INSTITUTOPOLITCNICONACIONAL

EscuelaSuperiordeMedicina

Sntesis,caracterizacinyevaluacinmicrobiolgica
decompuestosEspirolactmicos

QUEPARAOBTENERELGRADODE:
MAESTRAENCIENCIASCONESPECIALIDADEN
FARMACOLOGA

Q.F.B.IoStephanieZamudioVega

MXICOD.F.JUNIODEL2009

ProyectodirigidoporelDr.JosG.TrujilloFerraradellaboratoriode
bioqumicadelaEscuelaSuperiordeMedicinadelInstitutoPolitcnico
Nacional,conelapoyodelosproyectosSIP20070652ySIP20080433.

LapartedesntesisqumicasellevacaboenelLaboratoriodeQumica
OrgnicadelCentrodeInvestigacinenCienciaAplicadayTecnologa
Avanzada.UnidadlegaradelInstitutoPolitcnicoNacional,conapoyodelos
proyectosSIP20080495ySIP20090322;bajoladireccindelaDra.Delia
QuintanaZavala

LapartemicrobiolgicasellevacaboenelLaboratoriodeMicrobiologa
generaldelDepartamentodeMicrobiologadelaEscuelaNacionalde
CienciasBiolgicasdelInstitutoPolitcnicoNacional,bajoladireccindela
Dra.Ma.LourdesVillaTanaca

AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Trujillo por su confianza al darme este proyecto, por sus consejos, su apoyo a lo largo de la
maestra y por ser una gran persona.

A la Dra. Delia por que como investigadora su tica es inmensa, su amor y dedicacin a su trabajo
es loable y su temple ante cualquier adversidad es alabable. Como persona su grandeza habla por s
misma, y para quien no la conoce su apoyo, su confianza, su tiempo, su paciencia, y su gua me
ayudaron a lo largo de la maestra; pero sobre todo su amistad fue y es muy valiosa.

A la Dra, Ma. Lourdes Villa Tanaca por su apoyo, su tiempo y su gua a lo largo del desarrollo de
este trabajo. Gracias a que me permiti trabajar a su lado, conoc varias personas maravillosas
como: el Dr. Csar, Maru, Emma, Bere, Mariela, y todas aquellas personas que siempre me
apoyaron, orientaron y me brindaron su amistad.

Al Dra Eduardo Ramrez San Juan, porque me ense que la grandeza de una persona no est en
cuanto sabe, sino en su manera de conducirse y su manera de comportarse. Gracias por sus
enseanzas, que no fueron fciles pero fueron muy grandes y gratificantes. Me ayud a motivarme
para continuar en el camino de la investigacin, an cuando el camino a veces se ve casi imposible
de cruzar.

Al Dr. Correa por su apoyo en el desarrollo de este trabajo y por su paciencia a travs de este
mismo.

A Maru por su tiempo, dedicacin, amistad y sus enseanzas que me permitieron concluir con este
trabajo de manera exitosa.

A mis amigos y ms grandes hermanos Alberto Guevara y Olivier por su amistad, su tiempo, su
gua, y por escucharme completamente. Pero sobre todo por aceptarme desde el primer momento
como era y como soy, y permitirme entrar a sus vidas a travs de la amistad. Su apoyo
incondicional fue y es una de mis fortalezas que me ha permitido levantarme cuando ms me senta
derrotada a nivel personal y profesional.

A mis amigos de la maestra Arianna, Iris, Carlos y Marvin por todos esos momentos de alegra, por
haberme permitido conocerlos y por que dejaron una huella en mi corazn. Que nuestra amistad
perdure mas all de cualquier ideologa, sendero tomado o incluso de nosotros mismos.

A Flix por su amistad, su alegra y su apoyo en la Maestra. Y aunque empec a conocerlo hace
poco tiempo, encontr a una gran persona en l.

A todas aquellas personas que me ayudaron a cerrar un ciclo ms en mi vida.

DEDICATORIA
Este trabajo lo dedico con todo mi corazn a mi esposo que desde antes de iniciar con este proyecto
me ha brindado su apoyo incondicional a travs de su amor, paciencia, cario, comprensin y
dedicacin a nuestra relacin. El tiempo no marca la grandeza de una relacin, lo que la hace
grande es la pureza con que se entrega el corazn y la conviccin de que tal vez no haya un maana
pero si un ahora.

A mi hija Isilien Ahtziri luna-sol que es mi mayor tesoro en la vida, con este trabajo te regalo un
gran tesoro: el conocimiento del saber.

A mi abuelita Chelito que siempre est conmigo. Hoy cierro otra etapa de mi vida y le doy gracias a
Dios de que te sigue dando vida para compartirlo a tu lado.

A mi abuelo Chavita que siempre est cuidando de mi familia, pero sobre todo que el mi ngel
guardin.

A mi madre porque una vez ms cumplimos un sueo juntas. T que eres mi pilar y mi vida te
dedico con todo mi corazn este trabajo.

A Adolfo Morales PP por apoyarme en todo momento y formar parte de mi familia.

A mi ta Luna Myrna porque siempre me acompaa en mi corazn y me gua para ser mejor cada
da.

A mi to Juanito Vera porque gracias a l, estoy en el momento y lugar adecuado. A travs de tu

apoyo comprend que cada quien decide cmo vivir tranquilo y en paz.

A mi familia Zamudio por compartir esta etapa de mi vida a mi lado, pero sobre todo porque son
parte de mi alma.

La crtica convertida en sistema es la negacin del conocimiento

y de la verdadera estimacin de las cosas
Henri Frderic Amiel

El carcter consiste ante todo en no dar importancia al ultraje

o al abandono de quienes estn con nosotros
Andr Malraux

CONTENIDO
CAPTULO

PG.

ndices
ndice general

ndice de tablas

ndice de imgenes

vi

Abreviaturas

viii

Summary

ix

Resumen

xi

Maleamidas sintetizadas

xiii

Isomaleamidas sintetizadas

xiv

N-aril-espiro--lactamas sintetizadas

xv

I. INTRODUCCIN

II. ANTECEDENTES

II.1. Estructura bacteriana

II.2. Clasificacin de las bacterias

II.3. Pared Celular

II.3.1. Biosntesis del peptidoglicano

10

II.3.2. Accin de los antibiticos sobre los procesos de sntesis de los

componentes de la pared
II.4. Antibiticos

11
12

II.4.1. Concepto

12

II.4.2. Historia

13

II.4.3. Clasificacin

14

II.4.4. Mecanismo de accin de los antibiticos

15

II.4.5. Estructura qumica de los compuestos -lactmicos

17

II.4.6. Mecanismos de accin

19

II.4.7. Descubrimiento y obtencin de nuevos antibiticos

22

II.4.8. Relacin estructura-actividad (SAR)

24

II.5. Resistencia bacteriana

25

II.5.1. Origen

26

II.5.2. Introduccin a la gentica de la resistencia

29

II.5.2.1. Evolucin vertical

29

II.5.2.1. Evolucin horizontal

30

II.5.3. Mecanismos de resistencia

II.6. Enzimas -lactamasas

31
33

II.6.1. -lactamasas en bacterias Gram- y en bacterias Gram+

35

II.6.2. Origen de las -lactamasas

35

II.6.3. Mecanismos de accin

38

II.6.4. Clasificacin de las -lactamasas

38

II.6.5. Patogenicidad directa e indirecta de las bacterias productoras

de las -lactamasas
II.7. Inhibidores de las -lactamasas

43
45

II.7.1. Estructura qumica y clasificacin

46

II.7.2. Mecanismo de accin

47

II.7.3. Resistencia

50

II.8 Aspectos qumicos

50

II.8.1. cidos carboxlicos y sus derivados.

51

II.8.2. Amidas

52

II.8.3. Imidas cclicas

53

II.8.4. Isomaleimidas

54

II.8.5. -lactamas

55

II.8.5.1. Mtodos para la sntesis de -lactamas

56

II.8.5.2. Sntesis asimtrica de -lactamas

59

III. JUSTIFICACIN

62

IV. HIPTESIS

63

V. OBJETIVOS

64

V.1. Objetivo general

64

V.2. Objetivos particulares

64

VI. METODOLOGA EXPERIMENTAL

66

VI.1. Instrumentacin

66

VI.2. Reactivos

67

VI.2.1. Qumicos

67

VI.2.2. Microbiolgicos

68

VI.3. Sntesis
VI.3.1. Destilacin del disolvente Tetrahidrofurano (THF)

68
68

ii

VI.3.2. Destilacin del disolvente Diclorometano (CH2Cl2)

68

VI.3.3. Reaccin No. 1. Sntesis de Vinil amidas para sustitudas

69

VI.3.4. Reaccin No. 2. Sntesis de Aril-isomaleimidas para sustitudas

69

VI.3.5. Reaccin No. 3. Sntesis de N-aril-espiro--lactamas

70

VI.4. Optimizacin mediante clculos tericos de la N-p-F-fenil-espiro-lactama (3c)

VI.5. Pruebas microbiolgicas

71
72

VI.5.1. Protocolo general

72

VI.5.2. Obtencin y recuperacin de cepas

72

VI.5.2.1. Manejo y conservacin de cepas

VI.5.3. Evaluacin de la produccin de -lactamasas

73
73

A) Fundamento de la prueba

74

B) Procedimiento de la prueba

76

VI.5.4. Determinacin de la actividad potencial antibitica de las

espiro--lactamas: Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana
A) Fundamento de la prueba

76

B) Procedimiento de la prueba

76

VI.5.5. Pruebas de sinergismo

VII.

76

78

A) Fundamento de la prueba

78

B) Procedimiento de la prueba

79

RESULTADOS Y DISCUSIN

VII.1. Sntesis de las N-aril-espiro--lactamasas

80
80

VII.1.1. Caractersticas de los cidos p-X-fenilmalemicos. (1a-1e)

81

VII.1.2. Caracterizacin de las p-X-fenilisomaleimidas.(2a-2e)

84

VII.1.3. Caracterizacin de las espiro-p-R-fenil--lactamas. (3a-3d)

86

VII.1.4. Estudio de difraccin de rayos X para la N-p-F-fenil-espiro-lactama 3c

90

VII.2. Optimizacin geomtrica

91

VII.3. Pruebas Microbiolgicas

93

VII.3.1. Evaluacin de la produccin de -lactamasas

93

VII.3.2. Evaluacin de la actividad potencial antibitica de las espiro-lactamas

VII.3.3. Prueba de sinergismo

94
95

iii

VIII.

CONCLUSIONES

97

IX. BIBLIOGRAFA

99

X. ANEXOS

108

X.1. Espectros

108

X.2. Fotos

134

iv

ndice de Tablas
NO. DE TABLA
1

PG.
Antibiticos -lactmicos frecuentemente empleados en
clnica.

18

PBPs con actividad Transglucosidasa o Transpeptidasa.

21

Antibiticos obtenidos de forma natural.

23

Clasificacin de -lactamasas por Bush, Kacoby y Madeiros.

40

Resultados de los compuestos sintetizados.

80

Identificacin por espectroscopa de IR de los cidos p-Xfenilmalemicos.

Desplazamientos qumicos (ppm) RMN de 1H y 13C para los

cidos p-X-fenilmalemicos en DMSO d6 (270 MHz).

Identificacin por espectroscopa de IR de las p-Xfenilisomaleimidas.

Identificacin por espectroscopa de IR de las espiro-p-Rfenil--lactamas.

10

Desplazamientos qumicos (ppm) RMN de1H para las p-Xfenilisomaleimidas y espiro-p-R-fenil--lactamas.

11

Desplazamientos qumicos (ppm) RMN de13H para las p-Xfenilisomaleimidas y espiro-p-R-fenil--lactamas.

12

ngulos diedros de la p-espiro-F--lactama.

Distancias de enlaces de la p-espiro-F--lactama. (3c)
Amstrongs[]

14

Prueba

Cefinasa:

identificacin

de

microorganismos

productores de -lactamasa.
15

Criterios establecidos por la CLSI para las pruebas de

susceptibilidad en medio lquido.

16

Comparacin de los desplazamientos qumicos de las N-pespiro--lactamas en diferentes solventes.

82
85
87
87
88
91

Grados []
13

81

92
93
94
96

ndice de Figuras
NO. DE
FIGURA

PG.

Estructura bacteriana.

Clasificacin de las bacterias de acuerdo a la tincin Gram.

+

4
-

Diferencias estructurales entre las bacterias Gram y Gram .

Representacin del esqueleto de la pared celular bacteriana;

constituda por el peptidoglicano murena.

Aminocidos caractersticos que conforman la estructura bsica de

la pared celular.

6
7
8

Diferencia en las conexiones entre las unidades peptdicas y las de

glicano durante la formacin de la lmina de peptidoglicano, de las

bacterias: a) Gram- y b) Gram+.

7

Estructura de los cidos teicoicos de la pared celular.

10

Proceso general de la biosntesis del peptidoglicano.

11

Semejanza estructural entre los compuestos lactmicos y la Dalanil-D-alanina terminal.

12

10

Modos de accin de los agentes antimicrobianos.

15

11

Estructura de las -lactamas (2-azetidinonas).

17

12

Estructura de los ncleos de los antibiticos -lactmicos.

18

13

Reaccin enzimtica de las serin proteasas con diversos sustratos.

20

14

Descubrimiento y desarrollo de nuevos antibiticos.

22

15

Estructura qumica del Lorabid.

24

16

Estructura qumica del Tribactam.

25

17

Estructura qumica del a) inhibidor de la proteasa de

citomegalovirus humano y del b) inhibidor de absorcin del

25

colesterol.
18

Ciclo de adquisicin de genes de resistencia por la bacteria, en

respuesta a la presin selectiva debido al uso de los antibiticos.

19

Mecanismos de transferencia gentica, de la resistencia bacteriana.

a) Conjugacin, b) Transduccin, y c) Transformacin.

20

Diversos mecanismos de resistencia bacteriana.

28
31
32

vi

21

Enzimas que pueden actuar sobre los antibiticos -lactmicos.

22

Interacciones claves en el sitio de unin de las sern--lactamasas de

clase A.

23

Alineamiento entre: a) la -lactamasa de clase A, b) la -lactamasa

de clase C, c) la Transpeptidasa (PBP2).

24

34
36
37

Diagrama que muestra la posible unin entre a) el pptido L-LysD-Ala-D-Ala con la transpeptidasa y b) el antibitico penicilina con

37

una -lactamasa de clase A.

25

Inhibidores -lactmicos, ms usados en el rea clnica.

26

Blancos enzimticos de las -lactamas: a) Actividad de la penicilina

sobre las transpeptidasas, b) hidrlisis de la penicilina por las
Serin--lactamasas, e c) inhibicin de las Serin--lactamasas por el

46

48

cido clavulnico.
27

Mecanismos de inhibicin de las -lactamasas de clase A por el

cido clavulnico.

28

Mecanismos de inhibicin de las -lactamasas de clase A por el

sulbactam.

29

Estructura qumica de a) cido actico, b) prostaglandina y c) cido

acetilsaliclico.

49
49
51

30

Estructura qumica de los derivados de cido carboxlico.

52

31

Deslocalizacin electrnica de la formamida.

52

32

Obtencin de una isomaleimida.

54

33

Mecanismos de formacin de una isomaleimida.

55

34

Antibiticos -lactmicos.

56

35

Mtodos para la formacin del anillo -lactmico.

57

36

Mecanismo alterno de cicloadicin.

58

37

Reactividad del ncleo 2-azetidinona.

60

38

Fragmentacin de la N-p-F-fenil-espiro--lactama por EM.

89

39

Fragmentacin de la espiro-p-Cl-fenil--lactama por EM.

90

vii

ABREVIATURASYSMBOLOS
(NCCl)3 Cloruro cianrico

FEUM Farmacopea de los Estados Unidos

ngulo dihedro

Mexicanos

6-APA 6 aminopenicilnico

GlcNAc N-acetilglucosamina

ADN cido desoxirribonucleico

Gly Glicina

Ala Alanina

Gram- Bacterias Gram negativas

AMP Ampicilina

Gtam+ Bacterias Gram positivas

AMX Amoxicilina

HF Hartree-Fock

ARN cido ribonucleico

I.P.N. Instituto Politcnico Nacional

ATCC (American Type Culture Collection).

IR Espectroscopia de Infrarrojo

Coleccin americana de cultivos celulares

kcat Constante de Catlisis

ATP Adenosn trifosfato

KM Constante de Michaelis Menten

BLEEs -lactamasas de espectro extendido

Lys Lisina

c.c.f. cromatografa en capa fina

MHA Mueller Hinton Agar

CAZ Ceftazidima

MHB Mueller Hinton Broth

CDCl3 Cloroformo deuterado

MurNAc N-acetilmuramato

CI50 Concentracin inhibidora 50

NEt3 Trietilamina

CLSI Clinical and Laboratory Standards

OMe O-metilo

Institute

OXA Oxacilina

CMI Concentracin mnima inhibidora

p.f. Punto de fusin

COOEt Benzoato de etilo

PADAC piridina 2-azo-p-dimetil-alinina

CP Clavulanato de potasio

cromforo

CTX Cefotaxima

PBPs Protenas de unin a penicilina

DAP cido meso-diaminopimlico

pCMB p-cloromercuribenzoato

DCC Diciclohexilcarbodimida

RMN 13C Resonancia magntica nuclear de

DCU Diciclohexilurea

carbono 13

DMSO-D6 Dimetil sulfxido deuterado

RMN 1H Resonancia magntica nuclear de

EDTA cido etilendiaminotetraactico

protn

EM Espectro de masas

TEM Temoeira

ESMIS Espectrometra de masas de

THF Tetrahidrofurano

ionizacin por electrospray

UDP Uridina difosfato

UV-VIS Ultravioleta-visible

viii

SUMMARY
From the coming of penicillin, and its primary biological target; the penicillin binding protein
(PBPs) anchored in the cellular membrane bacterial and ordered of the final step of the
biosynthesis of the cellular wall, It determine the way of action of these drugs. Nevertheless the
indiscriminate use of such -lactams antibiotics as penicillins and cephalosporines has been in the
increase of the number of resistant bacterial strains to the present quimioterapeutic by the
production of -lactamases. Like a strategy to this mechanism of resistance of the bacteria, to new
molecules with activity on PBPs and/or -lactamases have been developed. A proposal in this work
is the synthesis of N-aryl--lactams, for which the reaction of Staudinguer was used, and consists of
a cycle reaction addition [2+2] between a ketene and imine.
The synthesis of four N-aryl--lactams sustituited (3a-3d) was taken by the addition of the ketene
(2-Cloroetenone) generated in situ, to the corresponding ones isomaleimides to -78C and under
nitrogen atmosphere, with greater yields of 60% after its purification. All the compounds obtained
in the synthesis of these N-aryl--lactams were characterized by Infrared Spectroscopy (IR),
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of proton and carbon thirteen (RMN 1H and

13

C), as

well as, Mass Spectrometry (GC-MS). Additionally the structure of these compounds was
corroborated by mean of a study of x-rays diffraction of N- aril--lactam 3c, being observed an
adjustment almost coplanar between the -lactam ring and the aromatic ring of -51.8. For the
optimization of the geometry of the compound 3c Spartan Pro 06 V102 program at level of HF/631G was used and the most stable conformer with the structure obtained by x-rays diffraction was
compared, being very similar.
To the strains used in this work, the production of the -lactamase enzyme was determined by the
cefinace test. Following the standards of the CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) the
tests of antimicrobial susceptibility in microplates were developed as much as in agar, using as
antibiotic of reference to the ampicilline within the concentration interval from 0,5 to 256 g/mL,
determined that the minimal inhibitory concentration (MIC) was of 4g/mL for the bacteria E.coli
ATCC 35198 and E.coli ATCC 25922, and of 32g/mL for the bacterium K. pneumoniae ATCC
700603, which corroborated that indeed both strains of E.coli are sensible to the ampicilline and the
strain of K. pneumoniae is resistant. In the sinergism study the reference combinations used
cefotaxime /acid clavulanic and ceftazidime/acid clavulanic (30/10g); being observed that K.
pneumoniae (producing of -lactamase) it was sensitized with this combination.

ix

Under that conditions previously described were evaluated the four compound N-aryl--lactamics
synthesized, obtaining that no of them showed activity neither as inhibitors of the PBPs (antibiotic
activity), nor as inhibitors of -lactamases.

RESUMEN
Con el descubrimiento de la penicilina, y su blanco biolgico primario; la protena de unin a
penicilina (PBPs) anclada en la membrana celular bacteriana y encargada del paso final de la
biosntesis de la pared celular, se determino el modo de accin de estos frmacos. Sin embargo el
uso indiscriminado de tales antibiticos -lactmicos como penicilinas y cefalosporinas ha resultado
en el incremento del nmero de cepas bacterianas resistentes a la quimioteraputica actual por la
produccin de -lactamasas. Como una estrategia a este mecanismo de resistencia de las bacterias,
se han desarrollado nuevas molculas con actividad sobre PBPs y/o -lactamasas. Una propuesta
en este trabajo es la sntesis de espiro -lactamas, para lo cual se utiliz la reaccin de Staudinguer
que consiste en una reaccin de ciclo adicin [2+2] entre una cetena y una imina.
La sntesis de cuatro N-aril-espiro--lactamas sustituidas (3a-3d) se llev a cabo mediante la
adicin de la cetena (2-Cloroetenona) generada in situ, a las correspondientes isomaleimidas a 78C y bajo atmsfera de nitrgeno, con rendimientos mayores del 60% despus de su purificacin.
Todos los compuestos obtenidos en la sntesis de estas espiro--lactamas se caracterizaron por
espectroscopa de Infrarrojo (IR), espectroscopa de resonancia magntica nuclear de protn y
carbono trece (RMN 1H y

13

C), as como, espectrometra de masas (GC-MS). Adicionalmente se

corrobor la estructura de estos compuestos mediante un estudio de difraccin de rayos X de la Naril-espiro--lactama 3c, observndose un arreglo casi coplanar entre el anillo -lactmico y el
anillo aromtico de-51.80. Para la optimizacin de la geometra del compuesto 3c se utiliz el
programa Spartan Pro 06 V102 a nivel de HF/6-31G y se compar el confrmero ms estable con
la estructura obtenida por difraccin de rayos X, siendo muy semejantes.
A las cepas utilizadas en este trabajo, se les determin la produccin de la enzima -lactamasa, a
travs, de la prueba de cefinace. Siguiendo los lineamientos de la CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute) se desarrollaron las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana tanto en
microplacas como en agar, usando como antibitico de referencia a la ampicilina dentro del
intervalo de concentracin de 0,5-256 g/mL, se determin que la concentracin mnima inhibitoria
(CMI) fu de 4g/mL para las bacterias E.coli ATCC 35198 y E.coli 25922, y de 32g/mL para la
bacteria K. pneumoniae 700603, lo que corrobor que efectivamente ambas cepas de E.coli son
sensibles a la ampicilina y la cepa de K. pneumoniae es resistente. En el estudio de sinergismo se
utiliz de referencia la combinacin de cefotaxima/cido clavulnico y ceftazidima/cido

xi

clavulnico (30/10g); observndose que K. pneumoniae (productora de -lactamasa) se sensibiliz

con esta combinacin.
Bajo las condicione descritas anteriormente se evaluaron los cuatro compuestos N-aril-espiro-lactmicos sintetizados, obtenindose que ninguno de ellos mostr actividad ni como inhibidores de
las PBPs (actividad antibitica), ni como inhibidores de las -lactamasas.

xii

Maleamidassintetizadas
O

NH

OH

NH

OH
O

Fenilmaleamida
(1b)

p-OMe-fenilmaleamida
(1a)

Cl

NH

O
OH

NH

OH
O

p-Cl-fenilmaleamida
(1d)

p-F-fenilmaleamida
(1c)

NO2

NH

OH
O

p-NO2-fenilmaleamida
(1e)
xiii

Isomaleimidassintetizadas
O

Fenilisomaleimida
(2b)

p-OMe-fenilisomaleimida
(2a)
F

Cl

O
O

O
O

p-Cl-fenilisomaleimida
(2d)

p-F-fenilisomaleimida
(2c)
NO2

O
O

p-NO2-fenilisomaleimida
(2e)

xiv

Narilespirolactamassintetizadas

N
O

O
O

Cl

espiro-p-OMe-fenil--lactama
(3a)

Cl

espiro-fenil--lactama
(3b)

Cl

N
O

Cl

espiro-p-F-fenil--lactama
(3c)

O
O

Cl

espiro-p-Cl-fenil--lactama
(3d)

xv

INTRODUCCIN
En la segunda mitad del siglo pasado se crea que las enfermedades infecciosas haban dejado de ser la
principal causa global de mortalidad en los pases desarrollados; sin embargo, durante los ltimos
treinta aos surgieron una serie de hechos que no permitieron seguir manteniendo la ideologa de una
batalla definitiva contra las bacterias: algunas infecciones extra hospitalarias no slo han aumentado,
sino que han sufrido una autntica metamorfosis que las hace ms variadas y de diagnstico ms
difcil, ciertas infecciones nosocomiales, producidas por autnticos acorazados microbianos, estn
en aumento y la aparicin incesante de cepas resistentes, como consecuencia del uso masivo e
indiscriminado de los antibiticos, ha adquirido ya proporciones alarmantes en muchos casos.
Durante los ltimos la bsqueda y desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos ha ido en aumento; lo
cual se refleja en las largas listas de nuevas penicilinas, cefalosporinas y quinolonas, que no estaban
disponibles en 1965. Esto se debe a la gran cantidad de investigaciones y descubrimientos en las
diferentes reas tanto de la qumica como de la medicina. Una revisin detallada, sugiere que el
desarrollo de las diferentes clases estructurales de los antibiticos es cercanamente interdependiente.
Por ejemplo, los avances en el estudio de la qumica de la penicilina impulsaron el rpido desarrollo de
las cefalosporinas y otras -lactamas; as mismo, los avances en la comprensin de la fisiologa
bacteriana han permitido establecer una relacin estructura-actividad (SAR ), usada para controlar las
modificaciones qumicas de los antibiticos con el propsito de mejorar su actividad antimicrobiana, y
as combatir a las bacterias que han adquirido resistencia a los antimicrobianos anteriores.
El proceso de desarrollo de nuevos antibiticos involucra estudios exhaustivos que permiten
caracterizar su mecanismo de accin y garantizar su seguridad y eficacia tanto en animales como en
humanos. Este proceso puede llevar hasta 8 aos para llegar a su etapa final y representar una gran
inversin (hablando de remuneracin econmica), principalmente para la industria farmacutica. Dada
la inversin y el recurrente ambiente competitivo; en el cual, cada vez son ms los agentes
antimicrobianos en el mercado, es conveniente encontrar nuevos compuestos que demuestren ventajas
sobre las terapias antimicrobianas1 ya existentes. Por otro lado, la urgencia de encontrar nuevos
compuestos nace de la necesidad de erradicar aquellas enfermedades infecciosas causadas por agentes
patgenos resistentes a la terapia antimicrobiana preexistente y que causan estragos tanto a nivel social
como econmico.

Del Ingls Structure-activity relationships

Este trabajo tiene relacin con la industria farmacutica especificamente en el rea de la

quimioteraputica bacteriana, y con el objetivo de aportar conocimiento en este campo, se propone la
sntesis de dos nuevos compuestos spiro--lactmicos y dos previamente reportados, as como realizar
su evaluacin microbiolgica. Para ello, se debe estudiar la estructura y clasificacin de las bacterias,
su participacin en los procesos patognicos de las enfermedades infecciosas y los mecanismos y
procesos evolutivos por los cuales ha logrado sobrevivir a los agentes antimicrobianos; as mismo, se
debe conocer las estructuras qumicas que conforman a la familia de las -lactamas, su actividad como
antibiticos o inhibidores de las -lactamasas, y sus molculas dianas que permiten establecer la
relacin estructura-actividad, y que favorecern el desarrollo de nuevas molculas.

I. ANTECEDENTES
II.1. Estructura Bacteriana.
Las bacterias son clulas procariticas, por lo que carecen de orgnulos especializadoscomo: el ncleo,
mitocondrias, cloroplastos, entre otros. Las clulas microbianas generalmente son muy pequeas,
presentan tamaos que van desde 0,1 a 0,2 m de ancho a ms de 50 m de largo. Por otro lado,
mantienen una estructura superficial compleja que consta de: cilios o flagelos, membrana
citoplasmtica, cpsula, y pared celular. Vase Figura 1, cada componente lleva a cabo funciones
vitales definidas:

Figura 1. Estructura bacteriana3.

a. La cpsula es una capa gelatinomucosa de tamao variable, con una composicin de

polisacridos o protenas que rodean a la bacteria. Y juega un papel importante en las
bacterias patgenas.
b. Los cilios, o flagelos, no existen ms que en ciertas especies, y son rganos de locomocin,
filamentosos y de longitud variable. Segn las especies, pueden estar implantados en uno o en
los dos polos de la bacteria o en todo su entorno. Constituyen el soporte de los antgenos "H".
En algunos bacilos gramnegativos se encuentran pili, que son apndices ms pequeos que los
cilios y que tienen un papel fundamental en gentica bacteriana.
c. La membrana citoplasmtica, situada debajo de la pared, tiene permeabilidad selectiva frente
a las sustancias que entran y salen de la bacteria. Es soporte de numerosas enzimas, en
particular las respiratorias.

d. La pared es la responsable de la forma, rigidez y de la resistencia a la presin del medio que

rodea a la bacteria. Su originalidad reside en la naturaleza qumica del compuesto
macromolecular que le confiere su rigidez, este mucopptido, est formado por cadenas de
acetilglucosamina y de cido murmico sobre las que se fijan tetrapptidos de composicin
variable. Las cadenas estn unidas por puentes peptdicos.
Adems de la pared, las bacterias dependen de las caractersticas taxonmicas como su morfologa,
sus propiedades antgenas especficas en que se basa su clasificacin, su composicin qumica y las
interacciones entre los microorganismos patgenos y su hospedante2a.

II.2. Clasificacin de las Bacterias.

Las paredes celulares de las bacterias permiten resistir a la presin de turgencia; consecuencia de la
concentracin de solutos disueltos dentro de la clula, adems son las responsables de la forma
y rigidez de la clula. Las diferencias que existen en la estructura de las paredes celulares,
permite distinguir a las bacterias en Gram positivas (Gram+) o Gram negativas (Gram-)
mediante una tincin diferencial denominada tincin de Gram . Vase Figura 2

Figura 2. Clasificacin de las bacterias de acuerdo a la tincin Gram2b.

En dicha tincin se forma dentro de las clulas un complejo cristal insoluble violeta-yodo que en el
caso de las Gram- puede extraerse con alcohol, pero no en las Gram+. El alcohol deshidrata las
bacterias Gram+ que poseen una pared celular muy grues con varias capas de peptidoglicano. Esto

Tcnica desarrollada por el bacterilogo Christian Gram en 1884.

provoca el cierre de los poros de la pared impidiendo la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las
bacterias Gram-, el alcohol penetra rpidamente en la capa externa que es rica en lpidos y la fina capa
de peptidoglicano no impide el paso del disolvente, por lo que el complejo se extrae fcilmente.
La clasificacin de estos dos grupos de bacterias se debe a la complejidad de las estructuras de las
bacterias Gram-, que presentan tres capas principales: a) La membrana citoplasmtica, que rodea el
citoplasma de la clula y contiene protenas y fosfolpidos. La membrana citoplasmtica sirve como
una barrera de permeabilidad selectiva para las substancias que entran o salen de la clula, tambin se
considera el sitio donde se produce la energa de la clula. Dentro del citoplasma celular tambin se
encuentran los cromosomas, ribosomas y otras estructuras internas, b) El peptidoglicano, es un
polmero relativamente delgado que consiste de cido N-acetil murmico y N-acetil glucosamina
entrelazados; esta se conoce con frecuencia como la capa de murena o pared celular, y es responsable
de mantener la forma del organismo, y est localizada dentro del espacio periplsmico. El espacio
periplsmico, localizado entre la membrana externa y la membrana citoplasmtica contiene protenas
periplsmaticas que incluyen: protenas de enlace para sustratos especficos, enzimas hidrolticas y
enzimas detoxificantes, y c) La capa externa o capa L (Lipopolisacrido), representa una segunda
bicapa lipdica; sin embargo, hay que destacar que no consta solamente de fosfolpidos como la
membrana citoplasmtica, sino que contiene polisacridos y protenas, lo que justifica su nombre.
Tambin sirve como una barrera de permeabilidad de la clula, ya que ayuda a retener protenas en el
espacio periplasmtico. Contiene protenas embebidas, llamadas porinas, estos canales llenos de agua
facilitan el transporte de nutrientes y sustancias de bajo peso molecular dentro de la clula, incluyendo
agentes antimicrobianos. Las bacterias varan en el nmero y tipo de porinas que contienen2c. Los
polisacridos; localizados en la superficie de la clula, son los componentes esenciales de las
endotoxinas (Estos contribuyen a la capacidad de la bacteria para causar enfermedad), y son la causa
de la carga neta de las bacterias Gram-. Las familias representativas de este grupo de bacterias son:
Enterobacteriaceae, No Enterobacteriaceae, Haemophilus spp, Neisseria/Moraxella y Anaerobios
Por otro lado, las bacterias Gram+ son menos complejas debido a que nicamente contienen dos
capas: la membrana citoplasmtica y la capa de peptidoglicano. La membrana citoplasmtica, el
citoplasma, y otros componentes internos son similares tanto en bacterias Gram+ como en bacterias
Gram-. Sin embargo, la capa de pptidoglicano o capa de murena es mucho ms gruesa que la de las
bacterias Gram-, y es la responsable de mantener la forma del organismo; por lo que se conoce como la
pared celular. Dentro de la capa de murena se encuentran los cidos teicoicos, que son polmeros que
estn entrelazados en la capa de pptidoglicano y se extiende en forma de cilios ms all de la

superficie de las clulas Gram+. Estos son tambin antgenos importantes de superficie en aquellos
organismos que los poseen4a. Las familias representativas de este grupo de bacterias son:
Staphylococcus, Enterococcus spp., y Streptococcus spp. Vase Figura 3

Figura 3. Diferencia estructural entre las bacterias Gram+ y Gram-4b.

II.3. Pared celular.

Debido a la importancia que tiene la pared celular en la clula, es necesario explicar su constitucin.
La pared celular se encuentra formada por peptidoglicn (tambin llamado glucopptido o
mucopptido o murena); en las bacterias Gram+ representa hasta el 90% de la pared, aunque otra clase
de componentes, los cidos teicoicos, tambin suelen estar presentes; los cuales se hallan unidas de
forma covalente a la superficie externa de la clula. Por otro lado en las bacterias Gram- la cantidad de
este compuesto es mnimo (10% de la pared) y no se observa la presencia del cido teicoico. La
estructura bsica del peptidoglicn es prcticamente similar en todas las bacterias, y consiste en una
pequea cantidad de aminocidos (algunos de configuracin D) y 2 azcares, la N-acetilglucosamina
(GlcNAc) y el N-acetilmuramato (MurNAc). Este esqueleto se encuentra formado por: a) residuos
alternos de MurNAc y GlcNAc, unidos por enlaces glicosdicos: -1-4, b) un tetrapptido formado por
residuos D y L tambin alternos, y c) un enlace peptdico que une al grupo carboxilo terminal de un

tetrapptido (posicin 4) con un grupo NH2 o COOH libre en uno de los tetrapptidos vecinos. Vase
Figura 4

N-Acetilglucosamina
CH 2 OH

N-Acetilmurmico
CH 2 OH

b-1,4
O

H
OH
HO

O OH

H
H

NH-COCH 3

NH-COCH 3

O
O

H 3C

HN

L-Alanina

CH 3
O

D-Glutmico

NH

HOOC

O
NH

m-Diaminopimlico
H
H 3C

NH

O
COOH

H 2N

D-Alanina

Figura 4. Representacin del esqueleto de la pared celular bacteriana; constituda por el peptidoglicano
murena4c.

Cuando los elementos del esqueleto se unen forman una cadena recta y no ramificada, que constituye
la estructura bsica de la pared celular ("backbone"). Entre los aminocidos tpicos de esta cadena se
encuentran la L-alanina, cido D-glutmico, cido m-diaminopimlico o la L-lisina o D-alanina. Cabe
destacar, que las bacterias Gram- contienen nicamente cido meso-diaminopimlico (DAP) en su
peptidoglicano, y las bacterias Gram+ poseen lisina u otros aminocidos en lugar del DAP. Vase
Figura 5

Figura 5. Aminocidos caractersticos que conforman la estructura bsica de la pared celular3.

Los enlaces glucosdicos que unen a las cadenas lineales son fuertes, pero no confieren rigidez en todas
las direcciones; de tal forma que, las cadenas al entrecruzarse por puentes peptdicos, confieren la
rigidez caracterstica de la pared. Estas estrcuturas entrecruzadas forman una estructura bidimensional
unida covalentemente y en forma de saco (sculo de murena). El nmero de puentes peptdicos no es
igual en todas las especies de bacterias, y las paredes con mayor nmero de puentes intercatenarios, son
ms rgidos. Cabe mencionar que existen aminocidos que nunca estn presentes en los puentes
interpeptdicos como los ramificados, aromticos, azufrados, Histidina, Arginina o Prolina4a. En las
bacterias Gram-, la pared celular est compuesta por varias capas y es bastante compleja; ya que los
puentes intercatenarios se establecen por lo general, mediante enlace peptdico directo del grupo amino
del diaminopimlico al grupo carboxilo de la D-alanina terminal. Vase Figura 6.a. En las bacterias
Gram+, la pared celular est formada fundamentalmente por un solo tipo de molcula y suele ser ms
ancha. De tal forma que el enlace se establece con frecuencia a modo de puente interpeptdico mediante

varios aminocidos, cuyo nmero y tipo dependen del tipo de microorganismo. Vase Figura 6.b.
Muchas de las bacterias Gram+ presentan embebidos en su pared polisacridos cidos, denominados
cidos teicoicos. Este trmino se refiere a los polmeros de la pared de la membrana o de la cpsula que
contienen unidades de glicerolfosfato o de ribitolfosfato. Estos polialcoholes estn unidos por steres de
fosfato y a menudo presentan unidos otros azcares y D-alanina. Debido a su carga negativa, los cidos
teicoicos, son en parte responsables de la carga negativa neta de la superficie de las clulas y puede
intervenir en el paso de iones a travs de la pared celular. Debido a su asociacin con lpidos, estos
cidos tambin se le denominan cidos lipoteicoicos. Vease Figura 7

L-Ala

L-Ala

D-Glu

D-Glu-NH2

D-Ala

DAP

L-Lys

DAP

D-Ala

D-Ala

D-Glu
L-Ala

Puente intercatenar
Gly intermedio
Gly
Gly
Gly
Gly
D-Ala

DAP

a) Pared celular de bacterias

Gram-

D-Glu
L-Ala
G

b) Pared celular de bacterias

Gram+
Figura 6. Diferencia en las conexiones entre las unidades peptdicas y las de glicano durante la formacin
de la lmina de peptidoglicano, de las bacterias: a) Gram- y b) Gram+3.

Figura7. Estructura de los cidos teicoicos de la pared celular4d.

II.3.1. Biosntesis del peptidoglicano.

La secuencia del

proceso de biosntesis del peptidoglicano se determin gracias a los estudios

enzimticos realizados in vitro por Strominger (1950)5a. Y en el cual se describe el proceso en cuatro
etapas:
1. Sntesis de precursores hidrosolubles en el citosol.
2. Unin a un lpido de membrana.
3. Formacin de polmeros lineales en la superficie externa de la membrana.
4. Formacin de enlaces cruzados entre estos polmeros.
Durante el crecimiento celular la sntesis del nuevo peptidoglicano supone el corte controlado del
peptidoglicano preexistente por las autolisinas y la insercin simultnea de precursores. En este
proceso interviene un lpido transportador; el bactoprenol o undecaprenol (C55), un alcohol muy
hidrofbico, el cual transfiere las unidades estructurales a travs de la membrana, convirtiendo a los
precursores lo suficientemente hidrofbicos para atravesarla. Una vez en el periplasma; se lleva a cabo
la transpeptidacin, en el cual el bactoprenol conecta con enzimas los precursores en el punto de
crecimiento de la pared celular y catalizan la formacin de los enlaces glucosdicos. Al final de este
proceso de polimerizacin, el undecaprenol-PP liberado se dirige hacia la superficie interna de la

10

membrana. El paso final, consiste en la formacin de enlaces cruzados entre las cadenas laterales de
los polipptidos, este proceso se produce en el exterior de la membrana celular, por lo que no puede
utilizar directamente el ATP intracelular para establecer los enlaces peptdicos. Vase Figura 8 La
energa utilizada proviene del mismo pentaptido; as, el enlace cruzado se produce gracias a una
reaccin de transpeptidacin, que es neutra desde el punto de vista energtico. La transpetidacin
consiste en el desplazamiento de una D-alanina terminal por un radical de NH2 libre, liberando dicho
residuo y formando un puente con la D-alanina subterminal6.

Figura 8. Proceso general de la biosntesis del peptidoglicano5b.

II.3.2. Accin de los antibiticos sobre los procesos de sntesis de los componentes
de la pared.
Hasta ahora se han identificado diversos puntos especficos de inhibicin. De acuerdo con Strominger
y cols., los antibiticos -lactmicos inhiben la ltima etapa de la sntesis del peptidoglicano,
impidiendo la reaccin de transpeptidacin. Por ejemplo la penicilina fue identificada como un agente
ltico, el cual bloquea la formacin de enlaces cruzados en el peptidoglicano. La semejanza estructural
de la penicilina con el anlogo de la D-alanil-D-alanina se puede observar mediante la construccion de

11

modelos atmicos, donde el enlace peptdico situado en el anillo -lactmico es el que se rompe
durante la reaccin de transpeptidacin. Vase Figura 9.

D-alanil-D-alanina

Ampicilina

Figura 9. Semejanza estructural entre los compuestos -lactmicos y la D-alanil-D-alanina terminal7a.

Debido a esta relacin estructural la penicilina inhibe irreversiblemente la reaccin que da lugar a la
formacin de enlaces cruzados, mediante la formacin de una enzima peniciloil estable, en lugar de la
enzima normal de tipo peptidil, la cual es transitoria. Los agentes -lactmicos pueden penetrar
fcilmente en las bacterias Gram+, mientras que en las bacterias Gram- lo hacen a travs de porinas las
cuales se encuentran ubicadas en la bicapa lipdica externa7b. El grupo COOH-terminal de la D-alanina
y el grupo NH2-terminal de la glicina son los sitios participantes en la transpeptidacin, en donde
participan las protenas de unin a pencilina (PBPs * ); como catalizadores de esta reaccin. Las PBPs
son un grupo de enzimas involucradas en la sntesis de la capa de peptidoglucanos de la pared
bacteriana, y cumplen funciones como transpeptidasas, transglucosilasas, endopeptidasas, o
carboxipeptidasas, y se localizan en la superficie de la membrana citoplasmtica8.

II.4. Antibiticos.
II.4.1. Concepto.
Tradicionalmente se definen como compuestos de bajo peso molecular producidos por
microorganismos que matan o inhiben el desarrollo de otros microorganismos y pueden ser ingeridos o
inyectados dentro del cuerpo humano. Se han descubierto un gran nmero de antibiticos; sin
embargo, algunos han sufrido modificaciones qumicas para ser ms efectivos en los tratamientos y
son llamados antibiticos semisintticos o sintticos. Sin embargo, la susceptibilidad natural de los

Del ingls Penicillin Binding Protein

12

microorganismos a los antibiticos vara de especie a especie. Las bacterias Gram+ generalmente son
ms susceptibles a los antibiticos en comparacin con las GramUn antibitico que acta en ambos tipos de bacteria se conoce como un antibitico de amplio espectro,
el cual tiene un uso teraputico ms extenso. Es posible que en la naturaleza surgiesen los antibiticos
como un medio para que un microorganismo eliminase de su alrededor a otros que competan con l
por los nutrientes. Actualmente se incluyen los antibiticos y los quimioterpicos (molculas
obtenidas por sntesis) dentro del concepto de antimicrobianos. El trmino agente quimioterpico ha
sido empleado para referirse a agentes antimicrobianos y tambin se refiere a agentes que actan
contra clulas humanas como inmunomoduladores y frmacos antitumorales.

II.4.2. Historia.
El afn del hombre por encontrar un mecanismo con el fin de combatir y controlar las infecciones,
data desde la misma poca en que el hombre se constituye como tal. A lo largo de los aos, y el
desarrollo de la ciencia han dado paso a la teraputica como la conocemos hoy en da.
Uno de los primeros cientficos que revolucion la era de los microorganismos fue Anton van
Leeuwenhoek en 1683, quien observ la bacteria por primera vez. En 1828 el cientfico C. Ehrenberg;
di la primera descripcin precisa de las bacterias (nombre derivado del griego bakter bastn).
Posteriormente, Louis Pasteur (1822-1895) y Robert Koch (1843-1910) describieron el papel de la
bacteria como causa de enfermedades9. Gracias a estos avances, comenz la era de los quimioterpicos
con los trabajos del mdico alemn Paul Ehrlich (1854-1915), quin pensaba que para protegerse de
las infecciones, la toxicidad de algunas sustancias podra ser aprovechada en funcin a una
determinada dosis y a su selectividad. Y dedic parte de su vida a la bsqueda de lo que denomin "la
bala mgica", a travs del estudio del salvarsn. El buscaba una molcula con capacidad de unirse
especficamente a un blanco determinado (agentes productores de la enfermedad), para destruirlo. Sin
embargo, este objetiv se alcanz cuando el cientfico P. Gelmo hubo sintetizado la sulfanilamida un
par de aos antes de que Paul Ehrlich anunciara el descubrimiento del salvarsn. Un avance
importante en esta rea fue, el descubrimiento de la penicilina por A. Fleming (1881-1955), y su
purificacin posterior y uso comercial, por H. Florey (1988-1968) y E. Chain (1906-1979), que junto
con el descubrimiento, aos despus por S. Waksman, de la estreptomicina abriran un nuevo camino
en la lucha contra la enfermedad y el descubrimiento de los quimioterpicos y el desarrollo de nuevos
frmacos ms potentes que han venido transformando la medicina moderna y la calidad de vida

13

humana. Aunque el trmino quimioterapia parece en la actualidad dirigido al uso de los frmacos
empleados en el tratamiento oncolgico (de los diferentes cnceres); es mucho ms amplio, ya que
engloba sustancias que poseen una afinidad especial por ciertos microorganismos y/o estructuras
moleculares, capaces de destruir o neutralizar a los agentes productores de las infecciones. Por lo tanto
se origin el trmino quimioterapia o quimioteraputica, es decir, el tratamiento por frmacos con una
alta afinidad por las estructuras bioqumicas de los microorganismos, sin daar los tejidos u rganos
del husped10, 11.

II.4.3. Clasificacin.
El aislamiento de un agente infeccioso a partir de un paciente no es con frecuencia suficiente para
establecer la terapia adecuada. Muchas bacterias y algunos hongos presentan resistencia a los agentes
antimicrobianos. Ya que no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias, hongos y virus a los
agentes antimicrobianos, con frecuencia es necesario estudiar la sensibilidad individual de cada
patgeno a estos frmacos, pudindose elegir entonces el agente apropiado (el ms activo contra el
patgeno, el menos txico para el husped, con las caractersticas farmacolgicas apropiadas y el ms
econmico), que proporciona mayores posibilidades de una evolucin favorable. Por supuesto, el
resultado teraputico final depende de muchas otras variables, como la enfermedad que subyace y
condicin clnica del husped, las propiedades farmacolgicas del agente antimicrobiano, la
administracin de otros agentes teraputicos adicionales y otros factores ejercern una fuerte
influencia sobre el desenlace final. En lneas generales y en funcin del resultado final sobre los
microorganismos, los antibiticos se dividen en dos grandes grupos:

Los antibiticos bactericidas, los cuales no solo inhiben el crecimiento bacteriano, sino que
desencadenan mecanismos dentro de la clula que conducen a la muerte celular. Su accin,
por lo tanto es letal e irreversible sobre las bacterias (ej. Vancomicina, -Lactmicos,
Aminoglucsidos, etc.)

Los antibiticos bacteriostticos, que inhiben el crecimiento y multiplicacin de las bacterias,

pero no matan al microorganismo, permitiendo que las propias defensas del husped pueden
eliminar a las bacterias. Sin embargo, si el agente es retirado, las clulas vuelven a
multiplicarse (ej. Tetraciclina, Cloranfenicol, Sulfonamidas, Clindamicina, Macrlidos, etc.)12

14

II.4.4. Mecanismo de Accin de los Antimicrobianos.

Los frmacos antimicrobianos se clasifican de acuerdo a su estructura qumica (-lactmicos,
aminoglucsidos, quinolonas, etc.), mecanismo de accin (inhibidores de la sntesis de la pared
celular, inhibidores de la replicacin del ADN, etc.), u actividad contra tipos particulares de
microorganismos (bactericidas, fungicidas, antivirales, etc.).

Figura 10. Modos de accin de los agentes antimicrobianos13a.

Como se observa en la figura 10, existen diversas familias de antibiticos; las cuales, cada una tiene
un blanco especfico (mecanismo de accin). Dentro de esta clasificacin se encuentran:
a) Las quinolonas: inhiben aquellas enzimas bacterianas involucradas en la replicacin del ADN.
b) La Rifampicina: inhibe la transcripcin, al unirse a la ARN polimerasa de la bacteria.
c) Macrlidos, tetraciclinas y aminoglucsidos: inhiben la funcin del ribosoma 70S; por lo tanto,
inhiben la sntesis de protenas.
d) Vancomicina y -lactmicos: inhiben la sntesis de la pared celular a diferente nivel cada una.
(murena y peptidoglicano, respectivamente)13b.
Los agentes antimicrobianos que interfieren con la sntesis de la pared celular bloquean la sntesis del
pptidoglicano, y para que estos agentes muestren su mxima eficacia, se requiere que las bacterias se
encuentren en proliferacin activa; de otra manera su efecto sera escaso o nulo, por lo tanto son

15

activos contra bacterias en crecimiento. Los agentes antimicrobianos que interfieren con la sntesis de
la pared celular son bactericidas. Los miembros ms importantes de este grupo son los antibiticos lactmicos, as llamados por que contienen en su estructura el anillo -lactmico, (Vase Figura 8)
indispensable para su actividad; los cuales, son uno de los grupos de antibiticos ms usados en la
prctica mdica, y el enfoque principal de este proyecto. Poseen una gran eficacia teraputica; adems
actan bloqueando las enzimas biosintticas de una estructura como el peptidoglicano, que solo se
encuentra en las clulas bacterianas, y no tienen homlogo en las clulas animales; ambas
caractersticas hacen de estos antibiticos una de los mejores grupos teraputicos bacterianos.
Los antimicrobianos -lactmicos en bacterias Gram-, entran a la clula a travs de los canales
pornicos de la membrana externa. En las clulas susceptibles, las molculas -lactmicas inactivan
una serie de transpeptidasas, localizadas en la superficie de la membrana citoplsmica y que catalizan
el ltimo paso de la formacin del peptidoglicano. Debido a su similitud estructural de las -lactamas
con el sustrato natural D-alanil-D-alanina, se forma un complejo peniciloil-enzima anlogo a la
enzima acilada transitoria formada durante la transpeptidacin normal. Las transpeptidasas son
difciles de purificar y son mejor conocidas como protenas de unin de penicilina (PBPs), la bacteria
posee mltiples PBPs, las cuales tienen diferentes funciones durante la sntesis del peptidoglicano del
ciclo celular14.
La unin de los antibiticos -lactmicos a las PBPs produce paredes celulares debilitadas o
defectuosas, seguido de lisis celular por activacin de enzimas autolticas, que conducen a la muerte
celular. Puesto que las bacterias Gram+ no poseen una membrana externa, los antimicrobianos lactmicos actan directamente sobre el peptidoglicano, y los siguientes pasos son similares a los de
las bacterias Gram- 15.

16

II.4.5. Estructura Qumica de los Compuestos -lactmicos.

La presencia de un anillo -lactmico define qumicamente a esta familia de antibiticos, de la que se
han originado diversos grupos: penicilinas, cefalosporinas, carbapenemas, monobactamas e
inhibidores de las -lactamasas. Estos agentes -lactmicos son derivados cclicos de los aminocidos, aunque en productos naturales tambin encontramos a sus anlogos . Por otro lado, los
-aminocidos se encuentran presentes en la naturaleza, como componentes de pptidos
biolgicamente activos16, y su incorporacin como pptidos tienen un inters farmacolgico. La 2azetidinona (Vase Figura 11); tambin llamada -lactama, es una amida cclica de cuatro miembros;
la cual, fue sintetizada por primera vez por Staudinger en 190717. Posteriormente, el descubrimiento de
la penicilina en 1929 por Fleming, la elucidacin de su estructura por cristalografa de rayos X18 y su
purificacin por Chain y Florey19, permitieron la sntesis de nuevos compuestos -lactmicos de
inters farmacolgico. Lo cual, en la actualidad sigue siendo un campo interesante; adems de su
importancia biolgica las -lactamas en forma enatiomricamente puras, son indispensables para la
sntesis de una gran variedad de productos naturales, tales como los -aminocidos, oligopptidos,
pptidos y azetidinas20.

Sitio de desdoblamiento
por beta lactamasas o
por cido

R1
N
R2

R3

Figura 11. Estructura de las -lactamas (2-azetidinona)20.

En los ltimos aos, se han descubierto un gran nmero de antibiticos tiles en el tratamiento de
enfermedades infecciosas, sin embargo algunos han sufrido modificaciones qumicas para ser ms
efectivos en los tratamientos. Todos las estructuras de los antibiticos -lactmicos se pueden
considerar derivados de un ncleo qumico, que es el anillo -lactmico el cual esta fusionado a otro
heterociclo (S, O) ya sea de cinco o seis miembros21. Vase Figura 12.

17

Penam

N
R

O
CO

NH

Clavam

Penem

Monobactam

Carbapenam

N
O Clavem

N
O

Oxacefam

Oxacefem

N
O

Cefem

SO3H

N
O

Cefam

N
O

N
O

Carbapenem

Carbacefam

Carbacefem

Figura 12. Estructura de los ncleos de los antibiticos -lactmicos22.

Los antibioticos -lactmicos presentan escasa toxicidad, tienen un amplio margen de seguridad y se
clasifican en: penicilinas, cefalosporinas, carbapenems y monobactamas22b. VaseTabla 1.

A. Beta lactmico
B. Anillo tiazolidnico

E
R

C
NH

C. Fragmento procedente de L-cistena

D. Fragmento precedente de D-valina

CH3

N B

CH3

D
COOH

E. Grupo acilo

Tabla 1. Antibiticos -lactmicos

frecuentemente empleados en clnica22.
PENICILINAS
Bencilpenicilina
Penicilina G
Isoxazolilpenicilinas
Oxacilina
Aminopenicilinas
Ampicilina, amoxicilina
Carboxipenicilinas
Carbenicilina, ticarcilina
Acilureidopenicilinas
Azlocilina, mezlocilina
Temocilina
Temocilina
CEFALOSPORINAS
1 Generacin
Cefazolina, cefalotina
2 Generacin
Cefoxitina, cefuroxima
3 Generacin
Cefotaxima, ceftazidima
4 Generacin
Cefpiroma, cefepime
CARBAPENEMAS
Imipenem, meropenem
MONOBACTAMAS
Aztreonam, carumonam

18

a) La penicilinas poseen una estructura bicclica, el cido 6 aminopenicilnico (6-APA), un

dipptido cerrado en forma de ciclo que se forma por la condensacin de L-cistena y Dvalina, resultando en un anillo -lactmico y un anillo tiazolidnico.
b) Las cefalosporinas, tienen un ncleo que es derivado de los mismos aminocidos que el 6APA, pero una de los grupos metilo de la valina se incorpora al anillo tiazolidnico, por lo que
este contiene seis elementos, en lugar de cinco. A este se le denomina cido 7aminocefalospornico.
c) Los carbapenems, se diferencian de las penicilinas por que existe una substitucin de un tomo
de carbono (CH2) por un tomo de sulfuro del anillo tiazolidnico.
d) Los monobactmicos, que son compuestos monocclicos donde un grupo de cido sulfnico,
en lugar de un anillo fusionado, permite que el anillo -lactmico sea activo.

II.4.6. Mecanismo de accin.

Se han descrito dos mecanismos que intervienen de una manera ms o menos directa en la accin
antibitica de los -lactmicos. El primero es la inhibicin directa de las protenas de unin a
penicilina (PBPs) de la membrana citoplasmtica. El segundo mecanismo, inductor de la lisis celular,
viene determinado por la accin concomitante de las autolisinas. Las protenas PBPs son la diana por
excelencia de los antibiticos -lactmicos a las que se unen por el residuo de serina anlogamente a
como lo hara el sustrato natural de las PBPs, los residuos acil-D-alanil-D-alanina del peptidoglicano;
como resultado de esta inhibicin, los pptidos UDP-acetilmuramil-L-Ala-D-Gln-L-Lys-D-Ala-D-Ala
se acumulan. La figura 13 muestra el mecanismo de accin de las transpeptidasas con diversos
ligandos y la obtencin de sus respectivos productos, propuesto en 1965 por Tipper y Strominger23.

19

CH3
R

H3C H

I)

H2N

NH H

NH H

H2

-N
R 2a

ENZ-XH

H 2b
2O

H3C

H3C

COOH

NH

NH

CH3

ENZ-XH

H3C

X
O

ENZ

HOOC

OH

NH
+

Dipptido D-ala-D-ala

ENZ-XH

HN

II)

CH3

CH3

N
O

HN
I

CH3

ENZ-XH
O

COOH

CH3

H2
-N
R 2a

H 2b
2O

R
HN

X-ENZ COOH

Penicilina

CH3
CH3

HN

OH
+

COOH

ENZ-XH

R
CO
HN
2

R
CO

CO

HN

III)

H
-N
R 2a

R
HN

S
I

H
N
O
H3C
Cafalosporina

CH3

H
HN
O
+ OH
ENZ-XH

CH2
CO 2

ENZ-XH
O

CH3

X-ENZ
CH3

H 2b
2O

R
CO
HN

H
HN
OH

O
+

CH3
CO 2

ENZ-XH

Figura 13. Reaccin enzimtica de las serin proteasas con diversos sustratos23.

20

En la literatura se ha reportado hasta 12 tipos diferentes de PBPs (PBP 1- PBP12), y dentro de

algunas existen subfamilias (PBP1a, PBP2b, etc.). El nmero de PBP vara con el tipo de
microorganismo y la variacin de estas molculas confiere resistencia al microorganismo (ej.
Staphylococcus aureus resistente a meticilina, un derivado de la penicilina). Vase tabla 2

Tabla 2. PBPs con actividad Transglucosidasa o Transpeptidasa23.

Funcin

Acccin al aadir
penicilina

Elongacin del cilindro celular

Lisis rpida

PBPs
PBP 1a y PBP 1b
PBP 2

Condiciona la forma de la clula

PBP 3
PBPs con actividad D-D
carboxipeptidasa (endopeptidasa)

Formacin del septo transversal

La clula se redondea y
muere
Filamentacin y muerte

Funcin natural

Accin penicilina

Eliminan la D-ala terminal del

pentapptido (maduracin PG)

No letal

PBP 4, PBP 5, PBP 6

Algunos -lactmicos actan inhibiendo especficamente a una sola de estas PBPs (Principalmente las
PBPs de la 1 a la 3, que son esenciales para la bacteria, y son las dianas de las penicilinas que explican
la actividad bactericida), pero la mayora inhiben a varias de ellas con una afinidad variable siguiendo
el siguiente modelo cintico:

PBP
+
Penicilina

k1
k2

PBP-Penicilina

k3

Peniciloil-PBP

k4

PBP
+
Penicilina
degradada

En la primera reaccin de carcter reversible, la enzima (PBP) reconoce al sustrato (el antibitico lactmico) producindose una serie de cambios conformacionales en la enzima que terminan formando
un complejo no covalente (interacciones dbiles). En una segunda reaccin, que ocurre de una manera
rpida, el sustrato acila un residuo de serina del centro activo de la enzima uniendo covalentemente el
antibitico a la enzima mediante un enlace tipo ster. La reaccin final de desacilacin libera la
enzima y un producto resultante de la inactivacin del antibitico. Un antibitico -lactmico ser
considerado mejor, cuanto ms rpidamente se una de forma covalente a la enzima (k3 alta), y
permanezca unido el mayor tiempo posible (k4 pequea) bloqueando y saturando las enzimas24. Tipper
y Strominger plantearon que las -lactamasas podran haber evolucionado a partir de enzimas

21

relacionadas con la sntesis del peptidoglicano (PBPs)

25, 26

. De la misma forma que ciertas -

lactamasas son inducibles por exposicin a los antibiticos -lactmicos, tambin algunas PBPs son
inducibles27, 28, sin embargo no ocurre el proceso inverso, ya que no se ha observado ninguna lactamasa con una funcin directa en el metabolismo de la pared bacteriana. Las autolisinas
intervienen en el crecimiento de la pared celular generando una serie de rupturas en la estructura del
peptidoglicano, en la separacin de las clulas en el momento de la divisin celular, en el proceso de
transformacin gnica y en la liberacin de fagos4, 29a.

II.4.7. Descubrimiento y obtencin de nuevos antibiticos.

La mayora de los antibiticos lderes se obtuvieron de forma natural a partir de microorganismos ver
Tabla 3. El descubrimiento y purificacin de cada uno de estos compuestos han sido la base e
inspiracin necesaria para llevar a cabo estrategias qumicas, encaminadas a la modificacin
estructural de dichos compuestos con la finalidad de mejorar; sus espectros de actividad, su
farmacocintica y reduccin en la toxicidad29b. Vase Figura 14

Figura 14. Descubrimiento y desarrollo de nuevos antibiticos29b.

22

Tabla 3. Antibiticos obtenidos de forma natural1.

Antibitico

Microorganismo(s) productor(es)

Penicilina G
Penicilina V
Cefalosporina C
cido clavulnico
Vancomicina
Eritromicina
Estreptomicina
Clorafenicol
Tetraciclina

P. notatum, P. chysogenum
P. chysogenum
C.acremonium
S. clavuligerus
S. orientalis
S. erythreus
S. griseus
S. venezuelae
S. viridifaciens, S. aureofaciens

En la literatura se han descrito tres metodologas, utilizadas para obtener nuevos antibiticos de
fuentes naturales: 1) Aislamiento directo de microorganismos marinos y del subsuelo, 2) Modificacin
gentica de microorganismos productores de antibiticos ya conocidos, para inducir la produccin de
nuevos metabolitos, y 3) Diversificacin de las rutas metablicas de los microorganismos productores
de antibiticos, a travs de la introduccin de sustratos precursores dentro del sistema de fermentacin.
La purificacin de molculas con potencial actividad a partir de microorganismos marinos y del
subsuelo requiere de grandes esfuerzos, como la aplicacin de mltiples tcnicas cromatogrficas y
ensayos biolgicos que permiten seguir la actividad antibitica de stos. En un estudio se estim que
de 21, 830 fermentos bacterianos estudiados, 6,464 eran productores de antibiticos; de los cuales, 490
posean ciertas actividades de inters y nicamente 6 se les determin su estructura, de los cuales slo
dos fue posible aislarlos1.
Cabe mencionar que primero se requiere detectar la actividad que pudiera haber en cada fermento,
para posteriormente identificar la fuente qumica de aquellos fermentos que producen antibiticos ya
conocidos, las cantidades obtenidas de nuevos agentes antibacterianos son del orden de picogramos ()
a microgramos (). Otra forma de obtencin de nuevos agentes antimicrobianos es el uso de la
tecnologa de ADN recombinante; con la que se obtienen resultados poco favorables, ya que se
obtuvieron antibiticos con pocas modificaciones estructurales de los ya conocidos. Finalmente; la
tercera metodologa tiene como fin, bloquear completamente la va sinttica involucrada en la
produccin de antibiticos ya conocidos, dentro de la bacteria, con el propsito de forzar a la bacteria
a usar otra va metablica, usando diferentes grupos estructurales y funcionales para producir nuevos

23

antibiticos. Este procedimiento permiti descubrir algunos aminoglucsidos, macrlidos y lactamas. Sin embargo, la cantidad obtenida es an tan pequea, como para una produccin masiva.

II.4.8. Relacin estructura actividad (SAR).

Una forma de bsqueda de nuevos compuestos que pudieran tener actividad es el estudio de la relacin
estructura-actividad (SAR) a partir de molculas lderes. El objetivo de estudio de esta relacin, es
determinar qu tipo de sustituciones o modificaciones en la molcula lder pueden realizarse para
mejorar su actividad. Es decir se puede llegar a desarrollar de una manera racional y dirigida la sntesis
de compuestos con potencial actividad biolgica. Entre los antibiticos biciclicos naturales, la
penicilina y cefalosporina son los ms importantes. El estudio detallado de la relacin estructuraactividad permiti entender que el xito de un antibitico para producir la muerte celular se relaciona
con su tamao, carga elctrica e hidrofobicidad. Sin embargo, debido a la presencia de diversos
mecanismos de resistencia en la bacteria, la eficacia teraputica de los agentes -lactmicos se ha visto
disminuido. Es por esto que la quimioteraputica se ha vuelto un campo atractivo de estudio, tanto en
el rea clnica como farmacutica30. Algunos de los desarrollos recientes en el campo de los
antibiticos -lactmicos son los que se describen a continuacin:
a) Los carbacefems; que tienen la caracterstica de ser ms estables que las cefalosporinas y
pueden ser fcilmente sustituidos en la posicin 3 del anillo -lactmico, un ejemplo claro es
el loracarbef (lorabid) de uso clnico31. Vase Figura 15

Figura 15. Estructura qumica del Lorabid31.

b) Los -lactmicos tricclicos; mejor conocidos como trienems. Son una nueva clase de
carbapenems tricclicos, que tienen la caracterstica de ser potentes, y son antibacterianos de
amplio espectro32, efectivos contra bacterias Gram+, Gram-, y bacterias patgenas anaerbicas;
como el GV 104326. Vase Figura 16

24

Figura 16. Estructura qumica del Tribactam32.

c) Los nuevos compuestos -lactmicos trombin33, inhibidores de la proteasa de citomegalovirus

humano34, inhibidores de absorcin del colesterol35, son el resultado de estudios exhaustivos
de la relacin estructura actividad de la penicilina. Vase Figura 17

Figura 17. Estructura qumica del a) inhibidor de la proteasa de citomegalovirus humano y del b)
inhibidor de absorcin del colesterol34, 35.

II.5. Resistencia bacteriana.

En 1940 se inicia el uso de antibiticos en el tratamiento de las enfermedades infecciosas; sin
embargo, es hasta 6 aos despus de la introduccin de la bencilpenicilina, que se observ un aumento
en la frecuencia de resistencia de los estafilococos en los hospitales, y un aumento del 10% hasta un 60
% a nivel mundial. A travs del uso de diversos antibiticos, han emergido cantidades crecientes de
bacterias de diversas especies resistentes a estos frmacos; lo que pone en evidencia la enorme presin
selectiva que ejercen los antimicrobianos para promover la seleccin de cepas resistentes y la
transferencia del material gentico. La resistencia bacteriana se define como el crecimiento bacteriano
a la concentracin mxima (del orden de g) de un antibitico tolerada por el hospedante. Este
concepto fue propuesto por Ehrlich (1854-1915), quin en su trabajo con protozoos, permiti entender
la rpida adaptabilidad de los microorganismos frente a los antibiticos y la necesidad de acelerar la
investigacin qumica y mdica, para mantener el mismo nivel teraputico. En esta parte del escrito se
propone revisar el origen de la resistencia, el medio por el cual los procesos de resistencia se han

25

diseminado en la poblacin microbiana, y los mecanismos por los cuales los antibiticos pueden ser
eliminados36.

II.5.1. Origen.
Para entender la base molecular del estudio antimicrobiano, primero es necesario plantearnos la
siguiente pregunta -las bacterias ya contenan la resistencia o la adquirieron por una necesidad de
adaptacin al medio?- Entre el ao de 1800 y 1859 esta pregunta fue respondida, por Jean-Baptiste
Lamark y Charles Darwin con sus respectivas teoras que revolucionaron el pensamiento
evolucionista. Cabe mencionar que en esa poca todava no se conoca la estructura del ADN, por lo
que sus teoras se basaron en el simple estudio fenotpico (trmino todava no acuado en esa poca)
de la especies. Pero se puede decir que la corriente Lamarckista se opone a la corriente Darwinista?

La teora de Lamark (predecesor de Darwin), explica que la adaptacin de los microorganismos al

medio se debe, no slo al impulso vital que los empuja hacia una creciente perfeccin; sino a un
mecanismo especfico de ajuste al medio: la herencia de los caracteres adquiridos. Por otro lado, la
teora de Darwin explica que la diversidad biolgica deriva de una nica forma de vida ancestral, a
partir de la cual la vida evolucion a lo largo de mltiples y sucesivas vas divergentes; en donde el
mecanismo fundamental es la seleccin natural. Debe entenderse, que Darwin concibi a la evolucin
como un proceso de descendencia con modificacin (mutaciones al azar); el cual es lento y se da de
forma gradual.
Darwin explicaba dentro de su teora que la evolucin se basada en factores y procesos puramente
mecnicos o materiales, de tal manera que no slo comprenda toda la diversidad biolgica, sino que
aceptaba aquellas propuestas de Lamarck; sobre los mecanismos que producen la evolucin, siempre
que fuesen puramente materiales; es decir, acept la herencia de los caracteres adquiridos (un

26

mecanismo por el que pueden explicarse ciertas adaptaciones puntuales a las circunstancias), pero
rechaz el vitalismo Lamarckiano37.. Hoy en da, existen diversas hiptesis que explican el origen de
la resistencia bacteriana. Todos ellos siguen una corriente Darwiniana.
Una hiptesis indica que el origen de los determinantes (genes) de la resistencia antibitica
encontrados en varias bacterias, son los propios microorganismos productores de antibiticos
(principalmente Actinomicetos), debido a que los usan como un medio de proteccin ante sus propios
metabolitos. Esta hiptesis se basa en la comparacin de secuencias de aminocidos y cido nuclicos
como determinantes de la resistencia de aminoglucsidos, tanto en microorganismos productores de
antibiticos como de bacterias aisladas en el rea clnica. Aunque la evidencia es consistente en cuanto
a la transferencia de genes entre los Actinomicetos y otras bacterias, no es posible conocer cul es
donador y cual es receptor, o si los nuevos genes de resistencia adquiridos se encuentran codificados
en cromosoma o en plsmidos. Sin embargo, los organismos productores de antibiticos no son la
nica fuente de los mecanismos de resistencia antimicrobiana, las micobacterias participan en un
intercambio de genes inter-especficos por conjugacin, con otro gnero bacteriano, lo que
ejemplificara el primer paso de diseminacin de los genes de resistencia con otras especies
bacterianas en la naturaleza (o el ambiente). Por otro lado la adquisicin exgena de estos genes
resistentes por micobacterias patgenas, es de gran consideracin; ya que la presencia de elementos de
resistencia en aislados clnicos de micobacteria, se asocian generalmente a una mutacin38. Vase
Figura 18

27

Figura 18. Ciclo de adquisicin de genes de resistencia por la bacteria, en respuesta a la presin selectiva
debido al uso de los antibiticos. La piscina de genes que codifican para la resistencia a antibiticos
representa todas las fuentes potenciales del ADN (que codifica para los determinantes de la resistencia) en el
ambiente; incluyendo hospitales, granjas, y otros microambientes donde los antibiticos son usados para el
control del crecimiento bacteriano. Despus de la absorcin de una cadena sencilla o doble de ADN por la
bacteria husped, la incorporacin de los genes resistentes dentro de replicones estables (elementos del ADN
capaces de replicarse autnomamente) que pudieron seguir diferentes vas; las cuales todava no se han
definido. La participacin de integrones; como se muestra aqu, ha sido demostrado por una gran clase de
elementos transponibles (pedazos de ADN que se mueven de un sitio a otro en el cromosoma) en las
Enterobacterias. Los plsmidos resultantes resistentes pudieron existir en forma lineal o circular en las
bacterias husped. Finalmente el ltimo paso en el ciclo diseminacin- se lleva a cabo por uno o varios de
los mecanismos de transferencia de genes, discutidos ms adelante38.

28

II.5.2. Introduccin a la gentica de la resistencia.

Como ya se

mencion la resistencia a los antimicrobianos est determinado por el genoma

microbiano, el cual se encuentra en la clula en tres tipos de elementos genticos: el cromosoma, los
plsmidos y los bacterifagos lisgenos. La resistencia puede ser intrnseca o adquirida.
La resistencia intrnseca es la resistencia natural que poseen algunas especies bacterianas; un
mecanismo es la presencia de enzimas inactivantes. Por otro lado, la resistencia adquirida se produce
por alguno de los mismos mecanismos por los que tiene lugar la resistencia natural y se adquieren por:
1) mutacin y seleccin (evolucin vertical); 2) transferencia de fragmentos de ADN que codifican la
resistencia entre cepas y especies (evolucin horizontal) 39.
La variabilidad gentica es esencial para que la evolucin microbiana pueda ocurrir. Debido a que los
agentes antimicrobianos ejercen una presin selectiva sobre las poblaciones bacterianas, favoreciendo
aquellos microorganismos capaces de sobrevivir a ellos, cada vez son ms las bacterias que responden,
segn su estrategia, seleccionando individuos que poseen mecanismos de resistencia40.

II.5.2.1. Evolucin vertical.

Esta evolucin se produce bajo una seleccin caracterstica de la evolucin Darwiniana, es decir por
un principio de seleccin natural: una mutacin espontnea en el cromosoma bacteriano puede conferir
resistencia a uno o varios antimicrobianos en al menos un miembro de la poblacin bacteriana. Estas
mutaciones generalmente involucran substituciones, delecciones, o adiciones de al menos un par de
bases. Tales errores se dan al azar y espontneamente, y son independientes de la presencia o ausencia
de un antibitico en particular41.
En el cromosoma bacteriano las mutaciones son el resultado de errores en el proceso de replicacin del
ADN y pueden ocurrir con una frecuencia de aproximadamente 10-8 por divisin celular. La mayora
de las mutaciones son reparadas sin que la clula tenga un cambio; pero cuando se produce este
cambio, pueden alcanzar una densidad poblacional de clulas muy grande, y cada mutante puede ser
desarrollado en una sola generacin en pocos minutos de crecimiento bacteriano. Sin presin selectiva
es muy difcil que se fije una mutacin en la poblacin, pero la sola influencia del antibitico tiende a

29

seleccionar al mutante resistente, con la cual la cepa sensible ser eliminada, mientras que las mutantes
sobrevivirn y proliferarn hasta llegar a ser el tipo predominante42.

II.5.2.2. Evolucin horizontal.

Esta evolucin refiere a la adquisicin de genes de resistencia a partir de otro microorganismo no
parental. El mecanismo por el cual se establece este tipo de resistencia es variado, pero con frecuencia
las bacterias con genes de resistencia donan estos genes a otras bacterias a travs de varios procesos de
intercambio gentico propios de las bacterias. Estos genes se pueden transmitir fuera del propio linaje
(intercambio gentico con diferente especie y/o gnero)43.
Esta adquisicin de ADN externo se debe a los plsmidos, bacterifagos, secuencias de ADN libre o
elementos genticos transponibles como los transposones. Los mecanismos responsables de esta
adquisicin son44, 45a:
a. Conjugacin: trasferencia del ADN plasmdico de una bacteria dnate a una bacteria receptora
por contacto entre clula y clula.
b. Transformacin: intercambio gentico producido cuando una bacteria es capaz de captar
fragmentos de ADN; de una bacteria lisada, que se encuentran dispersos en el medio donde
vive.
c. Transduccin: la transferencia de ADN de una bacteria a otra, se realiza a travs de un virus
bacterifago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias. Vase
Figura 19.

30

Figura 19. Mecanismos de transferencia gentica, de la resistencia bacteriana. a) Conjugacin, b)

Transduccin, y c) Transformacin45b.

II.5.3. Mecanismos de resistencia.

La resistencia a diversos antibiticos se debe a mutaciones genmicas o por adquisicin vertical u
horizontal del material gentico que contiene determinantes de resistencia. Esta resistencia puede ser
activa (como resultado de una presin especfica evolutiva, que adapta un mecanismo de contra ataque
contra un antibitico o varias clases de antibiticos), o pasiva (donde la resistencia es una
consecuencia de un proceso adaptativo general, que no necesariamente est ligado a una clase
especfica de antibiticos).
La bacteria alcanza una resistencia antimicrobiana activa a travs de 4 mecanismos:
A. Presencia de un sistema de flujo de salida que bombea el frmaco hacia fuera, las
bombas son protenas embebidas en la membrana plasmtica.
B. Menor capacidad de penetracin del frmaco por disminucin de la permeabilidad.
C. Ausencia de un sitio efector o alteracin del mismo; sobre el cual acta el antibitico,
debida a una mutacin.

31

D. Presencia de enzimas inactivadoras; como las -lactamasas, las cuales destruyen

penicilinas y cefalosporinas principalmente46. Vase Figura 20

Figura 20. Diversos mecanismos de resistencia bacteriana46.

Estos mecanismos requieren de un programa gentico dentro de la clula en respuesta a un ambiente

estresante; de tal manera que la presencia de los antibiticos o su accin regulan genticamente la
expresin de genes resistentes. Por lo tanto, las bacterias gastan una gran energa y espacio gentico
para resistir activamente a los antibiticos. Incluso en cepas bacterianas aisladas en hospitales se ha
encontrado que presentan una combinacin de varios mecanismos de resistencia.
En 1940, Abraham y Chain identificaron una enzima capaz de hidrolizar el anillo -lactmico de esta
familia de antibiticos, lo cual interfera con la terapia de la penicilina. Observaciones experimentales
en el laboratorio con Enterobacterias, tales como Escherichia coli o Salmonella typhimurium;
encontraron que la frecuencia para observar bacterias mutantes espontneas resistentes es de 10-9 o
menos por generacin. Es por esto, que los genetistas bacterianos de hoy en da sugieren que el
desarrollo de la resistencia bacteriana debida a la terapia es improbable, ya que la frecuencia de las
mutaciones que dan la resistencia bacteriana es demasiado baja47.
Entre los mecanismos de resistencia identificados, la inactivacin enzimtica es uno de los procesos
bioqumicos ms comunes, que confieren resistencia a una amplia variedad de antibiticos en las

32

bacterias. Es sorprendente que los mecanismos de inactivacin de antibiticos han sido importantes en
la determinacin de la resistencia bacteriana; ya que son consecuencia de diversas mutaciones; aunque
algunos determinantes para la inactivacin enzimtica de los antibiticos en aislados clnicos, pueden
deberse a la herencia de funciones exgenas (genes). No por esto, se menosprecia a las mutaciones
como un factor influyente en el desarrollo y evolucin de la resistencia antimicrobiana en aislados
patgenos clnicos; de hecho, una vez que el gen que codifica para las enzimas hidrolticas se establece
en el patgeno, este puede sufrir mutaciones que remodelan el sitio activo de la enzima, cambiando su
espectro de inhibicin48, 49.
Como ya se explic, el rol de la mutacin es importante en la evolucin de la resistencia, un simple
cambio de una base nitrogenada en el gen puede cambiar; en el caso de las -lactamasas, su
especificidad por el sustrato. El ciclo de ingeniera de la protena natural en respuesta a la presin de
seleccin del antibitico ha sido demostrado especialmente para los genes de las -lactamasas, donde
se observa una gran diversidad de enzimas, dentro de esta misma familia. La familia de las lactamasas difieren por un nmero substancial de aminocidos, permitiendo la expansin secuencial
del rango de sus sustratos debido a una serie de mutaciones puntuales en diferentes sitios dentro de un
mismo gen, lo que genera un cambio en las interacciones funcionales entre la enzima y el sustrato
(agentes -lactmicos).
Otros mecanismos de resistencia que se desprenden en respuesta al continuo uso de antibiticos son: a)
el aumento de la resistencia a travs de una sobre expresin de -lactamasas debido a una mutacin en
el promotor de regulacin y b) la sobre expresin de genes de -lactamasa cromosmicos en cepas
sumamente resistentes, como consecuencia de los cambios en la regulacin transcripcional48.

II.6. Enzimas -lactamasas.

Es importante entender la resistencia basada en enzimas, ya que tienen un impacto significativo en el
tratamiento de las enfermedades infecciosas. La produccin de enzimas es un mecanismo de
resistencia comn entre las bacterias patgenas. Para los antibiticos de tipo aminoglucsidos, lactmicos y cloranfenicol su inactivacin enzimtica se debe a la hidrlisis o a la formacin de
derivados inactivos. Tales enzimas, pueden ser: Vase Figura 21.

33

Amidasas o acilasas, producidas por bacterias Gram- que eliminan la cadena lateral acil de las
-lactamas.
Estearasas, producidas por mamferos que rompen el enlace acil ster.
-lactamasas, hidrolizan el enlace amido del anillo -lactmico.
R

NH

CH3

CH3

N
O

COOH

Amidasa
(acilasa)

-lactamasa

Esterasa
O

COOH
O
N

O
R

NH

CH3

Figura 21. Enzimas que pueden actuar sobre los antibiticos -lactmicos49a.

Las -lactamasas son de importancia para la quimioterpica y son tambin llamadas penicilin
(cefalosporn) amido--lactam hidrolasas (EC 3.5.2.6.), son enzimas capaces de hidrolizar tambin
cidos carboxlicos y derivados de cidos que sean activos, dejndolos ms estabilizados. En 1940
Abraham y Chain detectaron que en extractos de una cepa de E. coli, desapareca la actividad
antibacteriana de la penicilina49b, debido a una enzima que denominaron: penicilinasa. Posterirmente
(1944) Kirby demostr la presencia de la penicilinasa en Staphylococcus aureus resistentes a la
penicilina G.
Las -lactamasas se han encontrado en prcticamente todas las especies bacterianas que se han
buscado. Aunque son caractersticas de los organismos que poseen peptidoglicano en la pared celular,
tambin se han descrito en clulas eucariotas como Candica albicans, Candica boidinii y Pichia
pinus50. El trmino penicilinasa fue quedando en desuso con la aparicin de las cefalosporinas y se
acu el trmino -lactamasa. Sin embargo, todava se emplean los trminos penicilinasa, para
cuando la -lactamasa tiene mayor actividad frente a penicilinas; cefalosporinasa, cuando la actividad
es preferentemente frente a cefalosporinas; o -lactamasas de amplio espectro cuando muestran una
actividad similar frente a ambos grupos. Las -lactamasas hidrolizan el enlace amida del anillo lactmico impidiendo la interaccin con las PBPs.

34

II.6.1. -lactamasas en bacterias Gram- y bacterias Gram+.

Las -lactamasas de los microorganismos Gram- difieren de las enzimas de las bacterias Gram+,
principalmente en su localizacin. La gran cantidad de -lactamasas que las bacterias Gram+ liberan al
medio extracelular da como resultado un efecto poblacional. En contraste, la localizacin y
permanencia de la enzima en el espacio periplasmtico de las bacterias Gram-, restringe la accin de
las -lactamasas hasta despus que el -lactmico ha penetrado al espacio periplasmtico, por lo tanto
el nivel de resistencia es una propiedad individual de cada clula y depende de la competencia que se
establece entre las velocidades de penetracin del antibitico y de inactivacin.

II.6.2. Origen de las -lactamasas.

Se cree que las enzimas -lactamasas evolucionaron de las diferentes PBPs (a travs de la inclusin
de agua, u otra maquinaria hidroltica requerida dentro del sitio activo), con las que guardan
homologa secuencial y estructural. Es posible que su funcin natural originaria fuera la de participar
en la biosntesis de la pared celular o evitar la autolesin en los microorganismos que producen
naturalmente antibiticos -lactmicos; por lo que se hallan codificadas en el cromosoma en diversas
bacterias; dado su significado funcional. Las -lactamasas tambin se pueden difundir ampliamente
entre las bacterias, mantenindose por la presin selectiva de los antibiticos usados en la teraputica.
Gracias a la cristalografa de rayos X, fue posible encontrar homologa entre las estructuras
tridimensionales de las enzimas -lactamasas con las enzimas transpeptidasas; as como, su similitud
entre los sitios de unin y las rutas catalticas51. A travs de los parmetros cinticos de acilacin
(kcat/KM) y desacilacin (k3) se encontr que la hidrlisis de los antibiticos -lactmicos es ms
eficiente frente a las -lactamasas que con las PBPs. Estos estudios surgen con el objetivo de tratar de
contestar si las -lactamasas provienen de un antecesor involucrado en la sntesis del peptidoglicano o
diverge de un antecesor proveniente de un mecanismo bioqumico diferente.
Algunos estudios han demostrado, que el reconocimiento entre las -lactamasas de clase A y sus
diversos sustratos (-lactamas) se deben a las interacciones que se dan dentro del sitio cataltico;
donde se observa que existe una cavidad cargada positivamente la cual reconoce a los carboxilatos, un
hueco oxianinico que reconoce al oxgeno carbonlico del ncleo -lactmico, y que acelerando la

35

formacin del intermediario tetrahdrico, adems se presenta un puente de hidrgeno con los grupos
acilamino. Vase Figura 22

Figura 22. Interacciones claves en el sitio de unin de las serin--lactamasas de clase A52a.

En la figura 23 se muestra la comparacin de las estructuras terciarias de las transpeptidasas con las lactamasas de clase C y A. En la cual, se encuentra que los aminocidos de las PBPs tienen una
mayor similitud con las -lactamasas de la clase C. Tambin se muestra, que la distancia del sitio
cataltico entre la penicilina y las -lactamasas es menor comparado con las PBPs. Vase Figura 24.
Sin embargo, se observa que la unin entre la penicilina y las -lactamasas de clase A es ms efectiva,
as como su hidrlisis; principalmente por su acentuada inclinacin de la lmina y la incrementada
electrofilicidad del hueco oxianinico52a.

36

Figura 23. Alineamiento entre: a) la -lactamasa de clase A, b) la -lactamasa de clase C, y

c) la Transpeptidasa (PBP2)52b.

Figura 24. Diagrama que muestra la unin entre a) el pptido L-Lys-D-Ala-D-Ala con la transpeptidasa y
b) el antibitico penicilina con una -lactamasa de clase A52c.

37

II.6.3. Mecanismos de accin.

Las -lactamasas al unirse al antibitico -lactmico, forman un complejo no covalente
(EnzimaSustrato). Si el complejo no se disocia, se forma un enlace entre el enzima y el sustrato
producindose una estructura acil-enzima por unin del antibitico con el grupo hidroxilo de la serina
del centro activo. Finalmente el producto de la hidrlisis se desprende de la enzima quedando sta
nuevamente libre para su accin.

-lactamasa
+
Penicilina

k1
k2

-lact.-Penicilina

k3

Peniciloil--lact.

k4

-lactamasa
+
Peniciloato

Cuando el ncleo -lactmico de las penicilinas es hidrolizado por una -lactamasa se produce
estequiomtricamente el correspondiente peniciloato; el cual es un compuesto inactivo, fcilmente
detectable, y relativamente estable. El primer producto generado tras el ataque de la -lactamasa sobre
una cefalosporina es, hipotticamente, un cefalosporato anlogo al peniciloato. Sin embargo, los
cefalosporatos son muy inestables y se degradan rpidamente a molculas ms sencillas por lo que son
muy difciles de detectar como tales51, 53, 54. Como ya se ha comentado al hablar de los mecanismos de
accin de los antibiticos -lactmicos sobre las PBPs, segn la hiptesis de Tipper y Strominger
(1965) las -lactamasas habran evolucionado a partir de las enzimas relacionadas con la sntesis del
peptidoglicano como respuesta a la produccin de antibiticos -lactmicos por parte de algunas
bacterias y hongos55. Sin embargo, la configuracin del sitio activo de las transpeptidasas (PBPs) no
permite el acceso del agua para completar la segunda parte de la reaccin de las -lactamasas, por lo
tanto el intermediario acil-enzima es el producto de la reaccin final, dando como consecuencia el
debilitamiento de la pared celular56.

II.6.4. Clasificacin de las -lactamasas.

Las -lactamasas son un grupo complejo de enzimas con propiedades diferenciales, tales como el tipo
de sustrato que hidrolizan o el tipo de sustrato que las inhibe (parmetros cinticos), su localizacin
(intra o extracelular), su codificacin (cromosmica y/o extracromosmica), expresin gentica
(constitutiva o inducible) y otras propiedades fsicoqumicas (peso molecular, pI, inmunologa). Estas

38

propiedadess se utilizarn para establecer una clasificacin funcional de las -lactamasas. En 1973,
Richmond y Sykes propusieron un esquema formado por cinco grupos de enzimas basado en sus
perfiles de sustrato57. Sykes y Matthew en 1976, introdujeron a esta clasificacin las denominadas
enzimas plasmdicas que podan diferenciarse adems por su punto isoelctrico58. Ambler en 1980,
propuso la primera clasificacin basada en la estructura molecular59: La clase A, son penicilinasas que
poseen un residuo de serina en el centro activo; y la clase B, son cefalosporinasas, metalo-lactamasas que requieren zinc (in bivalente) como cofactor. Posteriormente Jaurin y Grundstrm en
1981 completaron esta clasificacin aadiendo la clase C, que son cefalosporinasas con una serina en
su centro activo. A finales de los aos 80, se segrega la clase D, que son enzimas que hidrolizan la
oxacilina, que es otra -lactamasa de tipo serina60.
Con el fin de establecer una clasificacin ms homognea, en 1988 primero57 y despus nuevamente
en 1989. Bush estableci una clasificacin que intentaba unificar los criterios anteriores61-64.
Finalmente la clasificacin ms reciente ha sido propuesta por Bush-Jacoby-Medeiros en 199565 Vase
Tabla 4. En esta se emplean los criterios de funcionalidad clsicos con los datos moleculares ms
actuales, a la vez que se intenta correlacionar los esquemas de clasificacin ms frecuentemente
citados.

39

Tabla 4. Clasificacin de -lactamasas por Bush, Kacoby y Madeiros64.

Grupo
Bush,
Jacoby y
Madeiros

Grupo
de
Bush

2a

2b

Clases
Richmond
y
Sykes
1973

Tipos
MitsuhashiInoue
1981

Clase
molecular

Preferencia al
sustrato

Perfil de
inhibicin
por cido
clavulnico

Tipo de ESBL

Ia, Ib, Id
No
incluida

Cefalosporinasa

Cefalosporinas

Amp C

Penicilinasa V

Penicilinas

Penicilinasas

2b

III

Penicilinasa I

TEM-1, TEM2, SHV-1

2be

2b

No
incluida

Cefuroximasa

TEM-3, TEM26, SHV-2 a

SHV-6

2br

No
incluida

II, IV

No incluida

2c

2c

Penicilinasa IV

2d

2d

Ic

Penicilinasa II
y III

2e

2e

No
incluida

2f

No
incluida

No
incluida

Cefuroximasa

Penicilinas y
Cefalosporinas
Penicilinas y
Cefalosporinas
de amplio
espectro
Penicilinas
Penicilinas y
carbecilina
Penicilinas y
Cloxacilina

+/+
+/-

Cefalosporinas

No incluida

Penicilinas,
Cefalosporinas
y
Carbepemnicos

No
incluida

No incluida

-lactamasas,
Carbepemenos

No
incluida

No incluida

Penicilinas

TEM-30 a
TEM-36, TRC1
PSE-1, PSE-3,
PSE-4
OXA-1, OXA11, PSE-2
Cefalosporinasa
inducible de
Proteus
vulgaris
NMC-A de
Enterobacter
cloacae, Sme-1
de Serratia
marcescens
L1 de
Xanthomonas
maltophila,
Ccra de
Bacteroides
fragilis
Penicilinasa de
Pseudomonas
cepacia

40

Es necesario tomar en cuenta si las -lactamasas son producidas por bacterias Gram+ y/o Gram-,
as como el tipo de expresin cromosmica o plasmdica que presentan.

Bacterias Gram+. Incluidas dentro del Grupo 2a, (Vase Tabla 4) producen una -lactamasa
de localizacin fundamentalmente extracelular, de produccin inducible, actividad
preferentemente penicilinasa que se inhibe por accin del cido clavulnico; aunque existen
excepciones (Nocardia y micobacterias) que son intracelulares y de amplio espectro. Las lactamasas de S. aureus (A, B, C, y D) representan el estndar de este grupo y sus genes
suelen estar codificados por plsmidos. B. cereus sin embargo presenta -lactamasas (I-III) de
codificacin cromosmica.

Bacterias Gram-. Las -lactamasas producidas por estas bacterias representan una gran
diversidad. Se localizan en el espacio periplsmico. Casi todas las bacterias Gram negativas
producen una, o ms de una -lactamasa codificada por genes cromosmicos y en ocasiones
pueden expresar otras de origen extracromosmico.
A. -Lactamasas

cromosmicas.

Las

-lactamasas

codificadas

por

genes

66

cromosmicos son caractersticas de gnero e incluso especie especficas El nivel

de expresin de los genes codificantes suele ser bajo (sntesis constitutiva), pero
puede verse incrementado de manera importante por diversos factores: a)
Induccin con determinados antibiticos -lactmicos, b) Mutaciones en genes
reguladores de la expresin gnica67, c) Por alteraciones en la regin del promotor
o en la atenuadora68-71, y d) Por amplificacin gnica (duplicaciones) 79. Atendiendo
a la especificidad del sustrato que hidrolizan y a las sustancias que las inhiben, se
han clasificado en 4 grupos.
Grupo

1.

Cefalosporinasas

dbilmente

inhibidas

por

cido

clavulnico, pero s por azeitram o claxacilina. Son enzimas

codificadas en su totalidad por el genforo, y son frecuentemente
inducibles. Incluye las -lactamasas de las especies siguientes:
Aeromonas hydrophila (A1), Enterobacter cloacae, Escherichia coli,
etc. Las enzimas estudiadas de este grupo corresponden a la clase
molecular C.

41

 Grupo 2. Encontramos varias subclases, debido al variado perfil de

sustratos que presentan, pero todas son inhibidas por cido
clavulnico. Las enzimas que se encuentran clasificadas en este
gnero corresponden a la clase molecular A.
Grupo 3. Metalo--lactamasas que hidrolizan carbapenems y no son
inhibidas por cido clavulnico, pero s por EDTA

y p-

cloromercuribenzoato (pCMB). Corresponden a la clase molecular B.

Grupo 4. Penicilinasas no inhibidas por cido clavulnico, y su clase
molecular no ha sido determinado.
B. -Lactamasas extracromosmicas. Son -lactamasas codificadas por genes
localizados en plsmidos o en transposones. En las bacterias Gram- se han descrito
un gran nmero diferente de estas enzimas, que se diferencian entre ellas por su pI,
peso molecular y su espectro de hidrlisis e inhibicin. En general, son enzimas
con actividad hidroltica de amplio espectro y se inhiben por cido clavulnico.
Suman su actividad, que por lo general es ms elevada, a la de la -lactamasa
cromosmica. Se encuentran ampliamente distribuidas entre los diferentes gneros
y especies bacterianas. La limitacin para su distribucin taxonmica radica en la
capacidad de transposicin, en el grado de incompatibilidad73 y en la capacidad de
autotransferencia de los plsmidos74. La expresin gnica de estas enzimas es
constitutiva y su tasa de sntesis depende de: a) Nmero de copias del plsmido o
transposn en la clula, b) Eficiencia del promotor, y d) Amplificacin gnica.
Atendiendo tanto a su espectro de actividad como a su clase molecular, se les
conoce como -lactamasas de espectro extendido (BLEEs), y se clasifican de la
siguiente manera:
1. Enzimas de amplio espectro (sin actividad sobre cefalosporinas de 3
generacin), clase molecular A y D.
TEM. Deben su nombre a las tres primeras letras del apellido
(Temoniera) de la paciente griega de la que se aisl la cepa
portadora de esta enzima (TEM-1), en el ao 1965 por Datta y
Kontomichalou75.

42

SHV. Fue descrita por Pitton en 1972 por lo que tambin se la conoce
como Pit-2.

76

Se la design SHV (por sus siglas en ingls:

Sulphydril Variable) por su comportamiento frente a la inhibicin

por para-cloro-mercurio-benzoato (pCMB).
CTX-M. Hidrolizan la cefotaxima, y se encuentran reportadas dentro
de la familia Enterocateriaceae. Actualmente confieren resistencia
a la cefotaxima y otras cefalosporinas.
Otras -lactamasas del Grupo 2b: HMS, ROB, OHIO, TLE, LXA.
Poseen actividad similar a TEM-1 pero son mucho menos
frecuentes.
Enzimas tipo OXA. Hidrolizan la cloxacilina ms rpidamente que la
bencilpenicilina.
Enzimas con actividad carbenicilinasa. PSE, CARB, y SAR.
2. -lactamasas de espectro extendido derivadas de TEM y SHV.
3. -lactamasas derivadas de TEM y SHV resistentes a los inhibidores.
4. -lactamasas de espectro extendido no relacionadas con TEM y SHV77.

II.6.5. Patogenicidad directa e indirecta de las bacterias productoras de las lactamasas.

Al comienzo del siglo XX las causas de muerte ms frecuentes eran las enfermedades infecciosas. En
la actualidad, tales riegos han disminuido; esto se debe al control sobre los agentes causales de las
enfermedades infecciosas, debido al conocimiento integrado de los procesos infecciosos, por la mejora
de la prctica sanitaria y por el descubrimiento y uso de los agentes antimicrobianos. Sin embargo, aun
cuando muchos microorganismos patgenos estn controlados, todava existe un riesgo importante
para la supervivencia, principalmente por patgenos con resistencia mltiple.
Las bacterias productoras de -lactamasas tienen un papel clnico importante en las enfermedades
infecciosas. Pueden tener un papel patgeno directo cuando ellas mismas producen la infeccin, o
pueden tener un efecto indirecto a travs de su capacidad de producir -lactamasas. Las bacterias con
esta capacidad no solo sobreviven a la terapia con antibiticos -lactmicos, sino que tambin
protegen a las bacterias susceptibles a los mismos; a travs de la liberacin de enzimas libres al medio,

43

pero se requiere de la liberacin de cantidades suficientes de -lactamasas para realizar esta accin
sobre bacterias susceptibles localizadas en el mismo sitio78, 79.
Las bacterias productoras de -lactamasas pueden aislarse de diversas infecciones, ya sean solas o
mezcladas con otra flora:

1.

Klebsiella, es un gnero de gran importancia clnica; se asla principalmente Klebsiella

pneumoniae, que suele ser comn en neumona caracterizada por la expectoracin purulenta
de esputo con leucocitos y sangre, en infecciones en tracto urinario se obtiene de pacientes
caracterizados80.

2.

Escherichia coli, es la bacteria que ms coloniza el cuerpo humano principalmente; el

intestino grueso, lo que explica su aislamiento con mayor frecuencia en el laboratorio clnico;
sin embargo, este microorganismo se observa con mayor frecuencia en infecciones urinarias,
neumona, meningitis; suele ser causantes de infecciones comunes que se presentan con mayor
frecuencia en nios menores de 2 aos y en adultos mayores de 65 aos.

3.

Aeromonas, recientemente algunas de las especies han emergido como un problema de salud
pblica para la poblacin humana provocando infecciones intestinales y extra-intestinales que
incluyen bacteriemia. Anteriormente llamado bacilo de Pfeiffer o Bacillus influenzae.

4.

Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, son una fuente importante de infecciones

nosocomiales81.

Las infecciones nosocomiales (IN); las cuales aparecen despus de 72 h de estancia hospitalaria y que
no estn presentes en el periodo de incubacin cuando el paciente ingresa al hospital, representan un
grave problema en Amrica Latina82. Y pese a los esfuerzos de las naciones por enfrentar este
problema nicamente el 5% de los hospitales toman las medidas adecuadas. Gracias a los trabajos
realizados en Mxico por Ponce de len y col83, se estim que las IN en los hospitales de segundo y
tercer nivel se encuentran entre el 10-15%. En Mxico la tasa de mortalidad asociada con IN es del
5%, ubicndose como la sptima causa de muerte84,

85

. Las IN generalmente son causadas por

diferentes microorganismos como Gram del tipo Staphylococcos aureus, y Enterococcus spp., y
levaduras como Candida spp., y en microorganismos Gram- como Escherichia coli, Enterobacter.,
Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Providencia ssp., Serratia ssp., Klebsiella oxytoca y Klebsiella
pneumoniae86, 87.

44

Las enterobacterias como E. coli y K. pneumoniae son responsables de una gran cantidad de IN,
principalmente en la sala de cuidados intensivos en la mayora de los hospitales.83 El desarrollo de
nuevos antibiticos; as como, el uso indiscriminado de stos, han generado una seleccin de estas
cepas bacterianas con resistencia a los antibiticos de uso comn; caracterstica que se asocia a las IN
provocadas por la aparicin de cepas multirresistentes, particularmente especies como K. pneumoniae
resistente a cefalosporinas de tercera generacin debido a la produccin de enzimas capaces de
inactivar a los diferentes tipos de antibiticos -lactmicos como las penicilinas, las cefalosporinas, los
inhibidores de -lactamasas, los carbapenems y monobactamas81.

II.7. Inhibidores de las -lactamasas.

Los inhibidores de las -lactamasas son compuestos con poca actividad antimicrobiana intrnseca, y
alta afinidad por las -lactamasas, por lo que combinados a los antibiticos -lactmicos, restauran la
propiedad antimicrobiana que stos han perdido debido a la presencia de estas enzimas, como
componentes principales en el mecanismo de resistencia a las penicilinas. La existencia de los
inhibidores de las -lactamasas se conoce desde los aos 50, y su utilidad teraputica no fue una
realidad hasta el descubrimiento del cido clavulnico en 1977, cuando fue administrado
conjuntamente con un antibitico -lactmico favoreciendo la actividad antibacteriana de ste
ltimo88a.
En la actualidad se emplean los inhibidores de las -lactamasas; tales como; a) el cido clavulnico el
cual tiene un ncleo similar al cido penicilnico de las penicilinas con la sustitucin del tomo de
azufre en la posicin 3 por un tomo de oxgeno (que incrementa la reactividad de la molcula y
proporciona una afinidad mayor por las -lactamasas), y la falta de la cadena lateral acilamino en
posicin 6. b) el sulbactam que es una sulfona semisinttica del cido penicilnico, y c) El tazobactam
que se diferencia del sulbactam por la presencia de un grupo triazol en posicin 388b. Vase Figura 25

45

6
7
O

5 1S
2

O
CH3

CH3

5 1S
2
N
4
3

6
O

N
N

CH3

COOH

COOH

Tazobactam

Sulbactam

O1

OH

COOH
Acido clavulnico

Figura 25. Inhibidores -lactmicos, ms usados en el rea clnica88b.

II.7.1. Estructura qumica y clasificacin.

Para combatir el mecanismo de resistencia regido por las enzimas -lactamasas, se han empleado dos
estrategias:
1) La identificacin de antibiticos resistentes a la hidrlisis de las enzimas.
2) El desarrollo de inhibidores de -lactamasas.
Como se mencion anteriormente, las -lactamasas pueden ser divididas dentro de 2 categoras,
aquellas que emplean un metal en el sitio activo y las que utilizan una serina nucleoflica. A pesar de
que cada da van adquiriendo ms importancia las metalo--lactamasas, las serin--lactamasas son las
ms importantes dentro del rea clnica. Por lo tanto, los frmacos usados en clnica por eleccin son
los inhibidores de las serin--lactamasas, mejor conocidos como inhibidores -lactmicos. Algunos
compuestos poseen la dualidad de antibiticos e inhibidores; como por ejemplo, carbapenems. Sin
embargo, existen otras -lactamas (ej. Sulbactama) que carecen de actividad antibitica per se * , y por
lo tanto, son administrados en combinacin con antibiticos.
Los carbapenems son productos totalmente sintticos, el sulbactam (sulfona del cido penicilnico) y
el tazobactam (sulfona del cido clavulnico) son inhibidores sintticos, producidos por semisntesis.

Del latn per se = por s mismo

46

Por otro lado, el cido clavulnico (oxapenam) es el inhibidor ms usado dentro del rea clnica y es
un frmaco natural aislado del actinomiceto Streptomyces clavuligerus.
Como ya se mencion, estos inhibidores comerciales son administrados en combinacin con un
antibitico; los cuales se encuentran disponibles en algunas presentaciones comerciales.

La combinacin Amoxicilina/Ac. Clavulnico representa un antibacterial de amplio espectro, que ha

sido usado por ms de 20 aos y contina siendo ampliamente usado. Particularmente estas
combinaciones comerciales son efectivas contra microorganismos susceptibles que expresan enzimas
de clase A; las cuales, se encuentran comnmente en aislados clnicos.
Generalmente los inhibidores se encuentran sustitudos en el Carbono 6 (C6), y sus mecanismos de
inhibicin son similares entre ellos. Los carbapenem tienen una cadena lateral hidroxietil en el C6,
que le da la capacidad de ser reconocido como antibiticos de amplio espectro y como pobres
sustratos o inhibidores competitivos de varias serin--lactamasas; sin embargo, como inhibidores
tienen ms afinidad por las enzimas metalo--lactamasas que por las serin--lactamasas; y su relacin
estructura-actividad sigue en estudio para mejorar su eficiencia89.

II.7.2. Mecanismo de accin.

Los inhibidores -lactmicos actan por dos mecanismos: a) unindose de manera irreversible por su
alta afinidad con el sitio cataltico de las -lactamasas, previniendo de esta manera la hidrlisis de las
penicilinas; y b) mediante la fijacin directa a las PBP bacteriana, lo cual incrementa la actividad
antibacteriana de la penicilina. Por esta razn se les denomin en un principio "antibiticos suicidas".
Adems son inhibidores potentes de la mayor parte de las -lactamasas plasmdicas y de algunas de las
-lactamasas cromosmicas
El mecanismo de inactivacin de las -lactamasas por el cido clavulnico, fue estudiado inicialmente
por grupo de Knowles90, posteriormente el estudio fue refinado por el grupo de Mobashery91. Los
primeros estudios cristalogrficos fueron realizados sobre las -lactamasas PC1 de la clase A de
Staphylococcus aureus por el grupo de Chen y Herzberg92, y los estudios de espectrometra de masas
de ionizacin por electrospray (ESIMS * ) fueron realizados por el grupo de Schofield93. Las serin--

Del ingls electrospray ionization mass spectrometry

47

lactamasas operan a travs de multiples pasos que involucran la formacin y destruccin hidroltica
del intermediario acil-enzima. La mayora de los inhibidores -lactmicos de la clase A de las lactamasas funcionan a travs de la formacin de un ster, estabilizado hidrolticamente. Dependiendo
de la especificidad del inhibidor, este intermediario acil-enzima puede estar estabilizado: a)
electrnicamente (ej. interacciones de resonancia, que favorecen la estabilidad del enlace ester del
intermediario con un aminocido serina), b) por enlaces covalentes a un segundo residuo nuclefilico
en el sitio activo, o c) estabilizado debido a su posicin en el sitio activo. Este ltimo tipo de
estabilizacin puede deberse al movimiento del inhibidor o por el cambio conformacional de la propia
enzima94a. Vase Figura 26

a) Transpeptidasa
RCONH

b) Serin--lactamasa
RCONH

N
O
CO 2

OH

Penicilina

Ser

OH
Enz

Ser

OH

N
O
Enz

c) Serin--lactamasa

CO 2

Penicilina

CO 2

OH
Enz

cido clavulnico

Ser

-CO2
NHCOR
O

Ser
Enz

NHCOR
O

HN

Ser
CO 2

Enz

Acil-enzima estable

S
O

HN

Ser
CO 2

H2 O

Acil-enzima lbil

HN
OH

Enz

-C4H9NO2

-H2O

+ 2H2O
OH

Enz

NHCOR
O

S
OH
OH

Enz

Ser

CO 2

OH
O

Enz

HN

Ser

Ser

O
O
Enz

Ser

Acil-enzima estable

Figura 26. Blancos de las -lactamasas: a) Actividad de la penicilina sobre las transpeptidasas, b)
hidrlisis de la penicilina por las Serin--lactamasas, y c) inhibicin de las Serin--lactamasas por
el cido clavulnico94b.

Knowles tambin estudi el mecanismo del sulbactam, y propuso que segua un mecanismo similar al
del cido clavulnico, usando el sulfuro de la sulfona como grupo saliente (en forma de sulfinato), en

48

lugar del oxgeno del enol ter del clavulanato. Mobashery complement el mecanismo de inhibicin
del sulbactam ayudndose del mecanismo del cido clavulnico52a. Vase Figura 27 y 28

Figura 27. Mecanismos de inhibicin de las -lactamasas de clase A por el cido clavulnico52a.

Figura 28. Mecanismos de inhibicin de las -lactamasas de clase A por el sulbactam52a.

Segn los mecanismos descritos en las figuras 26 y 27 existe una similitud de los procesos;
particularmente en la formacin de dos iones iminium (4 y 5) relacionados estructuralmente, as como
su divisin entre las especies transitorias (7 y 16) y las especies inhibidas irreversiblemente (11 y 18).

49

El tazobactam est relacionado estructuralmente con el sulbactam, con la nica diferencia de la adicin
de un grupo tiazol en el grupo -metilo del C2. Esta modificacin mejora la actividad contra varias lactamasas (IC50 2 a 100 veces mejor) y microorganismos (valores de CMI de 4-64 veces ms baja). El
sulbactam es ligeramente ms activo sobre las cefalosporinasas y sobre las enzimas tipo TEM. El
tazobactam presenta una buena actividad inhibitoria frente la enzimas de tipo plasmdico (TEM-1,
SHV-1, OXA.1, etc.) y sobre algunas enzimas cromosmicas cefalosporinasas, pero no es suficiente
para ser usado clnicamente49b. El tazobactam tiene un mecanismo relacionado al del cido clavulnico
y el sulbactam.

II.7.3. Resistencia.
Dada la frecuencia de la administracin de combinaciones antibitico/inhibidor; as como, de una alta
tasa de reproduccin y frecuencia mutacional en la bacterias, se ha desarrollado una resistencia hacia
el inhibidor. El trmino resistencia-inhibidor hace alusin a la combinacin amoxicilina/clavulanato,
y no necesariamente implica resistencia a otros inhibidores. Se ha visto que tal resistencia puede
ocurrir por hiperproduccin de -lactamasas sin modificar, por la modificacin de las protenas de la
membrana externa; as como, de la produccin de una forma de enzima mutante, que puede ser ms
resistente a los inhibidores comerciales92, 94a, 96.

II.8. Aspectos Qumicos.

El campo de la qumica es considerada como una de las herramientas que impulsaron una mayor
comprensin de nuestro mundo, esta rea estudia la materia y los cambios que sufre, y se desarroll
lentamente, hasta cerca del final del siglo XVIII. El objetivo de la qumica es investigar la estructura
de la materia y la forma en la cual se llevan a cabo sus transformaciones. Una conocida clasificacin
de las ciencias pone a la qumica entre la fsica, que es muy matemtica, y la biologa, que es muy
descriptiva. Entre las subdisciplinas de la qumica, la orgnica es menos matemtica que descriptiva,
por que subraya los aspectos cualitativos de la estructura molecular, las reacciones y las sntesis. En
fecha ms reciente, los qumicos orgnicos han encontrado que las posibilidades grficas de las
computadoras personales estn bien adaptadas para visualizar una molcula como objeto
tridimensional, y evaluar su capacidad de interaccionar con otra molcula. Dada una biomolcula de
estructura conocida, una protena, por ejemplo, y un frmaco que acta sobre ella, los programas de

50

modelado molecular pueden evaluar las diversas formas en que los dos pueden interaccionar entre s.
Esos estudios pueden dar informacin sobre el mecanismo de accin del frmaco, y guiar el desarrollo
de nuevos frmacos de mayor eficacia.

II.8.1. cidos carboxlicos y sus derivados.

Los cidos carboxlicos que son compuestos del tipo RCOOH, constituyen uno de los grupos
funcionales que se encuentras con ms frecuencia. Incontables productos naturales son cidos
carboxlicos o se derivan de ellos. Algunos, como el cido actico se conocen desde hace siglos. Otros
como las prostaglandinas, que son poderosos reguladores de procesos biolgicos se conocieron hasta
fecha relativamente reciente, hay otros como la aspirina, que son productos de sntesis qumica. Los
efectos teraputicos de la aspirina, conocidos desde hace ms de un siglo se deben a su capacidad de
inhibir la biosntesis de las prostaglandinas. Vase Figura 29.
O
O

(CH2)6CO2H
O
H3C

OH
OH

(CH2)4CH3

HO
HO

PGE 1

Aspirina

OCOCH3

Figura 29. Estructura qumica de a) cido actico, b) prostaglandina y c) cido acetilsaliclico97.

Los derivados de los cidos carboxlicos son compuestos en los cuales existen otros grupos
funcionales unidos en el tomo de carbono del grupo carbonlico97. Vase Figura 30.

51

OH
R
cido carboxlico
O

R
NH2
amida

ster

H
imida

O
R

anhdrido de cido

Cl

cloruro de cido

Figura 30. Estructura qumica de los derivados de cido carboxlico97.

II.8.2. Amidas.
Las amidas son derivados monoacilados del amoniaco, la mayora son slidos cristalinos, sus puntos
de ebullicin son mucho ms elevados que los de los cidos correspondientes, por ejemplo: el cido
actico (p.e.=118 C); y la acetamida (p.e.=223 C). Como pueden obtenerse fcilmente a partir de los
cidos, se emplean con frecuencia para identificarlos cuando estos son lquidos. La deslocalizacin del
par electrnico no compartido del nitrgeno disminuye el carcter positivo del carbono carbonilo y
hace que las amidas sean menos reactivas que otros derivados de cido carboxlico ante el ataque de
nuclefilos. Vase Figura 31.

O:

..

.. _
:O :

.. _
:O :

..

H
H

..
+ N
H

H
H

Figura 31. Deslocalizacin electrnica de la formamida102.

Principales mtodos de preparacin de amidas:

1. Por la deshidratacin de las sales de amonio; cuando estas son calentadas de 200 a 230 C
pierden una molcula de H2O dando amidas.

52

R-COONH4

R-CO-NH2 + H2O

2. La hidratacin de nitrilos; el calentamiento de nitrilos a 40 C con agua oxigenada ligeramente

alcalina da buenos rendimientos de las amidas.

R-CN + 2H2O2

R-CO-NH2+ H2O + O2

3. Mediante la accin del amoniaco o aminas primarias sobre cloruro de cidos, anhdridos o
steres98.
O

HNR2

NR2

X
X = Cl, OR, OAc

II.8.3. Imidas cclicas.

Las imidas cclicas de los cidos dicarboxlicos se preparan por descomposicin trmica de sus sales
de diamonio.
O

H2C

H2C

+
2
- NH4

100-150C

H2C
H2C

NH +

NH3 + 2H2O

La formacin de imidas cclicas slo ocurre cuando dos o tres grupos metilenos separan a los dos
grupos carboxlicos. La ftalimida y sus sales derivadas de potasio son compuestos que se utiliza en la
obtencin de aminas primarias, sntesis de Gabriel.

NH

O
Ftalimida

N -K

O
Ftalimida potsica

53

II.8.4. Isomaleimidas.
La formacin de isomaleimidas N-sustituidas se realiza mediante la deshidratacin de sus
correspondientes cidos malicos con; N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC), cloroformiato de etilotrietilamina (C2H5OCOCl/NEt3), anhdrido trifluoroactico-trietilamina, anhdrido acticotrietilamina (CH3CO2COCH3/NEt3), proceden probablemente a trves de mecanismos similares. Vase
Figura 32.
O
H

COOH

A. deshidratantes
H

CONHR

cido malico N-sustitudo

Isomaleimida N-sustituda

Figura 32. Obtencin de una isomaleimida99.

El mecanismo propuesto consiste en la donacin de un protn del cido malico hacia la base terciaria
o hacia la DCC99 lo que permite la formacin de un anillo de cinco miembros, el cual posteriormente
reacciona con el agente deshidratante formando las estructruras que se muestran en el esquema, y
finalmente se lleva cabo la deshidratacin para obtener la isomaleimida. Debido a que en la reaccin
no existe un in acetato libre, el cual pudiera catalizar la isomerizacin, y obtener la maleimidas Ndisustituidas, esta isomerizacin no se lleva a cabo. Las isomaleimidas se usan principalmente como
herbicidas100 Vase Figura 33.

54

Figura 33. Mecanimos de formacin de la isomaleimida103.

II.8.5. -lactamas.
Las lactamas son amidas cclicas y son anlogas de las lactonas que son steres cclicos. As como las
amidas son ms estables que los steres las lactamas son ms estables que las lactonas. Entonces,
aunque son raras las -lactonas, las -lactamas se encuentran entre los productos mejor conocidos de
la industria farmacutica. Los antibiticos penicilina y cefalosporina que son tan tiles para tratar las
infecciones bacterianas, son -lactamas; los cuales se les llama antibiticos -lactmicos. Vase
Figura 34

55

O
C6H5CH2CNH

S
N

CH3
CH3

RHN

S
X

N
O
CO2H

CO2H

Penicilina G

Cefalosporina

Figura 34. Antibitico -lactmicos101.

Estos antibiticos inhiben una enzima bacteriana que es esencial para la formacin de su pared celular.
Un sitio nucleoflico de la enzima reacciona con el grupo carbonilo del anillo de cuatro miembros y se
abre el anillo para acilar la enzima. Una vez acilado su sitio nucleoflico, la enzima ya no es activa y
las bacterias mueren. Los anillos -lactmicos de las penicilinas y cefalosporinas combinan
exactamente el nivel correcto de estabilidad en medios acuosos, y de reactividad hacia la sustitucin
nucleoflica, por lo que son agentes acilantes efectivos contra esta enzima bacteriana critica.
El estudio de este tipo de compuestos permiti encontrar que algunas -lactamas monocclicas
exhiben actividad antibacteriana. La necesidad de desarrollar nuevos compuestos ha llevado a la
creacin de diferentes rutas para la obtencin de anillos -lactmicos que tengan la propiedad de
debilitar e inhibir a las cepas resistentes. Como consecuencia de la amplia investigacin de
compuestos -lactmicos se ha descubierto que estos compuestos pueden ser precursores no slo de
penicilinas y cefalosporinas, sino que tambin son precursores de aminocidos, entre otras
sustancias101.

II.8.5.1. Mtodos para la sntesis de -lactamas.

Inspirado por las aplicaciones farmacolgicas de las -lactamas y debido a las limitaciones asociadas
con su biosntesis, la sntesis qumica de este tipo de compuestos ha llamado la atencin en los ltimos
80 aos, donde el principal reto es la obtencin de nuevos compuestos que contengan como ncleo el
anillo de 4 miembros, mejor conocido como -lactama. Para la obtencin de esta familia de
antibiticos existen diversos mtodos que utilizan la formacin de los cuatro enlaces simples del anillo
lactmico o mediante una cicloadicin [2+2]. Vase Figura 35

56

Figura 35. Mtodos para la formacin del anillo -lactmico103.

La metodologa ms obvia fue la formacin del enlace amida N1-C2 es y fue la utilizada en la sntesis
de la penicilina, la formacin del enlace simple C1-C2 es muy rara. Se ha reportado una metodologa
que involucra un cierre de anillo mediado por tri-n-butil estao, para obtener el enlace C2-C3. A pesar
de que su rendimiento es pobre, este mtodo es una alternativa para la obtencin de -lactamas
quirales considerando que la materia prima puede prepararse de -aminocidos disponibles.
Comparada con la metodologa que involucra la formacin de un enlace simple en la sntesis de las lactamas, la cicloadicin de cetena-imina es un mtodo fundamental y verstil para la sntesis de
derivados -lactmicos (2-azetidinonas) en un solo paso. Aunque esta reaccin es conocida desde
1907, la naturaleza de su mecanismo sigue en estudio hasta hoy da. Este problema se complica con el
desarrollo de diferentes variantes en la reaccin. Quiza la metodologa ms utilizada es la que
involucra un cloruro de acido y una imina, donde una gran variedad de investigaciones de este tipo han
sido reportadas98, 102.
Existen una gran cantidad de investigaciones experimentales y tericas sobre la reaccin de Staudinger
un mecanismo alterno y aceptado para esta reaccin es el siguiente:

1.- La reaccin de cicloadicin de la cetena-imina, ms que una reaccin concertada es una reaccin
paso a paso.

57

2.- La reaccin se inicia con el ataque nucleoflico de la imina a la cetena dando un zuiter-in como
intermediario.
3.- El cierre de anillo conrotatorio electrocclico del zuiter-in intermediario produce la - lactama
como producto final. En general, las iminas (E) dan preferentemente cis--lactamas, mientras que las
iminas (Z) dan predominantemente ismeros trans Vase Figura 36.

Figura 36. Mecanismo alterno de cicloadicin103.

Estudios tericos realizados para establecer el origen de la estereoseleccin cis/trans, revelaron que las
energas relativas de la ruta determinante de los estados de transicin, que conduce al zuiter-in a la
formacin de las -lactamas, no necesariamente estn gobernadas por efectos estricos, pero si por
efectos electrnicos selectivos-torque (trmino referido a la preferencia de la rotacin de los
sustituyentes hacia afuera outward o hacia adentro inward, en las reacciones de apertura
electrocicclica conrotatoria o disrotatoria). Clculos en ab initio han mostrado la correlacin existente

58

entre la estereoqumica del cierre del anillo y las caractersticas de donador/aceptor por parte de los
sustituyentes. Si R es electrodonador, el cierre conrotatorio se produce a travs de una rotacin hacia
afuera, favoreciendo una estereoqumica cis (~ 10 kcal/mol). Si el grupo es electroatractor la rotacin
ocurre hacia dentro favoreciendo una estereoqumica trans. El concepto de torque-selectividad, aunque
permite la racionalizacin de una cantidad sustancial de datos experimentales conocidos referente a la
reaccin de Staudinger; requiere de un mayor estudio en esta rea103, 104.

II.8.5.2. Sntesis asimtrica de -lactamas.

Se ha encontrado que la actividad biolgica de ciertos antibiticos esta muy relacionada con su
estereoqumica. La cicloadicin de isocianato-olefinas, la cicloadicin de enolato-imina, y la
ciclocondensacin de ster metaloenolado-imina son mtodos muy poderosos en la sntesis asimtrica
de -lactamas, involucrando el uso de: a) una imina quiral y un cloruro cido aquiral o cetena, b) una
imina aquiral y una cetena quiral, o c) mediante una doble estereodiferenciacin en la cual ambos
componentes son quirales. Estos mtodos adems se han reportados con altas diastereoselectividades.
Georg y colaboradores, han reportado el uso del ster quiral silil protegido 1 en la sntesis de lactamas-NH (3) con alta enantioselectividad105.

TBDMS

Ph

O
O

OTBDMS

Ph

LDA
94%
TMS

NH
O

ee% 93-97%

SO 2NH(C6H11)2

El estado de transicin propuesto para la reaccin de cicloadicin del ster enolato-imina involucra un
estado de transicin de 6 miembros (4)106,107 similar al de la condensacin tipo aldol.

59

Li
L

OR
N
L

R1 O

R3
R4O

Li
L

R2

R3

R2

R3
R4O

N
R2

R1

4
Las -lactamas formadas son amidas excepcionalmente reactivas, capaces de acilar una diversidad de
reactivos nucleoflicos. La considerable tensin en el anillo de 4 miembros favorece la reactividad de
las -lactamas, as por ejemplo el enlace N1-C2 se puede romper fcilmente por la accin de
nuclefilos (ej. Oxgeno, Nitrgeno, y Carbono), dando como resultado derivados de -aminocidos
-aminocidos108. Vase Figura 37

R2

R3

Ruptura N 1-C 2

HO

R1

H 2N

Ar

R1

R3

N
O

HN

R2

-aminocidos
Ar

Ruptura N 1-C 4
N

R1

H 2N
O

NH

R1

-aminocidos

Figura 37. Reactividad del ncleo 2-azetidinona104.

Finalmente hablando de la actividad de los antibiticos; para que estos lleven a cabo su accin,
primero requieren penetrar en las bacterias y posteriormente unirse de forma activa al blanco. Con los
estudios de la relacin estructura-actividad, y el descubrimiento de nuevas molculas biolgicamente
activas, los conceptos actuales en cuanto a la comparacin de la actividad qumica y la biolgica han
comenzado a hacerse ambiguos. La razn estructural y mecanstica precisa para la selectividad todava
es materia de algunas especulaciones. A pesar de que las combinaciones antibitico/inhibidor son uno
de los ms grandes sucesos de la historia dentro del rea de la quimioteraputica, estos frmacos han
favorecido la evolucin de la resistencia en la bacteria. Sin embargo, todava existen diversas
cuestiones que faltan ser afinadas, como la identificacin de un inhibidor tal, que pueda

60

simultneamente inhibir ambas clases de enzimas (serin- y metalo--lactamasas), e inhibir a las

transpeptidasas (actividad de antibitico).
En relacin a que las -lactamas han figurado prominentemente tanto en sntesis orgnica, por su
versatilidad estructural, como a nivel medicinal por sus propiedades farmacolgicas como agentes
quimioteraputicos, el desarrollo de mtodos eficientes para su preparacin juega un papel muy
importante.
La contribucin de este trabajo tiene la finalidad de aportar conocimiento en este campo mediante la
sntesis de nuevos compuestos espiro--lactmicos, utilizando la metodologa que involucra a la
reaccin de Staudinger, as como realizar su evaluacin microbiolgica.

61

III.JUSTIFICACIN.
Los antibiticos -lactmicos son agentes quimioteraputicos con una gran efectividad, actividad de
amplio espectro y baja toxicidad. Las diversas -lactamas que conforman a esta gran familia se
caracterizan por tener el ncleo azetidinona, responsable de su actividad biolgica; y en la cual, esta
actividad se ve modificada por la presencia de cadenas laterales, por la insaturacin de la molcula,
por presencia de heterotomos y/o por la fusin de anillos de 5 o 6 miembros en el ncleo lactmico. Sin embargo, en los ltimos 50 aos el mal uso y abuso de tales antibiticos ha favorecido
la presencia de bacterias multiresistentes, limitando el tratamiento quimioteraputico y aumentando la
incidencia de infecciones nosocomiales, principalmente en pases subdesarrollados. Por tal motivo, la
resistencia antimicrobiana se ha convertido en un problema global de grandes dimensiones, y el
impacto sobre la morbidez, la mortalidad y los costos de la salud pblica cada vez es mayor. Esto
genera la necesidad de sintetizar nuevas molculas -lactmicas de mayor efectividad, amplio espectro
y con la capacidad de evitar los diversos mecanismos de resistencia que presentan las bacterias.
A pesar de esta necesidad, diversas compaas farmacuticas no invierten en el desarrollo de nuevos
antimicrobianos, debido a que no representan una mejora econmica, comparado con otros frmacos
involucrados en otras terapias. Sin embargo, la resistencia bacteriana ha ido forzando la continua
modificacin tanto de la estructura como de las cadenas laterales de los compuestos -lactmicos
activos ya conocidos; apoyndose en el estudio de la relacin estructura-actividad (SAR).
A raz de esta problemtica, en este trabajo se propone la sntesis de N-aril-espiro--lactamas
sustituidas; a travs de la reaccin de cicloadicin [2+2] de una cetena con una isomaleimida. Este tipo
de reaccin se conoce como la reaccin de Staudinger (1907), utilizada principalmente para la
preparacin de -lactamas, y en la que se ha obtenido rendimientos de moderados a buenos.

62

IV.HIPTESIS.
R

HN

OH

CH3
CH3

N
O

COOH

cido clavulnico

COOH

Penicilinas

Cl

OMe

Cl

NO2

O
N
O

N-aril-espiro--lactamas

La estereoselectividad con que los sistemas biolgicos reconocen a los frmacos, sustratos o antgenos,
se debe a que los receptores poseen caractersticas estructurales que actan de forma complementaria
con el frmaco, permitiendo iniciar una serie de eventos que conducen a la respuesta biolgica. Es por
esto que la relacin estructura-actividad juega un papel muy importante en el reconocimiento del
frmaco por el receptor, con lo anterior y debido a la relacin estructural que tienen los compuestos
propuestos en este trabajo con el anillo -lactmico de la penicilina y del cido clavulnico, se espera
que los compuestos sintetizados:
a. Acten como inhibidores de la pared celular y como inhibidores de las -lactamasas.
b. Acten nicamente como inhibidores de la sntesis de la pared celular.
c. Acten nicamente como inhibidores de las -lactamasas.
d. No acten ni como inhibidores de las PBPs, ni como inhibidores de las -lactamasas.
Esta actividad pudiera modificarse principalmente por dos factores; la presencia de grupos
electroatractores y electrodonadores en la posicin para del anillo aromtico unido al nitrgeno del
anillo -lactmico, y por la presencia del tomo de cloro que se encuentra unido al carbono alfa al
grupo carbonilo del anillo lactmico de estos compuestos.

63

V.OBJETIVOS.
V.1. Objetivos Generales.
Sintetizar y caracterizar qumicamente y microbiolgicamente 5 compuestos N-aril espiro lactmicos.

V.2. Objetivos Particulares.

1. Sintetizar los 5 compuestos N-aril espiro -lactmicos propuestos, partiendo primeramente de
la sntesis de amidas, posteriormente la sntesis de isomaleimidas y finalmente la sntesis de
las N-aril espiro--lactamas.
R

R
O
O

NH2

Anhidrido malico

p-anilina monosustituda

Cl

-Lactamas N-Aril-p-sustituidas

R= H, Cl, F, OMe, NO 2

2. Purificar y caracterizar todos los compuestos sintetizados utilizando tcnicas espectroscpicas

tales como; Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear (RMN) de

H y

13

C,

espectroscopa de infrarrojo, y espectrometra de masas, as como, por tcnicas simples como

cromatografa en capa fina, determinacin de punto de fusin y cromatografa en columna tipo
flash, entre otras.
3. Realizar un estudio de difraccin de Rayos X para determinar la estructura relativa de las Naril espiro -lactamas sintetizadas.

64

4. Mediante clculos tericos optimizar la geometra del compuesto N-p-F-fenil-espiro-lactama, usando el programa Spartan Pro 06 V102 a nivel HF/6-31G, y comparar los
resultados con los datos experimentales obtenidos por el estudio de difraccin de Rayos X.
5. Determinar mediante la prueba de Cefinasa, si las cepas Aeromona hidrophila ATCC 7966,
Klebsiella pnuemoniae ATCC 700603, Pseudomonas aeruginosas ATCC 27852, Escherichia
coli ATCC25922, Escherichia coli ATCC35218, Escherichia coli DH10b sensible (DH10bs)
y Staphylococcus aureus ATCC 29213; son productoras de -lactamasas.
6. Realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana segn lo marca The Clinical and
Laboratory Standards Institute mejor conocida como la CLSI. para los compuestos
sintetizados, con la finalidad de:
a) Evaluar su actividad como antibiticos.
b) Determinar la concentracin mnima inhibitoria (CMIs).
c) Evaluar su actividad sinrgica.
7. Determinar la potencia (CI50) de cada una de las N-aril espiro -lactamas sintetizadas, segn lo
marca la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. (FEUM).

65

VI.METODOLOGAEXPERIMENTAL.
VI.1. Instrumentacin.
El material utilizado para la sntesis de las -lactamas fueron secados en una estufa a
180C durante 24h. antes de usarse.
Las materias primas, productos y reactivos fueron pesados en la balanza analtica
Sartorius.
Las reacciones fueron agitadas en una parrilla de calentamiento y agitacin magntica
Corning.
La concentracin de los productos de reaccin se realiz en un rota vapor Yamato RE 50
con ayuda de una bomba de vaco Duo Seal.
La purificacin de los compuestos sintetizados se llev a cabo mediante cromatografa en
columna tipo flash109, utilizando slica gel Merck de 230-240 mallas (0.040-0.063mm),
destilacin fraccionada y recristalizacin fraccionada segn fue necesario.
Los puntos de fusin de las materias primas y los productos fueron determinados en un
aparato de punto de fusin Electrothermal 9300.
Para la determinacin cromatogrfica de las materias primas y los productos se emplearon
cromatofolios de aluminio ALUGRAM SIL 20x20 cm, recubiertos con gel de slice
60F254 (Micherey-Nagel). Para el revelado se utiliz una lmpara de UV UVP
Laboratory Products Epi Chem II Darkroom.
Los espectros de infrarrojo (IR) se determinaron en pastillas de KBr y fueron realizados en
un espectrmetro Spectrum One FT-IR de Perkin Elmer. Las frecuencias de absorcin
se reportan en cm-1.
Los espectros de resonancia magntica nuclear de y se determinaron en un espectrmetro
JEOL modelo FX-270Q. Para 1H a 270 MHz y para los espectros de 13C a 67.89 MHz; y
en un Varian modelo VNMRS-500. para 1H a 500 MHz y para

13

C a 125.787 MHz. La

determinacin se llev a cabo utilizando como disolventes: cloroformo deuterado (CDCl3)

y dimetilsulfoxido deuterado (DMSO-D6) y tetrametilsilano (TMS) como referencia
interna. Para indicar la multiplicidad de las seales en 1H se utilizaron las siguientes
abreviaturas: (s) simple, (d) doble, (t) triple, (m) mltiple, los valores de los
desplazamientos qumicos () se presentan en partes por milln (ppm) y las constantes de

66

acoplamiento (J) se describen en Hertz (Hz). En los casos en que no se pudo determinar la
multiplicidad de una seal se reporta el intervalo de desplazamiento qumico en el que
aparecen.
Los espectros de masas de impacto electrnico se obtuvieron en un equipo Perkin Elmer
GC-MS con un voltaje de ionizacin de 70 electrn/volts y corriente de filamento de 100
picoamperes, las seales de fragmentacin se reportan en m/z.
La estructura de rayos X del monocristal se obtuvo utilizando un difractmetro de Brucker
Smart Apex CCD area.
La optimizacin molecular se llev a cabo con el programa Spartan Pro 06 V102 a nivel
HF/6-31G110.
El ajuste del inculo se realiz en un espectrofotmetro de UV-VIS variant Carywin
conc. 50

VI.2. Reactivos.
VI.2.1. Qumicos.
Se utilizaron los siguientes reactivos para la sntesis de las N-aril-espiro -lactamas,la purificacin, y
la determinacin espectral: anilina (J. T. Baker), p-metoxianilina (Sigma), p-cloroanilina (Sigma), pfluoroanilina (Aldrich), p-nitroanilina (Sigma), 4-aminobenzoato de etilo (Sigma), anhdrido malico
(Sigma),

tetrahidrofurano

destilado

(THF,

ver

procedimiento),

hexano

destilado,

diciclohexilcarbodiimida (DCC, Aldrich), diclorometano destilado (CH2Cl2, ver procedimiento),

cloruo de cloroacetilo (ClCH2COCl, Aldrich), trietilamina (NEt3, Aldrich), acetato de etilo destilado
(Aldrich), sulfato de sodio anhidro (J. T. Baker), sulfato de calcio anhidro (CaSO4, Drierite), bromuro
de potasio anhidro (KBr, Merck), cloroformo deuterado (CDCl3, Aldrich), dimetilsulfxido deuterado
(CD3SOCD3, Aldrich). Todos los reactivos utilizados durante el proyecto tienen grado analtico de
pureza.

67

VI.2.2. Microbiolgicos.
Para las pruebas de sensibilidad, se usaron los siguientes reactivos: medio de culivo BBLTM Mueller
Hinton broth (Becton Dickinson and company), medio de cultivo LB Miller broth (Sigma), sensidiscos
con cefinasa BBL Cefinace (Becton Dickinson and company), medio de cultivo BD Broxon Muller
hinton agar (Becton Dickinson and company), sensidiscos con cefotaxima BD BBL (CTX) 30 g
(Becton Dickinson and company), sensidiscos con ceftazidima BD BBL. (CAZ) 30 g (Becton
Dickinson and company), antibacteriano antibenzil concetrado rojo (Farmacuticas Altamirano),
DMSO (Sigma). Los antibiticos de referencia: ampicilina trihidratada y amoxicilina trihidratada,
fueron amablemente otorgados por los Laboratorios Sinbiotik International S.A. de C.V., y el
inhibidor de referencia: clavulanato de potasio fue amablemente otorgado por los Laboratorios Fermic.
S.A. de C.V.

VI.3. Sntesis.
VI.3.1. Destilacin del disolvente tetrahidrofurano (THF).
El tetrahidrofurano (THF) usado en las reacciones se sec de la siguiene manera: se mantuv por
agitacin durante 12 h con sodio metlico bajo atmsfera de nitrgeno, despus de este tiempo se
destil. A continuacin se pas a otro matraz seco y se le adicion nuevamente sodio metlico ms
benzofenona, agitndose a reflujo hasta la aparicin de un color violeta intenso. Para ser utilizado en
las reacciones, es necesario destilarlo y adicionarlo a las materias primas, va cnula, para mantenerlo
seco y exento de humedad.

VI.3.2. Destilacin del disolvente diclorometano (CH2Cl2).

El diclorometano (CH2Cl2) empleado en las reacciones se destil y posteriormente se sec
mediantela adicin de sulfato de calcio con indicador (diedrita de color azul); y se agit con
reflujo durante 6 h. para ser utilizado en las reacciones, es necesario destilarlo y adicionarlo a las
materias primas, va cnula, para mantenerlo seco y exento de humedad.

68

VI.3.3. Reaccin No 1. Sntesis de Vinil amidas para sustitudas.

El mtodo general consiste en hacer reaccionar una mezcla en cantidades equimolares de p-anilina
sustituda con anhdrido malico, previamente disueltos en tetrahidrofurano anhidro (THF). La adicin
se realiza en bao de hielo/sal (0-5 C) gota a gota por va cnula de la solucin del anhdrido malico
a la solucin de la anilina. Al terminar la adicin se retira el bao de hielo-sal y se agita a temperatura
ambiente durante 12 h, tiempo durante el cual se forma un precipitado color crema. El slido se filtra
sobre un embudo Buchner y se seca al vacio. A continuacin se muestra la reaccin general.
R
R
O

THF/ 0C
12 h

anhdrido malico

NH2
anilina

NH

O
OH

fenilmaleamida

R= Cl, F, H, OMe, NO2

VI.3.4. Reaccin No 2. Sntesis de Aril-isomaleimidas para sustitudas.

El mtodo general consiste en hacer reaccionar una mezcla en cantidades equimolares de la pfenilmaleamida monosustituda con diciclohexilcarbodiimida (DCC), previamente disueltos en
diclorometano anhidro (CH2Cl2). La adicin se realiza en bao de hielo/sal (0-5C) gota a gota por va
cnula de la solucin de la diciclohexilcarbodiimida a la solucin de la fenilmaleamida, al terminar la
adicin se retira el bao de hielo-sal y se agita a temperatura ambiente durante 12h, tiempo durante el
cual se forma un precipitado blanco; el cual corresponde a la diciclohexilurea (DCU). El slido se
separa de la fase lquida por filtracin, y se lava con diclorometano sobre un embudo Buchner.
Finalmente, la fase lquida, que contiene a la p-isomaleimida sustituda, se le evapora parte del
disolvente a vaco, y posteriormente se precipita con n-hexano fro; para obtener un slido amarillo
que es el producto deseado, el cual se filtra a vaco, se lava con n-hexano y se seca a temperatura
ambiente. A continuacin se muestra la reaccin general.

69

N
+
O

NH

DCC, CH 2Cl 2/ 0C

12 h

N
O

Diciclohexilcarbodiimida
OH

R= Cl, F, H, OMe, NO2

fenilmaleamida

DCU

arilisomaleimida
para sustituda

VI.3.5. Reaccin No 3. Sntesis de N-aril-espiro--lactamas.

Finalmente a travs de una reaccin de cicloadicin [2+2], mediante la adicin de la cetena la cual es
generada in situ, a partir del cloruro de cloroacetilo, a las arilisomaleimidas y utilizando como base a
la trietilamina para extraer el protn del metileno, se obtienen las N-aril-espiro--lactamas sustitudas.
Esta metodologa fue descrita por Staudinger, tal como se muestra en la siguiente reaccin108, 111, 112.

R
O
Cl

Cl

CH2Cl 2, NEt 3

Cl

-78C

"

"

+ HCl.NEt3

arilisomaleimida
para sustituda

Cl

N-aril-espiro--lactamas

R= Cl, F, H, OMe, NO2

El mtodo general consiste en hacer reaccionar la p-isomaleimida sustituda con una mezcla en
cantidades equimolares de cloruro de cloroacetilo y trietilamina, previamente disueltos en
diclorometano seco (CH2Cl2). La adicin se realiza en bao de hielo seco con acetona (CO2)/acetona;
con lo que se alcanza una temperatura de -78C, gota a gota por va cnula de la mezcla a la pisomaleimida sustituda. Al terminar la adicin se retira el bao de hielo seco y se deja agitar a
temperatura ambiente durante 46 h, tiempo durante el cual se forma una mezcla de color caf. Esta
mezcla se filtra para eliminar el clorhidrato de trietilamina formado, posteriormente se lava con una

70

solucin 9:1 de bicarbonato de sodio/agua destilada, y finalmente se hacen 3 extracciones con CH2Cl2
y otras tres con agua destilada, la fase orgnica se seca sobre sulfato anhidro, se filtra y se concentra.
Finalmente se purifica por columna tipo flash109, utilizando una mezcla de disolventes 9:1
hexano/acetato de etilo, para obtener en todos los casos cristales.

VI.4. Optimizacin mediante clculos tericos de la N-p-F-fenil-espiro--lactama (3c).

La espiro-p-F--lactama (3c) se optimiz a nivel HF/6-31G por medio del programa Spartan 2003.
Utilizando la configuracin relativa de la molcula que se obtuvo por el estudios de difraccin de
rayos X.

71

VI.5. Pruebas Microbiolgicas.

VI.5.1. Protocolo general.
Para la realizacin de las pruebas microbiolgicas se muestra a continuacin un esquema general del
procedimiento a seguir:

VI.5.2. Obtencin y recuperacin de cepas.

Se recuperaron 7 cepas, Aeromona hidrophila ATCC 7966, Klebsiella pnuemoniae ATCC 700603,
Pseudomonas aeruginosas ATCC 27852, Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC
35218, Escherichia coli DH10 sensible (DH10s) y Staphylococcus aureus ATCC 29213; las cuales
pertenecen al cepario del grupo de investigacin del laboratorio de Bacteriologa mdica de la Escuela
Nacional de Ciencias Biolgicas del I.P.N.

72

VI.5.2.1. Manejo y Conservacin de cepas.

Estas cepas se conservaron por congelacin a -80 C en caldo Mueller-Hinton con glicerol al 40 %
como crioprotector y fueron resembradas en agar Mueller-Hinton. Despus de la incubacin se
comprob su pureza por tincin de Gram. Se tom un inculo y se sembr en una caja de agar
Mueller-Hinton por estra cruzada. El vial empleado se regres al congelador inmediatamente despus
de utilizarlo. Las cajas se incubaron a 28 C durante 24 horas. Las cepas recuperadas se conservaron a
corto plazo en microtubos conteniendo medio de mantenimiento, para su uso posterior.

VI.5.3. Evaluacin de la produccin de -lactamasas.

Se han desarrollado diversas pruebas clnicas para la deteccin de -lactamasas. Estas pruebas
proporcionan una informacin rpida que predice el desarrollo de la resistencia. La interpretacin de
los resultados de la prueba de la -lactamasa debe tener en cuenta los siguientes factores: la
sensibilidad de la prueba para las diferentes clases de enzimas de tipo -lactamasa, los tipos de lactamasas producidos por diferentes grupos taxonmicos de microorganismos y las especificidades de
sustrato de las diferentes -lactamasas. Los mtodos rpidos para la deteccin de -lactamasas usados
en el rea clnica son: el mtodo iodomtrico, el mtodo acidomtrico y diversos sustratos
cromgenos113. Las pruebas iodomtrica y acidomtrica suelen realizarse utilizando penicilina como
sustrato y, por consiguiente, slo pueden detectar enzimas que hidrolizan a la penicilina. Se ha
comprobado que una de las cefalosporinas cromgenas, PADAC (Calbiochem-Behring), es eficaz en
la deteccin de la mayora de las -lactamasas conocidas, exceptuando algunas de las penicilinasas
producidas por estafilococos y algunas -lactamasas producidas por bacterias anaerobias114. Otra
cefalosporina cromgena es la Nitrocefina; de la cual, se han reportado dos metodologas para su
sntesis, una de ellas aparece como una patente por Glaxo Research (Middlesex, Inglaterra) en 1973, y
la segunda metodologa aparece en 1998115. Ambas estrategias de sntesis involucran mltiples pasos y
bajos rendimientos. Investigaciones subsecuentes encontraron, que la Nitrocefina es la cefalosporina
utilizada en la metodologa para la deteccin de las -lactamasas conocidas, incluidas las penicilinasas
estafilococcicas116.

73

(Ismero E)

NO2

HOOC
O
S

O
NH

N
7

S1

NO2

cido
3-(2,4-dinitroestiril)-(6R,7R)-7-(2-tienilacetamido)-cef-3em-4-carboxlico
(NITROCEFINA)

Algunos estafilococos pueden precisar induccin (exposicin a un agente -lactmico) para aumentar
su produccin de -lactamasa hasta niveles detectables. Segn las referencias estndares, cualquier
resultado negativo de la prueba de -lactamasa de un aislado estafiloccico sin inducir,
independientemente del mtodo de anlisis, debe ser confirmado por la induccin del aislado y
repeticin de la prueba. Para muchos grupos taxonmicos de microorganismos, p. ej.,
Enterobacteriaceae, la prueba de la -lactamasa es de escaso valor debido a que en el grupo, o incluso
en una sola cepa, pueden producirse diversas enzimas de tipo -lactamasa con diferentes
especificidades de sustrato.
En otras bacterias, p. ej., Neisseria gonorrhoeae117, Staphylococcus aureus118, Moraxella catarrhalis119
resistentes a la penicilina y Haemophilus influenzae120 resistente a la ampicilina, las cepas resistentes
slo producen una clase de enzima. La prueba de la -lactamasa realizada con estos microorganismos
permite realizar una prediccin de la resistencia inmediatamente despus del aislamiento primario, 18
- 24 h antes del momento en el que se dispondra de los resultados de sensibilidad dependientes del
crecimiento. Aunque la prevalencia de enterococos productores de -lactamasa parece ser pequea, un
inculo bajo puede hacer que las cepas no sean detectadas mediante los procedimientos de pruebas de
sensibilidad, por lo que se recomienda el estudio sistemtico mediante el procedimiento del disco de
nitrocefina116.

A) Fundamento de la prueba.
La prueba de Cefinasa, consta de varios discos impregnados con nitrocefina (estos discos se
impregnan con 0.5 mL de Nitrocefina previamente disuelta en un buffer de fosfatos y dimetil
sulfxido). Esta cefalosporina presenta un amplio espectro de sensibilidad, comparados con los

74

compuestos -lactmicos comercialmente disponibles. Hasta ahora, se sabe que no reacciona con otras
enzimas microbianas113. Cada disco se utiliza para determinar la presencia de -lactamasa, en una cepa
bacteriana dada. Es una prueba altamente sensible, de tal forma que puede detectar la actividad
enzimtica de -lactamasas a nivel nanomolar (nM). El compuesto tiene un inusual espectro
ultravioleta, por lo que el cambio de color puede ser seguido cuantitativamente, midiendo los cambios
en la absorcin; los cuales ocurren dentro de la regin del espectro de 380 a 500 nm. Generalmente, en
esta regin las cefalosporinas normales no tienen espectro de absorcin. La reaccin se fundamenta en
la produccin de un compuesto coloreado al colocar el substrato nitrocefina en contacto con un
cultivo productor de -lactamasa.

O
S

O
NH

COOH
N
S

NO2

lactamasa
k1

O HN

NO2

NO2

Ser COOH
O

NH

k2

O HOOC HN

NO2

Cefalosporina cromognica

2
3

COOH

NH

1
S

6 NO2
5

4
NO2

cido cefalosporanico

Cefalosporina
acilada

(coloracin rojiza)

El desarrollo del color se le atribuye a la conjugacin del sustituyente dinitroestireno en la posicin 3

con el anillo -lactmico y el doble enlace en el anillo dihidrotiazina; caracterstica que puede ser
observada a 386 nm. Esta conjugacin hace altamente reactivo al anillo -lactmico, por lo que al ser
rpidamente hidrolizado por las -lactamasas la absorcin a 386 nm decrece y aparece uno nuevo a
482 nm113, 114
O
+
N

HOOC
O
S

O
NH

N
S

NO2

Conjugacin de la cefalosporina cromognica

En ocasiones, es necesario conocer, incluso antes del resultado de las pruebas de sensibilidad, si un
aislamiento produce enzimas -lactamasa, lo que contribuye a una correcta eleccin del
antimicrobiano. Pero para efecto de este proyecto se desea conocer si las cepas de estudio son

75

productoras de -lactamasa, para posteriormente ser utilizadas en el estudio de la actividad antibitica

de los compuestos sintetizados.

B) Procedimiento de la prueba.
La prueba de cefinasa se realiz usando el kit BD BBL, bajo los estndares del fabricante. (Beckton
Dickinson). Se tom de 2 a 3 colonias de cada cepa y se depositaron en los discos previamente
rehidratados con agua estril. El desarrollo de una coloracin roja al cabo de 1 a 5 minutos indica la
produccin de -lactamasas.

VI.5.4. Determinacin de la actividad potencial antibitica de las N-aril-espiro-lactamas: Prueba de susceptibilidad antimicrobiana.

A) Fundamento de la prueba.
Dentro del rea de investigacin se requiere evaluar la actividad antimicrobiana de nuevas molculas o
de las ya existentes frente a patgenos y determinar su capacidad bactericida. Las limitaciones que se
encuentran son la indisponibilidad de tcnicas normalizadas a pesar de las recientes revisiones del
CLSI121, ya que en estas pruebas influyen variables tales como: los mtodos de dilucin: medios de
cultivo, variaciones del medio elegido (lote, fabricante, etc.), iones, pH, inculo (fase de crecimiento y
tamao), incubacin (atmsfera, temperatura y tiempo, etc.). Es necesario utilizar el inculo en la fase
logartmica de crecimiento ya que los antibiticos -lactmicos, slo son bactericidas durante este
periodo, y el valor de la prueba se determina por el xito de su aplicacin en el laboratorio122.

B) Procedimiento de la prueba.
Se trabaj de acuerdo a los lineamientos de la CLSI, utilizando la tcnica de dilucin en medio lquido
(microplaca). Se utiliz Ampicilina trihidratada como antibitico de referencia; as mismo, las cepas
con las que se trabaj fueron: Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Escherichia coli ATCC 25922,
Escherichia coli ATCC 35218, y Escherichia coli DH10s. El intervalo de concentracin usado fue de

76

0.5-256 g/mL (4.9x10-6- 2.5x10-5 M) para la ampicilina trihidratada (AMP.3H2O), y para las espiro-lactamas, se tom en cuenta la relacin molar de la AMP.3H2O, trabajando en el mismo intervalo de
concentraciones. Se adicionaron 100 L del posillo No 1 al 10 de cada una de las concentraciones,
empezando de mayor a menor concentracin, en el posillo No. 11 se adicion 50 L del disolvente y
50 L de medio Mueller Hinton Caldo (MHB * ), como control positivo del creciemiento bacteriano, y
en el posillo No. 12 se adicionaron 200 L de MHB, como control negativo del crecimiento
bacteriano. Vase Figura 38.
Una vez que a las microplacas se les coloc las espiro--lactamas correspondientes y la ampicilina, se
dejaron a prueba de esterilidad por 24 h. Posteriormente, cada una de las cepas bacterianas se ajustaron
partir de un cultivo de 18 horas en solucin salina fisiolgica (ssf) hasta 0.5 unidades Mc Farland ** .
Del inculo estandarizado se realiz una dilucin 1:10000 con caldo Mueller-Hinton, y del cual se
adicionaron 100 L a cada posillo, exceptuando el posillo No. 12. Finalmente se incubaron las
microplacas a 28 C por 18 h. Esta tcnica se realiz por triplicado.

Figura 38. Disposicin de las microplacas para estudiar la actividad antibitica de los compuestos espiro-lactmicos.
*

Del ingls Muelle Hinton Broth

Lo que equivale a 1.5x104 clulas/mL

**

77

VI.5.5. Prueba de sinergismo.

A) Fundamento de la prueba.
En los aos 80, se crearon una nueva clase de antimicrobianos las oxmino cefalosporinas, como
tratamientos contra infecciones severas causadas por bacterias Gram-, sin embargo su uso provoc la
produccin de enzimas resistentes a estos antimicrobianos y debido a su amplio espectro de accin, se
les llam -lactamasas de espectro extendido (BLEE). Estas enzimas derivan de mutaciones de las lactamasas de amplio espectro (BLEA) presentes en la mayor parte de las Enterobacterias; tales como,
K. pneumoniae (predominantemente) y E. coli.
Las BLEE confieren resistencia a las bacterias contra cefalosporinas de tercera generacin, por
ejemplo Ceftazidima, Cefotaxima y Ceftriaxona, as como, a monobactmicos como el Aztreonam; sin
embargo, no afectan a cefalosporinas de segunda generacin como Cefamicinas, Cefoxitin, y
Cefotetan ni carbapenems como Imipenem y Meropenem. Actualmente, se han descrito alrededor de
150 de estas enzimas y se les ha encontrado en una variedad de gneros bacterianos de
Enterobacterias (E. coli y K. pneumoniae principalmente), Enterobacter spp, Salmonella spp, Proteus
spp, Citrobacter spp, Morganella morganii, Pseudomona aeruginosa, Burkholderia cepacia y
Capnocitophaga ochracea123.
El problema de las -lactamasas de espectro extendido es de magnitud mundial. Fue primero descrito
en Europa y posteriormente en Amrica y Asia. La prevalencia es muy variable de pas a pas y
tambin en diferentes hospitales. Es sabido que los pacientes que cursan con infecciones causadas por
organismos productores de BLEE presentan mayor riesgo de que falle el tratamiento antimicrobiano
usualmente utilizado. Las bacterias aisladas con este tipo de resistencia, se obtienen comnmente en:
unidades de cuidados intensivos, y servicios quirrgicos; as mismo, en pacientes que toman de
manera indiscriminada antibiticos de amplio espectro124. Por otro lado, los factores asociados a la
presencia de estas enzimas son: hospitalizacin prolongada, permanencia en unidades de cuidado
intensivo, intubacin endotraqueal, ventilacin mecnica, catter urinario, catter venoso, uso previo
de antibiticos, entre otros. En un principio los brotes fueron asociados a cepas productoras de un solo
tipo de -lactamasa, actualmente los brotes se asocian a cepas productoras de mltiples -lactamasas.
En nuestro pas; la deteccin de BLEE en las bacterias, an no ha sido incorporada como estudio
rutinario dentro del laboratorio de microbiologa en la mayora de los hospitales. El mtodo de

78

deteccin descrito en la CLSI125 para la deteccin de -lactamasas de espectro extendido es solo para
bacterias: Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Proteus mirabilis y Escherichia coli4. Para esta prueba
se utiliz la tcnica de difusin de disco y que permite detectar -lactamasas de espectro extendido
(BLEEs). Adems, los resultados se usaron para estudiar el efecto inhibitorio de los compuestos
sintetizado125.

A) Procedimiento de la prueba.
Para esta prueba, nicamente se utilizaron las cepas Klebsiella pneumoniae ATCC 700603,
Escherichia coli ATCC 25922, y Escherichia coli ATCC 35218, como lo marca la CLSI.
Primero, se ajust el inculo de cada una de las cepas de acuerdo al punto VI.5.4. apartado B, se
prosigui a la siembra masiva de cada una de las placas en el medio de cultivo MHA y posteriormente
se colocaron 3 sensidiscos de cefotaxima 30g (CTX) por placa (a una distancia de 20 mm entre cada
uno). En estos sensidiscos a uno se le adicion 10 L del clavulanato de potasio (CP), que
corresponden a 0.0042 mol del compuesto, a otro 10 L que contenan 0.0042 mol de la espiro-lactama, y el tercer sensidisco se utiliz solo, como control positivo. Adicionalmente se coloc un
sensidisco blanco sin antibitico y solo se le agreg 10 L de CP. Finalmente, las placas se incubaron
a 28 C por 18 h; este procedimiento se repiti 3 veces y posteriormente para la ceftazidima 30g
(CAZ) tambin se realiz tres veces.

79

VII.RESULTADOSYDISCUSIN
VII.1. Sntesis de las N-aril-espiro--lactamas.
La sntesis de las compuestos -espiro-lctamicos se realiz siguiendo la metodologa descrita
anteriormente los rendimiento obtenidos en las dos primeras reacciones son muy buenos (90%) y estn
de acuerdo con los reportados en la literatura. Finalmente utilizando la reaccin de Staudinger que
involucra la cicloadicin entre una cetena y una imina la cual incluye la insercin de un carbenoide, y
que es conocida tambin como una cicloadicin [2+2]. Se obtuvieron cuatro de los 5 compuestos espiro-lactmicos propuestos con rendimiento moderados (70%), como se muestra en la siguiente tabla:
R

R
O

R
O

anhdrido malico

Cl

THF/ 0C
12 h

DCC, CH 2 Cl 2 / 0C

NH

12 h

(2)

(1)

Cl

-78C

OH

anilina para sustituda.

CH 2Cl 2, NEt 3

NH2

Cl

"
Cl

"

C
H

(3)

Compuesto

Tabla 5. Resultados de los compuestos sintetizados.

Maleamida
Rendimiento
%
(1)

Punto de
fusin
(C)

Isomaleimida
Rendimiento
%
(2)

Punto
de
fusin
(C)

Espiro--lactama
Rendimiento
%
(3)

Punto de
fusin
(C)

-OMe

99

189-190

99

72-73

74

128-130

b
c
d
e

-H
-F
-Cl
-NO2

98
94
92
95

204-205
210-212
198-200
194-195

97
85
85
28

60-62
74-76
92-94
94-96

75
72
65
X

132-133
132-133
127-129
X

80

VII.1.1. Caracterizacin de los cidos p-X-fenilmalemicos. (1a-1e).

En la sntesis de las aril maleimidas aunque es una reaccin muy noble, para que proceda con buenos
rendimientos, es necesario utilizar condiciones anhidras, y para no tener subproductos se necesita
hacerla la adicin lenta y a baja temperatura. Todas las maleamidas sintetizadas son compuestos
coloridos unas de color crema y otras amarillas esto se debe a que son derivadas de anilinas y adems
tienen sustituyentes como el -NO2 y OCH3 que les confieren mayor coloracin. Los puntos de fusin
coinciden con los reportados en la literatura99, 100
Con la finalidad de hacer una adecuada identificacin de estos cinco compuestos, se realiz, una
comparacin de sus espectros de infrarrojo (IR). Vase tabla 6

Tabla 6. Identificacin por espectroscopia de IR de los cidos p-X-fenilmalemicos.

O

Compuesto

CH3

O
O

OH

NH

NH

OH

OH

1a

1b

1c

1d

1e

(cm-1)

(cm-1)

(cm-1)

(cm-1)

(cm-1)

2613

2579

2544

-OH

2500

-CH3, -CH2-CO- cido

-CO- amida
-NHCO-C-O-C- ter
-C-NO2
-C-F
-C-Cl

2921
1701
1624
3258
1240
------------3071, 3017,
1624

-C=C- vinil

NH

OH

No.
de onda

NH

NH
OH

Grupo
funcional

Cl

Aromticos

1556, 1503,
1399

sustitucin para

No se
aprecia

2680, 2613,
2535
----1701
1632
3274
----------------No se
aprecian
3028, 1586,
1537, 1488,
1544
2240, 2071,
1963

--------1701
1701
1635
1634
3224
3235
----------------1227
--------1100
3079, 1635, 3079, 1635,
624
624

----1707
1637
3294
----1508, 1334
--------3090, 3031

1515, 1407, 1515, 1407,

828
828

3031, 1561,
1508, 1454

2243, 1888

1920, 1883,
1804

2243, 1888

81

Donde podemos observar las bandas de vibraciones caractersticas para cada una de las maleamidas,
por ejemplo la banda de absorcin que se observa nicamente en la maleamida 1a es la correspondiente
al grupo ter (1240 cm-1), para las maleamidas 1c, 1d y 1e las bandas de absorcin caractersticas de los
sustituyentes en posicin para corresponden a 1227 (C-F) y 1100 (C-Cl), 1508 y 1334 cm-1 (NO2)
respectivamente. Un aspecto importante es la identificacin de las bandas de los carbonos carbonilo de
cido y amida presentes en las cinco molculas, las cuales aparecen a 1700 y 1630 cm-1
respectivamente. En relacin a la caracterizacin por RMN de 1H y 13C de estos compuestos debido a
que son muy polares, se adquirieron todos utilizando dimetilsulfxido deuteado Vase tabla 7.

Tabla 7. Desplazamientos qumicos (ppm) RMN de 1H y 13C para los cidos p-X-fenilmalemicos
en DMSO d6 (270 MHz).
F

CH3

O
5

1
2
3
4
1
2 y 6
3 y 5
4
-NH
-OCH3
-NO2

1b

1a
H
(ppm)
(J Hz)
----6.48 d
(12.12)
6.30 d
(12.12)
--------6.89 d
(8.91)
7.55 d
(8.91)

13

C
(ppm)
167.13
132.26
131.82
163.54
131.66

H
(ppm)
(J Hz)
----6.50 d
(12.00)
6.32 d
(12.12)
--------7.65 d
(8.29)

1d

1c
13

C
(ppm)
167.42
139.03
132.38
163.90
131.08

H
(ppm)
(J Hz)
----6.22 d
(12.00)
6.47 d
(12.00)
--------7.01 m
(8.29)

13

C
(ppm)
166.94
131.5
132.34

NH

OH

OH
3

2
1

NH

NH

H
(ppm)
(J Hz)
----6.31 d
(12.00)
6.47 d
(12.00)
--------7.66 d
(8.41)
7.36 d
(8.54)

163.79
134.99
122.07
114.51
129.37
(7.8)
115.74
121.91 7.32 t 120.19 7.61 t
(22.32)
159.12
----- 156.51 7.08 t 124.53 --------(241.8)
10.45 s ----- 10.44 s ----- 10.62 s ----- 10.49 s
3.70 s 55.68
-------------------------------------------------

N
4

OH
3
2

OH

NH

OH

Posicin

NH

2
1

Compuesto

Cl

13

C
(ppm)
163.94
130.83
132.27
167.43
128.03
121.59
129.26

1e
H
13C
(ppm)
(ppm)
(J Hz)
----- 167.41
6.51 d
132.26
(12.00)
6.34 d
142.98
(11.88)
----- 164.44
----- 130.77
7.84 d
119.60
(9.15)
8.19 d
125.48
(9.15)

138.09

-----

145.42

-------------

10.85 s
-----

-------------

s = seal simple; d = seal doble; m = seal mltiple; J= constante de acoplamiento; = desplazamiento

qumico.

82

Las seales y desplazamientos qumicos de las posiciones 1, 2, 3 y 4 son constantes para los espectros
de 1H y 13C, ya que en esta porcin de la molcula no se ve afectada por el sustituyente en el anillo
aromtico. Las seales correspondientes a los protones vinlicos dan una seal doble para cada protn
ya que es un sistema acoplado, cuya constante es de J 12.00 Hz.
En el anillo aromtico la diferencia ms importante de sealar es en 1c debido a que el tomo de flor
tiene un spin de y como su frecuencia de resonancia (254.21 MHz) es diferente a la del protn, se
observa el acoplamiento de este con los protones vecinos generando una seal mltiple que aparece en

7 ppm en el espectro. Este particularidad tambin se observa en el espectro de

13

C y como

consecuencia de la presencia del flor sobre los tomos de carbono del anillo aromtico, se genera un
acoplamiento con estos, y el valor de su constante de acoplamiento es muy grande J1C-F 240 a 272 Hz
a un enlace, y J2C-F 20 a 27 Hz a dos enlaces, de J3C-F 8 a 10 Hz a tres enlaces lo cual es muy
inusual.
Por otro lado, el compuesto 1d presenta una seal simple que integra para 3 protones en 3.70 ppm, que
corresponde a los hidrgenos del grupo metilo.
As mismo en 13C para el anillo aromtico, las diferencias radican en las posiciones 3, 4 y 5 segn el
el sustituyente que tengan. El compuesto 1a presenta una seal adicional de carbono a 55.68 ppm que
corresponde al carbono del grupo OMe.

83

VII.1.2. Caracterizacin de las p-X-fenilisomaleimidas. (2a-2e).

En cuanto a la isomaleimidas, se puede apreciar que su punto de fusin disminuy significativamente
(62-94 C) y que los 5 compuestos son menos polares debido a que ya no se tiene el grupo cido se
convirti en un ster cclico, y el nitrgeno de la amida tiene ahora un doble enlace, y estos datos
concuerdan con los reportado en la literatura98, 99, 108.
En relacin a la formacin del derivado 2e (p-NO2-isomaleimida) se obtuvo un rendimiento de 28.68%
debido a la naturaleza del sustituyente nitro (NO2) que debilita el ataque nucleoflico del oxgeno del
carbonilo de la amida al carbonilo del cido en la formacin del ciclo.
As mismo la identificacin de los compuestos se realiz por espectroscopia de infrarrojo, los datos se
presentan en la tabla 8.
La principal diferencia que se aprecia en las cinco fenilisomaleimidas es la banda que esta alrededor de
1780-1800 cm-1 y que corresponde a las vibraciones del carbonilo del ster cclico (ster) presente en la
molcula, y la aparicin de otra banda que es caracterstica del grupo imina la cual se aprecia
claramente en los compuestos 1c-1d.
En relacin a la caracterizacin por RMN 1H y

13

C de estos compuestos, se analizaron de forma

comparativa con sus correspondientes -lactamas, con excepcin del compuesto 1d el cual debido
probablemente al efecto inductivo del grupo NO2, no fue posible obtener su correspondiente beta
lactama.

84

Tabla 8. Identificacin por espectroscopia de IR de las p-X-fenilisomaleimidas.

O

CH3

Compuesto

Cl

O
O

2a

O
O

2b

2c

2d

2e

(cm-1)

(cm-1)

(cm-1)

(cm-1)

(cm-1)

-CH3, -CH2-

2928

-----

-----

-----

-----

-CO- lactona, ster

1788, 1715

1784

1794

1799.78

1801

-C-O-C- ter

1262

-----

-----

-----

-----

-N=C- imina

No se aprecia

No se aprecia

1635

1678

1686

-C-NO2

-----

-----

-----

-----

1346

-C-Cl

-----

-----

-----

1079

-----

-C-F

-----

-----

1233

-----

-----

-C=C- vinil

1659

3085, 1669

3082, 624

3056, 626

3109. 3054

3061, 1591, 1563,

1567, 1482,

1508, 852,

3079, 1575,

1598, 1522,

1502, 1454

1446

828

1433, 825

1392

No se aprecia

1964, 1899

1227

1824

No. de onda
Grupo funcional

Aromticos
sustitucin para

No se
aprecia

85

VII.1.3. Caracterizacin de las espiro-p-R-fenil--lactamas. (3a-3d).

Finalmente, mediante la reaccin de Staudinger solo se obtuvieron cuatro de las 5 espiro beta lactamas
propuestas, los rendimientos fueron buenos ya que son mayores al 65%, y los puntos de fusin de (3a,
3b,) coinciden con los reportados en la literatura108, 111. Las dos nuevas N-aril-espiro- lactamas 3d y
3e; adems de realizar su caracterizacin por medio de tcnicas espectroscpicas: RMN de 1H y 13C, e
infrarrojo y espectrometra de masas, se le determino su configuracin relativa mediante un estudio de
difraccin de rayos X, de la N-p-F-fenil-espiro -lactama .
En la tabla 9 muestro el comparativo de las bandas de absorcin caractersticos de las cuatro espiro-lactama sintetizadas. La principal caracterstica de los cuatro espiro--lactamas (3a-3d) sintetizadas es
que la banda del grupo funcional imina de las isomaleimidas desaparece dando paso a la banda de la
amida cclica de 4 miembros (3105 cm-1).
Las bandas de los anillos aromticos, los carbonos vinlicos, los carbono carbonilos de la lactona,
permanecen casi constantes, aunque la presencia del cloro de la -lactama influye principalmente en el
anillo de cinco miembros (lactona).

86

Tabla 9. Identificacin por espectroscopa de IR de las espiro-p-R-fenil--lactamas.

CH3
O

Compuesto

Cl

N
Cl

Cl

3a

Cl

(cm-1)

3b
(cm-1)

3c
(cm-1)

3d
(cm-1)

1770
1809
1249
703
3435
--------3089, 589
2936, 819
1249

1775
1775
----762
3442
--------3088, 2985
1498, 831
1380

1778
1778
----701
3547
1233
----3105, 629
1508, 827
1233

1780
1780
----816
3547
----824
3108, 674
1494, 824
1220

No. de onda
Grupo funcional
-CO- lactona, ster
-CO- lactama
-C-O-C- ter
-C-Cl lactama
-lactama (anillo de tomos)
-F
-Cl
-C=C- vinil
Aromticos
sustitucin para

Cl

Para la comparacin de los datos de RMN de 1H y 13C de (2a-3d) y (3a-3d) vase Tablas 10 y 11

Tabla 10. Desplazamientos qumicos (ppm) RMN de1H para las p-X-fenilisomaleimidas y
espiro-p-R-fenil--lactamas.
R

4
3

-OMe

-H

-F

-Cl

-NO2

Cl
H

(ppm)CDCl3
(J Hz)
H-C(2)
H-C(3)
7.29 d
6.54 d
(5.44)
(5.44)
6.66 d
7.34-739 m
(5.44)
7.36 d
6.66 d
(5.44)
(5.69)
7.37 d
6.68 d
(5.44)
(5.44)
7.43 d
6.78d
(5.69)
(5.69)

O5

O
1

Compuesto

H-C(3)

(ppm)
(J Hz)
H-C(7)

H-C(8)

5.32 s

6.54 d

7.57 d

5.31 s

6.55 d

7.58 d

5.32 s

6.57 d
(5.57)

5.32 s

6.58 d

7.56 d
(5.69)
7.56 d
(5.69)

87

Tabla 11. Desplazamientos qumicos (ppm) RMN de13C para las p-X-fenilisomaleimidas y espiro-p-R-fenil--lactamas.
CH3
O

CH3

Compuesto

8
1
2

2a

2
3

O5

3a

Cl

1
4

2
3

O5

1
6

4
2

Cl

5
2

4
3

3b

Posicin

ppm

ppm

ppm

ppm

1
2
3
4
5
6
7
8
1
2 y 6
3 y 5

167.70
126.65
143.52
148.52
----------------136.54
114.32
128.42

----158.28
64.58
96.62
-----167.62
127.79
149.81
127.37
120.97
114.76

167.25
128.01
143.29
150.20
----------------143.57
129.07
125.18

----157.77
64.66
94.34
----167.53
127.89
149.93
134.84
118.46
129.61

159.37

157.71

127.45

126.73

-OCH3

55.50

55.52

-----

-----

8
1
2

1
6

Cl

2b

Cl

Cl

4
3

1
2

2c

3c

Ppm
(JC-F)
167.17
127.84
143.42
149.86
----------------139.62
127.76
116.01
161.70
(249.11)
-----

Ppm
(JC-F)
----157.80
64.79
96.49
----167.45
128.10
149.69
130.77
120.79
116.69
160.78
(248.09)
-----

O
O

2
3

O5

1
6

O5

Cl
H

3
2

6
1

2d

3d

2e

ppm

ppm

ppm

166.92
128.13
143.25
150.50
----------------133.23
126.81
129.25

----157.73
64.83
96.32
----167.34
128.14
149.71
132.27
119.77
129.84

165.94
129.68
142.47
152.44
----------------134.54
123.99
124.25

141.99

133.32

145.01

-----

-----

----

88

Se observa que los desplazamientos entre 5.31 y 5.32 ppm una seal simple que corresponde al
hidrgeno al carbonilo de las -lactamas. As mismo, se observan dos seales dobles a 6.54 y 7.58
ppm con una constante de acoplamiento de 5.69 Hz, lo que describe el acoplamiento entre los
hidrgenos de los carbonos vinlicos. En cuanto a los protones del anillo aromtico sus seales casi
no cambian.
Es importante sealar que aunque cambia el entorno qumico de los protones vinlicos, en las cuatro
molculas 3a-3d el desplazamiento de la seal doble que tiene una constante de acoplamiento
caracterstica para este tipo de Hidrgenos de J 12.00 Hz, no varia prcticamente.
Una evidencia adicional de la formacin de las espiro-p-X-fenil--lactama a travs de RMN 13C, son
las seales del carbono carbonilo (NCO) y del metileno (CHCl) provenientes de la cetena las cuales,
se observan en estas molculas a 157 ppm y 62 ppm respectivamente.
Es importante sealar que para el compuesto 3c, las seales de los carbonos aromticos aparecen en
160.78 ppm y tiene una J1C-F = 241.84 Hz debido al acoplamiento con el tomo de flur, en 115.75
ppm con una J2C-F = 22.32 Hz a dos enlaces, y a 122.1 ppm con una J3C-F = 7.79 Hz a tres enlaces.
En la espectroscopa de masas para el compuesto 3c se determin el in molecular de 267.5 m/z y en
138 m/z el pico padre correspondiente al fragmento ms estable. Vase Figura 38 y anexos 15
M= 109 m/z

M= 267.5

N
F

O
N

M= 190 m/z
F

O
F

Cl

M= 146 m/z

M= 138 m/z

Figura 38. Fragmentacin de la N-p-F-fenil-espiro--lactama por EM.

89

Para el compuesto 1d se determin el in molecular de 285 m/z y en 137 m/z el pico padre
correspondiente al fragmento ms estable. Vase Figura 39 y anexos 24

M= 127 m/z

Cl

M= 285

N
Cl

O
N

M=208 m/z
Cl

O
Cl

Cl

M= 138 m/z

Cl

M= 160 m/z

Figura 39. Fragmentacin de la espiro-p-Cl-fenil--lactama por EM.

VII.1.4. Estudio de difraccin de rayos X para la N-p-F-fenil-espiro--lactama

3c.
Se obtuvieron cristales adecuados para realizar este estudio. La estructura del cristal del
compuesto comprende una celda unitaria monoclnica en un grupo espacial de P21/c con las
siguientes dimensiones a = 19.346(2), b = 8.160(1) c = 16.262(2), =90,
=114.812(2) y =90. El volumen de la celda unitaria es de 2330.28 (5) 3 y se
encuentran 8 molculas en cada celda unitaria.
Mediante la determinacin en estado slido de este compuesto 3c adems de corroborar que
si se tiene la estructura propuesta, se determin la configuracin relativa de estas
molculas, ya que se observa la relacin que guardan el anillo de la beta lactama con el
anillo de la lactona , insaturada los cuales se encuentran fusionados, observndose que el

90

tomo de cloro se encuentra del lado opuesto al tomo de oxigeno del anillo de la lactona
, insaturada.
VII.2 Optimizacin geomtrica de la N-p-F-fenil-espiro--lactama (3c).
La optimizacin de la p-espiro-F-fenil--lactama se llev a cabo con el programa Spartan Pro 06
V102 a nivel HF/6-31G. En la optimizacin de la geometra del compuesto N-p-F-fenil-espiro-lactama (3c),

el confrmero ms estable que se obtuvo fue el muy similar al que se obtuvo en el

estudio de difraccin de rayos X, con una energa de optimizacin de -809248.026 kcal/mol. Se

determinaron los ngulos dihedros obtenidos con este confrmero, se midi los ngulos de enlace y
las distancias de enlace, con el fin de evaluarlos con los obtenidos de la estructura de Rayos X.
Vase tabla 12

Tabla 12. ngulos diedros de la p-espiro-F--lactama.

Grados []
tomos
Difraccin de Rayos X Modelado Molecular
C10-C9-N1-C2
-51.8 (4)
-50.8
C14- C9-N1-C4
-60.0 (3)
-57.4
Cl1-C3-C4-O5
-126.75 (19)
-120.13
Cl1-C3-C4-C8
-0.6 (3)
8.92

91

Estos datos permitieron comparar la geometra de la -lactama cuando se encuentra en el vaco

(tiene movimiento), y cuando se encuentra fija.
En cuanto a la distancia de enlace, los carbonos carbonilo tanto de la lactona como de la -lactama
tienen una distancia ms corta que lo usual (1.18 y 1.20 , respectivamente), mostrando el carcter
de doble enlace. Por otro lado la distancia de enlace del C9-N1 es de 1.42 , el cual es consistente
con los dobles enlaces de N=C. Vase tabla 13

Tabla 13. Distancias de enlaces de la p-espiro-F--lactama. (3c)

Amstrongs[]
tomos
F1-C12
N1-C9
N1-C2
C2-C3
C3-C4
C4-N1
O5-C4
C4-C8
Cl1-C3
C6-O6
C2-O2

Difraccin de Rayos X
1.358 (3)
1.428 (3)
1.362 (3)
1.530 (3)
1.546 (3)
1.460 (3)
1.419 (3)
1.485 (3)
1.762 (3)
1.181 (3)
1.205 (3)

Modelado Molecular
1.358
1.404
1.384
1.540
1.561
1.456
1.424
1.507
1.765
1.188
1.195

92

VII.3 Pruebas Microbiolgicas

VII.3.1 Evaluacin de la produccin de lactamasas
Una reaccin positiva de la prueba de sefinasa nos da un cambio de color amarillo a rojo en el rea
en la que se aplic el cultivo. Un resultado negativo de esta prueba, se observa cuando no hay
cambio de color en el disco. En la mayora de las cepas, el resultado positivo apareci en menos de 5
min. A continuacin se muestran los resltados. Vase tabla 14

Tabla 14. Prueba Cefinasa: identificacin de

microorganismos productores de -lactamasa.
Microorganismo
Staphylococcus aureus
(ATCC 25923)
Escherichia coli
(ATCC 25923)
Escherichia coli
(DH10S)
Escherichia coli
(ATCC 25923)
Aeromonas hydrophila
(ATCC 25923)
Pseudomonas aeruginosa
(ATCC 25923)
Klebsiella pneumoniae
(ATCC 25923)

Bacteria
Gram

Desarrollo de
color

Positiva

Negativa

Negativa

Negativa

Negativa

Negativa

Negativa

El resultado de la reaccin de esta prueba se obtuvo dentro de los primeros 10 minutos, lo cual esta
de acuerdo con la norma, ya que puede dar falsos positivos si la respuesta se obtiene despus de ese
tiempo. Se observ el desarrollo del color en el disco para K. pneumoniae, P. aeruginosa y A.
hydrophila indicando su resistencia a penicilinas y cefalosporinas principalmente. En cuanto a las
cepas de E. coli y S. aureus desarrollaron un color rojizo muy claro por lo que la prueba para estas
cepas no es confiable; sin embargo, debido a que las cepas que se usaron en este trabajo son de
control de calidad, se sabe que no son productoras de -lactamasas. Se requiri de estudios
confirmatorios para determinar su sensibilidad a los antibiticos -lactmicos, los cuales se
realizaron a la par con las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana que se realizaron en este
trabajo.

93

Cabe mencionar que las cepas que se utilizaron para las subsecuentes pruebas microbiolgicas
fueron K. pneumoniae ATTCC700603, E.coli ATCC25922, ATCC35218, y DH10sensible (DH10s) y S.
aureus ATCC25923, ya que son las que recomienda la CLSI con el conocimiento de que estas cepas
su principal mecanismo de resistencia es la produccin de -lactamasas. Vase ANEXOS.

VII.3.2 Evaluacin de la actividad potencial antibitica de las espiro--lactamas.

Las condiciones que se usaron para evaluar la actividad antimicrobiana de las espiro -lactamas
sintetizadas se tomaron de la CLSI; as mismo, el antibitico de referencia usado (ampicilina
trihidrata) se trabaj bajo estas mismas condiciones y la tcnica empleada fue la de difusin en
medio lquido.
Debido a la naturaleza qumica de las espiro -lactamas sintetizadas, estas no son solubles en
soluciones acuosas, por lo que las soluciones stock se disolvieron con DMSO puro, y conforme se
hicieron las diluciones necesarias con el medio de cultivo Mueller Hinton caldo (MHB), quedando el
DMSO a una concentracin final del 1%. Por otro lado, la solucin stock de la ampicilina
trihidritada se realiz con un buffer de fosfatos 0.1M a pH= 7.5 y posteriormente las diluciones se
realizaron con el medio de cultivo MHB. El uso del disolvente DMSO esta permitido por la CLSI.
Tomando como referencia a la ampicilina, el intervalo de concentracin que se trabajo fue de 0.1258 g/mL (5.73x10-2 M), y su relacin molar se tom como base para trabajar con las respectivas
espiro--lactamas. Para establecer la actividad de los compuestos sobre las cepas bacterianas, se
consider la concentracin mnima inhibitoria (CMI) establecida por la CLSI, y en la cual se muestra
en la tabla 15

Tabla 15. Criterios establecidos por la CLSI para

las pruebas de susceptibilidad en medio lquido.
CMI*
(g/mL)

Interpretacin de la prueba

32

Cepa resistente

16

Intermedio (se repite la prueba)

Cepa sensible

*CMI= Concentracin mnima inhibitoria para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana realizadas en

caldo Mueller Hinton.

94

La CMI de la ampicilina observada en las microplacas, para las tres cepas de E. coli, fue de 4 g/mL
y para la cepa de K. pneumoniae fue de 32 g/mL. Con estos resultados se concluyen dos aspectos
importantes, el primero es que la ampicilina inhibe a las PBPs en las cepas de E. coli y por otro lado
las cepas de K. pneumoniae producen -lactamasa, las cuales abren al anillo -lactmico de la
ampicilina impidiendo su accin sobre las PBPs, por lo que se requiere mayor concentracin del
antibitico para inhibir el crecimiento bacteriano.
En cuanto a las espiro--lactamas sintetizadas ninguna inhibi el crecimiento bacteriano (esta prueba
se repiti 6 veces y se reprodujo 3 veces), ni sensibiliz a las bacterias productoras de -lactamasa
(K.pneumoniae). Vase fotos en ANEXOS.
Debido a la falta de respuesta por parte de las espiro -lactamas sintetizadas se prosigui a la prueba
de sinergismo.

VII.3.3 Prueba de Sinergismo.

Siguiendo la metodologa descrita por la CLSI, se determin si las espiro -lactamas sintetizadas
podan tener actividad como inhibidores de las -lactamasas. La tcnica empleada fue difusin en
agar y los antibiticos de referencia usadas fueron Ceftazidima (CAZ) y Cefotaxima (CTX) a una
concentracin de 30 g. Para lo cual, se utilizaron sensidiscos comerciales (co. Beckton Dickinson),
impregnados con el respectivo antibitico.
El inhibidor de referencia utilizado fue el cido clavulnico (establecido por la CLSI) a una
concentracin de 10 g (4.2 x10-8 mol), se utiliz la relacin molar para preparar las respectivas
espiro -lactamas. Los criterios utilizados para determinar la actividad de los compuestos son los
establecidos por la CLSI.
Cuando el halo de inhibicin de la CTX es 27 mm y de la CAZ es 22mm, posiblemente se trata
de una cepa productora de -lactamasa de espectro extendido. Para corroborar estos datos, la
combinacin de CTX/AC y CAZ/AC debe de incrementar la zona de inhibicin 5 mm o ms para las
bacterias E.coli, y 3 mm para la bacteria K. pneumoniae.

95

Debido a que las BLEEs son sensibles a la combinacin de ceftazidima-cido clavulnico y

cefotaxima-cido-clavulnico se usaron como parmetros de control, por su efecto sinrgico entre el
inhibidor y el antibitico -lactmico. Este parmetro nos permiti comparar la respuesta sinrgica
de las espiro -lactamas sintetizadas. Teniendo como antecedentes los resultados que arroj la
pruebade cefinasa y la prueba de sensibilidad antimicrobiana por difusin en disco, las 3 cepas de E.
coli que estudiadas no producan -lactamasas. Tambin es conocido que el AC no tiene actividad
antibitica per se, por lo que se esperaba que no hubiera aumento del halo de inhibicin con la
combinacin Antibitico/AC. Esto se corrobor con las placas obtenidas, donde se observ que
efectivamente no haba aumento del halo de inhibicin, y el halo observado era debido a la
actividad del antibitico CTX o CAZ sobre las PBPs, pero tambin se corrobor que efectivamente
las espiro--lactamas sintetizadas no tuvieron actividad sobre las PBP`s, ni sobre las -lactamasas.
Como no se observ actividad sobre las PBPs ni las -lactamasas, se sac los espectro de RMN de
1

H de las espiro -lactamas para determinar si los compuestos se hidrolizaban al contacto con el agua

(MHB) o por almacenamiento en DMSO (ya que absorbe agua del medio) por periodos prolongados
(meses). Los espectro se determinaron con DMSO y se observaron las seales correspondientes a las
espiro -lactamas, aunque los desplazamiento fueron diferentes debido al disolvente usado como se
muestra en la tabla 16.

Tabla 16. Comparacin de losdesplazamiento qumico de las

N-p-espiro--lactamas en diferentes solventes.
H-C(3)
CDCH3

H-C(3)
DMSO

5.32 s
5.31 s
5.32 s
5.32 s

6.03s
6.07 s
6.06 s
6.08 s

Lo anterior comprueba que los compuestos sintetizados simplemente no tienen actividad

antimicrobiana per se, aunque se sugiere realizar pruebas enzimticas sobre las PBPs y las lactamasas para estudiar a fondo la falta de actividad sobre las bacterias.

96

VIII.CONCLUSIONES.
1.

La sntesis de las maleamidas se llev a cabo con rendimientos mayores al 90%.

2.

La sntesis de las isomaleimidas fue exitosa y los rendimientos obtenidos fueron mayores
del 80%.

3.

Utilizando la metodologa descrita por Staudinger se realizo la sntesis de cuatro (3A, 3B,
3E, 3F) -lactamas monociclicas con rendimientos mayores a 60%.

4.

El rendimiento global obtenido en la sntesis de las cuatro -lactamas monociclicas

propuestas fue mayor al 70%.

5.

Fue posible obtener cristales adecuados de la p-F--lactama (3B) es decir, la [3-cloro-1-(4fluoro-fenil)-5-oxa-1-aza-espiro[3,4]oct-7-eno-2,6-diona] por lo que, se pudo realizar su
estudio de difraccin de Rayos X, con el cual adems de corroborar la estructura propuesta,
se determino la configuracin relativa de las -lactamas obtenidas.

6.

La identificacin y caracterizacin de todos los compuestos sintetizados estuvo de acuerdo

a lo esperado.

7.

Se realiz la optimizacin de la geometra de la p-espiro-F-fenil--lactama con el programa

Spartan Pro 06 V102 a nivel HF/6-31G, el confrmero ms estable que se obtuvo fue muy
similar al obtenido por el estudio de difraccin de rayos X.

8.

Se hizo una comparacin de algunos ngulos diedros con los obtenidos de la estructura de
Rayos X y estos son prcticamente los mismos.

9.

Se determin que las cepas de Escherichia coli ATCC25922, Escherichia coli ATCC35218,
Escherichia coli DH10b sensible (DH10bs) y Staphylococcus aureus ATCC 29213 no son
productoras de -lactamasa, pero las cepas de Aeromona hydrophila ATCC 7966,
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Pseudomonas aeruginosas ATCC 27852 s son
productoras de -lactamasas.

10.

Las condiciones utilizadas para las pruebas microbiolgicas correspondientes fueron

aquellas que establece la CLSI.

11. El intervalo de concentraciones que se utiliz para estudiar la actividad antibitica de las
espiro--lactamas sintetizadas fue de 0.5-256 g/mL; sin embargo, se hizo un pequeo
estudio a concentraciones mayores y no se observ respuesta bactericida.
12.

Para las cepas no productoras de -lactamasas la CMI de la ampicilina trihidratada fue de 4

g/mL, y para la cepa productora de -lactamasas la CMI fue de 32 g/mL

97

13.

Debido a la falta de la actividad como inhibidores de las PBPs de los compuestos

sintetizados, se prosigui al estudio de la actividad inhibitoria de las enzimas -lactamasas.

14. Para las cepas sensibles el halo de inhibicin observado se debe nicamente a la actividad
del antibitico correspondiente (CTX CAZ).
15.

Se corrobor que el AC no tiene actividad antibitica, sobre las cepas sensibles.

16.

El AC tiene actividad sobre las enzimas -lactamasas y en combinacin con el Antibitico

se logr sensibilizar a las bacterias resistentes (K.pneumoniae ATCC700603).

17. Las N-aril-espiro--lactamas no mostraron actividad antibacteriana an en combinacin con

el antibitico CTX o CAZ.
18.

Las N-aril-espiro--lactamas no mostraron actividad inhibitoria de las -lactamasas.

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Garca R. J. A. Mtodos Especiales para el Estudio de la Sensibilidad a los

Antimicrobianos. Procedimientos en Microbiologa Clnica Recomendaciones de la
Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica (2001)

107

X.ANEXOS
X.1. Espectros.

CH3

O
O

1. Espectro de RMN de 1H de la p-OMe-fenilisomaleimida.

108

CH3
O

O
Cl
O

2. Espectro de Infrarrojo de la espiro-p-OMe-fenil--lactama.

109

NH
O
OH

3. Espectro de RMN de 1H de la p-fenilmaleamida

110

NH
O
OH

4. Espectro de RMN de 13C de la p-fenilmaleamida

111

O
Cl
O

5. Espectro de Infrarrojo de la espiro-p-fenil--lactama.

112

O
Cl
O

6. Espectro de RMN de 1H de la espiro-p-fenil--lactama.

113

7. Espectro de Infrarrojo del cido p-F-fenilmalemico.

114

8. Espectro de RMN de 13C del cido p-F-fenilmalemico

115

N
O
O

9. Espectro de Infrarrojo de la p-F-fenilisomaleimida

116

J1C-F= 249.11 Hz
F
4
3

5
6

2
1

O
O

4
1
3
2

10. Espectro de RMN de 13C de la p-F-fenilisomaleimida

117

O
N
Cl
O

11. Espectro de Infrarrojo de la espiro-p-F-fenil--lactama.

118

O
Cl
O

12. Espectro de RMN de 1H de la espiro-p-F-fenil--lactama.

119

O
Cl
O

13. Espectro de RMN de 13C de la espiro-p-F-fenil--lactama.

120

O
H

Cl

14. Espectro Masas de la espiro-p-F-fenil--lactama.

121

O
H

Cl

15. Difraccin de rayos X de la espiro-p-F-fenil--lactama.

122

Cl

NH
O
OH

16. Espectro de RMN de 1H de la p-Cl-fenilmaleamida

123

Cl

NH
O
OH

17. Espectro de RMN de 13C de la p-Cl-fenilmaleamida

124

Cl

O
O

18. Espectro de Infrarrojo de la p-Cl-fenilisomaleimida.

125

Cl

O
O

19. Espectro de RMN de 13C de la p-Cl-fenilisomaleimida.

126

20. Espectro de Infrarrojo de la espiro-p-Cl-fenil--lactama.

127

Cl

O
Cl
O

21. Espectro de RMN de 1H de la espiro-p-Cl-fenil--lactama.

128

Cl

O
Cl
O

22. Espectro de RMN de 13C de la espiro-p-Cl-fenil--lactama.

129

Cl

O
Cl
O

23. Espectro Masas de la espiro-p-Cl-fenil--lactama.

130

NO 2

NH
O
OH

24. Espectro de RMN de 1H del cido p-NO2-fenilmalemico

131

NO 2

NH
O
OH

25. Espectro de RMN de 13C del cido p-NO2-fenilmalemico

132

NO2

O
O

26. Espectro de RMN de 1H de la p-NO2-fenilisomaleimida.

133

X.2. Fotos
X.2.1.Prueba de Cefinase.

Fotografa 1. Resultados obtenidos en la prueba de cefinase, de las

distintas cepas utilizadas.

134

XI. 2.2. Evaluacin de la actividad potencial antibitica de las espiro-lactamas en microplacas.

Fotografa 2. Estudio de la susceptibilidad antimicrobiana con a) ampicilina (AMP) como

antibitico de referencia, y b) DMSO al 1%.

135

Fotografa 3. Estudio de la susceptibilidad antimicrobiana de las espiro-p-R-fenil--lactamas.

136

X. 2.3. Prueba de Sinergismo en placa.

70 %

40 %

70 %

40 %

60 %
20 %

60 %
20 %

70 %
40 %

60 %
20 %

Fotografa 4. Estudio de la actividad del DMSO a diferentes concentraciones sobre las diferentes
cepas bacterianas.

137

E. coli ATCC 25922

4

-F

-OMe

E. coli ATCC 35218

-Cl

-H

K.pneumoniae ATCC 700603

3
2

-F

-OMe

Fotografa 5 Estudio de la actividad sinrgica del 1) antibitico cefotaxima (CTX) ms clavulanato

de potasio y 2) antibitico cefotaxima ms las espiro-p-R-fenil--lactamas. Usando como testigos 3)
clavulanato de potasio y 4). CTX sin combinar.

138

E. coli ATCC 25922

-Cl

-H

E. coli ATCC 35218

3

2
-OMe

-F

K.pneumoniae ATCC 700603

4

3
4

2
1

-Cl

2
-OMe

Fotografa 6. Estudio de la actividad sinrgica del 1) antibitico ceftazidima (CAZ) ms clavulanato

de potasio y 2) antibitico ceftazidima ms las espiro-p-R-fenil--lactamas. Usando como testigos 3)
clavulanato de potasio y 4). CAZ sin combinar.

139