Coordinador:
M. Angeles Domnguez
Autores:
Pere Coll
M. Teresa Coque
M. Angeles Domnguez
Julio Vzquez
Jordi Vila
ISBN: 84-609-7030-2
INDICE:
INDICE DEL DOCUMENTO CIENTFICO
1. Introduccin
2. Mtodos moleculares de tipificacin en el laboratorio de microbiologa
3. Caractersticas de los marcadores moleculares. Criterios para la eleccin de un buen marcador molecular.
3.1. Evaluacin de los marcadores moleculares
3.1.1. Criterios que evalan su eficacia
3.1.2. Criterios que evalan su eficiencia
3.1.3. Con qu coleccin de cepas deben evaluarse los marcadores epidemiolgicos?
3.1.4. Anlisis de los datos
3.2. Bibliografa especfica
4. Anlisis del ADN extracromosmico y de los elementos genticos de transmisin horizontal
4.1. Plsmidos
4.1.1. Fundamentos y variantes tcnicas
4.1.1.1. Crecimiento del cultivo bacteriano.
4.1.1.2. Centrifugacin, lisis bacteriana y extraccin del ADN plasmdico.
4.1.1.3. Purificacin del ADN.
4.1.1.4. Digestin del ADN plasmdico.
4.1.1.5. Determinacin del peso molecular de plsmidos.
4.1.2. Criterios para la interpretacin de los resultados
4.1.2.1. Anlisis de plsmidos sin restriccin.
4.1.2.2. Anlisis de perfiles de plsmidos tras restriccin.
4.1.3. Indicaciones para la aplicacin del anlisis de plsmidos
4.1.4. Inconvenientes de la tcnica
4.2. Anlisis de otros elementos de transmisin horizontal (ETH)
4.2.1. Indicaciones para el anlisis epidemiolgico de ETH
4.2.2. Criterios para la interpretacin de resultados
4.3. Bibliografa especfica
5. Anlisis del ADN mediante procedimientos de restriccin e hibridacin
5.1. Fundamentos y variantes tcnicas
5.1.1. Hibridacin con sondas especficas
5.1.2. Ribotipado
5.2. Procedimiento tcnico
5.2.1. Subcultivo de la cepa
5.2.2. Lisis bacteriana
5.2.3. Extraccin del ADN total
5.2.4. Restriccin del ADN
5.2.5. Electroforesis
5.2.6. Transferencia
5.2.7. Hibridacin
5.2.8. Revelado
5.3. Criterios para la interpretacin de los resultados
5.4. Indicaciones
5.5. Inconvenientes de la tcnica
5.6. Bibliografa especfica
6. Anlisis del ADN cromosmico mediante macrorrestriccin: Electroforesis en campo pulsante (PFGE)
6.1. Tratamiento previo de los microorganismos
6.1.1. Crecimiento bacteriano
6.1.2. Lisis
6.1.3. Lavados
6.1.4. Restriccin
6.2. Fundamentos y variantes tcnicas
6.2.1. Componentes de un sistema de PFGE
6.2.2. Variables que afectan a la resolucin del PFGE
6.3. Criterios para la interpretacin de resultados
6.4. Indicaciones
6.5. Inconvenientes de la tcnica
6.6. Bibliografa especfica
7. Anlisis del ADN mediante amplificacin con PCR
7.1. Tratamiento previo de los microorganismos
7.2. Fundamentos y variantes tcnicas
7.3. Criterios para la interpretacin de resultados
II
7.4. Indicaciones
7.5. Inconvenientes de la tcnica
7.6. Bibliografa especfica
8. Anlisis del ADN por secuenciacin: Multilocus sequence typing (MLST)
8.1. Tratamiento previo de los microorganismos
8.2. Fundamentos y variantes tcnicas
8.2.1. Aplicacin directa sobre muestras clnicas en ausencia de cultivo
8.2.2. Multilocus Restriction Type (MLRT)
8.2.3. Aplicacin de MLST mediante tecnologa de micromatrices
8.3. Criterios para la interpretacin de resultados
8.4. Indicaciones
8.5. Inconvenientes de la tcnica
8.6. Bibliografa especfica
9. Otras tcnicas de tipificacin molecular
9.1. Amplification fragment length polymorphism (AFLP)
9.2. Bibliografa especfica
9.3. Micromatrices de ADN
9.4. Bibliografa especfica
DOCUMENTOS TCNICOS
1. Anlisis de ADN extracromosmico y de los elementos genticos de transmisin horizontal: Anlisis de ADN
plasmdico (mtodos de kado-liu y birnboim-doly).
2. Anlisis del ADN mediante procedimientos de restriccin e hibridacin: anlisis del polimorfismo de restriccin
asociado a IS6110.
3. Anlisis del ADN cromosmico mediante macrorrestriccin: Tipificacin molecular del ADN cromosmico
mediante electroforesis en campo pulsante (PFGE).
4. Anlisis del ADN mediante amplificacin con pcr: Tipificacin molecular utilizando tcnicas de amplificacin de
ADN relacionado con secuencias rep (repetitive extragenic palindrom).
5. Anlisis del ADN por secuenciacin: Multilocus sequence typing (MLST) en Neisseria meningitidis
III
DOCUMENTO CIENTFICO
1. INTRODUCCIN
En esta nueva edicin de los Procedimientos en
Microbiologa Clnica, la Sociedad Espaola de
Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica ha
considerado de inters incluir un documento que
recoja las aplicaciones de los mtodos moleculares
en la tipificacin bacteriana y su utilidad en los
estudios epidemiolgicos.
Los sistemas de tipificacin molecular constituyen
una de las aportaciones microbiolgicas que ms
difusin han tenido en los ltimos aos. Estos
sistemas comprenden una gran variedad de tcnicas
que tienen como objeto comparar la composicin de
los cidos nucleicos de dos o ms microorganismos.
De este modo, se puede reconocer la relacin entre
aislamientos vinculados epidemiolgicamente y, por
tanto, derivados recientes de un microorganismo
precursor comn. A la vez, deben ser tcnicas
capaces de diferenciar aislamientos no relacionados,
con independencia de su pertenencia a la misma
especie microbiolgica o taxn. Con anterioridad
estos estudios se basaban en las caractersticas
fenotpicas de los microorganismos (propiedades
antignicas, metablicas o de resistencia antibitica).
Sin embargo, muchos de estos sistemas fenotpicos
son limitados para establecer diferencias o
similitudes concluyentes entre microorganismos.
En este documento se utilizar una nomenclatura
que mantiene las siglas originales en ingls de las
diferentes tcnicas y que son como se las conoce
internacionalmente.
2. MTODOS MOLECULARES DE TIPIFICACIN
EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
Las tcnicas moleculares que analizan propiedades
o polimorfismos genticos en los microorganismos,
han ampliado notablemente el campo de la
tipificacin en microbiologa. Los fundamentos de
estas tcnicas son variables: estudios de restriccin
del ADN cromosmico o extracromosmico, anlisis
del nmero de copias de determinadas secuencias
de insercin o repetitivas a lo largo del cromosoma o
de las regiones entre secuencias de insercin o
repetitivas adyacentes (REP-PCR; polimorfismo
IS6110
en
Mycobacterium
tuberculosis)
o
amplificacin arbitraria de fragmentos genticos (APPCR). La mayor ventaja de estos mtodos radica en
la estabilidad de los marcadores genticos utilizados
y en la posibilidad de aplicarlos universalmente a
distintos gneros y especies de microorganismos.
Los marcadores moleculares se han aplicado a
diferentes campos y su disponibilidad ha mejorado
nuestro conocimiento sobre:
- patognesis e historia natural de ciertas
infecciones,
- deteccin de brotes y epidemias, identificacin
de reservorios y de mecanismos de transmisin
de patgenos,
- diseo de medidas de control de propagacin de
la infeccin, y
- evolucin gentica de poblaciones microbianas.
En todas estas aplicaciones el objetivo de los
marcadores moleculares es el de definir la relacin
Tabla 1. Caractersticas de los marcadores moleculares ms utilizados (modificada de van Belkum et al. Clin Microbiol Rev 2001; 14: 547-560)
Marcador
Perfil plasmdico
REA de ADN total
Ribotipado
PFGE
PCR
AFLP
MLST
Tipabilidad
Reproducibilidad
Variable
Excelente
Excelente
Excelente
Excelente
Excelente
ptima
Regular
Variable
Excelente
Excelente
Regular
Buena
Excelente
Poder de
discriminacin
Variable
Variable
Buena
Excelente
Excelente
Excelente
Excelente
Facilidad tcnica
Interpretacin
Disponibilidad
Coste
Regular
Buena
Buena
Buena
Buena
Buena
Difcil
Buena
Regular
Buena
Buena
Regular
Regular
Excelente
Excelente
Variable
Variable
Variable
Buena
Baja
Baja
Medio
Medio
Alto
Alto
Medio
Alto
Alto
REA: anlisis del ADN total con enzimas de restriccin de alta frecuencia de corte; PFGE: digestin del ADN total con enzimas de baja frecuencia de corte y
resolucin de los fragmentos generados por electroforesis de campo pulsante; PCR: polimorfismo de amplificacin; AFLP: polimorfismo del tamao de los
fragmentos
de
amplificacin:
MLST:
tipado
por
secuenciacin
de
mltiples
loci.
Microorganismos
Tamao
Purificacin
DNA para
(kbp)
posterior
digestin
Aplicaciones/Observaciones
Referencia
Kado y Liu
Gramnegativos: Enterobacteriaceae,
Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas
Grampositivos: Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Bacillus,
Listeria
2-150
NO
SI**
J Bacteriol, 1981
Barton
>150
NO
NO
Analytical
Biochem, 1995
Birnboim y Doly
Gramnegativos: Enterobacteriaceae,
Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas
Grampositivos: Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Bacillus,
Listeria
< 60
Variable
SI
Nucleic Acids
Research, 1979
Holmes y Quigley
(boiling)
Gramnegativos: Enterobacteriaceae,
Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas
Grampositivos: Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Bacillus
< 50
NO
SI
Analytical
Biochem, 1981
Chassy
2- 50
NO
SI
Woodford
Grampositivos: estreptococos,
actinomicetos, rodococos o nocardias
Enterococcus spp
< 50
NO
SI
Townsend
S. aureus
< 50
NO
SI
Anderson y McKay
E. faecalis, Streptococcus
> 50 kbp
NO
SI
Gramnegativos
Grampositivos: Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium, Staphylococcus
aureus (modificacin del original en ref 3)
Gramnegativos: Enterobacteriaceae,
Pseudomonas aeruginosa, Legionella
Grampositivos: Enterococcus spp,
Streptococcus spp, Staphylococcus spp
>100
SI
SI
>100-530
SI
SI
Portnoy
Biochem Biophys
Res Comm, 1976
Antimicrob Agents
Chemother, 1993
12
Elemento
Tamao
(kbp)
Resistencia principal
Otras resistencias
Microorganismos
Fenotipo
Genotipo
BLEE clase A
(cefotaximasa)
BLEE clase A
(cefotaximasa)
blaCTX-M-9
Enterobacteriaceae
blaCTXM-2
-lac, Ag
Enterobacteriaceae
In60
Integron clase 1
13
InS21
Integron clase 1
8,8
Variable
BLEE clase A
blaGES-1
In36, In37
Integron clase 1
(distintos
integrones
descritos)
Integron clase 1
13 (In36)
14,8 (In37)
Quinolonas
qnr
In31 y otros
Integron clase 1
Variable
BLEE clase B
blaIMP-1
blaIMP-2
Tn1207.1
Transposon
clase II
7,2
macrlidos
mef(A)
Streptococcus
pneumoniae
Mef(E) macrolide
efflux genetic
assembly [the
mega-element]
Tn1546
Transposon
clase II
5,5
macrlidos
mef(E)
Streptococcus
pneumoniae
Transposon
clase II
10,8
VanA
(Van, Tei)
vanA
Tn1547
Transposon
clase I
Variable
VanB
(Van)
vanB
Tn5382
Transposon
clase I
27
VanB
(Van)
vanB
(Amp) b
Tn5381
Transposon
clase I
4,7
HLRGm
aac(6)-aph(2)
Enterococcus spp,
Oeskorvia,
Streptococcus spp,
Lactocoocci
Corynebacterium,
Bacillus circulans,
Staphylococcus aureus
E. faecium
E. faecalis,
S. bovis,
S. gallolyticus
E. faecium
E. faecalis,
S. bovis,
S. gallolyticus
E. faecalis,
SCC-mec
Comentarios
Enterobacteriaceae,
Pseudomonas
aeruginosa
Escherichia coli
Pseudomonas,
Alcaligenes,
Acinetobacte,
Klebsiella, Citrobacter
Staphylococcus aureus
(a)Tmp = trimetoprim, Sm= estreptomicina , Spec= Espectinomicina, Ag= aminoglicsidos, Su = sulfamidas, -lac = beta-lactmicos, HLRGm = alto nivel de resistencia a
gentamicina, Cm = cloranfenicol, Rf = rifampicina. (b) Tn5382 presente en los aislados clnicos de Enterococcus faecium descritos en EEUU est asociado al gen que confiere
resistencia a la ampicilina (pbp5). Esta estructura pbp5-Tn5382 se disemina como un ETH per se dando lugar a resistencia a glicopptidos y ampicilina.
13
Figura 3. Polimorfismos genticos en el Tn1546 tras digestin con enzimas de restriccin y posterior hibridacin con sondas
especficas de regiones parciales de este elemento. En la parte superior est representado el Tn1546. Las lneas gruesas
negras representan las sondas utilizadas y su correlacin con las secuencias del elemento. Los nmeros del 1-9 representan
los fragmentos tras hibridacin con las sondas anteriores. Las letras sobre los pocillos de la membrana reflejan los
polimorfismos de Tn1546 encontrados (imagen reproducida con permiso del autor, Willems et al. 1999. Antimicrob. Agents
Chemother 1999; 43:483-91).
5. ANLISIS
DEL
ADN
MEDIANTE
PROCEDIMIENTOS DE RESTRICCIN E
HIBRIDACIN
Con el fin de evitar la contaminacin de su genoma por
ADN exgeno, las bacterias han desarrollado un
sistema de proteccin basado en los enzimas de
restriccin, que reconocen una secuencia especfica
de nucletidos de unos 4 a 8 pares de bases (pb)
14
ADN
Membrana
(1)
(2)
Bomba
de vaco
17
Figura 5. Patrones de restriccin-hibridacin asociados a IS6110: Lnea 1, cepa control MT1423. Obsrvese como las cepas
de las lneas 5, 6, 7 y 8 comparten el mismo patrn constituyendo un cluster. Ello tambin ocurre con las cepas en las lineas 10
y 11.
18
6.ANLISIS
DEL
ADN
CROMOSMICO
MEDIANTE
MACRORRESTRICCIN:
ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE
(PFGE)
Como se ha expuesto en el apartado 5
(procedimientos de restriccin e hibridacin de ADN)
para una especie bacteriana concreta, podemos
encontrar enzimas de restriccin de baja frecuencia
de corte, es decir, enzimas cuyo lugar de restriccin,
por su longitud y secuencia, se encuentran
raramente a lo largo del ADN cromosmico de la
especie bacteriana en cuestin. El uso de este tipo
de enzimas permite la macrorrestriccin del ADN de
la bacteria y la divisin del ADN en pocos fragmentos
(entre 10 y 30). Muchos de estos fragmentos son de
gran tamao, ms de 40 kb, y no pueden separarse
por tcnicas de electroforesis convencional, en las
que se aplica un campo elctrico constante
esttico, sino que requieren tcnicas en las que la
orientacin del campo elctrico es variable
peridicamente, son las denominadas tcnicas de
electroforesis en campo pulsante o pulsed-field gel
electrophoresis (PFGE).
La
combinacin
de
estas
dos
tcnicas,
macrorrestriccin del ADN y separacin de los
fragmentos por PFGE, se ha aplicado con mucha
frecuencia en estudios epidemiolgicos en
bacteriologa. Se obtienen as, patrones de
restriccin sencillos que representan el ADN
cromosmico bacteriano distribuido en unas pocas
bandas con movilidades electroforticas distintas.
Sin embargo, las caractersticas de estas tcnicas
determinan una serie de cambios a tener en cuenta
en las distintas fases en las que se divide el proceso
de macrorrestriccin y PFGE: 1) el procedimiento de
extraccin de ADN, obliga a inmovilizar las clulas
bacterianas en bloques de agarosa, en los que se
llevar a cabo la lisis, de manera que el ADN
cromosmico tambin quede embebido en agarosa,
el objetivo es que el ADN permanezca ntegro y no
se fracture accidentalmente (al pipetear, agitar ...) lo
cual desvirtuara los patrones de restriccin y
afectara a la reproducibilidad de la tcnica, 2) la
restriccin del ADN debe hacerse tal y como ste
est preparado, es decir, inmovilizado en los bloques
de agarosa, utilizando enzimas de baja frecuencia de
corte, y 3) la tcnica de electroforesis utilizada para
la separacin de fragmentos debe ser una PFGE,
con las caractersticas diferenciales propias de sta.
6.1. TRATAMIENTO
PREVIO
DE
LOS
MICROORGANISMOS
Como se ha apuntado previamente, para poder
obtener patrones de restriccin reproducibles por
PFGE que permitan la comparacin de los genotipos
de una serie de microorganismos, el objetivo es
aislar el ADN cromosmico ntegro, sin fracturas y, a
la vez, en las mejores condiciones de pureza para
que los enzimas de restriccin puedan cortar
correctamente, evitando restricciones incompletas.
Para ello deben observarse una serie de
precauciones con relacin al procesamiento y
tratamiento previo de los microorganismos:
Figura 6. Esquema de la distribucin de electrodos en el sistema CHEF de electroforesis en campo pulsante. El ngulo
sealado (120) es el ngulo de reorientacin entre el campo elctrico A y el B.
6.4. INDICACIONES
Las tcnicas de macrorrestriccin y PFGE se han
utilizado para la tipificacin molecular de un gran
Figura 7. Electroforesis en campo pulsante del ADN cromosmico, tras restriccin con SmaI, de 15 cepas de Acinetobacter
baumannii. Las cepas en las lneas 1 al 4 estn genticamente relacionadas y pertenecen al tipo clonal A. Las cepas de los
clones B, C o D son idnticas entre ellas; (kb, kilobases).
23
7. ANLISIS
DEL
ADN
MEDIANTE
AMPLIFICACIN CON PCR
En los ltimos aos las tcnicas basadas en
reacciones de amplificacin de ADN, especialmente
la de PCR, han sido ampliamente utilizadas para la
tipificacin bacteriana. En general existen tres
grupos de variantes de la PCR: 1) Aquellas en las
que utilizando cebadores arbitrarios o con cierta
especificidad, se amplifican regiones del genoma
localizadas entre dos cebadores adyacentes
separados por una distancia no superior a la que la
Taq polimerasa puede amplificar. Estas variantes
suelen dar patrones de amplificacin constituidos por
un nmero variable de bandas de ADN, 2) Variantes
en las que previa o posterior a la amplificacin
gnica se somete el genoma o producto amplificado
a digestin con enzimas de restriccin, y 3) Aquellas
que amplifican regiones internas de ciertos genes y
posterior secuenciacin (Tabla 4).
En los genomas de todos los organismos se
encuentran secuencias de ADN repetidas que
pueden ser utilizadas para el diseo de cebadores
que amplifiquen la regin entre secuencias
repetitivas consecutivas. En las clulas procariotas,
las secuencias de ADN repetidas son cortas (<200
pb), no son codificantes, son intragnicas y
ampliamente distribuidas a lo largo del genoma. Una
de las primeras secuencias de este tipo descritas y
estudiadas
fue
REP
(repetitive
extragenic
palindrome) o PU (palindromic unit), descritas
inicialmente en Salmonella y E. coli. Otras
secuencias
repetidas
identificadas
en
enterobacterias, son las secuencias denominadas
ERIC
(enterobacterial
repetitive
intragenic
consensus), tambin conocidas como IRU (intergenic
repit units).
Tabla 4. Variantes de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) utilizadas en epidemiologa para la tipificacin
bacteriana.
A. PCR sin digestin posterior con enzimas de restriccin (ER) (Amplificacin mltiple)
- Amplificacin mltiple arbitraria:
- PCR mediante cebadores arbitrarios (AP-PCR, RAPD........)
- Amplificacin mltiple definida:
-PCR utilizando como cebadores secuencias repetidas encontradas a lo largo del genoma (REP-PCR;
ERIC-PCR, tRNA-PCR; BOX-PCR, IS.......).
B. PCR con digestin posterior con ER y comparacin de los fragmentos de restriccin generados (PCR-RFLP).
- PCR con digestin posterior con ER.
- PCR-RFLP de genes especficos.
- PCR con digestin con ER previa a la amplificacin.
- Amplificacin secuencias de ADN que flanquean lugares de restriccin infrecuentes (IRS).
- Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin amplificados (AFLP).
C. PCR y posterior secuenciacin
- Amplificacin y secuenciacin de varios loci genticos (Multilocus sequence typing).
______________________________________________________________________
24
Tambin
se
ha
utilizado
para
estudios
epidemiolgicos la amplificacin de secuencias
arbitrarias, en las que los cebadores no estn
dirigidos a ninguna regin especfica. La tcnica
RAPD (Random amplified polymorphic DNA) se basa
en la utilizacin de cebadores de 9 a 10 bases de
longitud, que hibridan con suficiente afinidad con
ciertas regiones del cromosoma bacteriano a bajas
temperaturas, permitiendo amplificar las regiones
que se encuentran localizadas entre dos cebadores
consecutivos. Si dos cebadores hibridan a una
distancia ptima uno de otro y en la direccin
apropiada, se obtendr un producto de PCR con un
tamao correspondiente a la distancia entre los dos
cebadores. El nmero y localizacin de las regiones
reconocidas por los cebadores vara para las cepas
de una misma especie bacteriana. Como los
cebadores no estn dirigidos frente a un locus
gentico
determinado,
pueden
tener
lugar
hibridaciones inespecficas entre los cebadores y el
genoma motivo de estudio, por lo que la
amplificacin es extremadamente sensible a ligeros
cambios en la temperatura de hibridacin lo que
puede conducir a variabilidad en el patrn de
bandas. Segn la concentracin, longitud de los
cebadores, as como las condiciones de
electroforesis, se han descrito tres variantes: i) DAF
(DNA amplification fingerprinting); ii) AP-PCR
(arbitrary primed PCR); iii) RAPD (random amplified
polymorphic DNA). Aunque estas tres variantes son
fciles de realizar y no es necesario conocer el
genoma de la bacteria, la reproducibilidad es
normalmente baja.
En el segundo grupo de tcnicas (amplificacin y
posterior digestin con enzimas de restriccin) se
encuentran aquellas que analizan el polimorfismo de
los fragmentos generados. Por lo general posee un
bajo poder de discriminacin para utilizarse como
marcador epidemiolgico. Sin embargo, en algunos
casos se utilizan para definir especies dentro de un
gnero determinado, por ejemplo para la
identificacin de las diversas especies del gnero
Acinetobacter. Tambin dentro de este grupo se
encuentra la PCR con digestin con enzimas de
restriccin de baja (IRS) o alta (AFLP) frecuencia de
corte previa a la amplificacin. Finalmente, el tercer
grupo incluye la amplificacin y posterior
secuenciacin de genes que codifican enzimas
involucradas en el metabolismo bacteriano. Las
tcnicas de PCR con digestin con enzimas de
restriccin previa a la amplificacin (AFLP y IRS), as
como la PCR y posterior secuenciacin (Multilocus
Sequence Typing MLST) se desarrollarn en los
apartados correspondientes.
7.1.
TRATAMIENTO
PREVIO
DE
LOS
MICROORGANISMOS
Se recomienda que la cepa de estudio proceda de
un cultivo reciente. Para la obtencin del ADN
cromosmico podemos partir de un cultivo
bacteriano lquido o slido. Existe un procedimiento
muy sencillo que consiste en resuspender una
25
7.4. INDICACIONES
La REP-PCR ha sido extensamente utilizada para la
tipificacin bacteriana, sobre todo en casos en los
que se necesita disponer de resultados con cierta
rapidez. Esta tcnica es ms sencilla y rpida que
otras que probablemente poseen un mayor poder de
discriminacin. Por ello, suele utilizarse como primer
paso ante la sospecha de un brote epidmico. Sin
embargo, se aconseja realizar de manera
complementaria otra tcnica con un poder de
discriminacin superior.
7.5. INCONVENIENTES DE LA TCNICA
El principal inconveniente de esta tcnica es la falta
de reproducibilidad que puede presentar. Puede ser
debida a la presencia de bandas de ADN de baja
densidad ocasionada por diferencias en la relacin
de la concentracin del ADN molde y del cebador.
Algunos estudios demuestran que la reproducibilidad
puede incrementarse utilizando concentraciones
definidas de ADN purificado en lugar de una
suspensin bacteriana hervida.
7.6. BIBLIOGRAFA ESPECFICA
1. Lupski JR, Weinstock, A. Short, interspersed repetitive
DNA sequences in prokaryotic genomes. J Bacteriol
1992; 174: 4525-4529.
2. Stern MJ, Ames GFL, Smith NH, Robinson EC, Higgins
CF. Repetitive extragenic palindromic sequences: a
major component of the bacterial genome. Cell 1984; 37:
1015-1026.
3. Hulton CS, Higgins CF, Sharp PM. ERIC sequences: a
novel family of repetitive elements in the genomes of
Escherichia coli, Salmonella typhimurium and other
enterobacteria. Mol Microbiol 1991; 5: 825-834.
4. Bassam BJ, Caetano Anolls G, Gresshof PM. DNA
amplification fingerprinting of bacteria. Appl Microbiol
Biotech 1992; 38: 70-76.
Figura 8. Patrones obtenidos mediante REP-PCR en cepas de Acinetobacter baumannii. Lnea M, Marcadores moleculares de
ADN.
26
Comparacin de las secuencias de cada fragmento con los alelos conocidos en cada locus
Asignacin de alelos en cada uno de los 7 loci, lo que determina el PERFIL ALELICO
Comparacin del perfil alelico con el de los aislados incluidos en una base de datos centralizada
10
22
ST12
Cepa 2
10
ST65
Cepa 3
10
12
ST123
Cepa 4
10
22
ST12
Cepa 5
12
32
11
22
ST76
Cepa 6
10
ST65
Cepa 7
22
ST15
Cepa 8
22
ST12
10
29
9.
OTRAS
TCNICAS
DE
TIPIFICACIN
MOLECULAR
9.1.
AMPLIFICATION
FRAGMENT
LENGTH
POLYMORPHISM (AFLP)
AFLP es un marcador molecular que combina dos
estrategias diferentes: digestin del ADN con
enzimas de restriccin y amplificacin selectiva
mediante PCR selectiva. Bsicamente, se basa en la
utilizacin de adaptadores que reparan los
fragmentos de ADN obtenidos en la digestin, con
una posterior amplificacin mediante iniciadores
complementarios de la secuencia diseada en los
adaptadores.
Este mtodo, originalmente descrito en 1995, fue
diseado para analizar ADN de cualquier origen y
complejidad, aunque posteriormente se han
desarrollado variante tcnicas ms sencillas para su
aplicacin en genomas bacterianos.
El mtodo original comienza con la extraccin y
purificacin del ADN mediante la utilizacin de
cualquier
mtodo
comercial
asequible.
A
continuacin el ADN bacteriano se somete a una
primera digestin, generalmente con un enzima que
reconozca un nmero intermedio de secuencias de
corte, tal como EcoRI, y seguidamente a una
segunda digestin con otro enzima que reconozca
un alto nmero de puntos de corte, como MseI o
TaqI. Este proceso va a originar fragmentos de ADN
cortados en ambos extremos por el mismo enzima, y
fragmentos mixtos, cortados en un extremo por
EcoRI y en el otro por MseI o TaqI.
El paso siguiente consiste en la unin mediante la
accin de ADN-ligasa, de unos oligonucleotidos de
doble cadena llamados adaptadores, en los
extremos de los fragmentos de ADN. Dichos
adaptadores se disean de tal forma que van a
unirse selectivamente en los fragmentos mixtos,
dejando pues al margen todos los fragmentos
digeridos en ambos extremos por el mismo enzima.
El diseo de los adaptadores incluye algn cambio
de base para impedir una nueva digestin tras la
accin de la ligasa ya que las reacciones de
digestin y de unin de los adaptadores se realizan
de forma simultnea.
31
DOCUMENTO TCNICO
PNT-MMT-01
ANLISIS DE ADN EXTRACROMOSMICO Y DE LOS ELEMENTOS GENTICOS DE TRANSMISIN
HORIZONTAL:
ANLISIS DE ADN PLASMDICO
(Mtodos de Kado-Liu y Birnboim-Doly)
ELABORADO
Nombre/Firma
EDICIN
01
Fecha
FECHA
REVISADO Y APROBADO
Jefe de Servicio
Nombre/Firma
Fecha
ALCANCE MODIFICACIONES
Edicin inicial
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
1. PROPSITO Y ALCANCE
Describir la metodologa asociada a diferentes
tcnicas de anlisis de ADN plasmdico.
2. FUNDAMENTO
El anlisis de ADN extracromosmico plasmdico
tiene 2 objetivos principales: 1) establecer las
posibles relaciones epidemiolgicas entre aislados
de la misma especie y 2) reconocer plsmidos
comunes o epidmicos entre aislados de la misma
o de diferentes especie bacterianas.
Cada una de las aplicaciones requiere metodologas
diferentes. Dado que todas ellas pueden ser
utilizadas en laboratorios de microbiologa con un
equipamiento medio describiremos los protocolos
ms representativos de cada una de ellas:
1. Tipificacin del perfil plasmdico o anlisis del
contenido plasmdico total: Extraccin de ADN
plasmdico por el Mtodo de Kado y Liu.
2. Analisis del polimorfismo gentico plasmdico
(plasmid fingerprinting): Extraccin de ADN
plasmdico por el Mtodo de lisis alcalina de
Birnboim y Doly y posterior digestin enzimtica
(adaptada para mini y midipreps).
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Bibliografa correspondiente de cada tcnica
- Manual de Seguridad. Laboratorio de Microbiologa
4. MUESTRAS
Cultivos bacterianos en cultivo puro, aislados en
placas de agar sangre o medios no selectivos.
Cultivos en medio lquido Luria Bertani
(Gramnegativos) y caldo infusin-cerebro-corazn
(Grampositivos).
(Normalmente, esta tcnica se aplica a una serie de
aislados dos o ms - entre los que se pretende
estudiar su relacin gentica).
5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y
PRODUCTOS
La composicin de los tampones y soluciones
empleadas en este procedimiento figura en el anexo
1.
Placas de agar sangre
Caldo de Luria-Bertani (LB)
Caldo infusin-cerebro-corazn (BHI)
Buffer de suspensin
Solucin de lisis (mtodo de Kado y Liu)
Solucin I (mtodo de Birboim y Doly)
Solucin II (mtodo de Birboim y Doly)
Solucin III (mtodo de Birboim y Doly)
Fenol: cloroformo: alcohol isoamlico
Lisozima
Lisostafina
Ribonucleasa (RNAsa-A)
Proteinasa K
Enzimas de restriccin
TE (Tris-EDTA)
Etanol 70C
Isopropanol
Bromuro de etidio
Fecha:
PNT-MMT-01
Edicin N 01 Pgina 2 de 7
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-01
Edicin N 01 Pgina 3 de 7
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Rango de peso
molecular de ADN
lineal a separar (kb)
1,0 70,0
0,7 45,0
0,4 20,0
0,3 10,0
0,2 8,0
0,2 6,0
0,1 5,0
Fecha:
PNT-MMT-01
Edicin N 01 Pgina 4 de 7
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-01
Edicin N 01 Pgina 5 de 7
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-01
Edicin N 01 Pgina 6 de 7
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-01
Edicin N 01 Pgina 7 de 7
DOCUMENTO TECNICO
DOCUMENTO TCNICO
PNT-MMT-02
ANLISIS DEL ADN MEDIANTE PROCEDIMIENTOS DE RESTRICCIN E HIBRIDACIN: ANLISIS DEL
POLIMORFISMO DE RESTRICCIN ASOCIADO A IS6110
ELABORADO
Nombre/Firma
EDICIN
01
Fecha
FECHA
REVISADO Y APROBADO
Jefe de Servicio
Nombre/Firma
Fecha
ALCANCE MODIFICACIONES
Edicin inicial
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
1. PROPSITO Y ALCANCE
Describir la metodologa necesaria para el estudio
epidemiolgico de aislados de Mycobacterium
tuberculosis mediante deteccin del polimorfismo de
restriccin asociado a la secuencia de insercin
IS6110.
2. FUNDAMENTO
El estudio del polimorfismo gentico asociado a la
secuencia de insercin IS6110 tiene como objeto
reconocer la relacin entre aislados de M.
tuberculosis vinculados epidemiolgicamente (esto
es que forman parte de una cadena de transmisin
reciente) y, a la vez, diferenciar aislados no
relacionados. Mediante esta tcnica determinamos el
nmero de copias de IS6110 presentes en el
genoma de las cepas de M. tuberculosis a estudiar, e
indirectamente, el contexto gentico en el que se
encuentran estos elementos. La IS6110 contiene un
lugar de restriccin para el enzima PvuII en su
secuencia, y se utiliza ste para la digestin del ADN
cromosmico de M. tuberculosis como paso previo a
la hibridacin con una sonda complementaria de
IS6110. De forma general, el presente procedimiento
consta de las siguientes fases: 1) extraccin del ADN
cromsomico de M. tuberculosis, 2) restriccin del
ADN con el enzima PvuII, 3) separacin de los
fragmentos mediante electroforesis, 4) transferencia
de los fragmentos de restriccin a un soporte slido
(membrana) mediante Southern blot, 5) hibridacin
de la membrana con una sonda complementaria del
IS6110 y 6) revelado por autoradiografa.
Mediante este procedimiento se consigue un patrn
de bandas caracterstico de cada cepa de M.
tuberculosis (polimorfismo asociado a la IS6110) que
permite la comparacin fcil entre aislados.
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Manuales de funcionamiento especficos de los
aparatos utilizados en este procedimiento
- Bibliografa correspondiente de cada tcnica
- Manual de Seguridad en el Laboratorio de
Microbiologa
4. MUESTRAS
Cultivos bacterianos en cultivo puro, aislados en
medio de Lowenstein-Jensen.
(Normalmente, esta tcnica se aplica a una serie de
aislados dos o ms- entre los que se pretende
estudiar su relacin gentica).
5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y
PRODUCTOS
- Medio de Lowenstein-Jensen
- Trizma base
- cido brico
- EDTA
- Lisozima
- SDS
- Proteinasa K
- NaCl
- ClH
Fecha:
PNT-MMT-02
Edicin N 01 Pgina 2 de 9
- NaOH
- Na2HPO4
- Citrato sdico
- Glicerol al 50%
- CTAB (N-cetil-N,N,N-trimetil bromuro de amonio)
- Solucin de cloroformo/alcohol isoamlico 24:1
- Etanol 70%
- Bromuro de etidio
- Reactivos de hibridacin: sistema ECL Direct
System, (Amersham Biosciences)
- Agarosa para geles
- Cepa control Mt14323
- Control de peso molecular (lambda-HindIII,
PhiX174-HaeIII, Supercoiled DNA ladder-PvuII)
- Enzima de restriccin PvuII
- Enzima de restriccin AluI
- Revelador fotogrfico Agfa
- Fijador fotogrfico Agfa
La composicin de los reactivos y soluciones de
trabajo se especifica en el Anexo 1.
6. APARATOS Y MATERIAL
6.1. APARATOS
Cntrfuga para tubos eppendorf.
Termociclador
Cubeta de electroforesis
Fuente de electroforesis
Transiluminador
Unidad de transferencia
Bomba de vaco para transferencia de geles
Tubos de hibridacin
Horno de hibridacin
Digitalizacin de geles:
Cmara de vdeo
Programa BioImage Whole Band Analyzer
6.2. OTRO MATERIAL
- Asas bacteriolgicas.
- Pipetas de volumen variable
- Puntas pipeta estriles
- Cassete fotogrfico (Hypercassete RPN-3643,
Amersham)
- Pelcula fotogrfica (Hyperfilm ECL, Amersham)
- Tubos estriles tipo eppendorf de 1,5 ml
- Cabina de Bioseguridad tipo IIA
7. PROCEDIMIENTO
7.1. OBTENCIN DEL ADN GENMICO DE M.
TUBERCULOSIS
1. Inocular la cepa de M. tuberculosis en medio
Lowenstein-Jensen e incubar a 37C hasta obtener
un crecimiento claramente visible.
2. Transferir como mnimo una asa de cultivo a un
tubo que contenga 400 l de TE 1x
3. Inactivar las clulas 20 minutos a 80C y enfriar
a temperatura ambiente.
4. Adicionar 50 l de lisozima 10mg/ml, mezclar
con vortex e incubar como mnimo una hora a 37C
(mejor toda la noche)
5. Adicionar 70 l de SDS/ 5l proteinasa K 10%
(precalentar la proteinasa K a 65C), mezclar e
incubar 10 minutos a 65C
6. Adicionar 100 l de NaCl 5M, mezclar
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-02
Edicin N 01 Pgina 3 de 9
5`...CAG / CTG... 3`
3`...GTC / GAC... 5`
Secuencia
BssHII
Bsp MII
Sst II
PvuII
SstII
Bam HI
IS6110
1
IS6110
1355
Sonda IS
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-02
Edicin N 01 Pgina 4 de 9
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
3min 96C
1min 96C
1min 65C
2min 72C
6min 72C
4C
Fecha:
PNT-MMT-02
Edicin N 01 Pgina 5 de 9
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-02
Edicin N 01 Pgina 6 de 9
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-02
Edicin N 01 Pgina 7 de 9
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-02
Edicin N 01 Pgina 8 de 9
ANEXOS
Anexo 1: Composicin de reactivos y soluciones
1. Tampn 10X TE
100 mM Trizma base [Sigma] / HCL [Panreac], pH= 8,0
10 mM EDTA [Sigma]
Disolver en agua destilada, autoclavar y conservar a temperatura ambiente menos de un ao
2. Lisozima
10 mg lisozima [Sigma] / ml de agua destilada
Conservar en alcuotas a -20C menos de un ao
3. SDS 10%
10 g SDS [Sigma] / 100ml de agua destilada.
Si es necesario, disolver a 65C. No autoclavar. Conservar a temperatura ambiente menos de un ao
4. Proteinasa K
10 mg proteinasa K [Boehringer Mannheim] / ml de agua destilada
Conservar en alcuotas a -20C menos de un ao
5. SDS/Proteinasa K
Se debe preparar al momento. Cantidad necesaria para una muestra:
5 l proteinasa K 10 mg/ml (antes de adicionarla ponerla al bao 65C durante 2 minutos)
70 l SDS 10%
6. NaCl 5M
29,22 g NaCl [Sigma]
Completar hasta 100 ml con agua destilada. Autoclavar y conservar a temperatura ambiente menos de un ao.
7. Solucin CTAB/NaCL
Disolver 4,1 g de NaCl en 80 ml de agua destilada, cuando se haya disuelto y mientras se esta agitando adicionar
lentamente 10 g CTAB (N-cetyl-N,N,N-trimethyl ammonium bromide) [Merck]. Si es necesario calentar a 65C.
Ajustar el volumen a 100 ml con agua destilada. Conservar a temperatura menos de 6 meses.
8. Cloroformo / alcohol isoamlico 24:1
Mezclar 24 volmenes de cloroformo [Merck] con un volumen de alcohol isoamlico [Sigma]. Conservar a
temperatura ambiente menos de un ao.
9. Etanol 70%
Mezclar 7 volmenes de etanol [Merck] con 3 volmenes de agua destilada. Conservar a temperatura ambiente
menos de un ao.
10. Tampn muestra 5X:
50% glicerol (v/v) [Merck]
50ml
50 mM Trizma base/HCl pH 7.5 5ml 1M Trizma/HCl pH 7.5
5 mM EDTA
5ml 100mM EDTA
0.05% Azul de bromofenol [LKB] 0.05g
11. Fag Lambda-Hind III + tampn muestra:
Fag Lambda-Hind III
40 L
TE 1X
120 L
Tampn muestra 5X
40L
Conservar a 4C menos de un ao
12. TBE 1X (Tampn Tris-borato-EDTA) pH 8,2
89 mM Trizma base
89 mM cido brico [Sigma]
2,5 mM EDTA
Autoclavar y conservar a temperatura ambiente menos de un ao.
13. Bromuro de Etidio 500 g/ml
Disolver 50 mg de bromuro de etidio [Sigma] en 100 ml de agua destilada. Conservar a 4C en una botella oscura
(proteger de la luz) menos de un ao.
14. HCl 1M
Adicionar 85,5 ml de HCl concentrado (37% p.a) a 914,6 ml de agua destilada. Conservar a temperatura ambiente.
15. NaOH 4M
Disolver 160g de NaOH [Panreac] en 800ml de agua destilada. Ajustar el volumen final a 1000 mL. Conservar a
temperatura ambiente menos de 3 meses.
16. Tampn marcador de pocillos
35l de ADN cromosmico de M. tuberculosis (1 g/ng)
5 l de NaOH 4M
10l (tampn muestra 5X mas marcadores internos)
Conservar a 4C
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-02
Edicin N 01 Pgina 9 de 9
DOCUMENTO TCNICO
PNT-MMT-03
ANLISIS DEL ADN CROMOSMICO MEDIANTE MACRORRESTRICCIN:
TIPIFICACIN MOLECULAR DEL ADN CROMOSMICO MEDIANTE ELECTROFORESIS EN CAMPO
PULSANTE (PFGE)
ELABORADO
Nombre/Firma
EDICIN
01
Fecha
FECHA
REVISADO Y APROBADO
Jefe de Servicio
Nombre/Firma
Fecha
ALCANCE MODIFICACIONES
Edicin inicial
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
1. PROPSITO Y ALCANCE
Describir la metodologa necesaria para el estudio
epidemiolgico de microorganismos mediante
macrorrestriccin
del
ADN
cromosmico
y
electroforesis en campo pulsante (PFGE). Este
procedimiento se describe segn la metodologa del
sistema de PFGE CHEF-DRII (o DRIII) de BioRad.
La utilizacin de otros sistemas de PFGE requerira
la adaptacin del procedimiento a las normas de
funcionamiento y a los componentes del sistema
correspondiente.
2. FUNDAMENTO
La tipificacin molecular de microorganismos
mediante PFGE tiene como objeto reconocer la
relacin epidemiolgica entre aislados y, por tanto,
derivados recientes de un microorganismo ancestral
comn. A la vez debe diferenciar aislados no
relacionados,
independientemente,
de
que
pertenezcan a la misma especie microbiolgica o
taxn. Mediante esta tcnica separamos fragmentos
de ADN cromosmicos de elevado tamao mediante
una tcnica especial de electroforesis, en la que se
aplican campos elctricos de incidencia pulsante.
Este procedimiento consta de varias fases:
1. Extraccin del ADN cromosmico bacteriano.
2. Restriccin del ADN, utilizando enzimas de
restriccin de baja frecuencia de corte.
3. Separacin de los fragmentos obtenidos mediante
PFGE.
Mediante este procedimiento se consigue dividir el
cromosoma bacteriano en patrones sencillos (de 1020 bandas), lo cual facilita la comparacin de unos
aislados con otros, permitiendo establecer grados de
similitud gentica entre las bacterias estudiadas.
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Manual de funcionamiento correspondiente al
sistema de PFGE
- Bibliografa correspondiente de cada tcnica
- Manual de Seguridad. Laboratorio de Microbiologa
4. MUESTRAS
Cultivos bacterianos en cultivo puro, aislados en
placas de agar sangre.
(Normalmente, esta tcnica se aplica a una serie de
aislados dos o ms- entre los que se pretende
estudiar su relacin gentica).
5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y
PRODUCTOS
(La composicin de los tampones empleados en este
procedimiento figura en los anexos 1 y 2)
Placas de Agar sangre
Agarosa para geles y agarosa de bajo punto de
fusin
EDTA
Acido brico
Fecha:
PNT-MMT-03
Edicin N 01
Pgina 2 de 8
Cloruro sdico
Deoxicolato sdico
Sarcosyl
Tris
Brij-58
Lisozima
Lisoestafina
Mutanolisina
Proteinasa-K
RNAsa-A
Enzimas de restriccin (Anexo 3)
Bromuro de etidio
Controles de peso molecular para PFGE
6. APARATOS Y MATERIAL
6.1. APARATOS
Equipo CHEF-DRIII (o similar) compuesto de:
controlador de pulsos, cubeta de electroforesis,
sistema de refrigeracin y bomba de recirculacin
de tampn
Elementos para la confeccin de geles de agarosa:
molde, bandejas y peines
Agitador orbital
Bao mara
Cmara fotogrfica, transiluminador luz UV
Centrfuga de sobremesa
Vrtex
Espectofotmetro y cubetas desechables de 1,5 ml
Calentador/Agitador
Termobloque
6.2. OTRO MATERIAL
Asas bacteriolgicas
Pipetas de volumen variable
Puntas pipeta estriles
Moldes para la solidificacin de bloques de
agarosa (suministrados por BioRad o similares)
Tubos estriles tipo eppendorf de 1,5 ml
Tubos de plstico desechables estriles de 4-6 ml
7. PROCEDIMIENTO
7.1. EXTRACCIN DEL ADN CROMOSMICO
Determinar el inculo del microorganismo
Hacer una lista de trabajo asignando nmeros
correlativos a cada una de las cepas a estudiar
Rotular tubos eppendorf de 1,5 ml con los nmeros
de cepa asignados y dispensar 500 l del tampn
PIV (Anexo 1) en cada tubo eppendorf
Aadir, aproximadamente, una asa blanca del
cultivo y homogeneizar mediante el vrtex
Centrifugar 3 minutos en la microcentrfuga de
sobremesa a 13.000 rpm
Eliminar el sobrenadante, primero por decantacin,
luego con punta amarilla. Dejar el pellet lo ms
seco posible
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-03
Edicin N 01
Pgina 3 de 8
Agarosa
1g
10xTBE
5 ml
Agua bidestilada
95 ml
1,5 g
7,5 ml
142,5 ml
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-03
Edicin N 01
Pgina 4 de 8
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-03
Edicin N 01
Pgina 5 de 8
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-03
Edicin N 01
Pgina 6 de 8
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-03
Edicin N 01
Pgina 7 de 8
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
PNT-MMT-03
Edicin N 01
Pgina 8 de 8
MICROORGANISMO
S. aureus
Estafilococos coagulasa negativa
PFGE
Enzima
Unidades/reaccin
BSA
Pulsos
Horas
SmaI (*)
10
0,8 l (200g/ml)
25C
1-30 s
14C
23 h
S. pneumoniae
SmaI (*)
10
S. pneumoniae
ApaI
10
E. faecalis
SmaI (*)
24
E. faecalis
ApaI
30
E. faecium
SmaI
24
E. gallinarum
SmaI (*)
24
S. pyogenes
Sfi I
30
C. difficile
SmaI (*)
20
E. coli
XbaI
40
E. aerogenes
XbaI
40
K. pneumoniae
XbaI
40
S. enteritidis
SpeI
2,5
S. enteritidis
XbaI
40
S. enteritidis
SpeI+XbaI
2,5+40
P. aeruginosa
SpeI
2,5
B. cepacia
XbaI
40
A. baumanii
SmaI (*)
10
A. baumanii
ApaI
20 (incubar 5 horas)
(*) El tampn ms adecuado para la restriccin en cada caso, es el que
utilizamos preparamos un tampn de restriccin (preSma) (ver anexo 1).
25C
1-30 s
11C
0,8 l (200g/ml)
25C
1-30 s
11C
0,8 l (200g/ml)
25C
5-35 s
11C
0,8 l (200g/ml)
25C
0,5-15 s
11C
25C
0,1-15 s
11C
0,8 l (200g/ml)
25C
0,1-10 s
11C
0,8 l (200g/ml)
50C
20-70 s
14C
25C
1-30 s
11C
0,8 l (200g/ml)
37C
1-30 s
14C
0,8 l (200g/ml)
37C
1-30 s
14C
0,8 l (200g/ml)
37C
1-30 s
14C
0,8 l (200g/ml)
37C
1-30 s
11C
0,4 l (100g/ml)
37C
1-30 s
11C
0,8 l (200g/ml)
37C
0,5-25
11C
0,8 l (200g/ml)
37C
0,5-15 s
14C
0,4 l (100g/ml)
37C
1-30 s
14C
0,8 l (200g/ml)
25C
0,5-15 s
14C
0,8 l (200g/ml)
25C
1-30 s
14C
0,8 l (200g/ml)
viene suministrado por el fabricante. Sin embargo, en la
23 h
23 h
26 h
18 h
24 h
20 h
24h
23 h
23 h
23 h
23 h
23 h
23 h
33h
20 h
23 h
20 h
23 h
restriccin con el enzima Smal,
DOCUMENTO TECNICO
DOCUMENTO TCNICO
PNT-MMT-04
ANLISIS DEL ADN MEDIANTE AMPLIFICACIN CON PCR:
TIPIFICACIN MOLECULAR UTILIZANDO TCNICAS DE AMPLIFICACIN DE ADN RELACIONADO CON
SECUENCIAS REP (repetitive extragenic palindrom)
ELABORADO
Nombre/Firma
EDICIN
01
Fecha
FECHA
REVISADO Y APROBADO
Jefe de Servicio
Nombre/Firma
Fecha
ALCANCE MODIFICACIONES
Edicin inicial
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
1. PROPSITO Y ALCANCE
Descripcin de una metodologa derivada de la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para
estudios de epidemiologa molecular
2. FUNDAMENTO
El campo de aplicacin de la REP-PCR (repetitive
extragenic palindrom) se encuentra limitado a bacilos
Gram-negativos; de hecho se ha utilizado para la
tipificacin de Escherichia coli, Citrobacter freundii,
Salmonella typhimurium y Acinetobacter baumannii
entre otros.
La tcnica se basa en la utilizacin de cebadores
diseados frente a secuencias palindrmicas
repetidas a lo largo del cromosoma bacteriano, que
permiten amplificar regiones del genoma localizadas
entre dos cebadores adyacentes.
Las fases de la metodologa son las siguientes: i)
Extraccin del ADN del microorganismo, ii) Reaccin
en cadena de la polimerasa y iii) Separacin de los
productos de PCR o amplicones.
El nmero de bandas de ADN que se observan en
los patrones de REP-PCR oscila de 3 a 10 con
tamaos variables, lo que permite su fcil
interpretacin.
Esta metodologa se utiliza cuando se necesita
disponer de resultados rpidos de tipificacin
bacteriana para la definicin de un posible brote
epidmico o para conocer si estamos delante de una
reinfeccin o recidiva. Los resultados se pueden
obtener en el mismo da.
Aceite mineral.
Agarosa
Bromuro de etidio, se utiliza a una concentracin
de 0,5 mg/L
Marcador de peso molecular: 100 bp Ladder
(Invitrogen - Ref. 15628019)
Tris base
EDTA
Azul de bromofenol
Sacarosa
Lisozima
Proteinasa K
RNasa
SDS
Cloruro de Magnesio
Cloruro de Potasio
Acido actico glacial
Fenol
Cloroformo-isoamilalcohol
Acetato amnico
Etanol absoluto
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Manuales de funcionamiento correspondientes a
los aparatos empleados (termociclador)
- Bibliografa correspondiente de cada tcnica
- Manual de Seguridad en el Laboratorio de
Microbiologa
6. APARATOS Y MATERIAL
6.1. APARATOS
Termociclador (Existen en el mercado un gran
nmero de termocicladores de diversas casas
comerciales. En principio cualquiera de ellos puede
servir).
Microcentrfuga para tubos eppendorf.
Cubetas para electroforesis en gel de agarosa.
Fuente de electroforesis.
Elementos para la confeccin de geles de agarosa:
molde, bandejas y peines.
Transiluminador de luz ultravioleta y camara
fotogrfica o analizador de imgenes.
Termobloque
4. MUESTRAS
Cultivo bacteriano puro crecido en placas de agar
sangre.
(Normalmente, esta tcnica se aplica a una serie de
aislados dos o ms- entre los que se pretende
estudiar su relacin gentica).
7. PROCEDIMIENTO
7.1. EXTRACCIN DEL ADN CROMOSOMICO
Opcin 1. Purificacin del ADN. La ventaja de este
procedimiento es que permite la cuantificacin
posterior del ADN purificado, favoreciendo de esta
manera la estandarizacin de la tcnica. Si bien
existe
una
amplia
variedad
de
sistemas
comercializados de extraccin de ADN cromosmico
bacteriano nosotros utilizamos la metodologa que se
cita a continuacin.
1. Obtener por centrifugacin (13.000 rpm durante
10 minutos) el sedimento de clulas de un cultivo
de toda la noche (1,5 ml). El medio de cultivo
utilizado es caldo LB.
2. Aadir al sedimento 500 l de Tris 50 mM pH=
8,0 + sacarosa 25%
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
DOCUMENTO TECNICO
DOCUMENTO TCNICO
PNT-MMT-05
ANLISIS DEL ADN POR SECUENCIACIN:
MULTILOCUS SEQUENCE TYPING (MLST) EN Neisseria meningitidis
ELABORADO
Nombre/Firma
EDICIN
01
Fecha
FECHA
REVISADO Y APROBADO
Jefe de Servicio
Nombre/Firma
Fecha
ALCANCE MODIFICACIONES
Edicin inicial
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
Anlisis del ADN por secuenciacin:
PNT-MMT-05
Multilocus sequence typing (MLST) en Neisseria
meningitidis
Edicin N 01 Pgina 2 de 5
1. PROPSITO Y ALCANCE
Describir la metodologa necesaria para el estudio
epidemiolgico de Neisseria meningitidis mediante
multilocus sequence typing (MLST). El procedimiento
que se describe aqu est adaptado para
meningococo, para estudios de cualquier otro
microorganismo se requerira la adaptacin de este
procedimiento.
2. FUNDAMENTO
La tcnica de MLST consiste en el anlisis mediante
secuenciacin del ADN de fragmentos internos de un
nmero determinado de genes codificantes de
distintos
enzimas
metablicos
bacterianos
(housekeeping genes). La comparacin de estas
secuencias entre distintos aislados permite
establecer identidades o diferencias clonales de
utilidad en el anlisis epidemiolgico bacteriano. El
hecho de utilizar enzimas metablicos, no sometidos
a presin selectiva, permite detectar variaciones
neutras que definen lneas clonales relativamente
estables. Por lo tanto, MLST es un marcador
molecular de aplicacin en epidemiologa global o a
largo plazo.
Para cada especie bacteriana, es preciso establecer
un grupo de genes metablicos a estudiar. El
esquema de MLST desarrollado para cepas de
meningococo utiliza fragmentos internos de los
siguientes genes: abcZ (transportador ABC), adk
(adenilato kinasa), aroE (sikimato deshidrogenasa),
fumC (fumarato hidratasa), gdh (glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa), pdhC (piruvato deshidrogenasa),
pgm (fosfoglucomutasa).
El procedimiento consta de las siguientes fases:
i) Extraccin ADN
ii) Amplificacin de los genes metablicos
iii) Reaccin de secuenciacin
En el caso de N. meningitidis, los iniciadores que se
utilizan para la amplificacin son diferentes a los que
se utilizan en la secuenciacin. En otros casos, como
neumococo o estafilococos, los iniciadores son los
mismos en ambos procesos.
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Manuales de funcionamiento correspondientes a
los aparatos empleados en este procedimiento
- Bibliografa correspondiente de cada tcnica
- Manual de Seguridad en el Laboratorio de
Microbiologa
4. MUESTRAS
Cultivos bacterianos en cultivo puro, aislados en
placas de agar sangre.
Esta tcnica puede aplicarse en aislados
individualmente ya que la pertenencia a complejos
clonales se establece por comparacin de los
resultados obtenidos con los almacenados en base
de datos mediante Internet.
5. MEDIOS DE
PRODUCTOS
CULTIVO,
REACTIVOS
6. APARATOS Y MATERIAL
6.1. APARATOS
Termociclador (Existe un gran nmero de
termocicladores de diversas casas comerciales. En
principio cualquiera de ellos puede servir).
Sistema de secuenciacin, en este procedimiento
se hace referencia al sistema de secuenciacin
utilizando el modelo ABI PRISM 3100
Microcentrfuga para tubos eppendorf.
Cubetas para electroforesis en gel de agarosa.
Fuente de electroforesis.
Elementos para la confeccin de geles de agarosa:
molde, bandejas y peines.
Transiluminador de luz ultravioleta y cmara
fotogrfica o analizador de imgenes.
Termobloque.
Bao de ebullicin.
6.2. OTRO MATERIAL
Asas bacteriolgicas.
Tubos eppendorf de 1, 5 ml.
Tubos dePCR de 200 l.
Pipetas de volumen variable y puntas estriles.
7. PROCESAMIENTO
7.1. EXTRACCIN DE ADN
Rotular un tubo eppendorf con el nmero
correspondiente al aislado que se este estudiando.
Aadir en el tubo 500 l de H2O destilada.
Aadir, aproximadamente, un asa azul del cultivo y
homogeneizar mediante el vrtex.
Introducir el eppendorf durante 10 minutos en bao
de ebullicin o termobloque a 100C.
Colocar el eppendorf a 20C dos minutos.
Centrifugar 5 minutos a 13.000 rpm.
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
Anlisis del ADN por secuenciacin:
PNT-MMT-05
Multilocus sequence typing (MLST) en Neisseria
meningitidis
Edicin N 01 Pgina 3 de 5
Taq
polimerasa
TOTAL
99,0 l
(Los iniciadores 1 y 2 dependen de cada uno de
los genes a amplificar y su secuencia viene
especificada en el punto 5 Medios, reactivos y
productos de este procedimiento)
- Multiplicar las cantidades sealadas por el nmero
de reacciones de PCR que se vayan a realizar ms
1,0
l
(aproximadamente
50ng/l) en cada tubo
el termociclador,
condiciones de
DE
LOS
GENES
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
Anlisis del ADN por secuenciacin:
PNT-MMT-05
Multilocus sequence typing (MLST) en Neisseria
meningitidis
Edicin N 01 Pgina 4 de 5
96C, 10 segundos
50C, 5 segundos
60C, 4 minutos
Refrigerar a 4C sin lmite de tiempo para
mantener las muestras refrigeradas hasta que
se recojan
- Una vez finalizada la reaccin de secuencia se lleva
el volumen hasta los 20 l recomendados, con la
adicin de 15 l de agua destilada.
- Se procede entonces a aadir 2 l de una solucin
3M de NaOAc pH= 4,6 y 50 l de etanol en un tubo
eppendorf de 1,5 ml, aadiendo entonces los 20 l
de cada reaccin de secuencia.Tras mezclar
suavemente se incuba 15 minutos a temperatura
ambiente.
- Seguidamente, se centrifugan los tubos a mxima
velocidad durante 15-30 minutos y se descarta el
sobrenadante con ayuda de una pipeta.
- Se lava el sedimento con 500 l de etanol
repitindose la centrifugacin durante 10 minutos.
Eliminar de nuevo el sobrenadante, recogiendo todo
el etanol que sea posible.
- Secar el sedimento en un desecador al vaco y
almacenar a 20C hasta que sea analizado en gel
de secuencia. En el momento de cargar el gel, cada
Servicio de Microbiologa
Hospital...........................
Fecha:
Anlisis del ADN por secuenciacin:
PNT-MMT-05
Multilocus sequence typing (MLST) en Neisseria
meningitidis
Edicin N 01 Pgina 5 de 5