Universidad Tcnica Federico Santa Mara.

Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental

Laboratorio de Introduccin a la Microbiologa

Practico N 1
PREPARACIN PARA LA OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS POR
MICROSCOPIA
Los microorganismos son demasiado pequeos para ser observados a simple vista,
por lo que es necesario utilizar un microscopio. Los modernos microscopios proporcionan,
con una gran claridad, aumentos de decenas a cientos de veces superiores a los obtenidos
con las lentes sencillas de van Leeuwenhoek.

Figura 1: Microscopio ptico

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Resumen de las caractersticas de distintos microscopios.

Tipos de microscopio

Caractersticas especiales

Usos principales

Campo claro

Utiliza luz visible como fuente de

iluminacin; no puede resolver
estructuras de menos de 0,2 m;
la muestra aparece sobre fondo
brillante.

Comnmente usado para observar

especimenes teidos (muertos)
diversos; no resuelve muestras
muy pequeas, como los virus. El
instrumento es econmico y fcil
de usar.

Campo oscuro

Utiliza un condensador especial

con un disco opaco que impide la
entrada directa de la luz en el
objetivo; entra la luz difractada
por la muestra, la cual aparece
brillante sobre fondo oscura.

Comnmente
usado
para
examinar microorganismos vivos
que
sean
invisibles
al
microscopio de campo claro, que
sean difciles de teir o que se
alteren por la tincin; usado a
menudo para detectar Treponema
pallidum.

Contraste de fases

Usa un condensador especial y

una placa de difraccin que
difracta los rayos de luz para que
se desfacen unos con respecto a
otros; la muestra aparece con
diferentes grados de brillo y
contraste.

Se usa frecuentemente para

permitir un examen detallado de
las estructuras internas de los
especmenes vivos; no se requiere
tincin.

Fluorescencia

Utiliza una fuente de luz

ultravioleta o cercana a la
ultravioleta que provoca la
emisin de luz por parte de
compuestos
fluorescentes
presentes en la muestra.

Su uso fundamental es en tcnicas

de inmunofluorescencia para
detectar o identificar con rapidez
microorganismos en muestras
clnicas.

Electrnico

Usa haces de electrones en vez de

luz gracias a la longitud de onda
ms corta de los electrones puede
resolver estructuras menores de
0,2 m.

Se usa el microscopio electrnico

de transmisin para examinar
virus o ultraestructuras celulares
en cortes delgados, la imagen no
es tridimensional . El microscopio
electrnico de barrido se usa para
estudiar la superficie de clulas y
virus, la imagen que se forma e
tridimensional.

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Para poder observar los microorganismos directamente, el microbilogo debe utilizar un

instrumento de precisin, el microscopio. Si lo que interesa observar es la motilidad o
reactividad frente a sustancias qumicas es conveniente examinar las bacterias sin teir; por
otra parte si se quiere visualizar estructuras celulares especficas es necesario tratar las
clulas con colorantes, proceso denominado TINCIN.

Examen de microorganismos sin tincin:

1.-

Preparacin hmeda: es la forma ms simple de examinar las bacterias y otros

microorganismos vivos, y consiste en la suspensin de un inculo de cultivo en
agua u otro lquido, colocando una gota de sta suspensin en un portaobjeto comn
y cubrirlo con un cubreobjeto. Este procedimiento requiere utilizar microscopa de
contraste de fase.

2.-

Preparacin de la gota pendiente: sta tcnica requiere de un portaobjeto con una

concavidad o depresin circular en su centro (portaobjeto excavado)
Tcnica:
- Colocar un anillo delgado de vaselina alrededor de la depresin central.
- Depositar una gota de solucin fisiolgica en el centro del cubreobjeto y
emulsionar en ella el material a examinar si proviene de un cultivo slido o
utilizar una gota de cultivo si es lquido.
- Invierta el portaobjeto de manera tal que la excavacin central quede
encima de la gota del cubreobjeto.
- Presione el portaobjeto y luego invirtalo con un movimiento rpido. La
gota que contiene el material quedar pendiendo sobre la excavacin del
portaobjeto como se muestra en la figura 2:

Con el estudio de la gota pendiente, se puede conocer la motilidad de los microorganismos,

sus agrupaciones naturales, sus reacciones en presencia de ciertas sustancias qumicas.

Figura 2: Tcnica de la gota pendiente.

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Examen de microorganismos teidos:

Colorantes: son compuestos qumicos orgnicos, generalmente sales, en las que uno
de sus iones es el portador del color. Segn su comportamiento qumico los colorantes
pueden clasificarse en : cidos, bsicos y neutros.
a).-

Colorante cido o aninico: la carga del in que imparte el color es negativa.

Ejemplo: fucsina cida, eosina. Los colorantes cidos no son atrados por la
mayora de las bacterias porque los iones negativos del colorante son repelidos por
la superficie bacteriana cargada negativamente. De modo que el colorante es
repelido por la bacteria y colorea en cambio el fondo de la preparacin. Esta
preparacin de bacterias incoloras sobre un fondo coloreado se llama tincin
negativa. Es til para la observacin de la morfologa externa de la clula, del
tamao y de la cpsula, porque las clulas resultan muy visibles al contrastar con el
fondo oscuro.

b).-

Colorante Bsico o catinico: el in que imparte el color tiene carga positiva.

Ejemplo: cristal violeta, azul de metileno, safranina. A pH 7.0 las bacterias tienen
carga ligeramente negativa y por lo tanto el in positivo coloreado de un colorante
bsico es atrado por la clula bacteriana.

c).-

Colorante neutro: sal compuesta de un colorante cido y otro bsico. Ejemplo:

eosinato de azul de metileno.

El proceso de tincin supone una reaccin de intercambio de iones, entre el

colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la clula.
Para teir una preparacin se pone una pequea cantidad del material a examinar en
un portaobjeto limpio y sin grasa. Si el inculo proviene de un medio slido se emulsiona
en una gota de solucin fisiolgica estril o agua destilada. La muestra se extiende con el
asa (esterilizada y enfriada) hasta que quede una fina pelcula. Esta pelcula se conoce
como FROTIS. Una vez realizado el frotis, se procede a la FIJACIN. ste es un
procedimiento que mata las bacterias del frotis y hace que se adhieran al portaobjeto, ya
que el calor desnaturaliza las protenas. La fijacin tambin se puede realizar sumergiendo
el portaobjeto en alcohol metlico, ter o formalina; sin embargo es el calor el ms indicado
para el trabajo de rutina. La fijacin por calor se logra pasando el portaobjeto varias veces
por sobre la llama del mechero.
Una vez realizado el frotis y la fijacin, se procede a aplicar el o los colorantes
segn sea la tincin. En bacteriologa se utilizan tres clases de tinciones:
a) Tincin simple
b) Tincin diferencial
c) Tinciones especiales.

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1.-Tincin simple: es aquella que hace uso de un slo tipo de colorante y sirve para
observar tamao y forma celular. Las ms comunes son la de azul de metileno,
carbolfucsina, cristal violeta y safranina.
Tcnica:
-frotis y fijacin de la muestra
-colorante durante un minuto
-lavar con agua para retirar exceso de colorante
-dejar secar al aire
-observar al microscpio de inmersin

Tinciones diferenciales: permiten dividir a las bacterias en grupos, de acuerdo a su

reaccin con los colorantes utilizados. Entre ellos la tincin de Gram y la de
alcohol-cido resistente son las ms usadas.
2.1-

Tincin Gram: es la tcnica de uso ms comn en microbiologa y permite dividir

las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram positivas y Gram negativas, de
acuerdo a las propiedades fsicas de la pared celular.
Tcnica:
-frotis y fijacin de la muestra
-cristal violeta durante un minuto
-lavar con agua
-mordiente: solucin de yodo (lugol) durante un minuto
-lavar con agua
-agente decolorante: alcohol durante 30 seg.
-lavar con agua
-safranina por 30 seg.
-lavar con agua y secar al aire
-examinar al microscpio con objetivo de inmersin

El mordiente tiene la funcin de aumentar la afinidad del colorante con las

estructuras celulares.
El agente decolorante tiene la funcin de retirar el colorante de la clula.
Las bacterias sometidas a la tincin de Gram que retienen el colorante "cristal
violeta" y aparecen de color violeta profundo se clasifican como bacterias Grampositivas. Aquellas que pierden el cristal violeta y se tien rojas por el colorante de
contraste, se clasifican como bacterias Gram-negativas. Este resultado se fundamenta en el
hecho de que las bacterias Gram(+), despus del tratamiento con alcohol, se produce una
deshidratacin con la consiguiente disminucin en el dimetro de los poros de
pptidoglicano de la pared celular. Esto permite que el colorante cristal violeta quede
retenido en el interior de la clula. Las paredes de las bacterias G(-) tienen una cantidad

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mucho menor de pptidoglicano con ligaduras cruzadas menos extensas, lo que le da una
consistencia mucho ms laxa que permite la salida del complejo cristal violeta-yodo y la
posterior tincin con safranina. (Cuadro I).

Figura 3: Tincin de Gram

CUADRO I: Reaccin de las clulas Gram (+) y Gram (-), frente a la tincin de Gram.
COLORANTE
Cristal violeta
Lugol
Alcohol
Safranina

GRAM (+)
azul
azul
azul
azul

GRAM (-)
azul
azul
decolorada
rojo

El mtodo de Gram es una de las tcnicas de tincin ms importantes en microbiologa

mdica. No obstante, los resultados de la tincin de Gram no son absolutos porque algunas
clulas bacterianas se tien mal o no lo hacen. La reaccin de Gram es ms reproducible
cuando se aplica a bacterias jvenes en crecimiento (cultivos de 18 - 24 horas).
En muchos casos la tincin de Gram de una bacteria proporciona una informacin til para
el tratamiento de una enfermedad. Por ejemplo, las bacterias Gram positivas tienden a ser
ms sensibles a la penicilina y a las sulfamidas. Las bacterias Gram negativas suelen ser
resistentes a estos frmacos pero son mucho ms susceptibles a antibiticos como la
estreptomicina, el cloramfenicol y las tetraciclinas. Por lo tanto, la identificacin de una
bacteria segn la tincin de Gram puede ayudar a determinar que frmaco ser ms eficaz
contra la enfermedad.

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2.2

Tincin de cido-alcohol resistencia

Otra importante tincin diferencial (que divide a las bacterias en grupos diferenciados) es la
tincin de cido alcohol resistencia. Los microbilogos utilizan esta tincin para identificar
bacterias pertenecientes a los gneros Micobacterium y Nocardia. Aunque muchas
bacterias de este grupo no son patgenas, hay dos miembros que son importantes
productores de enfermedad, Micobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae. La
diferencia principal del Micobacterium y Nocardia con otros microorganismos es que estos
dos gneros poseen ceras e sus paredes celulares.
En la tcnica de tincin de cido alcohol resistencia se aplica sobre la tincin fijada
el colorante rojo carbolfuchsina y el portaobjetos se calienta suavemente sobre la llama
durante varios minutos. El calor facilita la penetracin y retencin del colorante. Se deja
enfriar la preparacin y se lava con agua. A continuacin se trata con cido y alcohol, un
decolorante, que elimina el colorante rojo de las bacterias que no son cido alcohol
resistentes. Las bacterias cido alcohol resistentes retienen el color rojo porque la
corbolfuchsina es ms soluble en las ceras que forman parte de su pared celular que en el
cido alcohol. En las bacterias no cido alcohol resistentes, cuyas paredes carecen de ceras,
la carbolfuchsina es rpidamente eliminada durante la decoloracin, quedando sus clulas
sin teir. La extensin se tie entonces con azul de metileno como colorante de contraste.
Las bacterias que no son cido alcohol resistente aparecen azules tras la tincin de
contraste.
3.- Tinciones Especiales: Sirven para observar estructuras dentro o en el exterior de la
clula bacteriana, inclusiones citoplasmticas como tambin algunos microorganismos que
dadas sus caractersticas especiales no se tien adecuadamente con tcnicas rutinarias.
a. Esporas:
Son muy impermeables a los colorantes, por lo que se hace necesario usar
tcnicas especiales.
Tcnica:
- Frotis y fijacin de la muestra
- Cubrir frotis con papel filtro
- Teir con Verde Malaquita a emisin de vapores por 10 a 15 min.
- Enfriar y lavar con agua
- Aplicar Safranina por 30 segs a 1 min.
- Lavar con agua y secar al aire
- observar al microscopio con objetivo de inmersin
Las esporas aparecen de color verde y la clula vegetativa roja. La vaporizacin del
colorante sobre la muestra incrementa la penetracin de ste en los recubrimientos
impermeables de la espora (Cuadro II).

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CUADRO II: Reaccin de las clulas frente a la tincin de Esporas.

COLORANTE
Verde malaquita
Agua
Safranina

ESPORA
verde
verde
verde

CLULA VEGETATIVA
verde
decolorada
roja

b. Cpsula: Muchos microorganismos poseen una cubierta gelatinosa llamada

cpsula. En microbiologa clnica de demostracin de la presencia de cpsula es un medio
para determinar la virulencia de un microorganismo, es decir, la capacidad de un patgeno
para producir enfermedad. La cpsula es una envoltura mucosa, se compone de polisacridos, polipptidos y polmeros extracelulares complejos. Como estas estructuras se alteran
por el calor, nunca se podr utilizar calor en ninguno de los pasos de la tincin.
La cpsula no tiene afinidad con los colorantes ordinarios pero puede apreciarse como un
halo transparente alrededor de la clula. La tcnica de la tincin negativa incorpora
materiales tales como tinta china, que se compone de partculas demasiado grandes para
penetrar la clula y un colorante de contraste, la safranina, que penetra la clula bacteriana.
Al examinar la preparacin, la cpsula aparecer como una zona transparente que rodea la
pared celular. No se puede afirmar con certeza absoluta que todas las regiones claras
observadas sean cpsulas, debido a que el encogimiento de las clulas o la separacin de la
tinta china pueden producir resultados anormales. Sin embargo, en general cuando un
frotis tratado contiene muchas zonas transparentes con siluetas uniformes, es probable que
sean reales y no artificiales.
Tcnica:
- Sobre un portaobjeto limpio colocar una gota de tinta china (con
asa de loop) y emulsionar con ella los microorganismos a examinar.
- Extender la muestra y dejar secar al aire.
- Cubrir con Safranina por 30 a 45 segs.
- Dejar secar
- Observar al microscopio con inmersin.
La cpsula se ver como un halo transparente rodeando la clula de color rojo y el
resto de la preparacin aparecer de color negro.
c) Tincin de flagelos
Los flagelos bacterianos son estructuras de locomocin demasiado pequeas para
verse al microscopio ptico. Para poderlas visualizar se utiliza un procedimiento de tincin
tedioso y delicado que emplea un mordiente y carbolfuchsina para engrosar el dimetro de
los flagelos hasta hacerlos aparentes al microscopio ptico. Los microbilogos utilizan el
nmero y disposicin de los flagelos como una ayuda para la identificacin de las bacterias.

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Figura 4: Bacillus subtillis,

bacilo esporulado Gram+

Figura 5: Staphylococcus aureus,

azul-violeta Gram +

Figura 6: Bacillus subtillis, bacilo esporulado

Tincin espora , bacilo(rojo), espora (verde)