1.

Introduo
A famlia Baculoviridae compreende vrus capazes de infectar diversas ordens
de insetos, principalmente Lepidoptera (Miller, 1997). No entanto, j foram descritos
baculovrus em outras ordens, tais como himenpteros, dpteros e colepteros. Assim
eles tm sido amplamente utilizados como biopesticidas para o controle biolgico
(Castro et al., 1999). Tal famlia compreende dois gneros: os Nucleopolyhedrovirus ou
vrus da poliedrose nuclear (NPV), e os Granulovirus ou vrus da granulose (GV) (Funk
et al., 1997). Nos NPV, a replicao viral apresenta dois fentipos distintos. Vrus
extracelulares ou BV (do ingls budded virus) so produzidos na fase inicial da infeco
e so responsveis pela transmisso clula a clula. Com o avano da infeco, passam
a ser produzidos vrus ocludos ou OB (do ingls occluded bodies, denominados de
poliedros nos NPV e grnulos nos GV), os quais so responsveis pela transmisso
entre os insetos (Summers, M. D.; Smith, G. E, 1978).
No meio ambiente, a transmisso do vrus para o inseto ocorre pela via oral.
Quando o inseto ingere um alimento contaminado por poliedros, esses atingem o
intestino mdio. O pH alcalino do intestino, leva solubilizao dos poliedros e
liberao dos vrions. Essas partculas virais atravessam a membrana peritrfica devido
ao de metaloproteases virais. Aps romper a barreira da membrana peritrfica, os
vrus entram nas clulas colunares no intestino, atravs de fuso de membranas (fig 1).
O vrus ento transportado para o ncleo atravs do citoesqueleto (Slack & Arif,
2007).
Inicialmente, so formados os BVs, que deixam as clulas do intestino,
atravessam a membrana basal, atingem a traquia ou a hemolinfa e assim podem
infectar os demais tecidos do inseto, como o tecido adiposo, tbulos de Malpighi e
tegumento (Keddie, 1989). Numa fase tardia da infeco, h intensa produo de
poliedrina e a formao dos poliedros no ncleo. Aps alguns dias, a lagarta morre e os
poliedros so liberados no ambiente (Williams & Faulker, 1997). Alguns baculovrus,
como o baculovrus tipo AcMNPV, possuem os genes das proteases catepsina e
quitinase, que levam liquefao do inseto. Tal processo facilita a disperso do vrus no
ambiente (Cory et al, 1997).
Em cultura de clulas, a infeco iniciada com os BVs, que entram na clula
via endocitose adsortiva. Diferentemente, os OBs atingem a clula atravs da fuso
direta de membranas (Ribeiro, 1999).
1

Figura 1: Ciclo de infeco oral do inseto pelo baculovrus. Representao esquemtica de uma larva de
Lepdoptera. Ao ingerir um alimento contaminado pelos corpos de ocluso (OB), esses atingem o intestino
mdio do inseto, onde eles so dissolvidos pelo pH alcalino. A partcula viral liberada e atinge as clulas
colunares do intestino, dando incio infeco (Adaptado de Slack & Arif, 2007).

Em cultura de clula possvel analisar em detalhes a regulao da expresso

gnica em baculovrus, que pode ser dividida em duas fases principais: fase precoce
(early) e fase tardia (late). Essas fases podem ser subdivididas em fase precoce imediata
(immediately early), cujos genes so expressos nas primeiras horas de infeco, e fase
muito tardia (very late), que representa os genes que so expressos aps 24 horas de
infeco (Maruniak, 1986). A fase imediata se inicia a partir de aproximadamente 20
minutos at 8 horas ps-infeco (h.p.i.) e corresponde basicamente a fatores de
transcrio, bem como protenas pertencentes maquinaria de replicao viral. O DNA
do vrus comea ento a ser transcrito, ocorre rearranjos do citoesqueleto e a cromatina
da clula hospedeira se dispersa no ncleo (Friesen, 1997). Quando o DNA viral
comea a ser replicado, inicia-se a fase tardia. Nessa fase h intensa produo de
protenas responsveis pela construo de partculas virais extracelulares (BV), como a
protena GP64, principal constituinte do envelope viral. Essa fase se estende at 24 h.p.i.
(Lu & Miller, 1997). Na ltima fase da infeco (very late), que se inicia a partir de 18
2

horas, a poliedrina, uma protena de aproximadamente 30kDa, largamente produzida

para que haja a formao dos corpos de ocluso. Ao fim ocorre a lise celular
(Rohrmann, 1986).
A poliedrina a principal constituinte do vrus ocludo (OV), que ao ser ingerido
pelo inseto dissolvido no intestino mdio devido ao pH alcalino (Funk et al., 1997).
Ela compreende mais 95% de todas as protenas virais na fase very late (Jarvis, 1997).
Devido a sua alta produo, o lcus da poliedrina comumente utilizado para a
construo de baculovrus recombinantes como vetor de expresso (Rohrmann, 1986).
O sistema de expresso em baculovrus vem sido utilizado desde a dcada de
1980 (Smith et al, 1983). Protenas de diferentes organismos podem ser expressas
atravs desse sistema. Para isso, o gene de interesse deve ser introduzido no lcus de um
gene no essencial para a replicao viral, como o gene da poliedrina, sob o comando de
um promotor forte (OReilly et al, 1994). O promotor da poliedrina um dos mais
utilizados para esse objetivo. Alm dele, o promotor da protena p10 tambm
amplamente empregado (Rohrmann, 1986).
H diversos mtodos para a construo de um vrus recombinante e, atualmente,
h uma mirade de vetores e genomas comerciais para a produo desses vrus. A
escolha depender do estudo a ser realizado.
2. Objetivos
Compreender os mtodos mais utilizados em virologia molecular, a biologia
molecular dos baculovrus, seus efeitos no hospedeiro e as tcnicas mais comuns para a
produo de baculovrus recombinantes.
3. Materiais e Mtodos
Clulas
Para a obteno do vrus recombinante, foi utilizada a linhagem celular BTITN5B-14 (TN5B), derivada de Trichoplusia ni (Granados et al., 1994). As clulas
foram mantidas em meio TC-100 (GIBCO) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), a
28C.
Anlise da infeco viral em cultura de clula
3

Para anlise de infeco e produo de protena heterloga foram utilizados os

vrus AcMNPV, vSynGal (Lee & Miller, 1978), vSynCry1C (Aguiar, 2006), vSynYFe
(Machado, 2007) e M7 (Rocha, J., no publicado). Tais vrus foram utilizados para
infectar uma placa de 6 poos de clulas TN5B: o meio das clulas foi retirado, foi
adicionado 500L de vrus (cerca de 108 vrus/mL) e as clulas foram incubados por 1
hora a temperatura ambiente. A seguir, foi adicionado 250L de meio TC-100 contendo
10% de FBS. As clulas foram fotografadas diariamente em um microscpio de luz
invertida (Zeiss Axiovert 200), com um aumento de 40 vezes, para acompanhamento
dos efeitos citopticos causados pelo vrus.
96 horas ps-infeco o extrato de clulas foi coletado. As clulas foram
coletadas e centrifugadas por 5 minutos, 3.000 rotaes por minuto (RPM). O
sobrenadante foi descartado e o pellet foi lavado trs vezes com 1 mL de PBS, com o
intuito de eliminar o excesso de albumina bovina da amostra (protena abundante no
FBS). Por fim, o pellet foi ressuspendido em 50L de PBS. As amostras foram
analisadas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
Gel de poliacrilamida desnaturante SDS-PAGE
O gel de poliacrilamida composto por um gel separador e um gel concentrador.
O gel separador contendo 12% de acrilamida foi preparado em tampo tris-HCl 1,5 M
pH 8,8 contendo SDS 10%, 10L de TEMED e 120L de persulfato de amnio (10%)
em volume final de 5 ml. Aps a polimerizao do gel separador, foi preparado o gel
concentrador (acrilamida 4%, tris-HCl 0,5 M pH 6,8, SDS 10%, 10L de TEMED e
120L de persulfato de amnio 10%). As amostras foram fervidas por 5 minutos com
tampo super-desnaturante (1X tris-HCl 0,06 M pH 6,8, SDS 2%, glicerina 10%,
bromofenol 0,02%, 5% de 2--mercaptoetanol).
A corrida de eletroforese foi realizada em tampo tris-HCl 0,025 M, glicina 0,18
M, pH 8,3 SDS 1% em corrente de 200V. Aps a corrida, o gel de poliacrilamida foi
corado em uma soluo de "Coomassie-blue" R-250 (0,25% em soluo de metanol,
gua e cido actico 5:5:1) por 16 horas. A remoo do excesso de corante foi
realizada com gua destilada aquecida.
Purificao em larga escala de budded vrus (BV)
4

Duas placas contendo cerca de 106 clulas TN5B cada foram infectadas com o
vrus vSynGal. Sete dias ps infeco (dpi) o material foi coletado, centrifugado por 5
minutos a 3.000 RPM para remover o excesso de clulas e o sobrenadante coletado. O
sobrenadante o estoque viral e nele encontram-se os budded vrus (BV). 1,5 mL do
sobrenadante foram coletados para uma mini-preparao de DNA. O material restante
(33 mL) foi utilizado para uma purificao de BV em larga escala. 28 mL do estoque
viral

foram

colocados

em

tubos

para

ultracentrfuga

(Beckman

SW28).

Cuidadosamente, foi colocado no fundo do tubo, com uma pipeta de vidro, 3 mL do

colcho de sacarose (25% de sacarose, peso/volume, em 5 mM de NaCl e 10 mM de
EDTA). Os 5mL restantes do estoque viral foram adicionados sem perturbar o colcho.
A amostra foi centrifugada a 24.000 RPM, por 75 minutos, a 4C. O sobrenadante foi
descartado e o pellet ressuspendido em 2 mL de PBS.
Extrao de DNA de BV Anlise Eletrofortica do DNA Viral Purificado e Digerido
Foi extrado DNA viral do sobrenadante da infeco com vSynGal e do BV
vSynGal purificado. Para a mini-preparao, utilizando o sobrenadante, a amostra foi
centrifugada a 14.000 RPM por 25 minutos, o sobrenadante descartado e o pellet
(concentrado viral) ressuspendido em 100L de tampo de disrupo viral (10mM trisHCl pH 7.6; 10mM EDTA; 0,25% SDS). Foram adicionados 2,5L de proteinase K
(20mg/mL) e a amostra foi incubada a 37C por 16 horas. Foi adicionado 400L de
gua miliQ e 500L de fenol-clorofrmio. A amostra foi vortexizada e centrifugada
14.000 RPM por 5 minutos. A fase aquosa foi coletada, a ela foi adicionado 400L de
clorofrmio, vortexizada e centrifugada novamente. A nova fase aquosa foi coletada,
precipitada com acetato de sdio 3M e etanol absoluto por 1 hora a -20C, centrifugada
a 14.000 RMP por 10 minutos, lavada com etanol 70% e ressuspensa em 20L de gua
miliQ.
O BV purificado foi centrifugado a 14.000 RPM por 25 minutos, o sobrenadante
descartado, o pellet ressuspendido em 500L de tampo de disrupo, adicionado
12,5L de proteinase K e incubada a 37C por 16 horas. Foi adicionado 500L de fenolclorofrmio e o protocolo seguiu-se como descrito para a minipreparao.
A qualidade dos DNA purificados foi analisada em gel de agarose 0,8%. As
amostras foram ento digeridas com a enzima de restrio EcoRI para anlise do perfil
5

de restrio. As reaes de restrio foram 2L de tampo 10X, 2L de BSA 10mg/mL,

0,3L de enzima 12 unidades/L e DNA (2L do DNA do BV purificado e 5L do
DNA de sobrenadante). O volume final das reaes foi 20L e as mesmas foram
analisadas em gel de agarose 0,8%.
Transformao DH10Bac e PCR de colnia
Clulas DH10Bac (Invitrogen) foram transformadas com o plasmdeo
pFastBacLAP2, um plasmdeo contendo o gene lap, que codifica uma protease do
Trypanossoma cruzi. 3L do plasmdeo foi misturado a 100L de clulas DH10Bac e
incubado no gelo por 30 minutos. Aps esse tempo as clulas receberam um choque
trmico de 42C por 2 minutos e imediatamente depois incubadas no gelo por 2
minutos. Foi adicionado 1 mL de meio LB sem antibiticos e as clulas foram
incubadas a 37C, sob agitao por 4 horas. As clulas foram ento centrifugadas por 8
minutos a 6.000 RPM e plaqueadas em placas LB-gar contendo 50 g/ml de
canamicina, 7 g/ml de gentamicina, 10 g/ml de tetraciclina, 100 g/ml de X-gal e 40
g/ml de IPTG. As placas foram mantidas a 37C por 48 horas.
Aps 48 horas foram coletadas as colnias brancas da placa e uma colnia azul,
para controle negativo. Cada colnia foi palitada delicadamente, colocada em 10L de
gua miliQ e aquecida a 94C por 5 minutos. 5L de cada amostra foram utilizados para
a realizao de uma PCR de colnia utilizando os oligonucleotdeos M13F e M13R ou
M13F e LAPR. A reao de PCR foi 1,25L tampo 10X; 0,5L M13F 10M; 0,5L
M13R 10M ou LAPR 10M; 0,25L dNTP 10mM; 0,75L MgCl 2 50mM; 0,125L
Taq DNA polimerase (Fermentas). As reaes de PCR foram analisadas em gel de
agarose 0,8%
As mesmas colnias foram palitadas novamente, colocadas em meio LB lquido
contendo 50 g/ml de canamicina, 7 g/ml de gentamicina, 10 g/ml de tetraciclina e
incubadas por 16 horas a 37C, sob agitao.

Transfeco com o bacmdeo BacAcLAP2 e SDS-PAGE

Previamente, clulas DH10Bac (Invitrogen) haviam sido transformadas com o

plasmdeo pFastBacLAP2. O DNA plasmidial, contendo o bacmdeo BacAcLAP2, foi
purificado atravs de uma minipreparao. A presena do gene lap2 foi confirmada por
PCR e o DNA foi utilizado para uma transfeco.
5x105 clulas TN5B foram transferidas para uma placa de 35 milmetros (mm),
aguardou-se 1 hora para que as clulas formassem uma monocamada e todo o meio foi
retirado. 500ng do DNA do bacmdeo foi incubado em outra placa de 35 mm com
250L de meio TC-100 sem soro por 10 minutos a temperatura ambiente.
Separadamente, foi incubado 10L de Cellfectina 10mg/mL (Invitrogen) com 250L de
meio TC-100 sem soro por 10 minutos. A seguir, as duas solues foram misturadas,
incubadas por 10 minutos, adicionadas s clulas TN5B e incubadas por mais 3 horas. O
sobrenadante foi retirado e adicionado 2 mL de meio TC-100 com soro.
Sete dias ps-infeco o sobrenadante foi coletado e utilizado para infectar uma
nova placa de clulas Sf21. As clulas foram coletadas, lavadas trs vezes com PBS e o
extrato analisado em um SDS PAGE.
Co-transfeco do DNA viral vSynGal com o vetor de transferncia pSyn-PP-PSBsTx em clulas TN5B
O DNA do vrus vSynGal foi digerido com a enzima Bsu36I a fim de linearizlo. A linearizao impede que o DNA viral seja infectivo. Isso facilita a purificao do
vrus recombinante, uma vez que somente o vrus de interesse dever replicar-se na
cultura de clulas, no havendo contaminao pelo vrus selvagem.
5x105 clulas TN5B foram transferidas para uma placa de 35 milmetros (mm),
aguardou-se 1 hora para que as clulas formassem uma monocamada e todo o meio foi
retirado.
500ng (6L) do DNA viral linearizado foi incubado em uma placa de 35 mm
com 1g (3L) do plasmdeo pSyn-PP-PS-BsTx (fig 2) e 250L de meio TC-100 sem
soro por 10 minutos a temperatura ambiente. O plasmdeo pSyn-PP-PS-BsTx codifica
uma toxina de aranha e sua expresso em baculovrus pode torn-lo mais virulento.
Separadamente, foi incubado 10L de Cellfectina 10mg/mL (Invitrogen) com 250L de
meio TC-100 sem soro por 10 minutos. A seguir, as duas solues foram misturadas,
incubadas por 10 minutos, adicionadas s clulas TN5B e incubadas por mais 3 horas. O
sobrenadante foi retirado e adicionado 2 mL de meio TC-100 com soro. A co7

transfeco foi observada ao longo de uma semana. O DNA viral utilizado no possui o
gene da poliedrina. Caso ocorra a recombinao homloga, o gene da poliedrina
presente no plasmdeo integrado ao genoma viral. Dessa forma, somente os vrus
recombinantes apresentaro formao poliedros.
96 horas ps-infeco havia uma contaminao por fungo na placa. O
sobrenadante foi recolhido, filtrado em um filtro de 0,22 m e o material obtido foi
utilizado para infectar uma nova placa de clulas TN5B. As clulas foram observadas
em microscpio de luz invertida para observar a presena ou ausncia de poliedros.

Figura 2: Mapa do plasmdeo pSynPPSPBsTx produzido no programa VectorNTI (Invitrogen). O gene

da toxina de aranha contm um peptdeo sinal e um pr-peptdeo sinal e est sob o comando dos
promotores pXI (promotor da poiedrina modificado) e pSyn. O plasmdeo contm ainda o gene da
poliedrina do vrus AcMNPV e as regies de recombinao homloga (ORF 1629 e ORF 603).

Ensaio da atividade da luciferase

Clulas TN5B foram infectadas com o vrus vAgie1Fluc, que possui o gene da
luciferase do vagalume sob o comando do promotor de baculovrus ie1. As clulas e o
sobrenadante foram coletados e centrifugados a 3.000 RPM, por 5 minutos. O
sobrenadante (estoque viral) foi coletado para titulao. O pellet de clulas foi
ressuspendido em 400L de tampo de lise (1M TrisHCl, glicerol 10%, BSA 10mg/mL,
1% Triton X-100). O lisado celular foi colocado no luminmetro (TD 20/20, Tuner)
para leitura da luminescncia de fundo das clulas. A seguir foram adicionados 2L do
substrato Luciferase Reagent System (Promega) e a luminescncia foi lida novamente.

Titulao
Clulas UFL-AG foram diludas em meio TC-100 com 10% de FBS para
obteno de uma concentrao de 105 clulas /mL. O estoque do vrus vAgie1Fluc foi
diludo em meio TC-100 com soro. Foram preparadas diluies seriadas de 10 -1, 10-2,
10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 e 10-8. As diluies 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4 foram descartadas, pois,
como a quantidade de vrus presente alta, todos os poos apresentariam infeco. Dez
microlitros de cada diluio viral (10-5, 10-6, 10-7 e 10-8) com 200 L de clulas foram
distribudos na placa de 96 poos. Quatro poos foram reservados como controle,
contendo apenas clulas. A placa foi incubada a 26C por sete dias. Segundo esta
metodologia, o ttulo viral expresso em TCID 50/mL (Tissue Culture Infectious Dose
50), ou seja, a quantidade de vrus necessria para produzir efeito citoptico em 50%
das clulas inoculadas. O clculo foi feito conforme descrito por OReilly et al (1994).
4. Resultados e discusso
Anlise da infeco viral em cultura de clula
As clulas infectadas com os vrus AcMNPV, vSynGal, vSynCry1C, vSynYFe e
M7 foram fotografadas ao longo de 70 horas de infeco para observao dos efeitos
citopticos (fig 3 e 4). Com 22 horas de infeco no possvel observar efeitos nas
clulas, com 46 horas de infeco foi possvel observar pequenas alteraes nas clulas
infectadas com os vrus AcMNPV, vSynCry1C e vSynYFe. No entanto, apenas com 70
horas de infeco os efeitos citopticos tornaram-se evidentes.
As clulas no infectadas (mock) se dividiram ao longo do tempo e com 70
horas de cultivo, a placa estava completamente preenchida por uma monocamada de
clulas (fig 3C). O vrus AcMNPV selvagem (fig 3D, E, F) provocou morte celular,
hipertrofia nuclear e 70 horas ps infeco (hpi) houve formao de poliedro (fig 5A).
O vrus vSynGal no causou efeitos citopticos e 70hpi a morfologia das clulas era
semelhante s clulas mock (fig 3I). Provavelmente havia algum problema com o
estoque viral usado inicialmente.
Algumas clulas infectadas com o vrus vSynCry1C apresentaram ncleo
hipertrofiado aps 70 horas de infeco (fig 4C) e houve formao de cristais (fig 5B),
uma vez que a protena Cry1C se cristaliza. O vrus vSynYFe expressa a protena do
9

envelope do vrus da febre amarela. Tal protena induz a formao de sinccio em

clulas de mosquitos e em clulas humanos. O mesmo efeito citoptico foi observado
nas clulas de lepidptero (fig 5C). O vrus M7 contm o gene da poliedrina, mas no
foi observada a formao de poliedros 70hpi (fig 4I).

Figura 3: Anlise dos efeitos citopticos em clulas TN5B infectadas por diferentes vrus. Clulas TN5B
com (A) 22 horas, (B) 44 horas e (C) 70 horas de cultivo. Clulas TN5B infectadas com cerca de 10 4
vrus de AcMNPV selvagem (D) 22 horas, (E) 44 horas e (F) 70 horas ps infeco ou do vrus vSynGal
(G) 22 horas, (H) 46 horas e (I) 70 horas ps infeco. Zeiss Axiovert 200, 40X.

10

Figura 4: Anlise dos efeitos citopticos em clulas TN5B infectadas por diferentes vrus. Clulas TN5B
infectadas com cerca de 104 do vrus vSynCry1C com (A) 22 horas, (B) 44 horas e (C) 70 horas de
infeco; do vrus vSynYFe com (D) 22 horas, (E) 44 horas e (F) 70 horas de infeco ou do vrus
vSynGal com (G) 22 horas, (H) 46 horas e (I) 70 horas de infeco. Zeiss Axiovert 200, 40X.

Figura 5: Efeitos citopticos observados 70 horas ps infeco com os vrus (A) AcMNPV, (B)
vSynCry1C e (C) vSynYFe. As setas indicam a formao de (A) poliedros, (B) cristais ou (C) sinccios.

11

SDS-PAGE
O extrato das clulas infectadas com os vrus AcMNPV, vSynGal, vSynCry1C,
vSynYFe e M7 foi coletado 96hpi e analisado em um gel de poliacrilamida (fig 6). Nas
clulas infectadas com os vrus AcMNPV, vSynCry1C e vSynYFe possvel observar a
banda de cerca de 30kDa correspondente poliedrina (poos 3, 5 e 6, respectivamente).

1
4
7

2
5

3
6

Figura 6: Anlise em SDS-PAGE do perfil de bandas proticas de clulas (2) no infectadas ou

infectadas com (3) AcMNPV, (4) vSynGal, (5) vSynCry1C, (6) vSynYFe e (7) M7. No poo 1, marcador
Benchmark (Invitrogen). Seta indica a altura da poliedrina.

Anlise Eletrofortica do DNA Viral Purificado e Digerido

O DNA viral purificado a partir do sobrenadante de infeco ou a partir do BV
purificado por colcho de sacarose foi digerido com a enzima de restrio EcoRI e
analisado em gel de agarose (fig 7). Foram observadas diversas bandas conforme o
esperado.

1
4

2
5

12

Figura 7: Anlise eletrofortica em gel de agarose 0,8% do DNA de BV intacto e digerido com a enzima
EcoRI. (1) 1kb DNA Ladder (Fermentas), (2) DNA extrado a partir do BV purificado, (3) digesto com
EcoRI, (4) DNA extrado a partir do sobrenadante de infeco, (5) digesto com EcoRI.

PCR de colnia
No ocorreu a transposio do gene Lap 2 para o bacmdeo, conforme foi
confirmado utilizando os primers M13F e LAPR (fig 8A) ou M13F e M13R (fig 8B).
Para controle positivo da reao foi coletada uma colnia azul e utilizados os primers
M13F e M13R. Com isso, foi amplificado um fragmento com cerca de 300 pares de
base (bp), correspondente ao fragmento do bacmdeo sem a transposio do gene de
interesse.
(A)

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10

2
11

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(B)

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Figura 8: PCR das colnias de DH10Bac transformadas com pFastBacLap2 para confirmao da correta
transposio para o bacmdeo. (A) (1-10) PCR utilizando os primers M13F e LAPR, (11) 1kb DNA
Ladder (Fermentas), (12) controle negativo, (13) controle positivo. (B) (1-11) PCR utilizando os primers
M13F e M13R, (12) 1 kb DNA Ladder (Fermentas).

Transfeco com o bacmdeo BacAcLAP2 e SDS-PAGE

Sete dias aps a transfeco com o plasmdeo pFastBacLAP2, as clulas TN5B
foram fotografadas (fig 9), o extrato de clulas foi coletado e analisado em um gel de
poliacrilamida (fig 10). Foi possvel observar efeito citoptico nas clulas, como
hipertrofia nuclear e clulas arredondadas. No extrato de clulas, foi identificada uma
13

banda mais forte de 60kDa, o tamanho esperado para a protease LAP. Para confirmar se
essa banda se trata da protena de interesse dever ser realizado um western blot.

Figura 9: Anlise dos efeitos citopticos em clulas TN5B transfectadas com o plasmdeo pFastBacLAP
7 dias ps transfeco. Zeiss Axiovert 200, 40X.

2
5
9

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7

4
8

Figura 10: Anlise em SDS-PAGE do perfil de bandas proticas de clulas TN5B (2, 3 e 4) transfectadas
com o plasmdeo pFastBacLAP2, infectadas com (5) vSynYFe, (6) vSynCry1C, (7) vSynGal, (8)
AcMNPV ou (9) clulas no infectadas. No poo 1, marcador Benchmark (Invitrogen). Seta indica a
altura esperada para a protease LAP.

Co-transfeco do DNA viral vSynGal com o vetor de transferncia pSyn-PP-PSBsTx em clulas TN5B
Clulas TN5B foram fotografadas 72 horas aps a co-transfeco (fig 11A).
Havia poucas clulas com poliedros e uma contaminao por fungo. Assim, uma nova
placa de clulas TN5B foi infectada com o sobrenadante filtrado da co-transfeco.
72hpi foi possvel observar algumas poucas clulas com poliedros (fig 11B). O vrus
dever ser purificado por diluio seriada (OReilly et al, 1994).

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Figura 11: (A) Anlise dos efeitos citopticos em clulas TN5B co-transfectadas com o DNA viral
vSynGal e o vetor de transferncia pSyn-PP-PS-BsTx aps 72 horas. 40X (B) Anlise dos efeitos
citopticos em clulas TN5B infectadas com o sobrenadante da co-transfeco do DNA viral e o vetor de
transferncia 72 hpi. 20X. Zeiss Axiovert 200.

Ensaio da atividade da luciferase

A leitura da luminescncia de fundo das clulas antes da adio do substrato
luciferina foi de 0,68 unidades luminosas (UL). Aps a adio do substrato esse valor
foi superior a 9.999 UL, indicando a presena da luciferase na amostra.
Titulao
A diluio 10-4 infectou todos os 24 poos, as diluies 10 -5 e 10-6
infectaram 7 e 2 poos, respectivamente. A dose que fornece 50% da resposta, TCID 50
/mL, foi calculada em uma planilha do Excel (fig 12) de acordo com o descrito por
OReilly et all (1994). O ttulo encontrado foi de 5,82E+6 TCID 50/mL, o que
corresponde a 4,01E+6 pfu/mL (unidade formadora de placa).

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Figura 12: Clculo da titulao viral numa planilha de Excel.

5. Concluses
Ao longo do curso foi possvel comprovar que os baculovrus so ferramentas
biotecngicas poderosas para o controle biolgico, expresso heterloga e potenciais
vetores de terapia gnica. Os experimentos realizados permitiram compreender as
tcnicas utilizadas para a construo de um baculovrus recombinante e como analisar
os parmetros desejados.
6. Referncias bibliogrficas
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