciarse, las diferentes lneas celulares podran entonces dar origen a
plantas genticamente diferentes. Por lo tanto, la utilizacin de explantos
con tejidos quim- ricos preexistentes puede resultar en una fuente extra de
variacin.
La va de regeneracin: tambin tiene un rol importante en la ocurrencia de
alteraciones en plantas obtenidas in vitro.

La iniciacin de un callo puede ser anloga a la respuesta de las plantas a

heridas, que se sabe que activan elementos transponibles y estimulan la
induccin de enzimas y productos especficos que se inducen tambin en
situaciones de estrs. Cuando comienza la divisin celular a partir de tejidos
diferenciados, que dar origen a un callo, se incrementa el riesgo de
inestabilidad cromosmica. La variacin que ocurre en los nmeros
cromosmicos en la primera fase de la induccin del callo sera el resultado
de fragmentacin nuclear seguida por mitosis de los fragmentos nucleares,
combinada con la mitosis normal de los ncleos intactos (ncleos
euploides).
Un callo verdadero es una masa de clulas desdiferenciadas que proliferan
desorganizadamente, lo cual probablemente genera considerable variacin.
En varias monocotiledneas, el callo representa, a menudo, una masa de
rganos suprimidos o proembriones ms que un tejido completamente
desorganizado.
En un estudio realizado en Cymbopogon se observ que muchas de las
plantas regeneradas a partir de callos de semilla fueron anormales,
mientras que las obtenidas por callos de inflorescencias fueron muy
semejantes a las plantas de las cuales provenan los explantos.
Medio de cultivo: Un mismo explanto puede tener diferente comportamiento
si se lo cultiva en medio slido o en medio lquido. Otro factor importante es
la temperatura, que puede inducir inestabilidad cariotpica o puede
incrementar el nmero de plantas albinas.
Los reguladores de crecimiento, principalmente el 2,4-D (cido 2,4
diclorofenoxiactico) han sido sealados como inductores de inestabilidad.
Ejercen profundos efectos sobre la respiracin celular, el consumo de
azcares y en el control de la divisin celular.
Si bien el modo de accin herbicida del 2,4-D no es totalmente
comprendido, aparentemente involucra un incremento sustancial en la
transcripcin que puede alterar la estructura de la cromatina, siendo
utilizado en gramneas como inductor de aneuploidas. Lo que algunos
autores sugieren es que el 2,4-D induce desdiferenciacin y este proceso
sera el generador de los cambios.
La fragmentacin nuclear amittica citada anteriormente observada en
algunas plantas regeneradas tambin se reconoce como causa de
aneuploida. Este fenmeno es causado por una relacin especial
auxina:citocinina. El 2,4-D, el AIA (cido indolactico) y el ANA (cido
naftalenactico) han sido sealados como los responsables de los
incrementos en la metilacin de la citosina que tiene lugar durante el cultivo
in vitro. Los sectores en el ADN, donde la citosina se encuentra metilada en
posicin 5 son considerados puntos calientes de mutacin, ya que la
desaminacin de una 5-metil citocina resulta en un cambio de la base de
citocina a timina. Las auxinas naturales y sintticas.
Estudios tendientes a analizar los efectos de los reguladores de crecimiento
sobre la regeneracin de plantas a partir de protoplastos, realizados en
papa, indicaron que la variacin en el tipo y concentracin de reguladores

de crecimiento en los estadios iniciales de cultivo no generara variacin

gentica. Sin embargo, si el cambio en la composicin de los reguladores
ocurre en el estadio que va desde el crecimiento del callo a la iniciacin de
los vstagos, se generan elevados niveles de variacin gentica. Estos datos
sugieren que la fase de callo sera un perodo sensible en el cual la
manipulacin hormonal afecta la estabilidad de las plantas regeneradas, de
manera que las hormonas induciran la inestabilidad gentica sin ser,
necesariamente, el origen de la misma. Otro factor a considerar es la
deficiencia de oxgeno que se genera durante el curso del cultivo. La tensin
de oxgeno de las clulas en la superficie del callo es diferente a la de
aquellas clulas que se encuentran situadas profundamente en la masa del
mismo. La anaerobiosis resultara en la produccin de etanol, el cual podra
comportarse como un mutgeno.
Un efecto similar podra tener la acumulacin de metabolitos producidos por
las propias clulas durante el proceso. Se ha mencionado que las
condiciones de cultivo in vitro podran afectar los niveles de resistencia
celular al efecto de los metabolitos que normalmente se encuentran
presentes en los tejidos en bajas concentraciones.
La edad del cultivo: es otro factor que afecta el nivel de variacin,
aumentando la proporcin de variantes en cultivos envejecidos y tambin
en plantas obtenidas a travs de varios subcultivos. Esto se ha observado
en ajo, maz, avena, tabaco, triticale y raigrs triploide.
Una observacin comn es que en los perodos prolongados de cultivo hay
una prdida de totipotencia y que esto sucedera debido a la acumulacin
de mutaciones y a la alteracin de los genes que son responsables de la
regeneracin.
La deficiencia o exceso de minerales tambin podra afectar la estabilidad
gentica in vitro. Se ha observado que las deficiencias o excesos de azufre,
fsforo, nitrgeno, calcio y magnesio pueden resultar en cambios
genmicos.

Ventajas que presenta la variacin somaclonal pueden resumirse de la

siguiente manera:
Es relativamente poco costoso generarla: requiere de un laboratorio de
rutina y facilidades de campo.
Constituye una forma rpida de generar variabilidad gentica,
particularmente para cultivos con base gentica estrecha y que son difciles
de mejorar a travs de tcnicas tradicionales.
Es exitosa para eliminar uno o pocos defectos en cultivares bien
adaptados.
Puede utilizarse para mejorar especies de propagacin sexual y
vegetativa.
Las tasas de mutacin son relativamente altas si se comparan con las
tasas de mutaciones espontneas. La variacin somaclonal ocurre con una

frecuencia de 1 mutacin cada 100 plantas regeneradas, en contraste con la

tasa esperada de mutacin espontnea de 10-7 10-9 mutaciones por par
de nucletidos por generacin.
El conocimiento de las condiciones que generan inestabilidad gentica
durante el cultivo in vitro permitira utilizar el fenmeno como estrategia de
mejoramiento y permitira eludirlo en aquellos casos en que se requiera
estabilidad gentica, como en la micropropagacin, la conservacin de
germoplasma y la transformacin gentica.
El nivel de cambios no deseados es menor que cuando se utilizan
mutgenos qu- micos o fsicos, ya que, en el caso de la variacin
somaclonal, la mayora de los cambios deletreos producidos son
eliminados por el filtro que representa la regeneracin de plantas.
Desventajas cabe mencionar:
En algunos casos, las variantes somaclonales no han avanzado de la
etapa de laboratorio o invernculo, probablemente debido a que el material
seleccionado tiene poca importancia prctica.
La escasa regeneracin de plantas en cultivos de largo trmino.
Generalmente en estos casos existe prdida de la capacidad morfognica.
La regeneracin est limitada a genotipos especficos que pueden no ser
de mucho inters para los mejoradores.
Algunos somaclones son inestables (originados por variacin epigentica).
Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploida,
esterilidad, etc.