Espectrofotometra: Cuantificacin.

Introduccin

La espectrofotometra es una tcnica analtica basada en la capacidad que

posee la materia para absorber luz y as identificar o cuantificar sustancias
qumicas entre ellas las protenas. La cantidad de luz absorbida se denomina
absorbancia y es medida por un espectrofotmetro. La ley de Lambert-BeerBouguer permite relacionar la concentracin con la absorbancia, en la
siguiente ecuacin:

A=cb
En donde A es la absorbancia (parmetro adimensional, que se puede
escribir con unidades de absorbancia u.a.); c es la concentracin de la
sustancia, generalmente en molaridad M; b es la longitud del paso ptico
que usualmente se expresa en cm y es el coeficiente de extincin
caracterstico de cada sustancia y dice cuanta cantidad de luz es absorbida
a una determinada longitud de onda, generalmente expresada en M -1cm-1
(se utilizan unidades de tal manera que el producto entre concentracin y
longitud sea adimensional).
Existen diversos mtodos que utilizan la espectrofotometra para medir la
concentracin de protenas de acuerdo a las caractersticas de cada
situacin. En este laboratorio se aplicaron los mtodos de Bradford y de
Lowry para determinar la cantidad de BSA (albmina de suero bovino) en
una muestra problema.
Mtodo de Bradford: Utiliza el reactivo de Bradford que contiene el colorante
azul brillante de Coomassie G-250. Este colorante hidrofbico en la solucin
cida del reactivo tiene una absorbancia mxima a una longitud de onda de
465 nm, pero cuando entra en contacto con la protena cambia a 595 nm.,
tornando la muestra de un color amarillo a azul. Mientras mayor sea la
concentracin de protenas, ms intenso ser el color. Dentro de sus
ventajas destacan su alta sensibilidad, bajo costo y rapidez.
Mtodo de Lowry: Utiliza reactivo cobre alcalino (RCA) y reactivo de Folin
modificado. Si hay protenas presentes, se produce una coloracin azul
debido principalmente a la presencia de residuos de tirosina y triptfano en
las protenas (aminocidos con grupo aromtico). La absorbancia se lee a
una longitud de onda analtica de 650 nm (Inst. Qumica PUCV, 2016).

Objetivos
Objetivo general:

Cuantificar protena BSA (albmina de suero de bovino) mediante

tcnicas espectroscpicas

Objetivos especficos:

Utilizar como tcnica el mtodo de Bradford.

Utilizar como tcnica el mtodo de Lowry.

Construir una curva de calibrado para cada uno de los mtodos con
concentraciones conocidas de protena.
Determinar las ventajas y desventajas de cada una de las tcnicas.

Resultados
1. Mtodo de Bradford:
Mediante este mtodo se prepararon soluciones homogneas las cuales se
manejaron en serie de 5 15 25 38 50 L de BSA, de concentracin
10[mg/mL], en las cubetas 2 a 6; adems se incluy un blanco (cubeta 1) y
tres muestras problema (cubetas 7, 8 y 9), con el fin de construir una curva
de calibrado. Las caractersticas de cada cubeta se encuentran en la tabla
1.1
Tabla 1.1 Composicin cubetas para el mtodo de Bradford
Cubeta

[L] BSA
10[mg/mL]

[L] H2O

1 (Blanco)
2
3
4
5
6
7 (MP 1)
8 (MP 2)
9 (MP 3)

0
5
15
25
38
50
0
0
0

50
45
35
25
12
0
25
25
25

BSA
muestra
problema
[L]
0
0
0
0
0
0
75
75
75

Reactivo de
Bradford
[L]
1500
1500
1500
1500
1500
1500
1500
1500
1500

Ya preparadas las cubetas, se calcul la concentracin de BSA de cada una

mediante la siguiente ecuacin:
V i * C i = Vf * C f
Vi corresponde al volumen inicial de cada cubeta, que es la cantidad de BSA
en L. Ci es la concentracin inicial de BSA correspondiente a 10 g/L. V f es
el volumen final de cada cubeta, que en todos los casos es 1500 L y C f es
la concentracin que se desea conocer para construir la curva de calibrado.
Posteriormente se dej las cubetas por 10 min y luego fueron llevadas al
espectrofotmetro para medir su absorbancia a una longitud de onda
analtica de 595 nm, obteniendo los siguientes resultados representados en
la tabla 1.2
Tabla 1.2 Concentraciones y absorbancias de cubetas conocidas
Cubeta
1 (Blanco)
2
3
4

Concentracin
[g/L]
0,000
0,033
0,097
0,161

Absorbancia [U.A]
0,000
0,923
1,293
1,421

5
0,245
1,420
6
0,323
1,430
Grfico 1.1 Curva de calibrado Absorbancia vs. Concentracin de BSA

Mtodo de Bradford
1.6

f(x) = 4.43x + 0.25

R = 0.73

1.4
1.2
1

Absorbancia (u.a)

0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Concentracin de BSA (g/L)

A partir de los datos de la tabla 1.2 se construy una curva de calibrado la

cual posee como ecuacin: Y = 1,5027x + 1,0395 con un R2= 0,6420
Tabla 1.3 Absorbancias de las muestras problema
Cubeta
Absorbancia [U.A]
7 (MP 1)
0,741
8 (MP 2)
0,754
9 (MP 3)
0,719
De la recta se pueden conocer los valores de concentracin a partir de las
absorbancias de las muestras problema tabuladas en la tabla 1.3,
extrapolando como se muestra en la ecuacin:

A1,0395
=c
1,5027
Se debe considerar adems que la muestra problema fue diluida por las
diferentes soluciones con las que se trat (agua y reactivo de Bradford). De
un volumen de 75 L fue llevado a un volumen final de 1600 L, por lo que
el factor de dilucin es de 21,333. Considerando los datos de absorbancia
obtenidos y ese factor, se tiene lo siguiente:
Tabla 1.4 Concentraciones de las muestras problema

Cubeta
7 (MP 1)
8 (MP 2)
9 (MP 3)

Concentracin
[g/L]
-0,199*21,333 =
-4,245
-0,190*21.333 =
-4,053
-0,213*21,333 =
-4,544

CONCENTRACIN MP FINAL = PROMEDIO LMITE DE CONFIANZA (

DESVIACIN ESTNDART est

numero de datos

CONCENTRACIN MP FINAL = -4,281 (

0,2474,30
)
3

CONCENTRACIN MP FINAL =-4,281 0,613 [g/L]

2. Mtodo de Lowry:
Con este mtodo se prepararon soluciones homogneas las cuales se
manejaron en series de 20, 40, 60, 80 y 100 L de BSA, de concentracin
1[mg/mL], en los tubos 2 a 6; adems se incluy un blanco (tubo 1) y 3
muestras problema (tubos 7, 8 y 9), con el fin de construir una curva de
calibrado. Las caractersticas de cada tubo se detallan en la tabla 2.1
Tabla 2.1 Composicin tubos para el mtodo de Lowry
Tubo

[L] BSA
1[mg/mL]

[L] H2O

Reactivo
de Folin
[L]
2000

RCA [L]

500

BSA muestra
problema
[L]
0

1
(Blanco)
2
3
4
5
6
7 (MP 1)
8 (MP 2)
9 (MP 3)

0
20
40
60
80
100
0
0
0

480
460
440
420
400
480
480
480

0
0
0
0
0
20
20
20

2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000

500
500
500
500
500
500
500
500

500

Luego se calcul la concentracin de BSA de cada uno mediante la siguiente

ecuacin:
V i * C i = Vf * C f
Donde: Vi corresponde al volumen inicial de cada tubo, que es la cantidad
de BSA en L. Ci es la concentracin inicial de BSA correspondiente a 1
g/L. Vf es el volumen final de cada tubo, que en todos los casos es 3000

L y Cf es la concentracin que se desea conocer para construir la curva de

calibrado.
Posteriormente los tubos fueron trasvasijados a cubetas, se dejaron 10 min,
luego se les agreg el reactivo de Folin, se incubaron por 5 min a 55C y
fueron llevados al espectrofotmetro para medir su absorbancia a una
longitud de onda analtica de 650 nm. Las concentraciones y absorbancias
se presentan en la tabla 2.2
Tabla 2.2 Concentraciones y absorbancias de cubetas conocidas
Cubeta
Concentracin
Absorbancia [U.A]
[g/L]
1 (Blanco)
0,000
0,000
2
0,007
0,074
3
0,013
0,168
4
0,020
0,099
5
0,027
0,216
6
0,033
0,044
Grfico 2.1.1 Curva de calibrado Absorbancia vs. Concentracin de BSA

Mtodo de Lowry
0.25
0.2
0.15

Absorbancia (u.a)

0.1

f(x) = - 0.12x + 0.12

R = 0

0.05
0
0.01

0.01

0.02

0.02

0.03

0.03

0.04

Concentracin de BSA (g/L)

A partir de los datos de la tabla 2.2 se construy una curva de calibrado la

cual posee como ecuacin: y = -0,1239x + 0,1227 con un R2= 0,0003
Tabla 2.3 Absorbancias de las muestras problema
Cubeta
Absorbancia [U.A]
7 (MP 1)
0,106
8 (MP 2)
0,130
9 (MP 3)
0,056

De la recta se pueden conocer los valores de concentracin a partir de las

absorbancias de las muestras problema tabuladas en la tabla 2.3,
extrapolando como se muestra en la ecuacin:

A0,1227
=c
0,1239
Adems se debe tomar en cuenta el factor de dilucin al momento de
calcular las concentraciones. En este caso, de 20 L se llev a 3000 L.
Luego el factor es 150. De lo calculado se obtiene lo siguiente:
Tabla 2.4 Concentraciones de las muestras problema
Cubeta
Concentracin
[g/L]
7 (MP 1)
0,1348*150 =
20,2179
8 (MP 2)
-0,0589*150 =
-8,8378
9 (MP 3)
0,5383*150 =
80,7506
CONCENTRACIN MP FINAL = PROMEDIO LMITE DE CONFIANZA (

DESVIACIN ESTNDART est

numero de datos

CONCENTRACIN MP FINAL = 30,7102 (

45,70654,30
)
3

CONCENTRACIN MP FINAL =30,7102 113,4712 [g/L]

Discusiones
Analizando los valores de absorbancia y de concentracin obtenidos se
puede observar que hubo errores tanto en el mtodo de Lowry como en el
de Bradford. Estos los podemos atribuir a muchos factores, como el manejo
inadecuado del material; no respetar los tiempos correctos; mala
homogenizacin de la mezcla. Cada uno de estos factores ser evaluado a
continuacin.
El principal indicio de errores cometidos son los resultados que se
obtuvieron. Para ambos mtodos utilizados se construye una curva de
calibrado para comparar las absorbancias de las muestras problema a partir
de una solucin de concentracin conocida de protena (en este caso se us
BSA)
El reactivo ocupado en el mtodo de Lowry es de color amarillo, que al
interactuar con protenas cambia a color azul segn la cantidad de protenas
(Garca y cols, 1998). Particularmente en los tubos 4 y 6, no hubo cambio
apreciable de color como los dems si lo hicieron. Esto es atribuible a una
mala homogeneizacin de la solucin porque indica que no hubo deteccin
de protenas. Usando el mtodo de Bradford tambin hubo algunos tubos en
lo que se mantuvo un color caf oscuro ms que azul que es el color al que
debe tornar en presencia de protenas.

Para el primer mtodo se obtuvo un coeficiente de determinacin (r 2) de

0,64 mientras que para el segundo fue de 0,0003, lo que indica que por el
mtodo de Bradford se acerca ms a una recta 89. Adems, por este
mtodo se forma un complejo colorante-protena con un alto coeficiente de
extincin, lo que hace al ensayo aproximadamente 4 veces ms sensible
que el ensayo de Lowry. En adicin a esto, en el mtodo de Lowry la
coloracin no es necesariamente proporcional a la cantidad de protenas
(Garca y cols, 1998).
El manejo y estado de materiales pueden haber causados errores. Como con
las micropipetas y pipetas usadas que pueden haber recibido aire y
formando burbujas y as no haberse completado el volumen que se iba a
medir experimentalmente, luego las concentraciones calculadas no eran las
reales y arrojaron absorbancias errneas. Tambin podemos atribuir la falta
de linealidad de las rectas a la suciedad dentro de los tubos de ensayo
utilizados producto
de experimentos anteriores en el laboratorio.
Los resultados obtenidos se alejan de ser lo esperado, ya que no tienen el
comportamiento de una recta (r 2 = 0,0003; cercano a cero. Para una
regresin lineal se espera un valor lo ms cercano a 1). Con el fin de tratar
las absorbancias obtenidas de las muestras problemas, se elimin el ltimo
valor de la curva de calibrado del procedimiento seguido para el mtodo de
Lowry. Este fue seleccionado por presentar la menor absorbancia a mayor
concentracin lo que no concuerda con la proporcionalidad directa por la
que se relacionan estos dos parmetros. Entonces se obtuvo el grfico que
sigue:

Grfico 2.1.2 Curva de calibrado Absorbancia vs. Concentracin de BSA

(modificado)

Mtodo de Lowry (sin ltimo valor)

0.25
0.2
0.15

Absorbancia (u.a)

f(x) = 5.27x + 0.05

R = 0.5

0.1
0.05
0
0.01

0.01

0.02

0.02

0.03

0.03

Concentracin de BSA (g/L)

Esta es una mejor a proximacn a una recta por lo que se utilizar esta y no
la anterior para clculos posteriores.
Tabla 2.3 Absorbancias de las muestras problema
Cubeta
Absorbancia [U.A]
7 (MP 1)
0,106
8 (MP 2)
0,130
9 (MP 3)
0,056
De la recta se pueden conocer los valores de concentracin a partir de las
absorbancias de las muestras problema tabuladas en la tabla 2.3,
extrapolando como se muestra en la ecuacin:

A0,051
=c
5,2692
Adems se debe tomar en cuenta el factor de dilucin al momento de
calcular las concentraciones. En este caso, de 20 L se llev a 3000 L.
Luego el factor es 150. De lo calculado se obtiene lo siguiente:
Tabla 2.4.2 Concentraciones de las muestras problema
Cubeta
Concentracin
[g/L]
7 (MP 1)
0,0104*150 = 1,566
8 (MP 2)
0,0150*150 = 2,249
9 (MP 3)
0,0009*150 = 0,1423

CONCENTRACIN MP FINAL = PROMEDIO LMITE DE CONFIANZA (

DESVIACIN ESTNDART est

numero de datos

CONCENTRACIN MP FINAL = 1,3191 (

1,07484,30
)
3

CONCENTRACIN MP FINAL =1,3191 2,6683 [g/L]

Conclusiones
Es necesario llevar a cabo el procedimiento de cada mtodo con mucha
precisin, limpieza y siguiendo el orden de los pasos con el mayor cuidado
posible, ya que cualquier falla altera a la muestra a analizar, obteniendo
resultados errneos.
Al realizar el mtodo de Bradford, adems del manejo de los materiales, no
hubo mayores dificultades en seguir el protocolo y no se requera de mucho
tiempo para este, en cambio el mtodo de Lowry result ser ms lento
debido a que las muestras requeran ser calentadas y posteriormente
enfriadas.
No se obtuvo los resultados esperados en ambos mtodos debido a la falta
de experiencia, pero aun as se comprob que el mtodo de Bradford es el
ms simple, rpido y sensible ante la presencia de protenas, puesto a que
se acerca ms a la linealidad.

Bibliografa
1

Instituto de Qumica PUCV. Gua Laboratorio Bioqumica QUI-343.

Laboratorio n1: "Espectrofotometra: Cuantificacin. Pginas 2, 3,

6,7.2016.
http://support.minitab.com/es-mx/minitab/17/topic-library/modelingstatistics/regression-and-correlation/goodness-of-fit-statistics/rsquared/ (referencia coeficiente de determinacin para linealidad)

acceso: Marzo 18 del 2016

Garca H., Vzquez R. Cuantificacin de protenas: una revisin.
Volumen 3. Pginas 77, 79,81. 1998.