Cariotipagem em Bovinos

1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS
DEPARTAMENTO DE GENTICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM GENTICA E BIOLOGIA

MOLECULAR
DISSERTAO DE MESTRADO
Avaliao de aberraes cromossmicas

em bovinos (Bos taurus taurus) infectados
pelo papilomavrus bovino
THATIANA CORRA DE MELO
Recife, PE
Abril, 2009
TC, Melo
Avaliao de aberraes cromossmicas em bovinos (Bos taurus taurus)...
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS
DEPARTAMENTO DE GENTICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM GENTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
DISSERTAO DE MESTRADO
Avaliao de aberraes cromossmicas

em bovinos (Bos taurus taurus) infectados
pelo papilomavrus bovino
THATIANA CORRA DE MELO

Dissertao apresentada ao Programa de
Ps-graduao em Gentica e Biologia
Molecular da Universidade Federal de
Pernambuco como requisito para obteno
do grau de Mestre em Gentica pela UFPE
Orientador: Prof Dra. Rita de Cssia Stocco, Laboratrio de Gentica:

Oncognese Viral -Papilomavrus- Instituto Butantan.
Co-orientador : Prof Dra. Tania Tassinari Rieger, Laboratrio de
Gentica e Citogentica Animal - Depto. Gentica UFPE
II
TC, Melo
III
TC, Melo
III
TC, Melo
Coordenador:
Dr. Antonio Carlos de Freitas
feliz quem tem no ntimo a confiana na fora da vida.

Nesta fora misteriosa que habita em cada um de ns e nos
faz crescer, viver, realizar. As pessoas, que tm coragem de
ser, que aprenderam a saber querer, optar e amar, elevam e
enriquecem o mundo. Porque um dia preciso parar de
sonhar, tirar os planos das gavetas e, de algum modo,
comear.
Amyr Klink
IV
TC, Melo
A Deus, por ter permitido a concluso deste

trabalho e a minha me Wilma, pelo apoio
incondicional e carinho a mim dispensado, dedico..
TC, Melo
AGRADECIMENTOS
Agradeo a realizao deste trabalho a todos que de vrias formas me ajudaram ao
longo de toda jornada percorrida. Em especial a:
Meu DEUS e meu SENHOR por ter me permitido iniciar e concluir mais uma etapa da
minha vida, que me d foras e coragem para continuar a sonhar, com a certeza de que
sempre irei vencer independente das dificuldades.
A minha famlia, pelo apoio incondicional nas inmeras etapas da minha vida. A minha
me Wilma, por sua existncia, pela luta e sacrifcio sempre em prol da felicidade de
suas filhas. As minhas irms, Alexandra e Raquel por sempre se preocuparem comigo.
Ao meu av Manoel, por todas as oraes feitas ao divino esprito santo, pedindo que
guiasse meus caminhos e me protegesse. Muito obrigada meu av, suas oraes foram
muito importantes nos momentos de dificuldades. As minha tia- me, Roseane, pelo
apoio, saber que posso contar com voc me permite caminhar com mais tranqilidade.
Ao meu namorado Andr, meu amor s tenho a te agradecer pela compreenso nas horas
de ausncia, por toda sua dedicao ao meu lado, fazendo o que era possvel para que
meus trabalhos dessem certos, ajudando nas coletas e dedicando horas de fim de semana
processando material comigo no laboratrio, te agradeo muito pela ajuda de amigo.
Voc conseguiu com sua alegria e pensamento positivo, tornar os meus momentos de
estresses menos angustiantes.
As minhas irms de corao: Nane e J, meu amor por vocs grandioso, agradeo por
tudo que vocs fazem e fizeram por mim. A Bethnia, obrigada por toda amizade,
carinho e ajuda durante todo o nosso perodo de mestrado. Vocs so pessoas abenoadas
por Deus.
Ao meu amigo Srgio Campos, obrigada pela amizade verdadeira, desde a poca da
minha monografia. Sergito, no existem palavras para agradecer todo apoio a mim
dispensado. Te agradeo pelos valiosos conselhos e por voc no ter desistido da minha
amizade nos momentos em que te deixei estressado. Admiro muito seu empenho em fazer
VI
TC, Melo
com que as pessoas estejam sempre bem, serei eternamente grata a voc por tudo que fez
por mim.
Prof Dr Rita Stocco pela confiana em ter me aceito como sua aluna, no programa de
Ps- graduao, mesmo no conhecendo meu trabalho me ofereceu todo apoio e suporte
financeiro, permitindo a concluso desta pesquisa. Tambm agradeo pela pacincia e
amizade nos momentos de orientao distncia. Saber que podia contar sempre com a
senhora me deu mais tranqilidade para seguir em frente.
A professora e co-orientadora Tania e Professor Ferreira, sou muito agradecida por todo
o apoio que me dispensaram desde a poca da minha graduao. A torcida e apoio de
vocs para que eu ingressasse no mestrado me possibilitou lutar mais uma vez e acreditar
que conseguiria passar no mestrado.
Aos meus amigos do laboratrio da Gentica Animal: Nara Diniz, por caminhar ao meu
lado nas jornadas de coletas, experimentos e viagens. A Bruna, pela ajuda nos meus
experimentos e coletas. A Corao, pela disponibilidade de ajudar, sempre se
disponibilizando no que fosse preciso. A Augusto, pela amizade e apoio como fotgrafo
nas coletas. A Nayara, pela amizade, carinho e apoio nas coletas. A Anglica pela
grande amizade e conselhos. A Prof Neide, pelas vezes em que me esclareceu algumas
dvidas em laboratrio e pelas valiosas consideraes que fez em meu trabalho. A
Merylanne, Jssica, Itusa, Pollyanna, Cibele, Barbara, Cirlene, Amanda, Carol,
Jefferson e Prof Dra Maria Jos, a todos obrigada pelo excelente convvio em
laboratrio.
Aos meus amigos de mestrado: Rodrigo, Marlia e Jlia foi muito bom ter convivido
com vocs neste perodo de mestrado.
Aos meus novos e grandes amigos do laboratrio de gentica do Instituto Butantan:
Priscilla Felix a Priscillona ,amiga agradeo pelo grande e imensurvel apoio na
minha passagem em SP, sua gentileza e simpatia tornaram os dias de trabalho no
laboratrio mais divertidos, te agradeo por todo apoio e amizade verdadeira, A Oilita,
por tudo que me ensinou no perodo em que estive em SP, mas, sobretudo sou
imensamente grata pela dedicao tcnica que voc teve em me ajudar na concluso do
meu trabalho; Priscila Mayrink a Priscilinha, pelo apoio e bom convvio no
VII
TC, Melo
laboratrio; Tia Carol, Pequenina, mas de um grandioso corao, obrigada pela amizade
e pacincia em resolver todas as questes burocrticas do nosso lab.; Papai Dalton, pela
ajuda na edio de imagens; Dra. Anglica, Dra Heloisa, Dra Suely, Dr. Rodrigo (R),
Guilherme, Willian (Will), Ana e Dona Zezinha, a todos obrigada pelo excelente
convvio em laboratrio e pelas boas conversas, certamente elas tambm foram
fundamentais para que os dias em So Paulo fossem mais divertidos.
A Dr. Willy Beak, pelo apoio na realizao do projeto.
A Dr Paulo Correia (dono da fazenda onde foi realizada a coleta), obrigada pela
confiana e por ter permitido a realizao da nossa pesquisa em sua fazenda.
Aos Prticos da fazenda: Thiago, J e tio de Nara, sou muito grata a vocs pela
disponibilidade na hora das coletas, posso dizer que sem a valiosa ajuda de vocs, os
nossos trabalhos nas coletas, teriam sido bem mais rduos.
Aos funcionrios do Departamento de Gentica, Dona Zizi e Romildo.
Ao programa de Ps graduao e ao CNpq pelo apoio finaceiro durante os dois anos de
mestrado.
VIII
TC, Melo
SUMRIO
Item
Pgina
Lista de Abreviaturas
XI
Lista de Figuras
XIII
Lista de Tabelas
XV
Resumo
XVI
Abstract
XVII
Introduo
1. Reviso Bibliogrfica
1.1 Papilomavrus (PV): aspectos gerais
1.1.1 Estrutura molecular dos papilomavrus (PV)
1.1.2 Transmisso e ciclo viral dos papilomavrus (PV)
1.2 Papilomavrus bovino (BPV)

1.2.1 Ao das oncoprotenas do BPV
10
12
1.3 Conseqncias da infeco pelo papilomavrus bovino
13
1.4 Interaes do BPV com co-fatores ambientais
15
1.5 Alteraes cromossmicas e interaes do vrus a
18
cromatina
1.6 Mecanismos de formao e denominao padro das
23
anomalias cromossmicas
1.7. Caritipo Bovino
1.7.1 Alteraes cromossmicas em bovino
28
31
2. Objetivos
33
3. Materiais e Mtodos
34
3.1 Grupo amostral
34
3.2 Coleta do material biolgico
34
3.3 Anlise citogentica
35
3.3.1 Cultura de linfcitos
35
3.3.2 Preparao das lminas
35
3.3.3 Parmetros para anlise citogentica
36
3.4 Anlise de Dados

3.4.1 Anlises estatsticas
38
38
IX
TC, Melo
4. Resultados
40
5. Discusso
50
5.1 Infeco viral vesos alteraes cromossmicas
50
5.2 PV em sinergismo com co-fatores ambientais podem desencadear
51
aberraes cromossmicas
5.3 Alteraes cromossmicas como conseqncias da ao das
53
oncoproteinas virais
5.3.1 Associaes telomricas (AT) associaes cntricas (AC),
53
fragmentos acnticos (FA) e gaps

5.3.2 Alteraes numricas (aneuploidias e tetraploidias)
5.4 Similaridades entre as oncoproteinas E6 e E7 do BPV-1 e HPVs de
55
56
alto risco
6. Concluses
59
7. Referncias Bibliogrficas
60
8. Anexos
68
Anexo 1
68
1.1: Valores absolutos e percentuais (%) do nmero de clulas
68
analisadas no grupo controle.

1.2: Valores absolutos e percentuais (%) dos tipos de aberraes
69
cromossmicas encontradas no grupo controle.

Anexo 2
70
70
analisadas no grupo assintomtico.

61
cromossmicas no grupo assintomtico.

Anexo 3
73
73
analisadas e tipos de aberraes cromossmicas do grupo sintomtico

74
cromossmicas do grupo sintomtico

Anexo 4. Manuscrito
76
Anexo 5. Regras para submisso do Artigo
87
9. Memorial
99
TC, Melo
Lista de abreviaturas
AC
Associao Cntrica
add
Adio
ATcr
Associao Telomrica por uma cromtide
AT
Associao Telomrica
BHV
Herpesvrus Bovino
BPV
Papilomavrus Bovino
Brd-4
COPV
Protena da famlia BET, relacionada ligao do genoma do papilomavrus

ao genoma hospedeiro sendo sua ao melhor evidenciada nos cromossomos
mitticos.
Papilomavrus canino
CRV
Papilomavrus do Coelho
Da
Daltons
del
deleo
EBV
Vrus Epstein- Barr
E1-8
gaps
HC
Genes de expresso precoce

Falhas na estrutura da cromtide, com largura menor que a largura da
cromtide
Heterocromatina Constitutiva
HEC
Hematuria enzotica crnica
HHV
Herpesvrus Humano
HPV
Papilomavrus Humano
ICTU
Kb
Comit internacional de Taxonomia de vrus

Kilobases
KDa
Kilodalton
LCR
Regio principal de controle de Transcrio
L1-2
Genes de expresso tardia
MHC
Complexo de Histocompatibilidade Maior
ORF
Regio de incio de transcrio (open reading frame)
Palf
PV
Linhagem celular de fibroblastos estabelecidas a partir de fragmentos do

palato de bezerro.
Protena de ao supressora tumoral, especificamente relacionada ao
retinoblastoma
Papilomavrus
p53
Protena de ao supressora tumoral
QM
Quebra cromossmicas
pRB
XI
TC, Melo
QT
Quebra cromatdicas
ras
Proto- oncogene relacionado ao Tumor de Wilmss
SPcr
Separao Precoce de cromtides
VLP
Partculas semelhante a vrus (vrus-like particles)
XII
TC, Melo
Lista de Figuras
Figura- 1: rvore filogentica dos PV traada por meio das seqncias da
ORF L1, contendo seqncias de 118 tipos de PV. Os smbolos
semicirculares identificam os gneros, e os nmeros dos smbolos
semicirculares se referem s espcies de papilomavrus.
Figura- 2: Mapa genmico linear do papilomavrus bovino tipo-1 (BPV-1).

Representao das regies codificadoras E (Early), L (Late) e as regies no
codificadoras LCR. Os nmeros da LCR indicam a numerao dos
nucleotdeos.
Figura- 3: Modelo estrutural do Papilomavrus bovino. Em destaque,

demonstrao esquemtica da interao dos pentmeros de L1 (vermelho) com
L2 (verde) interagindo com o DNA viral (azul).
Figura- 4: Representao diagramtica da infeco da pele por papilomavrus,

apresentando os diferentes estgios do ciclo viral com seu respectivo padro de
expresso gnica.
Figura- 5: Agrupamento dos tipos de papilomavrus bovinos conforme a

similaridade das suas seqencias genomicas. Delta-papilomavrus, BPV-1 e 2,
(vermelho); Xi-papilomavrus, BPV-3, 4, 6, 9, e 10 (amarelo) e Epsilonpapilomavius, BPV-5 e 8, (azul). Em um grupo diferenciado encontra-se o
BPV-7 (verde).
11
Figura- 6: Bovino da raa holandesa infectado com BPV exibido papilomatose

bovina. (A) papilomas em forma de couve-flor na regio do pescoo e cabea,
(B) papilomas em forma de couve-flor nas tetas.
14
Figura- 7: Diagrama esquemtico representando a interao entre BPV-4 e a

samambaia (Pteridium aquilinum) no desenvolvimento de tumor digestrio. O
BPV-4 presente no epitlio ativado pela ao imunossupressora da
samambaia. Oncoprotenas virais so expressas e podem levar progresso
maligna.
16
Figura- 8: Diferentes funes da protena E2 do BPV-1. Protenas E2

(Amarelo) conectando o genoma viral (roxo) aos cromossomos mitticos (azul)
e, protenas E1 (vermelho) atuando junto a E2 na replicao.
21
Figura 9 Estrutura do complexo E2/ Brd-4. A -hlice do domnio Nterminal da E2 est em verde e o domnio C-terminal, regio no conectado,
em vermelho. O segmento entre estes dois domnios, a dobradia, est em
amarelo. Em azul possvel visualizar a protena Brd-4 ligando- se a E2 pelo
domnio N- terminal.
21
Figura- 10: Demonstrao dos tipos de rearranjos estruturais provocados por

quebras cromossmicas. Os nmeros ou letras so a representao
esquemtica, dos genes envolvidos nas quebras.
26
XIII
TC, Melo
Figura- 11: Demonstrao esquemtica das inverses paracntrica e

pericntrica. As letras so a representao esquemtica dos genes envolvidos
nas quebras.
Figura- 12: Bovino da espcie Bos taurus taurus (A) e da espcie Bos taurus
indicus (B)
Resultados
Figura- 1: Metfases bovina, normal e com alterao cromossmica. (A):
Metafse normal; (B): Metfase poliplide com 120 cromossomos e um
fragmento acntrico (FA); (C): Metfase aneuploide com 59 cromossomos. A
seta em preto indica o cromossomo X e a em vermelho indica o tipo de
alterao encontrada.
27
29
42
Figura- 2: Alteraes cromossmicas estruturais. (A) associao telomrica

(AT); (B) associao telomrica por uma cromtide (ATcr); (C) separao
precoce de cromtides (SPcr) e fragmento acntrico (FA); (D) adio ou
deleo de segmentoscromossmicos (add ou del). As setas em preto indicam
os cromossomos X e as em vermelho indicam os cromossomos com alteraes.
43
Figura- 3: Alteraes cromossmicas estruturais. (A) fragmento acntrico

(FA) e Gap; (B) Quebra cromatdica (QT); (C) Quebra cromatdica (QT) e
quebra cromossomica (QM); (D) associao cntrica (AC). As setas em preto
indicam os cromossomos X e as em vermelho indicam os cromossomos com
alteraes.
44
Grfico- 1: Percentual de aberraes cromossmicas no grupo de bovinos

infectado com BPV.
45
Figura- 4: Bandamento C evidenciando algumas alteraes estruturais. (A)

associao cntrica (AC); (B) associao telomrica (AT); (C) associao
cntrica (AC), quebra cromatdica (QT); (D) associao cntrica (AC). As
setas em preto indicam os cromossomos sexuais e as em vermelho indicam os
cromossomos com alteraes.
48
Figura- 5: Localizao de nove cromossomos autossmicos com RONs ativas,

na regio distal ao centrmero (setas em preto). As setas em vermelho indicam
os cromossomos X.
49
XIV
TC, Melo
Lista de tabelas
Tabela- 1: Formas de atuao das oncoprotenas virais, presentes nos diferentes

gneros dos papilomavrus.
12
Material e Mdotos
Tabela- 1: Descrio dos protocolos utilizados nas tcnicas de bandamento C e
G.
Tabela- 2: Descrio do protocolo modificado, da tcnica de marcao com
nitrato de prata, para evidenciar as RONs.
Resultados
Tabela- 1: Descrio geral da anlise citogentica de cada grupo de bovino,
relatando a percentagem de clulas com aberrao por grupo.
37
Tabela- 2: Resultados estatsticos correlacionando todos os tipos de aberraes

encontradas em bovinos infectados por BPV.
46
37
40
XV
TC, Melo
Resumo
O papilomavrus bovino (BPV) representado por 10 subtipos virais,
epiteliotrpicos ou mucosotrpicos, que so transmitidos entre bovinos por meio do
sangue contaminado e/ou contato entre epitlios. O vrus pode estar presente na forma
latente nos linfcitos do hospedeiro, podendo originar instabilidades cromossmicas.
Neste contexto, este estudo teve como objetivo avaliar alteraes cromossmicas que
podem resultar deste processo de instabilidade. Foram coletadas amostras de sangue
perifrico de bovinos Bos taurus taurus, as quais foram enviadas para deteco viral,
utilizando a tcnica de reao em cadeia da polimerase (PCR). Em seguida, foram
estabelecidas culturas de linfcitos para anlise citogentica. Foram coletadas amostras
de 61 bovinos, apresentando papilomatose (animais sintomticos) e sem sinais clnicos
(animais assintomticos) e a anlise citogentica foi processada em teste cego (em
colorao convencional e bandamento C). Os resultados mostraram que no momento da
coleta 28 animais no estavam infectados pelo vrus BPV e 33 estavam infectados pelo
BPV tipo 1 e/ou 2. O grupo de bovinos infectados foi subdividido em dois subgrupos:
sintomticos e assintomticos. Analisando os animais infectados pelo BPV, o grupo
sintomtico (com papilomatose), representado por 17 bovinos, apresentou mdia de 42,71
% de clulas apresentando aberraes cromossmicas por indivduo, enquanto o grupo
assintomtico (sem papilomatose), representado por 16 bovinos, apresentou uma mdia
de 40,19 %. Foram analisados entre 50 a 100 clulas por amostra, totalizando 2203
clulas, das quais 918 (42%) apresentavam uma ou mais aberraes cromossmicas. A
taxa de alteraes cromossmicas observadas nos bovinos sintomticos (42,77,8) e
assintomticos (40,211) foi comparada com os ndices de aberraes espontneas
observadas no grupo controle (animais no infectados) (42). Para analisar diferenas
estatsticas entre os trs grupos, foi utilizado o Teste Kruskal-Wallis, seguido do Teste de
Mann Whitney. Estas anlises mostraram que a variabilidade de clulas alteradas entre o
grupo controle e os infectados por BPV maior no grupo dos bovinos infectados (P <
0,0001). No entanto, diferenas significativas no foram observadas entre os subgrupos
infectados por BPV (P= 0,62). As alteraes cromossmicas identificadas nas anlises
realizadas foram: associao cntrica (AC), fragmento acntrico (FA), associao
telomrica (AT), associao telomrica por uma cromtide (ATcr), quebra cromatdica
(QT), quebra cromossmica (QM), gaps, aneuploidia, poliploidia, adio oudeleo de
segmento cromossmico (add ou del) e separao precoce de cromtides (SPcr). As altas
taxas de anormalidades cromossmicas (numricas e estruturais) esto relacionadas
ao do BPV, tendo sido possvel a distino entre animais acometidos por vrus dos
animais no infectados.
Palavras chave: Bos taurus; papilomavirus bovino; alteraes cromossmicas.
XVI
TC, Melo
Abstract
Bovine papillomavirus (BPV) is represented by 10 papillomavirus subtypes,
epiteliotropic or mucosotropic, which are transmitted among bovines through
contaminated blood and ephitelial contact. This virus may be in a latent form on host
lymphocytes, triggering chromosomal instabilities. In this context, this study aimed to
evaluate chromosomal aberrations which might result from this process of instability.
Peripheral blood samples were collected from Bos Taurus females.Viral detection was
performed using polymerase chain reaction technique (PCR) and lymphocytes cultures
were established for cytogenetic analysis. 61 animals were analyzed in blind-test in
slides submitted to conventional staining and C-banding. Twenty eight (28) animals were
verified as no infected by BPV. Thirty three (33) animals presented BPV type 1 and /or
2. The BPV infected group was subdivided into two subgroups: symptomatic and
asymptomatic. Symptomatic group (with papillomatosis) represented by 17 females,
exhibited an average of 42.71% aberrant cells per individual.Asymptomatic group
(without papillomatosis), represented by 16 animals exhibited an average of 40.19%. The
analysis included 50 to 100 cells per sample, totalizing 2203 cells: 918 presented one or
more chromosomal aberrations. The chromosomal aberration rate in symptomatic and in
asymptomatic animals was respectively 42.7 7.8 and 40.2 11, compared with
aberration rate of control group,42. To analyze statistical differences among these three
groups, were used Kruskal-Wallis Test followed by Mann-Whitneys Test. These
analysis reported that aberrant cells variability between the control group and BPVinfected groups was larger on infected cattle group (P < 0,0001). However, significant
differences were not observed between infected subgroups (P = 0,62). The identified
chromosomal aberration types were: centric association (CA); acentric fragment (AF);
telomeric association (TA); telomeric association by a unique chromatid (TAcr);
chromatid breaks (CtB); chromossomic breaks (CmB); gaps; aneuploidy; polyploidy;
addition or loss of chromosomal segment (add or del) and early chromatid separation
(EcrS). The obtained data demonstrated that the high rates of cromossomal aberrations
(numeric and structural) are related to BPV action, allowing distinction between infected
and not infected animals.
Key-words: Bos taurus; bovine papillomavirus; chromosome aberrations
XVII
TC, Melo
Introduo
O papilomavrus (PV) considerado um dos vrus mais relevantes para o homem e
outros animais que ele infecta, devido s doenas causalmente relacionadas. O vrus induz
a formao de leses benignas (verrugas / papilomas) e malignas (carcinomas), neste caso
associado a co-fatores ambientais. Considerando suas caractersticas morfolgicas e
moleculares, pode-se afirmar que estes vrus de morfologia icosadrica no envelopados
possuem dimetro variando de 52 a 55 nm e so compostos por uma fita dupla de cido
6
desoxirribonuclico (DNA) circular, com massa molecular de 5 x 10 daltons.
O PV um vrus espcie-especfico que infecta uma grande variedade de animais

(aves, humanos, eqinos, caninos, coelhos, camundongos, hamster, caprinos, cervdeos e
bovinos), induzindo papilomas que geralmente regridem sem resultar em nenhum
problema clnico mais srio nos hospedeiros. Por outro lado, este tipo de vrus est muitas
vezes relacionado a doenas de alto impacto financeiro, sendo o papilomavrus bovino
(BPV) um dos tipos mais importantes neste aspecto, considerando-se a relevncia do setor
pecurio para economia global.
Os BPV so atualmente subdivididos em 10 subtipos: BPV-1, BPV-2, BPV-3,
BPV-4, BPV-5, BPV-6, BPV-7, BPV-8, BPV-9 e BPV-10. Tais subtipos so enquadrados
em trs grupos distintos: os Xi-Papilomavirus, os Delta-Papilomavrus e os EpsilonPapilomavirus.
Estudos descritos na literatura demonstram a integrao de seqncias virais de
PV cromatina da clula hospedeira, em leses de clulas humanas, em stios especficos
(prximo ao centrmero) dos cromossomos. Contudo, ainda no se tem relatos da
integrao do DNA do BPV nos cromossomos bovinos. O que se sabe que a interao
do vrus com a cromatina hospedeira e ao de co-fatores ambientais podem desenvolver
1
TC, Melo
uma instabilidade cromossmica, levando subseqentemente formao de aberraes

cromossmicas, relacionadas com alteraes na dupla fita de DNA, das clulas
hospedeiras, que no conseguiram ser corrigidas pelo sistema celular.
Neste contexto, de grande importncia o desenvolvimento de novos estudos para
se conhecer no apenas a prevalncia viral de acordo com a regio geogrfica, mas
tambm entender a relao entre o genoma do vrus (BPV) e do hospedeiro (bovino).
Portanto, este trabalho objetivou avaliar aspectos citogenticos decorrentes da interao
do papilomavrus bovino (BPV) com as clulas do hospedeiro. Para isto, foram avaliados
os ndices de aberraes cromossmicas em linfcitos perifricos de bovinos infectados
pelo BPV, sintomticos ou assintomticos, identificando a existncia dos eventuais tipos
de aberraes mais freqentes.
TC, Melo
1. Reviso da Literatura
1.1 Papilomavrus (PV): aspectos gerais
Os papilomavrus (PV) so vrus oncognicos de cido desoxirribonuclico

(DNA), espcie - especfico conhecidos por infectar o epitlio de uma grande variedade
de animais, induzindo papilomas ou verrugas que geralmente regridem sem resultar em
problemas clnicos mais srios nos hospedeiros (Campo, 1997; 2003).
Uma caracterstica interessante dos PV que estes vrus podem infectar quase
todos os vertebrados, tais como mamferos, aves e rpteis. Em mamferos, os PV mais
amplamente estudados so os papilomavrus humano (HPV), bovino (BPV), canino
(COPV) e de coelhos (CRPV) (Antonsson e Hansson, 2002; Campo, 2002; Villiers et al.,
2004; Vallve et al., 2005; Wosiacki et al., 2006). Acredita-se que os papilomavrus
tenham co-evoludos com seus hospedeiros, demonstrando alta especificidade. Deste
modo, os PV poderiam ser usados como pontos de datao seletiva do fssil hospedeiro,
desenvolvendo um mecanismo de interao temporal entre populaes, que pode levar a
possvel filogenia viral (Rector et al., 2007). Em condies experimentais, os PV no
infectam outro hospedeiro que no o seu natural. No entanto, em condies naturais,
puderam ser relatados dois casos de infeco cruzada entre espcies de bovinos e
eqinos, pelos tipos de BPV 1 e 2, desenvolvendo tumores denominados sarcoides
eqinos e infeces na bexiga urinria, respectivamente (Nasir e Campo, 2008;Yuan et
al., 2008).
Inicialmente, a classificao dos PV foi feita com base em similaridades do
genoma da dupla fita de DNA (atravs de anlises de suas bases) e da morfologia do
capsdeo icosadrico, caracterstico destes vrus. Atravs da microscopia eletrnica,
identificando a morfologia viral, e dos parmetros moleculares dos PV foi possvel
3
TC, Melo
enquadr-los
dentro
do
grupo
dos
Palyomaviruses,
classificados
na
famlia
Papovaviridade (que inclui os Polyomavirus) (Pfister e Fuchs, 1994).

Atualmente, a anlise de outros parmetros peculiares ao genoma dos PV,
diferentes tamanhos dos genomas, organizao diferenciada do genoma e maiores
similaridades de seqncias de aminocidos e nucleotdeos, permitiu ao Comit
Internacional de Taxonomia de Vrus (ICTV) separar os Palyomaviruses em duas
famlias:
Palyomaviridae
Papillomaviridae.
Os
papilomavrus
(famlia
Papillomaviridae, gnero Papillomavirus) formam um grupo muito heterogneo de vrus

compostos por 16 gneros (Figura 1), diferenciados por suas seqncias nucleotdicas,
caractersticas biolgicas e propriedades patolgicas (Villiers et al., 2004).
Fonte: Villiers et al., 2004.
Figura 1 rvore filogentica dos PV traada por meio das seqncias da ORF L1,
contendo seqncias de 118 tipos de PV. Os smbolos semicirculares identificam os
gneros, e os nmeros dos smbolos semicirculares se referem s espcies de
papilomavrus.
TC, Melo
Para identificar novos tipos virais de PV tm sido usadas seqncias de

nucleotdeos da ORF (Opening reading frames - regio de incio da transcrio do
DNA) do gene L1, por ser o mais conservado dentro do genoma dos papilomavrus. Para
avaliar diferenas entre os PV e assim poder classific-los em tipos, subtipos e variantes,
o genoma completo do PV clonado e, caso a seqncia da ORF L1 tenha divergido
em mais de 10% de um tipo de PV conhecido mais prximo, ele pode ser considerado um
novo tipo. Diferenas entre 2% e 10% de homologia definem um subtipo e menor que 2
%, uma variante (Villiers et al., 2004).
1.1.1 Estrutura molecular dos papilomavrus (PV)
O PV um vrus no envelopado, com estrutura icosadrica apresentando de 55 a

60 nanmetros (nm) de dimetro. Seu capsdeo formado de 72 capsmeros (60
hexamricos e 12 pentamricos), que podem formar partculas paracristalinas no ncleo
das clulas infectadas (Modis et al., 2002; Campo, 2006; Borzacchiello e Roperto, 2008).
O PV tem um genoma de DNA de dupla fita circular, com tamanho de
aproximadamente 8 kilobases (kb), complexado com histonas e de peso molecular de
cerca de 5,6 x 102 Daltons (Da). Este genoma dividido em trs principais regies:
regio predominante de controle (LCR), que contm elementos cis-regulatrios
necessrios para a replicao e transcrio do DNA do vrus; regio de transcrio
precoce (E) (early), que codifica genes para protenas no-estruturais, e regio de
transcrio tardia (L) (late), que codifica genes para protenas do capsdio (Trus et al.,
1997).
O genoma do PV constitudo por uma srie de oito ORFs, reconhecidas cada
uma como um gene, que codificam as protenas virais. Os genes da regio precoce so
TC, Melo
expressos nas camadas basais do tecido epitelial e codificam trs oncoprotenas,

responsveis pela modulao dos processos de transformao celular (E5 ou E8, E6 e
E7), e trs protenas regulatrias, que modulam a transcrio (E1 e E2) e replicao (E1,
E2 e E4). Os genes localizados na regio tardia (L) codificam duas protenas estruturais
(L1 e L2), que so expressas no ncleo dos queratincitos e so responsveis pela
formao do capsdeo viral (Campo, 1997; 2006) (Figura 2).
Fonte: modificada de Campo, 2006.
Figura 2: Mapa genmico linear do papilomavrus bovino tipo-1 (BPV-1).

Representao das regies codificadoras E (Early), L (Late) e as regies no
codificadoras LCR. Os nmeros da LCR indicam a numerao dos nucleotdeos.
A regio LCR corresponde a um segmento de cerca de 850 pares de bases (pb)
com funo no codificante, mas que contem um stio de replicao e muitos stios de
ligao a fatores de transcrio, que so importantes na ao da RNA polimerase
(Campo, 2002; Zheng e Baker, 2006; Gottschling, et al., 2007).
A protena L1 com peso molecular de 54 - 58 Kilodalton (KDa) possui cerca de
500 aminocidos e compe 90% capsdeo. A L1 encontra-se arranjada em 72 pentmeros
possuindo a capacidade de se auto organizar em VLPs (virus-like particles) (Villa et
al., 2005; Freitas et al., 2007). A protena L2 com um peso molecular de 68- 76 KDa
possui cerca de 469 aminocidos e se liga ao DNA viral, favorecendo a encapsidao. As
TC, Melo
protenas L em conjunto atuam na conexo viral com os receptores celulares (Liu et al.,
1997, Trus et al., 1997, Tomita et al., 2007) (Figura-3)
Fonte: modificada de Liu et al., 1997 e Trus et al., 1997.
Figura 3 Modelo estrutural do papilomavrus bovino. Em destaque, demonstrao

esquemtica da interao dos pentmeros de L1 (vermelho) com L2 (verde) interagindo
com o DNA viral (azul).
1.1.2 Transmisso e ciclo viral dos papilomavrus (PV)

A disseminao do PV ocorre por contato direto entre os organismos infectados.
Contudo, vem sendo investigada outras possveis formas de transmisso com o objetivo
de obter melhores estratgias de preveno (Yaguiu et al., 2006; Lindsey et al., 2009).
Em humanos tem sido largamente aceito que a transmisso do HPV ocorre por meio do
contato direto de epitlios infectados no ato sexual e, embora j tenha sido detectada a
presena de DNA viral em clulas sanguneas, o sangue no aceito ainda como um
meio de disseminao do vrus (Pao et. a.l, 1991; Kedzia et. al., 1992; Lindsey et al.,
2009). No entanto, estudos em bovinos relatam a presena do BPV em diferentes tecidos
e fludos corpreos, tais como sangue, plasma, leite, colostro, placenta, lquido amnitico
e gametas, sendo considerados possveis meios de infeco (Stocco dos Santos et al.,
1998; Freitas et al., 2003; Yaguiu et al., 2006; Freitas et al., 2007; Lindsey et al.,2009).
7
TC, Melo
O ciclo de vida dos PV difere de todas as outras famlias de vrus. Sua reproduo
requer que as clulas epiteliais de revestimento ou mucosas estejam ntegras, uma vez
que a infeco dos vrus ocorre inicialmente em clulas basais do epitlio (Campo, 1997).
Nos tecidos basais, ocorre a expresso dos genes E que, no entanto, limitada, resultando
na proliferao e expanso lateral do epitlio das clulas infectadas. A replicao do
genoma viral e expresso dos genes L se d nas camadas granulares, supra-basais e o
empacotamento do DNA viral, nas camadas escamosas. A liberao de novos vrus
infecciosos ocorre nas camadas escamosas queratinizadas da pele (zur Hausen, 2002;
Doorbar, 2005) (Figura 4).
Fonte: modificada de Doorbar, 2005.
Figura 4 - Representao diagramtica da infeco do tecido epitelial por papilomavrus,

apresentando os diferentes estgios do ciclo viral com seu respectivo padro de expresso
gnica.
TC, Melo
Ocasionalmente, as verrugas ou leses benignas persistem e podem progredir para

carcinomas de clulas escamosas. As clulas transformadas, destes carcinomas, no
permitem uma longa maturao do vrus na clula, de modo que a progresso tumoral
considerada um processo de morte do vrus. O material gentico do PV algumas vezes
incorporado no genoma hospedeiro ou mantido como um elemento extracromossomal
que se replica em sincronia com o ciclo celular (Campo, 2006).
Para que ocorra a progresso tumoral necessrio que fatores transcricionais
sejam ativados. O PV possui duas protenas, E1 e E2, que desempenham funo essencial
no ciclo viral, atuando como reguladores da transcrio, segregao do genoma do vrus
(E2) e replicao do DNA viral (E1) (Baxter et al., 2005).
Semelhante a outros vrus, os PV podem se estabelecer como uma infeco
latente, presente no epitlio normal ou em tumores benignos. Estes epitlios quando
sofrem traumas podem levar a formao de papilomas em animais sem sinais clnicos da
doena (Ogawa et al., 2004). A leso no epitlio infectado por PV desencadeia uma
reativao do vrus, estimulando a produo de citocinas inflamatrias induzindo a
proliferao celular devido expresso dos genes virais (Campo et al., 1994a). Contudo,
o epitlio pode no ser o nico stio de latncia do PV, visto que possvel observar a
presena de seqncias de DNA do BPV em linfcitos circulantes de bovinos (Campo et
al., 1994b; Stocco dos Santos et al., 1998).
A deteco de DNA de BPV em linfcitos de bovinos realizada por grupos de
pesquisa independentes (Campo et al., 1994b, Stocco dos Santos et al., 1998, Campo,
2006) uma forte indicao de que a presena do DNA viral nestas clulas no
acidental, mas provavelmente tem implicaes biolgicas (Da Silva et al., 2001). Estudos
in vitro de VLP (virus like particles) vm evidenciando que os PV demonstraram uma
forte ligao com uma variedade de clulas do sistema imunolgico, o que fortalece a
TC, Melo
evidncia de que clulas sanguneas so mais um local de latncia (Pao et al., 1991;
Knowles et al., 1996;1997; Tseng et al., 1999).
1.2 Papilomavrus bovino (BPV)
O BPV um dos vrus mais estudados, considerando os PV dos animais. Em

bovinos ele induz tumores benignos do epitlio cutneo e mucoso, chamados papilomas
ou verrugas, que geralmente regridem. Ocasionalmente eles progridem, transformando
tumores benignos em carcinomas celulares escamosos (Morgan e Campo 2000; Nasir e
Campo, 2008). Estes vrus so um dos nicos PV que infectam espcies prximas.
Existem por exemplo relatos de infeco cruzada, de bovinos (infectados com BPV-1 e
/ou BPV-2) para eqinos, induzindo tumores chamados sarcides eqinos (Nasir e
Campo, 2008).
Atualmente, so conhecidos dez tipos de BPV (BPV1-10), dos quais seis j foram
extensivamente estudados quanto localizao da infeco e estrutura molecular (BPV16). Os BPV-1, BPV-2 e BPV-5 apresentam uma dupla fita de DNA com
aproximadamente 8.000 nucleotdeos e os BPV-3, BPV-4 e BPV-6, um genoma um
pouco menor, com aproximadamente 7300 nucleotdeos (Bloch e Breen, 1997; Ogawa et
al., 2007; Hatama et al., 2008).
Os 10 tipos de BPV esto classificados em grupos distintos, diferenciados quanto
especificidade do local de infeco. Inicialmente, esta classificao separava-os em dois
subgrupos (A e B), usando como parmetro as diferenas na estrutura genmica e nas
propriedades patolgicas do vrus. O subgrupo A (BPV-1, BPV-2 e BPV- 5) era
representado pelos BPV do grupo dos fibropapilomavrus, e subgrupo B (BPV-3, BPV-4
10
TC, Melo
e BPV-6) agrupava os BPV puramente epiteliotrpicos, induzindo papilomas verdadeiros

(Jarrett et al., 1984; Campo, 2002).
Recentemente, os BPV foram reclassificados em quatro grupos, baseando-se nas
similaridades das seqncias nucleotdicas: os Xi-Papilomavirius (BPV-3, BPV-4, BPV6, BPV-9 e BPV-10), que causam leses epiteliotrpicas; Delta-Papilomavrus (BPV-1 e
BPV-2), causadores de fibropapilomas, e Epsilon-Papilomavirus (BPV-5 e BPV-8), que
causam fibropapilomas cutneos e papilomas localizados e, diferindo dos outros BPV, o
BPV-7 no apresentou similaridades que pudessem permitir enquadr-lo em um dos trs
grupos. Deste modo, uma anlise filogentica baseada na completa estrutura da L1 foi
necessria para caracterizar este tipo viral, permitindo descrev-lo como outro gnero na
famlia Papillomaviridae (Ogawa et al., 2004;Villiers et al., 2004; Ogawa et al., 2007;
Tomita, et al, 2007; Hatama et al., 2008). Atualmente existem 14 supostos tipos de BPV
serem identificados e enquadrados nos grupos j estabelecidos (Ogawa et al., 2004;
Hatama et al., 2008) (Figura 5).
Fonte: modificada de Hatama et al., 2008.
Figura 5 - Agrupamento dos tipos de papilomavrus bovinos conforme a similaridade das

seqencias genmicas do gene L1. Delta-papilomavrus, BPV-1 e 2 (vermelho); Xipapilomavrus, BPV-3, 4, 6, 9, e 10 (amarelo) e Epsilon-papilomavius, BPV-5 e 8 (azul).
Em um grupo diferenciado encontra-se o BPV-7 (verde).
11
TC, Melo
1.2.1 Ao das oncoprotenas do BPV
As protenas virais induzem a proliferao celular no programada (o que permite

o crescimento desordenado das clulas infectadas), atuando diretamente no controle do
ciclo celular e interferindo na ao de receptor de crescimento epitelial por inativao de
protenas supressoras de tumor (Campo, 2006). A importncia de cada protena na
transformao celular varia entre os diferentes BPV (Tabela 1).
Tabela 1 - Formas de atuao das oncoprotenas virais, presentes nos trs gneros dos
papilomavrus: Xi papilomavrus (BPV-4, 3, 6, 9, e 10) apresentando os oncogenes E5 e
E7; Delta papilomavrus (BPV-1 e 2) e Epsilon papilomavrus (BPV-5 e 8) possuindo
os oncogenes E5, E6 e E7.
Atuao das ocoprotenas E5
Ativa protena kinases
envolvidas no controle celular
Interage com ativadores e
receptores celulares aumentando
o potencial mitognico;
Atuao das
ocoprotenas E6
Pode atuar sozinha
como ativador
transcricional
Induz a telomerase
celular e altera a
funo da p53
Atuao das ocoprotenas E7

Induz inativao da protena
(pRB)
Pode atuar em conjunto com E5
na progresso tumoral.
Inibem receptores MHC-I,

levando a regulao inibitria do
sistema imune.
Fonte: Campo, 2006; Borzacchiello e Roperto, 2008
Como descrito na Tabela 1, os Deltas-Papilomavrus codificam trs oncoprotenas

(E5, E6 e E7), enquanto que os Xi-Papilomavrus s codificam duas (E5 e E7), sendo os
nicos a no possurem a ORF E6. A ausncia da ORF E6 acarreta formas
diferenciadas de ao transformante destes PV. Experimentos realizados por Jaggar e
colaboradores (1990) mostraram as diferenas de ao transformante entre o BPV-1 e o
BPV-4. O BPV-1 codifica todas as informaes genticas requeridas para diferenciao
celular, transformando sozinho clulas fetais bovinas (PalF), diferindo do BPV-4, que
12
TC, Melo
incapaz de induzir sozinho a transformao, e necessita da expresso das ORFs E5 e

E7, para transformar as clulas PalF. Estes dados evidenciaram que os Xi-papilomavrus
no precisam de protenas E6 para sucessivos ciclos de infeco, mas necessitam da E5
para progresso do papiloma a carcinoma, no caso de BPV-4.
Experimentos em bovinos demonstram que a protena E5 do BPV-4 atua no
mecanismo de escape do sistema humoral diminuindo a regulao do sistema MHC de
classe I (Complexo Maior de Histocompatibilidade de Classe I), facilitando o
estabelecimento da infeco viral (Marchetti et al., 2002; Ashafi et al., 2005;
Borzacchiello e Roperto, 2008).
O aumento da expresso das oncoprotenas E6 e E7 regulado pela expresso do
gene E2 do BPV, de forma que a perda desse controle ou a inativao da expresso do
gene E2 parecem ser o ponto chave na forma de como o genoma viral transcrito (Ilves
et al., 2006).
1.3 Conseqncias da infeco pelo papilomavrus bovino
A papilomatose bovina uma doena de importncia econmica por apresentar

relevantes prejuzos aos produtores tanto do setor leiteiro como de corte (Corra e Corra,
1992). uma enfermidade infecto-contagiosa crnica, desenvolvida pela infeco do
vrus BPV, de carter tumoral benigna e natureza fibroepitelial, caracterizando-se por
apresentar tumores localizados na pele e mucosa. Tais tumores apresentam um carter
cosmopolita, sendo conhecidos popularmente por verruga ou figueira dos bovinos,
apresentando diferentes morfologias (pedunculada, plana, gro de arroz e couve-flor) na
regio do bere, mucosa e epitlios de revestimento (Santin e Brito, 2004). Geralmente
esta enfermidade no tem preferncia por raa ou sexo, mas tem sido observada uma
13
TC, Melo
prevalncia maior em animais com idade inferior a dois anos, levando a alta morbidade
nestes rebanhos (Corra e Corra, 1992) (Figura 6)
Fonte: o autor.
Figura 6 - Bovino da raa holandesa infectado com BPV exibido papilomatose bovina. A)
Papilomas em forma de couve-flor na regio do pescoo e cabea. B) Papilomas em forma
de couve-flor nas tetas.
Os principais prejuzos econmicos decorrentes da infeco pelo BPV so:
A
desenvolvimento de verrugas no bere (dificultando a ordenha e prejudicando a produo
leiteira), perda do couro (devido grande quantidade de papilomas e proliferao de
bactrias no local afetado), hemorragias, transtornos gerais txicos e outras doenas
secundrias graves (hematria enzotica e caraguat) que podem levar o animal
morte. As infeces no trato reprodutivo tambm levam ao desenvolvimento de
problemas graves, por promover disseminao da doena e eventual infertilidade por
leses secundrias nos tecidos do trato reprodutivo (Corra e Corra, 1992; Santin e
Brito, 2004).
Quanto localizao da infeco e das diferentes leses histopatolgicas
induzidas pelo BPV, inmeras evidncias vm demonstrando uma forte associao das
infeces (fibropapilomas) a tipos de BPV especficos, como descrito por Bloch e
colaboradores (1994) e Campo e colaboradores (1994a), onde as infeces com BPV-3, 4
14
TC, Melo
e 6 esto associadas a fibropapilomas em epitlios cutneo, digestrio e da teta,

respectivamente; BPV-1, a fibropapilomas no pnis e nas tetas; BPV-2, a fibropapilomas
no trato digestrio e as com BPV-5, a fibropapilomas com morfologias similares a gro
de arroz no bere (Jarrett et al., 1984). Contudo, existem controvrsias quanto s
denominaes utilizadas e estrutura histolgica das leses (Campo, 2002).
Embora exista uma forte relao de especificidade de infeco do PV ao epitlio,
alguns trabalhos vm demonstrando a presena de seqncias de DNA de BPV em outras
clulas que no as epiteliais, como ocitos, clulas de ovrio e tero, fludos uterinos,
smen, espermatozides e clulas do sangue perifrico (Stocco dos Santos et al., 1998;
Carvalho et al., 2003; Freitas et al., 2003;Yaguiu et al 2006; 2008; Lindsey, et al , 2009).
1.4 Interaes do BPV com co-fatores ambientais

O cncer, incluindo os cnceres induzidos por PV, uma doena multifatorial que
requer transformaes celulares para alcanar o estgio neoplsico, e geralmente est
associado a fatores ambientais (zur Hausen, 2002). Os PV nem sempre originam
processos de malignizao, porm, quando no existe uma boa resposta imune humoral,
os tecidos infectados podem sofrer progresso tumoral. Naturalmente, o processo de
infeco pelo vrus leva a uma imunoevaso passiva. No entanto, o PV pode utilizar vias
ativas para se esquivar do sistema imune do hospedeiro, como a represso (down
regulation) do MHC I, responsvel por apresentar peptdeos antignicos a clulas-T
efetoras (Araibi et al., 2004; Campo, 2002).
Em bovinos, os compostos imunossupressores da samambaia (Pteridium
aquilinum), a quercetina (3,3,4',5,7-pentahydroxyflavone) e o ptaquilosdeo atuam como
co-fatores ao BPV na transformao celular (Hopkins, 1986; Campo, 1992; Campo et al.,
15
TC, Melo
1994a; Wosiacki et al., 2006). Embora seja baixa a atividade citotxica destes compostos,
em experimentos in vivo e in vitro observa-se que as aes carcinognicas da planta tm
sido atribudas a estes agentes qumicos, sendo possvel detectar a presena destes
mutgenos, na urina e no soro do leite dos bovinos (Wosiacki et al., 2002; Falbo et al.,
2005). Estes compostos mutagnicos da samambaia so descritos por Recouso e
colaboradores (2003) como os responsveis pelas taxas aumentadas de aberraes
cromossmicas estruturais em homens e mulheres de Ouro Preto (MG), que consumiam
habitualmente em sua dieta brotos de samambaia.
A ao dos compostos mutagnicos presentes na samambaia pode induzir o
aumento na expresso de protenas oncognicas virais e a down regulation do MHC I.
Estas protenas atuam na ativao e mutao de genes ras e p53, respectivamente,
acelerando os processos de transformao das clulas epiteliais (Campo, 2006;
Borzacchiello e Roperto, 2008) (Figura 7).
Pteridium aquilinum
Ptaquiloside e Quercetina
Imunossupresso
Mucosa normal
Regresso
Oncoprotenas
E5/ E7
P53 EGFR c-H-ras

avaas
Papiloma
Carcinoma
Represso do MHC-I pela E5
Fonte: modificada de Campo, 2006.
Figura 7 - Diagrama esquemtico representando a interao entre BPV-4 e a samambaia

(Pteridium aquilinum) no desenvolvimento de tumor digestrio. O BPV-4 presente no
epitlio ativado pela ao imunossupressora da samambaia. Oncoprotenas virais so
expressas e podem levar progresso maligna.
16
TC, Melo
As principais doenas associadas ao consumo da samambaia em bovinos so:

cncer do trato digestrio superior (em bovinos infectados pelo BPV-4) e cncer de
bexiga urinria, neste caso tendo como principal manifestao a hematria enzotica
crnica (HEC) (principalmente em bovinos infectados pelo BPV-2). Em alguns
experimentos realizados por Campo e colaboradores (1994a) com animais infectados com
BPV-4 e alimentados com samambaias, observou-se o desenvolvimento de carcinoma de
esfago, adenomas, adenocarcinomas no duodeno, jejuno e do clon. Portanto, estes
relatos evidenciam que a associao destes dois fatores representa um alto risco na
progresso do cncer (Campo, 2006).
O envolvimento da samambaia com o BPV-1 e/ou BPV-2, culminando no
desencadeamento de tumores na bexiga tem sido demonstrado como um processo bastante
demorado (Falbo et al., 2005). Estudos experimentais em bovinos relatam que a presena do
BPV-2 e ingesto de compostos qumicos da samambaia, induzem HEC, presena de sangue
na urina, produzindo anemia e emagrecimento progressivo, alm de leses hemorrgicas e
hiperplsicas no animal (Borzacchielo et al., 2003; 2007). Segundo Campo e colaboradores
(1992) e Campo (1997), a funo exata do vrus junto com a samambaia e o possvel
sinergismo entre os fatores virais, qumicos e imunolgicos na formao do tumor ainda no
est bem esclarecido.
Tais doenas tm sido associadas a aumentos dos nveis de alteraes

cromossmicas (Walter-Moura et al., 1988; Stocco dos Santos et al., 1998; Lioi et al., 2004).
Walter-Moura e colaboradores (1988) relataram em animais afetados por HEC, a
presena de altos nveis de aberraes cromossmicas estruturais, em linfcitos B do
sangue perifrico. Stocco dos Santos e colaboradores (1998) demonstraram o aumento
dos nveis de aberraes cromossmicas em linfcitos do sangue perifrico de animais
17
TC, Melo
infectados experimentalmente com BPV, porm no expostos a componentes da

samambaia, evidenciando a ao clastognica do vrus.
Experimentos utilizando clulas Palf (linhagem celular de fibroblastos de palato
do bezerro) transfectadas com plasmdeos onde esto inseridas sequncias do gene E7 do
BPV-4 e do gene ras ativado objetivaram realizar anlise citogentica nestas clulas e
mostraram aumento significativo de clulas com alteraes cromossmicas estruturais e
numricas. Subseqentemente, quando estas clulas foram submetidas a pulsos de
quercetina, transformando-se em outra linhagem celular (EQ), se visualizou uma adio
de alteraes estruturais, descritas como associaes cntricas. Este aumento de
cromossomos marcadores possivelmente est correlacionado com a ao da quercetina,
que induz mutao em protenas do controle do ciclo celular, como p53, elevando os
erros no processo de diviso mittica e alteraes na funo da enzima telomerase,
facilitando as associaes centromricas em caritipo constitudo principalmente por
cromossomos acrocntricos (Leal et al., 2003).
1.5 Alteraes cromossmicas e interaes vrus - cromatina

As interaes dos vrus com o genoma hospedeiro podem desencadear alteraes
cromossmicas nas clulas dos hospedeiros, e estas alteraes so decorrentes de
mutaes, presentes nas seqncias de DNA que escapam do sistema de reparo atuante
no ponto de checagem, no ciclo celular (You et al., 2004).
Trabalhos descritos na literatura com o papilomavrus bovino vm demonstrando
que o sinergismo entre os fatores carcinognicos (quercetina) e as transformaes
celulares induzida pelo BPV, podem desencadear aberraes cromossmicas estruturais
(quebras, deleo e/ou adio de segmentos cromossmicos, fragmentos acntricos,
trocas entre cromtides) e numricas (aneuploidias e poliploidia) (Stocco dos Santos et
18
TC, Melo
al., 1998; Leal et al., 2003; Lioi et al., 2004; Peretti et al., 2007). Entretanto, no existem
relatos de especificidade, correlacionando tipo de BPV e tipo de alterao cromossmica
e/ou cromossomo especfico, acreditando que tais alteraes por vrus no genoma
hospedeiro sejam randmicas (Fortunato et al., 2000).
Alteraes na cromatina do hospedeiro, induzidas por vrus, ocorrem
principalmente devido expresso de oncogenes virais, os quais podem desencadear
alteraes mitticas que culminam na produo de clulas com aberraes. Duensing e
colaboradores (2000) e Duensing e Mnger (2002) demonstraram que a expresso
conjunta da E6 e E7 do HPV-16 pode sozinha elevar significativamente o nmero de
clulas com centrossomos anormais, induzindo aneuploidias.
Assim como os PV, outros vrus podem causar anomalias cromossmicas, tais
como Epstein-Barr (EBV), Herpesvrus humano (HHV) e bovino (BHV) (Peat et al.,
1986), hepatite B e C (Simon et al., 1991; Pietschmann et al., 2006), Citomegalovrus
(Fortunato et al., 2000), Adenovrus (zur Hausen, 1967, Mc Dougall et al., 1971), vrus
da influenza (Thadani e Polasa, 1979), vrus da rubola e poliovrus (Fortunato et al.,
2000). Anlises cromossmicas, em pacientes infectados com estes vrus, revelaram um
aumento significativo das freqncias de metfases com alteraes cromossmicas, onde
as principais alteraes encontradas foram falhas (gaps), quebras cromossmicas,
condensao cromossmica prematura, diviso prematura dos centrmeros, formao
triradial dos cromossomos, fragmentos acntricos, quebras telomricas, hiperploidia e
translocaes. Geralmente, os danos cromossmicos decorrentes destas infeces virais
foram descritos como randmicos, salvo algumas excees, como o citomegalovrus tipo
12, que causa quebras preferenciais nos cromossomos 17 (regio q21) e 1 (regio p36), e
o adenovrus tipo 12, 18 e 31, que causam gaps e quebras especificamente no
cromossomo 17 (Mc Dougall et al., 1971; Fortunato et al., 2000).
19
TC, Melo
Muitas destas anomalias cromossmicas so decorrentes de uma interao direta

do vrus, presos fisicamente ou se integrando ao genoma por meio de protenas virais e
celulares, ou mesmo indiretamente, devido ao das oncoprotenas virais, atuando na
dupla fita de DNA, como no caso dos vrus: PV, Epstein-Barr e Herpesvrus humano e
bovino (Kalantari et al., 2001; Botchan, 2004; Oliveira, et al., 2006).
A integrao do PV cromatina da clula hospedeira j foi descrita em clulas
com leses nos humanos, com integrao de seqncias virais em stios especficos
cromossmicos (Kalantari et al., 2001). Contudo, ainda no tem sido relatada a
integrao do BPV em bovinos; onde, as seqncias virais mantm-se epissomais,
ligando-se cromatina atravs da oncoprotena E2 (Mc Bride et al., 2006). Sabe-se que
as protenas codificadas por BPV ligam-se especificamente a stios repetitivos do DNA
viral e prendem o genoma viral a cromossomos da clula hospedeira, sendo esta funo
de conexo mediada pela protena E2, conectada a seqncias especficas do genoma
(motifs) que a une aos cromossomos mitticos por meio da protena cromossmica
Brd-4 (Mc Bride et al., 2006).
A protena E2 tem a funo de regular os processos transcricionais, e em unio
com a E1 (protena helicase), regula a produo de RNA mensageiro (RNAm). A E2
tambm responsvel por ligar o genoma viral ao hospedeiro, garantindo a segregao
deste genoma entre as clulas de modo eqitativo durante a diviso celular (Mc Bride et
al., 2006) (Figura 8).
20
TC, Melo
Fonte: modificada de Mc Bride et al., 2006.
Figura 8 - Diferentes funes da protena E2 do BPV-1. Protenas E2 (Amarelo)

conectando o genoma viral (roxo) aos cromossomos mitticos (azul) e, protenas E1
(vermelho) atuando junto a E2 na replicao.
A arquitetura da protena E2 caracteriza-se por dois domnios (N- e C- terminal),
ligados por uma regio flexvel chamada dobradia. O domnio N-terminal, que atua na
trans-ativao, importante tanto para transcrio e replicao quanto para a interao do
vrus com os cromossomos dos hospedeiros durante a mitose. O domnio C- terminal, que
atua na dimerizao, importante para interao com a seqncia ACCN6GGT do DNA
viral (You et al., 2004; Baxter et al., 2005; Abbate et al., 2006) (Figura 9).
Fonte: Abbate et al., 2006 .
Figura 9 Estrutura do complexo E2/ Brd-4. A -hlice do domnio N- terminal da E2

est em verde e o domnio C-terminal, regio no conectado, em vermelho. O segmento
entre estes dois domnios, a dobradia, est em amarelo. Em azul possvel visualizar a
protena Brd-4 ligando- se a E2 pelo domnio N- terminal.
21
TC, Melo
Os domnios C e N terminal so conservados nas protenas E2 de diferentes PV.

No entanto, se observa que a regio da dobradia apresenta uma variabilidade muito
grande nas seqncias de aminocidos (Abbate et al., 2006). Baxter e colaboradores
(2005) demonstraram que a E2 do BPV- 1 tem 34% de semelhana com a E2 do HPV-16;
estes estudos vm elucidando a importncia de conservao desta protena no papel de
disseminao viral dos PV.
Para que a protena E2 se ligue aos cromossomos dos hospedeiros, nveis de
expresses moderados desta protena so necessrios, contudo a integridade dos fatores
que medeiam essa conexo da E2 aos cromossomos tambm muito importante (Oliveira
et al., 2006). A interao da E2 com a protena Brd-4 (membro da famlia BET) so
fundamentais no momento de transcrio e segregao do genoma viral nas clulas do
hospedeiro, de forma que qualquer alterao nesta estrutura inviabiliza a segregao viral
durante a mitose. Mutaes em alguns domnios da protena E2 do BPV-1 e HPV-16
demonstram inviabilidades na formao do complexo E2/ Brd-4, impedindo a conexo do
vrus aos cromossomos (Zheng et al., 2005; Abbate et al., 2006). Assim como os BPV e
HPV, outros vrus (Epstein-Barr e Herpesvirus humano) que tm o seu genoma
fisicamente preso aos cromossomos dos hospedeiros, tambm necessitam de protenas E2
e Brd (Brd2 ou Brd4) para se ligarem (Botchan, 2004).
Algumas protenas E2 de HPV apresentam um padro distinto de conexo aos
cromossomos mitticos, se comparado a E2 do BPV-1, que no demonstra um local
especfico de ligao. Experimentos com o HPV-8 e HPV-11 indicam uma localizao
preferencial de E2, nas regies pericentromricas dos cromossomos mitticos, associados
aos centrossomos e aos fusos mitticos, respectivamente. Em alguns membros do gnero
-papilomavrus humano, as E2 so detectadas em cromossomos mitticos em fases
iniciais (prfase e prometfase) e tardias (telfase e citocinese) (Oliveira et al., 2006).
22
TC, Melo
1.6 Mecanismos de formao das anomalias cromossmicas
Alteraes cromossmicas so resultados da ao de agentes biolgicos, fsicos ou

qumicos (agentes mutagnicos e/ ou clastognicos), que provocam modificaes na
estrutura ou composio qumica das seqncias de DNA podendo ser visualizadas no
nvel de resoluo da estrutura do cromossomo mittico ou meitico (Pfeiffer et al.,
2000). As molculas de DNA so alvos permanentes de danos das mais variadas origens
e quando estes danos apresentam extenses suficientemente grandes ao DNA, possvel
visualizar os efeitos nos cromossomos mitticos atravs das aberraes cromossmicas.
Anlises experimentais tm apresentado que quebras na dupla fita de DNA so as
principais leses no processo de formao das alteraes cromossmicas, visveis
microscopicamente (Obe et al., 2002).
Todos os seres vivos sofrem certo nmero de mutaes espontneas, como
resultado de funes celulares normais ou interaes aleatrias com o ambiente. Contudo,
a ocorrncia de mutaes pode ser aumentada pelo contato com determinados compostos
causando mutaes induzidas (Pfeiffer et al., 2000). As aberraes cromossmicas
induzidas so uma das conseqncias biolgicas da exposio radiao ionizante e a
agentes txicos (Nasonova e Ritter, 2004). Experimentos com radiao tm sido
realizados para avaliar as regies cromossmicas mais susceptveis (hot spots) a
rearranjos e quebras. Estes estudos vm evidenciando que as regies subtelomricas dos
cromossomos so consideradas hot spots para formao de trocas de seqncias
cromossmicas, no visveis em microscopia normal (Drets et al., 2004).
Os telmeros esto localizados na regio distal dos cromossomos e so
estabilizados por algumas protenas especificas (TRF1 e TRF2) e experimentos
realizados in vitro e in vivo demonstram que alteraes na estrutura dos telmeros,
23
TC, Melo
decorrente de alteraes na protena TRF2 ou na atividade aumentada da telomerase,

apresentam conseqncias no reparo do DNA levando a danos e formao de rearranjos
cromossmicos nestas regies. Portanto, as regies cromossmicas subtelomricas so
consideradas crticas e esto associadas com a criao de fuses cromossmicas, que
podem ocorrer espontaneamente, formando cromossomos marcadores. Tais alteraes
esto relacionadas senescncia das clulas, alm de anormalidades como o cncer e
retardo mental (Karlseder et al., 1999; Drets et al., 2004).
As
distribuies
dos
pontos
de
quebra
que
desenvolvem
alteraes
cromossmicas, em clulas de plantas e animais no so freqentemente randmicas.

Contudo, os resultados da localizao dos pontos de quebra nos cromossomos so difceis
de interpretar, isto porque, a condensao diferenciada ao longo dos cromossomos, pode
alterar a posio observacional, de modo que, no se possam observar as aberraes
originalmente formadas (Karlseder et al., 1999; Obe et al., 2002).
O
acmulo
de
mutaes
pode
desencadear
diferentes
anormalidades
cromossmicas caracterizadas como: alteraes numricas e alteraes estruturais,

que geralmente persistem atravs da diviso celular e so transmitidas s clulas-filhas.
As aberraes cromossmicas numricas se caracterizam por um aumento ou diminuio
do nmero de cromossomos do caritipo normal e as estruturais so observadas quando
um ou mais cromossomos apresentam alteraes de sua estrutura. Estas anormalidades
podem envolver tanto cromossomos autossmicos quanto sexuais ou ambos (Obe et al.,
2002).
As variaes numricas so de dois tipos: as euploidias, clulas com nmero de
cromossomos mltiplo do nmero haplide (n), e as aneuploidias, onde h perda ou
ganho de um ou poucos cromossomos. As aneuploidias se devem a no segregao de um
ou mais cromossomos para as clulas-filhas durante a meiose e mitose, podendo ser
24
TC, Melo
originadas de anomalias ocorridas na meiose (pr-zigticas) ou nas mitoses do zigoto

(ps-zigticas) (Vasconcelos et al., 2007).
As alteraes estruturais se caracterizam por rearranjos que resultam de danos
seguidos de falhas nos processos de reparo. Estes tipos de rearranjos so mais difceis de
serem visualidazados se comparados com as aneuploidias, e podem ocorrer de muitas
formas, originadas pelos processos de quebras cromossmicas e/ou rearrajos
cromossmicos. Os rearranjos estruturais podem ser definidos como balanceados: o
conjunto cromossmico possui o complemento normal de informaes, ou seja, todas as
informaes genticas esto presentes, mas esto posicionados de modo diferente, e nobalanceados: o caritipo possui material adicional ou ausente (Hassold e Hunt, 2001).
As aberraes estruturais balanceadas so caracterizadas por inverses,
translocaes recprocas e translocaces robertsoniana, enquanto que as alteraes nobalanceadas so representadas por delees, duplicaes, cromossomos em anel,
isocromossomos e cromossomos dicntricos. Estes rearranjos podem ser mantidos
inalterados em divises meiticas e mitticas, desde que no ocorra o envolvimento dos
telmeros e dos cntromeros funcionais (Obe et al., 2002; Hall-Heather et al., 2006)
(Figura-10).
25
TC, Melo
Fonte: O autor.
Figura 10: Demonstrao de tipos de rearranjos estruturais provocados por quebras

cromossmicas. Os nmeros ou letras so a representao esquemtica dos sengmentos
gnicos envolvidos nas quebras.
As delees podem ocorrer devido existncia de uma ou duas quebras
cromossmicas terminais ou intersticiais, para a retirada do segmento gnico. Este
processo pode desencadear a formao de cromossomos de tamanho reduzido (com
deleo) e fragmentos acntricos imveis, devido ausncia de centrmeros. As
duplicaes so ocasionadas por processos de mutao cromossmica, que produz uma
cpia extra de alguma regio do cromossomo. Em organismos diplides, o conjunto de
cromossomos contendo uma duplicao ter trs cpias da regio do cromossomo
alterado (Jackson, 2003).
As inverses so formadas por duas quebras em um cromossomo, as quais

originam fragmentos que sofrem uma rotao de 180 graus e se ligam novamente, de
26
TC, Melo
forma invertida. Tais inverses podem ser descritas como paracntrica (no envolvendo
os centrmeros) e pericntrica (centrmeros envolvidos na inverso). Diferentemente de
delees e duplicaes, as inverses no causam uma mudana no balano de material
gnico expresso. So normalmente viveis e no causam anormalidades fenotpicas ao
portador,contudo, trs conseqncias para a prole (Hassold e Hunt, 2001) (Figura 11).
Fonte: O autor.
Figura 11 - Demonstrao esquemtica das inverses paracntrica e pericntrica. As

letras so a representao esquemtica dos segmentos gnicos envolvidos nas quebras.
As translocaes ocorrem quando quebras cromossmicas geram um segmento
de cromossomo que se liga a outro cromossomo. Estas translocaes podem ser de trs
tipos: simples, quando o fragmento quebrado de um cromossomo se insere em outro
cromossomo homlogo, recproca; quando os segmentos so trocados entre dois
cromossomos no homlogos e Robertsoniana; quando os segmentos so trocados entre
dois cromossomos no homlogos acrocntricos. Estas translocaes podem alterar
27
TC, Melo
drasticamente o tamanho dos cromossomos e a posio do centrmero nos cromossomos

em questo (Jackson, 2003).
Estas aberraes quase sempre implicam em problemas srios, inclusive na
formao de gametas, devido deficincia de pareamento cromossmico durante a
meiose, ocasionada por cromossomos que se unem anomalamente com seu homlogo que
no sofreu alterao (Hassold e Hunt, 2001; Obe, et al.,2002)
1.7 Caritipo bovino

A nomenclatura clssica de Lineu classifica taxonomicamente a espcie de
bovinos Bos taurus na ordem artiodactyla, famlia Bovidae, Subfamlia Bovinae, tribo
Bovini, gnero Bos. Esta classificao distingue a existncia de duas espcies no gnero
Bos: Bos taurus (representado pelas raas europias) e Bos indicus (representados pelos
zebunos e originrios de raas afro-asiticas). Contudo, a fertilidade entre estas espcies
levou a consider-los como subespcies, Bos taurus taurus (respresentado pelas raas:
Angus, Charolais ou charols, Devon, Frsia ou Holstein, Hereford, Holands, Limousin,
Nguni e Simental-semental ou sua-malhada) e Bos taurus indicus (respresentado pelas
raas: Brahman ou zebu americano, Gir, Guzer - Guzerat ou Kankrej, Hariana,
Indubrasil, Nelore e Zebu). Acredita-se que a subespcie Bos t. indicus tenha evoludo do
Bos t. taurus. (Modi et al.,1996; Britto e Mello, 1999) (Figura 12).
28
TC, Melo
Fonte: Taxobox Wikipedia em: dic.academic.ru/dic.nsf/enwiki/3202.
Figura 12 - Bovino da subespcie Bos taurus taurus (raa Holandesa) (A) e da subespcie
Bos taurus indicus (raa Zebu) (B).
Nos mamferos, o mecanismo de determinao sexual o XX;XY, sendo os
machos o sexo heterogamtico, com o cromossomo Y sendo um dos menores do
caritipo, com poucos genes ativos em grande parte consistindo de seqncias
altamente repetitivas de DNA no codificantes, localizados em regies de
heterocromatina constitutiva (Gallagher et al., 1999). A espcie Bos taurus apresenta em
seu caritipo original o nmero diplide (2n) com 60 cromossomos, representado por 58
autossomos acrocntricos e 1 par de cromossomos sexuais (XX;XY), sendo os machos
representados pelo sexo heterogamtico (Ford et al., 1980; Valdovinos et al., 2000). Na
subespcie Bos t. taurus os cromossomos X e Y so submetacntricos, onde o X
considerado um cromossomo mdio se comparado aos maiores autossomos (Di Berardino
et al., 1990), e o Y um dos menores do caritipo (Britto e Mello, 1999; Issa et al., 2004).
A morfologia do cromossomo Y do Bos t. indicus acrocntrico diferindo dos Bos t.
taurus que submetacntrico (Jorge, 1974).
Acredita-se que o cromossomo Y do Bos t. taurus diferiu do cromossomo do Bos
t. indicus por meio de uma transposio centromrica ou uma inverso pericentromrica,
uma vez que eles conservam uma mesma ordem de genes ao longo de suas regies distais
29
TC, Melo
e tm braos cromossmicos de diferentes tamanhos (Di Meo et al, 2005). A

identificao do cromossomo Y acrocntrico dos Bos t. indicus apresenta dificuldades,
pois quando em colorao convencional, so confundidos com outros autossomos
acrocntricos. Contudo, os bandamentos C e G associados a outras tcnicas,
citomoleculares, como o FISH, fornecem uma melhor caracterizao, possibilitando a
devida diferenciao do cromossomo Y entre as espcies da famlia Bovidae (Gallagher
et al., 1998; Chaves et al., 2000). Este problema de identificao estende-se a todos os
cromossomos autossmicos, devido morfologia acrocntrica e padro de bandas muito
semelhante entre todos os cromossmos (Di Berardino et al., 1990).
O padro de bandamento C, demonstrando a heterocromatina constitutiva (HC),
em Bos t. taurus e Bos t. indicus, apresenta diferenas significativas que permitem
distinguir citogeneticamente cada subespcie. O cromossomo Y do Bos t. indicus
apresenta blocos de HC na regio mediana do brao curto, divergindo da subespcie Bos
t. taurus, onde a HC aparece na poro terminal do brao longo. Tambm, os blocos de
HC do cromossomo X de Bos t. taurus so menores se comparados ao bloco
centromrico encontrado nos cromossomos acrocntricos autossmicos do mesmo (Gupta
et al., 1974).
As primeiras informaes, em bovinos, relacionadas localizao das RONs
(regies organizadoras de nuclolos) foram descritas por Mayr e colaboradores (1985), e
revelaram a localizao de cinco pares de RONs nos cromossomos 2, 3, 4, 11 e 28. Este
estudo das RONs revelou um alto grau de conservao dentro do gnero Bos, sendo
considerado um importante informativo filogentico (Mayr et al., 1987). Sondas 28S
foram usadas para comparar a localizao RONs entre a famlia Bovidae e Cervidae, e
relataram uma distribuio variada de RONs. A localizao cromossmica das RONs
apresentou-se terminais no gnero Bos, exceto para espcie Nilgai (tribo Boselaphini) que
30
TC, Melo
foram intersticiais. Estes dados indicaram que a localizao das RONs pode variar entre
espcies e dentro de espcies (Gallagher et al., 1998; Gallagher et al., 1999).
Existem controvrsias na literatura quanto localizao cromossmica das RONs,
em Bos taurus. Solinas-Toldo e colaboradores (1992) descreveram que os Bos taurus
possuem seis pares de RONs, localizados nos cromossomos 2, 3, 4, 11, 25 e 28. Contudo,
Iannuzzi e colaboradoreres (1996) e Gallagher e colaboradores (1999) apenas localizaram
cinco RONs, presentes nos pares 2, 3, 4, 11 e 25.
As mais comuns diferenas cromossmicas entre espcies da famlia Bovidae,
envolvem as fuses cntricas, representando a principal forma de evoluo cariotpica
(Iannuzi et al., 1995; Robinson et al., 1997). Outros estudos citogenticos de bovinos
relacionados a rearranjos estruturais tm demonstrado poucos efeitos fenotpicos,
inclusive na fertilidade (Rangel e Iannuzzi, 1990). Contudo, a presena da translocao
(1;29), que causa diminuio da fertilidade, ou polimorfismos, pode estar associados a
eventuais vantagens seletivas (Buoen et al., 1988).
Tcnicas citogenticas, como: hibridizao in situ fluorescente (FISH) e
bandamento C, G, Q e R vm sendo usadas para estabelecer qual o conjunto
cromossmico ancestral dos bovinos e entender rearranjos sofridos em cromossomos
sexuais de cada raa da tribo Bovini, alm de analisar os processos de formao das
anormalidades cromossmicas nos bovinos (Iannuzzi et al.,1990; Gallagher et al., 1998,
Di Meo et al., 2006).
1.7.1 Alteraes cromossmicas em bovinos
A primeira alterao descrita em bovinos foi a translocao rob 1/29 relatada por
Gustavsson e Rockborn em 1964, num estudo sobre leucemia linftica em gado vermelho
31
TC, Melo
sueco. Esta translocaes roberstonianas so consideradas as alteraes cromossmicas

mais comuns em bovinos e merecem especial ateno por afetarem a fertilidade dos
animais, apesar de aparentemente no levar a outras conseqncias clnicas nos
portadores quando em forma balanceada (Gustavsson, 1980, Long, 1985).
Muitos estudos posteriores relataram essa mesma translocao em vrias outras
raas, principalmente nas europias. Acredita-se que essa vasta expanso da translocao
1/29 poderia ser explicada por distribuio de uma mutao ancestral mantida nas raas
atuais (Popescu e Pech, 1991). A translocao rob 1/29 tem sido evidenciada
apresentando cromossomos monocntricos, provavelmente ela deve ser oriunda de um
complexo rearranjo em indivduos ancestrais envolvendo uma fuso cntrica, perda de
parte da heterocromatina centromrica e inverses pericntricas (Di Meo et al., 2006).
Alm da translocao
robertsoniana 1/29,
muitas outras translocaes
robertsonianas foram encontradas, como a translocao rob 4/10 (Bahri-Darwich et al.,

1993) 14/20 (Iogue e harvey, 1978); 16/20 (Rubes et al., 1996); 1/26, 1/21 (Miyake, et
al.,1987;1991); 15/20,16/18 (Iannuzzi et al.,1992;1999), 5/22 (Slota e Switonski, 1992).
Todas essas outras translocaes, no entanto, mostraram-se dicntricas, provavelmente
tendo origem recente. (Chaves et al., 2003).
32
TC, Melo
2. Objetivos
2.1 Objetivo geral
Avaliar o percentual de aberraes cromossmicas em linfcitos perifricos de bovinos Bos
tauru taurus, com e sem papilomatose, em uma fazenda do Estado de Pernambuco.
2.2 Objetivos especficos

Avaliar os nveis de aberraes cromossmicas presentes em linfcitos perifricos
de bovinos, apresentando ou no papilomatose cutnea, mantidos em contato em
uma fazenda.
Buscar demonstrar diferentes alteraes cromossmicas (associaes cntricas,
quebras cromatdicas/cromossmicas e fragmentos acntricos), com o auxlio da
tcnica de bandamento C em casos especficos, principalmente em associaes
cntricas.
Observar o nmero e localizao das RONs dos cromossomos da subespcie Bos
taurus taurus.
Indentificar por meio de bandamento G os cromossomos mais frequentemente

envolvidos em quebras e rearranjos.
33
TC, Melo
3. Material e Mtodos
3.1 Grupo amostral
O grupo amostral de 61 bovinos, da subspcie Bos t. taurus raa holandesa, foi
dividido em dois grupos: grupo controle (28 bovinos saudveis), no infectados por
BPV, coletados no hospital veterinrio da Universidade de So Paulo (FMVZ-USP) e o
grupo de bovinos infectados (33 bovinos com BPV), selecionado aleatoriamente em
uma fazenda da cidade de RibeiroPernambuco. O grupo dos infectados foi subdividido
em dois subgrupos: sintomtico (17 bovinos, apresentado a papilomatose) e
assintomtico (16 bovinos, com ausncia do quadro clnico da doena). Para diagnosticar
a presena ou ausncias de seqencias virais do BPV, as amostras de sangue foram
avaliadas por meio de PCR (tcnica molecular para deteco viral) por Diniz (2009).
3.2 Coleta do material biolgico
As amostras de sangue perifrico dos bovinos foram coletadas por profissionais,

mdicos veterinrios e tcnicos veterinrios. Para evitar contaminao das amostras,
degradao do material e possvel contaminao entre animais, procedimentos de assepsia e
armazenamento do material foram realizados no momento da coleta. A assepsia da regio
do corpo do animal a ser puncionada, para coleta da amostra de sangue foi feita com gua,
sabo e etanol (70%). Aps a desinfeco da rea circundante do bere, foi realizada a
coleta do sangue perifrico utilizando agulhas descartveis de sistema vacutainers
contendo anticoagulante heparina ou EDTA.
As amostras de sangue foram transportadas para o laboratrio em isopor com
gelo, para evitar degradao. No laboratrio, as amostras foram separadas da seguinte
34
TC, Melo
forma: as coletadas com heparina foram utilizadas para estudos citogenticos, sendo
submetidas a culturas temporrias de linfcitos, e as com EDTA, encaminhadas para
avaliar a existncia ou ausncia do BPV, por meio de reao em cadeia da polimerase,
PCR, (dados utilizados na pesquisa de mestrado de Diniz, 2009).
3.3 Anlise citogentica

3.3.1 Cultura de linfcitos
Aps a obteno das amostras biolgicas, 18 gotas de cada amostra de sangue

perifrico com heparina foram inoculadas em meio caritipo pronto (Cultilab) e em meio
RPMI (Cultilab), enriquecido com 10 % de soro e 2 % de fitohemaglutinina (Cultilab).
As culturas foram mantidas em estufa a 37C por 71 horas e, decorrido este
perodo, acrescentou-se 0,1 mL de colchicina (concentrao 16 g/mL), por uma hora a
37C. As culturas foram, ento, centrifugadas a 1000 rotaes por minuto (rpm) durante
10 minutos, e as clulas do pellet de leuccitos foram hipotonizadas em soluo 0,075
M de Cloreto de Potssio (KCL) pr-aquecido (37C) durante 10 minutos. Em seguida,
foi adicionado 1 mL de fixador (metanol:cido actico, na proporo 3:1) nas culturas
hipotonizadas e novamente foram centrifugadas. As clulas do pellet foram fixadas por
trs trocas sucessivas de fixador. As culturas foram mantidas com 5 mL de fixador em
freezer, visando a conservao do material at a anlise.
3.3.2 Preparao das lminas
As culturas de linfcitos preparadas e conservadas como descrito acima, foram

centrifugadas a 1000 rpm por 10 minutos. Em seguida, retirou-se o sobrenadante at restar
35
TC, Melo
cerca de 1 mL de fixador. O pellet foi homogeneizado ao fixador com pipeta Pauster e,

por fim, duas ou trs gotas de material foram pingadas em lmina de vidro.
3.3.3 Parmetros para anlise citogentica
A anlise dos cromossomos bovinos foi realizada inicialmente sob condies de

teste cego, ou seja, no se sabia o quadro clnico do bovino a ser analisado, para
minimizar os possveis vieses que pudessem induzir a seleo preferencial de metfases
que sugerissem anormalidades.
Para anlise convencional, as lminas foram coradas com soluo de Giemsa a 5%
em tampo fosfato, pH de 6,8. Foram analisadas entre 50 a 100 metfases por indivduo,
avaliando as alteraes cromossmicas, de forma a contabilizar todos os tipos de
aberraes cromossmicas, numricas e estruturais, mais frequentes nos diferentes grupos
de bovinos estudados.
Dois parmetros principais de anlise foram levados em considerao:
1.
A determinao do nmero fundamental;
2.
O nmero e tipos de alteraes encontradas em cada clula.
As anlises do padro de bandamento C e G foram realizadas sob aspectos

qualitativos (Tabela-1). O bandamento C buscou evidenciar as regies centromricas das
metfases que comprovassem as associaes cntricas, quebras cromatdicas,
cromossmicas e fragmentos acntricos. O bandamento G foi usado para tentar
identificar os cromossomos preferencialmente envolvidos nos rearranjos. A marcao
com nitrato de prata foi necessria, para identificar o nmero e localizao das regies
organizadoras de nuclolos (RONs) ativas da subespcie Bos t. taurus, evidenciando as
36
TC, Melo
possveis associaes entre elas (Tabela 2). As metfases foram analisadas e fotografadas
em fotomicroscpio Axiophot Zeiss, em aumento de 1000X.
Tabela 1: Descrio dos protocolos utilizados nas tcnicas de bandamento C e G.

Bandamento C
Bandamento G
1- Lminas envelhecidas (3 a 4 dias)
1- Lminas envelhecidas (5 a 7 dias)
2- Hidrlise das lminas (30 minutos em HCl
2- Submeter as lminas em tripsina

(0,1%), a temperatura ambiente com
controle do tempo de imerso (1s para cada
dia de envelhecimento da lmina)
3- Lavagem (gua destilada e dois banhos
sucessivos de soro fisiolgico)
4- Colorao (coradas com soluo de azul
de metileno, segundo Wright -5% em
tampo fosfato pH 6,8)
0,1N, temperatura ambiente)

3- 1 lavagem lminas (gua destilada)
4- Hidrxido de Brio 5% (60C por 12s)
5- 2 lavagem (gua destilada seguida de cido
clordrico 0,1N, para retirar o Brio)
6- 2x SSC (incubar em 60C, por 40 minutos)
7- Colorao (Giemsa a 5%, por 7minutos)
*
*
*
Fonte: Leal et al., 2003
Tabela 2: Descrio do protocolo modificado, da tcnica de marcao com nitrato de

prata, para evidenciar as RONs.
Marcao com Nitrato de Prata: para observao das RONs

1- Utilizar uma lmina com material a ser analisado e pingar quatro gotas de gelatina, juntamente
com quatro gotas de soluo de nitrato de prata (50%) cobrindo com a lamnula
2- Colocar a lmina, em cama mida, a 70C por 3 minutos, transcorrido este tempo analisar ass
lminas em microscpio ptico
Fonte: Guerra e Sousa, 2002
37
TC, Melo
3.4 Anlise de dados

Foram realizadas comparaes entre as taxas de anormalidades cromossmicas,
estruturais e numricas, nos bovinos controles, assintomticos e sintomticos. Na anlise
das amostras independentes, verificou-se o percentual e a variabilidade de aberraes
cromossmicas nos trs grupos, observando em que grau de significncia as amostras
demostravam-se divergentes. O nmero total de clulas analisadas de bovinos foi
divergente dentro de um grupo e entre os grupos estudados, variando de 50 a 100 clulas
por indivduo. Portanto, os valores absolutos, foram transformados em percentagens para
assumirem um grau de equivalncia entre as amostras, possibilitando fazer comparaes
dentro de um grupo ou mesmo entre amostras de grupos diferentes (Anexos 1, 2 e 3). O
conjunto de dados foi analisado em um programa de estatstica (Bioestat 5.0).
3.4.1 Anlises estatsticas

O nmero de observaes citogenticas adquiridas durante a anlise foi submetido
a clculos estatsticos. Foram utilizados mtodos estatsticos que pudessem avaliar as
diferenas entre trs e duas amostras independentes respectivamente, com nmero
amostral inferior a 30. A anlise estatstica para comparar os trs grupos, controle,
assintomticos e sintomticos, foi realizada usando anlises de varincia Kruskal-Wallis
(Teste H), para avaliar a varincia dentro das amostras e entre as amostras. Em seguida,
utilisou-se um teste no paramtrico, chamado Teste Mann Whitney (Teste U). Estes
testes obedeceram ao nvel de significncia de P>0.05, onde o P representa a
probabilidade que determinar se a hiptese inicial (Ho) ser aceita (P>0,05, no existe
diferenas significativas entre os grupos), ou se uma hiptese alternativa (H1) prevalecer
(P<0,05 existe diferenas significativas entre os grupos). O teste de Mann Whitney foi o
teste escolhido por ser muito utilizado em estudos citogenticos (Lioi et. al., 2004).
38
TC, Melo
Estatsticas descritivas tambm foram usadas para mensurar a mdia (Md.) e o

desvio Padro (DP) do nmero de clulas dos grupos avaliados. O mtodo descritivo
possibilitou observar as proximidades estatsticas entre o conjunto de clulas aberrantes
nos trs grupos, alm de comparar a prevalncia dos tipos de alteraes.
39
TC, Melo
4. Resultados
Atravs da citogentica convencional (colorao com Giemsa) e em condies de
teste cego, observamos as frequncias e tipos de aberraes cromossmicas presentes
nos linfcitos perifricos dos 61 bovinos Bos t. taurus (raa holandesa) infectados ou no
por BPV.
No grupo amostral controle representado por 28 bovinos, foram analisadas 1400
clulas e apenas 55 apresentavam alteraes cromossmicas (percentual mdio de clulas
alteradas por indivduo de 4%). No grupo amostral de bovinos infectados por BPV (tipo
1 e/ou 2), representado por 33 animais, foram analisados 50 a 100 clulas por indivduo,
totalizando 2203 clulas das quais 918 apresentavam uma ou mais aberrao
cromossmica. No subgrupo sintomtico (17 bovinos) 1275 clulas foram analisadas,
destas 544 eram aberrantes, apresentando uma mdia de 42,71% de clulas alteradas por
indivduo. No subgrupo assintomtico (16 bovinos) 928 clulas foram analisadas, destas
374 demonstravam-se alteradas, apresentando uma mdia de 40,19% de clulas alteradas
por indivduo. As anlises citogenticas do grupo controle e dos bovinos infectados com
BPV esto descritas na Tabela-1.
Tabela -1: Descrio geral da anlise citogentica de cada grupo de bovino, relatando a
percentagem de clulas com aberrao por grupo.
Grupo
C(1)
As (2)
S (3)
Sexo/
Idade/
Raa
N de
bovinos
Avaliados
N de
clulas
Analisadas
N de
clulas
c/aberrao
% de clulas
c/aberrao
(md/DP)
P (Teste H)
P (Teste U)
Fmea/2- 6
anos/holands
28
1400
55
4 2
(P< 0, 0001)
1 e 2; 1 e 3
Fmea/4 - 6
anos/holands
Fmea/ 4 6
anos/holands
16
928
374
40, 1910
(P< 0,
0001)
1 e 2;3
(P= 0,62)
2e3
17
1275
544
42,77, 8
(P= 0,18)
2e3
Teste H: Teste de Kruskal-Wallis; Teste U: Teste Mann WhitneyC (1): grupo controle; As
(2): subgrupo assintomtico; S (3): subgrupo sintomtico. mdiaDP (Mdia aritmtica
desvio padro).
40
TC, Melo
Os dados descritos na Tabela-1 relataram que a avaliao estatstica, com o Teste

H, do nmero de clulas alteradas demostrou que o grupo dos bovinos AS e S foram
homogneos (P=0,62), no apresentando diferenas na varincia de clulas alteradas
entre as amostras de um subgrupo (AS ou S) ou mesmo comparando as amostras entre os
dois subgrupos (AS e S). Entretanto, pde-se relatar de maneira bastante significativa
(P<0,0001), que a variabilidade de clulas alteradas entre o grupo controle e os infectados
por BPV maior dentro do grupo dos bovinos infectados.
As anlises do Teste H foram corroboradas pelo Teste U, o qual no demonstrou
diferenas significativas (P=0,18) entre o percentual de clulas com alteraes, nos
subgrupos sintomticos e assintomticos. Entretanto, comparando os subgrupos
infectados (sintomticos e assintomticos) com o grupo controle, observa-se um aumento
bastante significativo (P< 0,0001) nos nveis de clulas com alteraes cromossmicas do
grupo infectado por BPV.
As principais alteraes cromossmicas identificadas foram: associao cntrica
(AC), fragmento acntrico (FA), associao telomrica (AT), associao telomrica por
uma cromtide (ATcr), quebra cromatdica (QT), quebra cromossmica (QM), gaps,
aneuploidia, poliploidia, adio ou deleo de segmento cromossmico (add ou del) e
separao precoce de cromtides (SPcr) (Figuras - 1, 2 e 3).
Os tipos de aberraes nos grupos infectados, encontradas com maior frequncia,
foram: associaes cntricas e fragmentos acntricos. O percentual de cada tipo de
alterao encontra-se ilustrada no Grfico 1.
41
TC, Melo
Figura 1- Metfases bovina, normal e com alterao cromossmica. (A): Metafse normal. (B): Metfase poliploide com 120 cromossomos
e um fragmento acntrico (FA). (C): Metfase aneuploide com 59 cromossomos. As setas em preto indicam os cromossomos X e em
vermelho indica o cromossomo com alterao.
42
TC, Melo
Figura 2 - Alteraes cromossmicas estruturais. (A) Associao telomrica (AT). (B)

Associao telomrica por uma cromtide (ATcr). (C) Separao precoce de cromtides
(SPcr) e fragmento acntrico (FA). (D) Adio ou deleo de segmento cromossmico
(add ou del). As setas em preto indicam os cromossomos X e em vermelho indicam os
cromossomos com alteraes.
43
TC, Melo
Figura 3 - Alteraes cromossmicas estruturais. (A) Fragmento acntrico (FA) e gap;

(B) Quebra cromatdica (QT). (C) Quebra cromatdica (QT) e quebra cromossmica
(QM). (D) Associao cntrica (AC). As setas em preto indicam os cromossomos X e
em vermelho indicam os cromossomos com alteraes.
44
TC, Melo
Grfico 1 - Percentual de aberraes cromossmicas no grupo de bovinos infectado com

BPV.
De acordo com os tipos de alteraes observadas, realizaram-se comparaes

entre os grupos C(1) e os subgrupos As(2) e S(3). Para execuo das anlises estatsticas,
utilizou-se o teste de Mann Whitney, o qual pde evidenciar quais aberraes eram
divergentes significativamente entre os grupos. Na Tabela 2 pode-se observar a
mdia/DP em percentual de cada tipo de alterao, com seu respectivo valor de P
(probabilidade), mensurado por meio do Teste U. Estes dados demonstram as diferenas
de alteraes cromossmicas com graus de significncia variados entre os subgrupos
As(2) e S
45
TC, Melo
Tabela 2 - Percentual (%) da mdia de clulas e seus respectivos desvios padro (DP) para cada alterao cromossmica encontrada no grupo
de bovinos e as diferenas estatsticas significantes de cada alterao, encontrada nos subgrupos infectados.
Alteraes numricas
Alteraes estruturais
Grupo
Aneuplidia
Poliploidia
AC
AT
ATcr
Gaps
FA
QT
QM
add ou del
SPcr
C (1)
--
--
--
--
--
2,712,19
--
0,711,24
--
--
0,570,92
As (2)
6,444,97
1,311,78
8,814,83
1,752,05
2, 8673,66
8,259,09
11,947,18
10,317,07
1,693,4
2,132,75
4,254,02
S (3)
5,243,51
0,591,23
1,181,81
4,593,74
3,473,84
10,297,85
5,066,41
0,350,7
2,242,73
6,064,79
P=0,288
P=0,101
P= 0,1567
P= 0,1245
P= 0,0373
P= 0,0047
P=0, 175
P= 0, 387
P= 0, 161
P (Teste U)
(S eAs)
17,538,39
P= 0,002
P= 0, 204
Em vermelho: Alteraes que demonstraram diferenas significativas

md DP: Mdia e desvio padro
Associao cntrica (AC), fragmento acntrico (FA), associao telomrica (AT), associao telomrica por uma cromtide (ATcr), quebra
cromatdica (QT), quebra cromossmica (QM), Gaps, aneuploidia, poliploidia, adio ou delo de segmento cromossmico (add ou del) e separao
precoce de cromtides (SPcr).
46
TC, Melo
As associaes cntricas s foram evidenciadas no grupo de bovinos com BPV. O

teste-U, relatou que existem diferenas significativas de AC com P= 0,002 entre os
subgrupos As(2) e S(3), sendo a maior proporo de AC no subgrupo S(3). No entanto
foi evidenciado que as diferenas significativas de QT (P=0,037) e gaps (P=0,0047),
esto em maior quantidade no subgrupo As (2).
Relacionando o grupo C(1) com os subgrupos As(2) e S(3), observou-se
diferenas bastante significativas de QT(P<0,0001), (P< 0,001), e SPcr, (P=0,002),
(P=0,003) respectivamente entre os grupos. Estes dados evidenciaram que o grupo
controle apresenta nveis menores QT e SPcr se comparados com os subgrupos com
BPV. Contudo, quando se fez comparaes entre o percentual de gaps observados entre
C(1) e os subgrupos As(2) e S(3), s foi possvel observar diferenas significativas entre
o grupo C(1) e As(2) (P=0,02), no evidenciando significncia (P=0,5) nas comparaes
entre o grupo C(1) e S(3).
Algumas aberraes cromossmicas, como associao cntrica (AC), quebras
cromatdicas (QT) e associao telomrica (AT), foram tambm avaliadas por meio da
tcnica de bandamento C (Figura 4).
47
TC, Melo
Figura 4 - Bandamento C evidenciando algumas alteraes estruturais. (A) Associao

cntrica (AC). (B) Associao telomrica (AT). (C) Associao cntrica (AC), quebra
cromatdica (QT). (D) Associao cntrica (AC). As setas em preto indicam os
cromossomos sexuais e as vermelho indicam os cromossomos com alteraes.
48
TC, Melo
Embora tenha sido possvel comprovar alguns tipos de rearranjos cromossmicos

e relatar o aumento de alguns tipos especficos de alterao, no foi possvel
correlacionar ao viral com stios especficos nos cromossmicos ou mesmo com
cromossomos preferenciais, devido s limitaes na resoluo da tcnica de bandamento
G.
A tcnica de colorao com nitrato de prata, realizada nas clulas da subspcie
Bos t. taurus, identificou nove RONs ativas, localizadas nos cromossomos autossmicos,
no brao longo na regio distal aos centrmeros (Figuras 5).
Figura-5: Localizao de nove cromossomos autossmicos com

RONs ativas, na regio distal ao centrmero (setas em preto). As
setas em vermelho indicam os cromossomos X.
49
TC, Melo
5. Discusso
5 .1
Infeco viral vesos alteraes cromossmicas

Devido ao oncognica do papilomavrus bovino (BPV), de grande
importncia o desenvolvimento de estudos sobre estes vrus e o entendimento das

diversas formas de atuao do vrus sobre a cromatina hospedeira nos diferentes estgios
do ciclo celular. Neste sentido, estudos pioneiros sobre nveis aumentados de aberraes
cromossmicas em linfcitos de animais cronicamente ou experimentalmente infectados,
expostos ou no ao consumo de samambaia trouxeram luz a importncia da ao viral
sobre a cromatina hospedeira e conduziram hiptese de ser o linfcito possvel stio
viral (Walter-Moura et. al.,1988; Stocco dos Santos et al., 1998).
Os BPV parecem poder permanecer em estgio latente nas clulas hospedeiras,
especialmente nos linfcitos (Campo, 1994b) o que vem sendo comprovando pela
presena de sequncias virais em tecidos clinicamente normais (Borzacchiello e Roperto,
2008). Considerando essa discusso sobre a latncia do vrus BPV em tecidos sem
sintomas para o BPV, porm infectados com vrus e com nveis aumentados de
aberraes cromossmicas em linfcitos perifricos, observou-se no presente estudo que
embora os animais controles (sem vrus) apresentassem alguns tipos de alteraes
cromossmicas, os animais infectados com BPV1e/ou 2 (assintomticos ou sintomticos)
apresentavam um aumento bem mais significativo na percentagem de clulas com
aberrao.
Dentre as alteraes cromossmicas peculiares ao grupo dos bovinos infectados,
observadas neste trabalho, destacam-se as alteraes numricas (aneuploidia e
poliploidia) e estruturais [associao cntrica (AC), associao telomrica (AT),
associao telomrica por cromtides (ATcr), quebra cromossmica (QM) e adio ou
50
TC, Melo
deleo se segmentos cromossmicos (add ou del)]. Algumas dessas alteraes

estruturais, tais como AT, ATcr, add ou del e SPcr no tem sido observadas com
frequncia em clulas bovinas sob ao do vrus BPV. Entretanto, existem evidncias de
clulas humanas infectadas por HPV in vitro com estes tipos de alteraes (White et al.,
1994; Toldo et al.,1997; Duensing et al., 2000; Duensing e Mnger, 2002).
5.2 PV em sinergismo com co-fatores ambientais podem desencadear aberraes

cromossmicas
Sabe-se que a maioria das aberraes cromossmicas ocasionada por
modificaes epigenticas no genoma, que levam a falhas no reparo do DNA na fase S
(sntese) do ciclo celular, alterando os mecanismos de controle e segregao dos
cromossomos. Estas mudanas na integridade do genoma tm sido evidenciadas, quando
as clulas esto sendo transformadas por vrus ou mesmo por agentes qumicos (Obe et.
al., 2002). Compostos flavonides, como a quercertina, presentes na samambaia podem
atuar como co-fatores para os PV, ativando as oncoprotenas (E6, E7 e E5) que
modificam primariamente a estrutura da dupla fita de DNA, induzindo diferentes
alteraes cromossmicas (Campo, 2006).
A maioria das anlises experimentais avaliando alteraes cromossmicas em
clulas bovinas com BPV tem sido demonstrada em animais expostos ao consumo da
samambaia, a qual possui compostos flavonides que atuam em sinergismo com as
oncoprotinas virais do BPV, promovendo condies para o vrus sair do estado de
latncia (Walter-Moura et al., 1988; Leal et al., 2003; Lioi et al., 2004; Campo, 2006;
Peretti et al., 2007).
Leal e colaboradores (2003) em experimentos utilizando clulas de PalF
transformadas experimentalmente in vitro, com um plasmdio contendo sequncias do
51
TC, Melo
gene E7 do BPV-4 e submetidas a pulsos quercetina, relataram a presena de diferentes

alteraes cromossmicas, tais como associao cntrica, fragmentos acntricos e
quebras cromossmicas. Outros estudos realizados por diferentes grupos de pesquisas,
tambm tm relatado a presena de alteraes cromossmicas semelhantes, como quebras
cromatdicas, quebras cromossmicas, fragmentos acntricos, gaps, aneuploidias e trocas
cromatdicas, nos grupos de bovinos infectados com BPV e expostos a compostos da
samambaia (Walter-Moura et al.,1988; Lioi et al., 2004; Peretti et al., 2007).
Neste estudo, embora os animais no estivessem em contato com co-fatores
presentes na samambaia, eles tambm demonstraram nos seus linfcitos muitas alteraes
cromossmicas. Estes achados tambm foram verificados por Stocco dos Santos e
colaboradores (1998), evidenciado a ao clastogentica viral, em linfcitos perifricos
de bovinos assintomticos infectados experimentalmente por seqncias de DNA do
BPV- 2, no expostos a samambaia. Outros experimentos realizados em humanos
demonstram que, mesmo na ausncia destes co-fatores possvel observar a atividade das
oncoprotinas virais dos PV desestabilizando o genoma do hospedeiro (Narechania et al.,
2004).
Embora relatos na literatura descrevam as diferentes alteraes ocasionadas por
BPV, estudos no tm descrito cromossomos especficos ou regies preferencialmente
envolvidas com a interao do BPV aos cromossomos da clula hospedeira (Leal et al.,
2003; Lioi et al., 2004). Isto pode ser devido s limitaes de identificao encontradas
no padro de bandamento G dos cromossomos bovinos, os quais apresentam um padro
de bandas claras e escuras similares, sendo difcil distingui-los, principalmente quando
eles no se encontram to alongados em fase de prometfase (Di Berardino et al., 1990).
52
TC, Melo
5.3 Alteraes cromossmicas como conseqncias da ao das oncoproteinas virais

5.3.1 Associaes telomricas (AT) associaes cntricas (AC), fragmentos acnticos
(FA) e gaps
Alguns experimentos tm discutido que a formao de AT e ATcr podem ser
decorrentes de associaes de RONs, localizadas na regio distal de alguns cromossomos
(Iannuzzi et al., 1996; Gallagher et al., 1999). Como pde ser observado para os
cromossomos: 2, 3, 4, 11 e 28, dos bovinos da espcie bison, realizados por Mayr e
colaboradores (1987). Portanto, poderamos supor ao analisar nossos resultados que
algumas das associaes telomricas (AT e ATcr), observadas neste experimento, fossem
decorrentes da associao destas RONs prximas aos telmeros distais, embora no tenha
sido observado associaes de RONs, nas clulas submetidas a marcao com nitrato de
prata. Entretanto, nossos dados demonstram uma alta frequncia de associaes entre
telmeros proximais (AC) (mdia de 8,84,8 nos bovinos assintomticos e 17,58,4 nos
sintomticos), no prximo s RONs. Neste caso estes rearranjos no esto ligados
presena das RONs associadas.
Portanto sugerimos que estas associaes podem ser decorrentes da perda parcial
ou total das regies subtelomricas, desencadeada pela ao oncognica do BPV, atravs
da disfuno da telomerase sob efeito de oncoprotenas p53 (Leal et al., 2003), uma vez
que, foram observadas em alta frequncia, estando presentes nos grupos infectados por
BPV e ausentes nos animais controles. Estas associaes telomricas tm sido
evidenciadas e comprovadas por meio da tcnica de FISH (hibridizao in situ
fluorescente), em experimentos com clulas humanas infectadas com HPV-16 (White et
al., 1994, Crabbe et al., 2007).
A presena de alteraes cromossmicas estruturais e numricas em clulas
humanas infectados com HPV tem sido atribuda principalmente ao das
53
TC, Melo
oncoproteinas E6 e/ou E7 de HPV de alto risco (White et al., 1994; Duensing e Mnger,
2002). Experimentos realizados por White e colaboradores (1994) utilizando fibroblastos
e queratincitos humanos, infectados com HPV-16, esclarecem a origem de algumas
aberraes cromossmicas ocasionadas pela ao viral mediada por oncoprotenas E6 e
E7. Estes experimentos demonstraram a existncias de instabilidades genmicas distintas,
em queratincitos humanos, nas primeiras passagens de cultivo celular, evidenciando a
presena de 8% de associao telomrica e 6% de clulas com outros rearranjos. As
associaes descritas nas clulas cultivadas (fibroblastos) em passagens tardias
expressando E6 e E7 ou apenas E6 demonstraram um agravamento dessas alteraes
(rearranjos, associaes telomricas, aneuploidias e tetraploidias). Estes tipos de
rearranjos podem ser cruciais na ativao de oncogenes e inativao de genes supressores
de tumor (Gisselsson et al., 2001).
A expresso de ocoproteinas E7 e/ou E6 evidenciada atravs da formao de
pontes anafsicas, as quais tipicamente desenvolvem quebras cromossmicas que levam
a produo de diferentes anormalidades estruturais, como associao telomrica,
decorrente da perda parcial ou total dos telmeros e fragmentos acntricos. A presena
de pontes anafsicas, observadas em clulas infectadas com HPV, leva a uma variedade
de fentipos e perfis genticos dentro de uma populao de clulas tumorais, e isso se
deve formao de rearranjos cromossmicos nos ciclos celulares, ocasionados pela
presena de quebras e fuses (Gisselsson et al., 2000; Gisselsson et al., 2001).
Uma grande quantidade de gaps tambm tem sido observada em clulas bovinas
com BPV (Peretti e colaboradores (2007). Entretanto, os referidos autores fizeram uma
anlise diferenciada excluindo os gaps do conjunto de clulas alteradas. Esses autores no
consideraram os gaps como sendo alteraes to importantes, por serem parmetros
muito subjetivos de serem interpretados, alm disso, sugeriram que esses tipos de
54
TC, Melo
alteraes podem ser fenmenos ocasionados por problemas tcnicos decorridos durante
as preparaes cromossmicas. Entretanto, de modo semelhante s anlises de Lioi e
colaboradores (2004) os gaps descritos neste experimento foram contabilizados, por
terem se mostrado muito significativos entre os trs grupos (controles, assintomticos,
sintomticos), principalmente no subgrupo de bovinos assintomticos, com uma mdia de
8,39,09 diferindo significativamente entre o subgrupo sintomtico (P= 0,04) e controle
(P= 0, 019).
5.3.2 Alteraes numricas (aneuploidias e tetraploidias)
Observou-se no presente estudo que o grupo dos bovinos infectado com BPV
possui clulas aneuploides, enquanto que nos bovinos controles essa alterao estava
ausente. As comparaes realizadas quanto ao aumento de clulas aneuploides
hipoploides (2n<60), entre bovinos sintomticos (5,243,5) e assintomticos (6,444,97)
no foram significativas (P=0,29), demonstrando que o vrus est atuando independente
do quadro clnico do bovino acometido pelo BPV. Considerando as frequncias de
alteraes cromossmicas, estruturais e numricas, do grupo controle deste trabalho
(21), foi possvel observar que as frequncias (21,5), (42) de clulas aberrantes nos
grupos controles de Peretti e colaboradores (2007) e Lioi e colaboradores (2004)
respectivamente, no divergiram muito.
A presena de alteraes numricas, em clulas infectadas por HPV,
evidenciada principalmente em clulas expressando a oncoproteina E7. Alguns trabalhos
sugerem que defeitos na segregao dos cromossomos, ou seja, erros nas divises
mitticas podem ser ocasionados pela formao de fusos mitticos multipolares,
presentes em clulas infectadas com PV expressando a oncoproteina E7 (Duensing e
Mnger, 2002)
55
TC, Melo
Duensing e colaboradores (2000) demonstraram em experimentos com

fibroblastos de camundongos infectados com o HPV-16 que, independente da expresso
da oncoproteina E7 atuar na inativao de genes supressor tumoral, como: o pRB, p107 e
p130 e interagir com as subunidades S4 do proteossomo 26S, havia a duplicao dos
centrossomos. Tais estruturas so os centros de organizao microtubular em animais e
clulas humanas, sendo indispensveis na funo e formao dos fusos mitticos.
Portanto modificaes na estrutura ou disfuno dos centrossomos podem induzir erros
na segregao dos cromossomos durante a mitose, formando clulas aneuploides.
Estes relatos tm sido corroborados por outros experimentos, utilizando
queratincitos infectados com HPV-16 e 18 expressando a oncoproteina E7, onde se
observa um padro de rearranjos cromossmicos no balanceados, com ganho ou perda
de material cromossmico, envolvendo alguns cromossomos especficos do caritipo
humano (cpias adicionais dos cromossomos 3, 5, 19 e 20 ou perdas dos cromossomos 1,
2, 4, 11, 14, 15 e 22). Alm destes achados, estes estudos tambm tm demonstrado a
presena de aberraes estruturais (envolvendo os cromossomos 1, 11 e 17) e numricas
(com presena de clulas tetraploides) (Southern et al.,1997; Toldo et al., 1997; Southern
et al.,2001). Portanto, se concluem que a expresso das oncoproteinas E6 e E7 pode
induzir danos no DNA, contribuindo independentemente ou em conjunto para as
instabilidades cromossmicas, estrutural e numrica.
5.4 Similaridades entre as oncoproteinas E6 e E7 do BPV-1 e HPVs de alto risco
Inmeras investigaes tm demonstrado que a expresso dos oncogenes virais E6
e E7 alteram as funes do ciclo celular devido desativao de genes supressores
tumorais, p53 e pRB (protenas do retinoblastoma), respectivamente, em humanos (Mietz
et al., 1992;Talis et al.,1998; Narechania et al., 2004).
56
TC, Melo
Embora no tenha sido descrito, em bovinos, como as oncoproteinas E6 e E7 dos

diferentes tipos de BPV, induzem alteraes cromossmicas especficas, sabe-se que a
oncoprotena E6/BPV1 apresenta uma ao transformante bastante similar s
desenvolvidas por HPV de alto risco, como o HPV-16. A E6 do BPV-1, semelhante E6
do HPV-16, se liga a uma protena alvo, formando um complexo E6AP (E6 associada
protena) para interferir na funo da p53 (Tong e Howley, 1997; Talis et al.,1998).
Entretanto, as formas pela qual a E6 de HPV de alto risco e de BPV-1 interferem no
ponto de checagem no ciclo celular so distintas. As E6/ HPV-16, atuam degradando p53,
impedindo que a mesma se ligue a seus complexos ativadores (CBP-p300), e a E6/BPV-1
liga-se a co-ativadores (CBP-p300) impedindo a ativao da p53, consequentemente as
duas vias impossibilitam os reparos do DNA pela p53 (Zimmermann et al., 2000). Tem
sido provado que a interao da E6 e E7 do BPV-1 apresenta um papel direto na
transformao celular (Bohl et al., 2001).
Diferente das similaridades encontradas entre a atuao da E6 do BPV-1 e de E6
do HPV-16, o mesmo no visto com as oncoprotenas E7 destes PVs. Observa-se que a
E7 do BPV-1 no apresenta ligantes na regio motif para protena do retinoblastoma
(pRB) como encontrado em E7 HPV-16. No entanto, existem relatos de que E7 e E5 do
BPV-1 se localizam dentro do citoplasma de clulas epiteliais basais diferenciadas, e a
co-expresso delas a base para transformao de linhagens celulares, mesmo no
possuindo a regio motif ligando E7 a pRB, levando ao desenvolvimento de
fibropapilomas (Bohl et al.,2001). Embora a E7 destes PV atuem funcionalmente de
forma diferenciada, acredita-se que a E7 de ambos os vrus possa ter uma ao ainda no
conhecida nas regies do citoplasma e ncleo (Narechania et al., 2004).
Yuan e colaboradores (2008) observaram que clulas do palato de equinos
infectadas com BPV-1 apresentavam genes de expresso no controlada, que interferem
57
TC, Melo
no controle do ciclo celular. Estes estudos relataram a inativao da p53 e uma elevada
expresso de genes que atuam no ciclo celular, como o gene c-IAP-1, que bloqueia a
apoptose das clulas tumorais levando a progresso do cncer. Entretanto, este
experimento no demonstrou quais oncoprotenas do BPV-1 estavam diretamente
envolvidas nos processos de ativao e inativao de genes que desestabilizam o ciclo
celular.
Neste estudo se observou que o grupo amostral apresentou apenas papilomavrus do
gnero Delta-Papilomavrus (BPV-1 e BPV-2). Considerando as similaridades discutidas
entre BPV1 e HPV16, podemos sugerir que as diferentes anormalidades cromossmicas
observadas, tenham origens semelhantes s encontradas em clulas infectadas por HPV de
alto risco (HPV-16) desencadeadas pela ao transformante das E6 e E7, desestabilizando o
ciclo celular.
Considerando, que os grupos amostrais de bovinos infectados e controles foram
analisados sob condies de teste cego, no sendo conhecido o estado clnico do bovino
durante a anlise citogentica, evidenciamos aps anlises estatsticas que, as altas taxas de
anormalidades cromossmicas estruturais e numricas nos animais infectados com BPV,
so conseqncias da ao viral. Neste contexto, foi possvel distinguir os animais
acometidos por vrus dos animais no infectados.
58
TC, Melo
6. Concluses
1. Foi possvel evidenciar um aumento da freqncia e tipos de alteraes

cromossmicas nos bovinos infectados com BPV em relao aos no infectados,
demonstrando um aumento significativo tanto nos bovinos sintomticos quanto em
bovinos assintomticos.
2. Observou-se que, embora os bovinos no estivessem consumindo a samambaia, os

nveis de aberraes cromossmicas encontrados em bovinos infectados com BPV
eram bastante elevados, constatando a ao clastognica dos vrus, mediado por suas
oncoproteinas.
3. A presena de RONs na regio distal do brao longo dos cromossomos autossmicos

bovinos confirma que as AC so ocasionadas pela desestabilizao dos telmeros.
4. Os dados expostos evidenciam que os papilomavrus (no caso BPV), podem

desencadear aumento dos nveis de aberraes cromossmicas, mesmo estando em
clulas de hospedeiro assintomtico, levando a indagaes sobre a possibilidade de
que os nveis de aberraes cromossmicas possam ser indicadores da presena viral.
59
TC, Melo
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TC, Melo
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67
TC, Melo
8. Anexos
Anexo 1
1.1: Valores absolutos e percentuais (%) do nmero de clulas analisadas no grupo
controle.
N de clulas
Analisadas
50
N de clulas C/
aberrao
1
% de clulas C/
aberrao
2
50
50
50
50
50
50
50
50
10
50
11
50
12
50
13
50
14
50
15
50
16
50
17
50
18
50
19
50
20
50
21
50
22
50
23
50
24
50
25
50
26
50
27
50
28
Total
50
1400
2
55
4
3,93
Bovinos (controle)
68
TC, Melo
1.2: Valores absolutos e percentuais (%) dos tipos de aberraes cromossmicas

encontradas no grupo controle.
Bovinos (controles)
gaps
% gaps
QT
% QT
SPcr
% SPcr
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
Total
38
2,71
10
0,71
0,57
69
TC, Melo
Anexo 2
2.1: Valores absolutos e percentuais (%) do nmero de clulas analisadas no grupo assintomtico.
Bovinos (assintomticos)
Bovino 01
Bovino 02
Bovino 03
Bovino 04
Bovino 05
Bovino 06
Bovino 07
Bovino 08
Bovino 09
Bovino 10
Bovino 11
Bovino 12
Bovino 13
Bovino 14
Bovino 15
Bovino 16
Total
N de cl. Analisadas
50
101
51
50
50
65
50
54
101
50
50
50
51
50
55
50
928
N de cl. com aberrao

22
45
12
22
24
34
22
20
32
17
14
19
15
30
16
30
374
% de cl. com aberrao

44
44,55
23,5
44
48
52,3
44
37,04
31,7
34
28
38
29,4
60
29,1
58,8
40,30
70
TC, Melo
2.2: Valores absolutos e percentuais (%) dos tipos de aberraes cromossmicas no grupo assintomtico.
Bovinos
(assintomticos)
Bovino 01
Bovino 02
Bovino 03
Bovino 04
Bovino 05
Bovino 06
Bovino 07
Bovino 08
Bovino 09
Bovino 10
Bovino 11
Bovino 12
Bovino 13
Bovino 14
Bovino 15
Bovino 16
Total
AC
%AC
AT
%AT
gaps
%gaps
FA
%FA
QT
%QT
QM
%QM
4
20
4
2
8
8
5
8
12
3
2
4
3
4
0
5
92
8
19,8
7,8
4
16
12,3
10
14,8
11,9
6
4
8
5,9
8
0
9,8
9,91
1
1
0
1
1
5
2
0
2
2
0
0
1
2
1
0
19
2
0,99
0
2
2
7,7
4
0
1,9
4
0
0
1,96
4
1,8
0
5,08
6
0
0
3
5
9
10
1
6
1
1
2
4
17
1
8
74
12
0
0
6
10
13,8
20
1.9
5,9
2
2
4
7,8
34
1,8
15,7
7,97
5
7
2
6
11
9
14
12
6
2
5
4
4
6
10
6
109
10
6,9
3,9
12
22
13,8
28
22,2
5,9
4
10
8
7,8
12
18,2
11,8
11,74
4
2
0
2
11
9
10
5
26
6
3
3
5
6
4
6
102
8
1,98
0
4
22
13,9
20
9,3
25,7
12
6
6
9,8
12
7,3
11,8
11,00
0
2
0
0
0
9
1
0
0
0
0
1
0
2
3
0
18
0
1,98
0
0
0
13,9
2
0
0
0
0
2
0
4
5,5
0
1,94
71
TC, Melo
Bovinos
Aneuploidia % Aneu
(assintomtico)
2
4
Bovino 01
2
1,98
Bovino 02
5
9,8
Bovino 03
4
8
Bovino 04
1
2
Bovino 05
8
12,3
Bovino 06
1
2
Bovino 07
0
0
Bovino 08
5
4,95
Bovino 09
1
2
Bovino 10
5
10
Bovino 11
5
10
Bovino 12
6
11,8
Bovino 13
8
16
Bovino 14
1
1,8
Bovino 15
6
11,8
Bovino 16
Total
60
6,46
add ou del
% add ou del
SPcr
% SPcr
ATcr
2
0
0
0
2
3
4
1
0
3
0
3
0
0
0
1
19
4
0
0
0
4
4,6
8
1,9
0
6
0
6
0
0
0
1,96
2,05
2
8
0
3
3
3
1
1
10
5
0
6
0
0
0
4
46
4
7,9
0
6
6
4,6
2
1,9
9,9
10
0
12
0
0
0
7,8
4,96
6
1
0
1
1
3
5
2
3
0
0
1
1
0
3
5
32
%ATcr Poliploidia
12
0,99
0
2
2
4,6
10
3,7
2,97
0
0
2
1,96
0
5,5
9,8
3,45
0
1
1
1
1
2
0
0
0
1
3
2
0
0
0
1
13
%Poliploidia
0
0,99
1,96
2
2
3,08
0
0
0
2
6
4
0
0
0
1,96
1,40
72
TC, Melo
Anexo 3
3.1: Valores absolutos e percentuais (%) do nmero de clulas analisadas no grupo sintomtico.
Bovinos (sintomticos)
Bovino 01
Bovino 02
Bovino 03
Bovino 04
Bovino 05
Bovino 06
Bovino 07
Bovino 08
Bovino 09
Bovino 10
Bovino 11
Bovino 12
Bovino 13
Bovino 14
Bovino 15
Bovino 16
Bovino 17
Total
N de cl. Analisadas
104
102
105
51
50
62
59
48
110
105
104
50
50
51
50
122
52
1275
N de cl. Com aberrao

46
34
41
27
17
33
22
22
40
41
58
17
26
24
25
54
17
544
% de cl. Com aberrao

44,2
33,3
39,1
52,9
34
53,2
37,3
45,8
36,4
39,05
55,8
34
52
47,06
50
44,3
32,7
42,67
73
TC, Melo
3.2: Valores absolutos e percentuais (%) dos tipos de aberraes cromossmicas do grupo sintomtico.
Bovinos
(sintomtico)
Bovino 01
Bovino 02
Bovino 03
Bovino 04
Bovino 05
Bovino 06
Bovino 07
Bovino 08
Bovino 09
Bovino 10
Bovino 11
Bovino 12
Bovino 13
Bovino 14
Bovino 15
Bovino 16
Bovino 17
Total
AC
% AC
AT
% AT
gaps
% gaps
FA
% FA
QT
% QT
QM
%QM
19
17
19
14
6
4
15
9
5
23
31
10
15
2
12
22
5
228
18,3
16,7
18,09
27,5
12
6,5
25,4
18,8
4,6
21,9
29,8
20
30
3,9
24
18,03
9,6
17,88
7
0
0
2
0
2
0
1
1
0
5
0
0
1
0
0
1
20
6,7
0
0
3,9
0
3,3
0
2,08
0,91
0
4,81
0
0
1,96
0
0
1,92
1,57
4
1
0
2
2
4
7
2
1
1
1
0
0
5
5
3
4
42
3,9
0,98
0
3,92
4
6,5
11,9
4,17
0,91
0,95
0,96
0
0
9,8
10
2,5
7,7
3,29
15
7
4
4
3
13
11
0
5
6
12
4
7
17
4
11
5
128
14,4
6,9
3,81
7,8
6
20,97
18,6
0
4,6
5,71
11,5
8
14
33,3
8
9,02
9,62
10,04
3
5
4
1
1
17
3
0
5
4
3
3
2
7
1
2
4
65
2,9
4,9
3,81
1,96
2
27,42
5,09
0
4,5
3,81
2,9
6
4
13,7
2
1,64
7,7
5,10
1
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
1
1
1
0
7
0,96
0
0,95
0
0
1,61
0
0
0
0
0
2
0
1,96
2
0,82
0
0,55
74
TC, Melo
Bovinos
Aneuploidia
(sintomtico)
4
Bovino 01
3
Bovino 02
8
Bovino 03
2
Bovino 04
2
Bovino 05
0
Bovino 06
1
Bovino 07
7
Bovino 08
6
Bovino 09
7
Bovino 10
9
Bovino 11
1
Bovino 12
2
Bovino 13
4
Bovino 14
4
Bovino 15
13
Bovino 16
3
Bovino 17
Total
76
%Aneu
add ou Del
% add ou del
SPcr
% SPcr
ATcr
%ATcr
Poliploidia
%Poliploidia
3,85
2,95
7,62
3,92
4
0
1,7
14,6
5,5
7,6
8,7
2
4
7,84
8
10,7
5,77
5,96
4
2
0
1
4
4
0
3
0
0
0
3
1
0
2
2
0
26
3,9
1,96
0
1,96
8
6,5
0
6,3
0
0
0
6
2
0
4
1,64
0
2,04
7
0
10
6
5
6
0
3
18
7
11
0
4
0
4
5
0
86
6,7
0
9,5
11,8
10
9,7
0
6,3
16,4
6,7
10,6
0
8
0
8
4,09
0
6,74
7
8
4
3
2
0
0
2
10
5
13
0
5
0
4
7
1
71
6,7
7,8
3,8
5,9
4
0
0
4,2
9,1
4
12,5
0
10
0
8
5,7
1,9
5,57
0
0
1
0
0
1
0
1
0
0
1
0
0
2
2
0
0
8
0
0
0,9
0
0
1,6
0
2,08
0
0
0,96
0
0
3,92
4
0
0
0,63
75
TC, Melo
Anexo-4
Manuscrito
Cytogenetic studies in bovines infected by BPV: first evaluation in

Pernambuco, Brazil.
Thatiana Corra de Melo, Nara de Diniz Soares Pessoa, Srgio Roberto

Campos, Oilita P. Ferraz, Charles J. Lindsey, Antonio C. Freitas, Tania T.
Rieger, Willy Beak, Rita de Cssia Stocco.
Manuscrito a ser encaminhado : Veterinary

dermatology.
ISSN: 1365-3164
Impact Factor: 1.379
76
TC, Melo
Cytogenetic studies in bovines infected by BPV: first evaluation in Pernambuco,

Brazil.
Running title: Chromosome aberrations in BPV infected animals
T.C. Melo, N. Diniz, S.R.C. Campos, O.P. Ferraz, C.J. Lindsey, A.C. Freitas,
T.T. Rieger, W. Beak, R.C. Stocco.
Departamento de Gentica, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE, Brazil.
Laboratrio de Gentica, Instituto Butantan, So Paulo, SP, Brazil.
Departamento de Biofsica, Universidade Federal de So Paulo, So Paulo, SP, Brazil.
Corresponding author: Rita de Cassia Stocco
Laboratrio de Gentica Instituto Butantan
Av. Vital Brasil, 1500
So Paulo SP
CEP 05503-900
Email: ritastocco@butantan.gov.br / ritastocco@yahoo.com
Abstract
Bovine papillomaviruses (BPV) present 10 types and are described as specific to
epithelium, reported as mainly transmitted by direct contact. Recent descriptions discuss
blood as possible virus transmission agent due to the detection of viral DNA sequences in
blood cells, and possible latent site for virus. The virus presence in blood is associated
with chromosome instability in lymphocytes as a possible consequence of virus action on
host chromatin, this study presents an evaluation of chromosome instability in cells
obtained from short term peripheral lymphocyte cultures using samples collected from
bovines with and without cutaneous papillomatosis: control animals (non infected
animals), infected animals without symptoms and with cutaneous papillomatosis. In a
total of 2203 cells, 918 (42%) presented at least one chromosome aberration: respectively
42.7 (7.8), 40.2 (11) and 4 (2) in animals presenting papillomatosis, animals without
any clinical symptom and control animals. Significant differences comparing control
group and infected group (P < 0.0001) were verified. The described results indicate viral
action on host cell chromatin expressed by increased levels of chromosome aberrations.
This action can be confirmed by the fact that the chromosome aberration levels allowed
the distinction of the group of animals infected by BPV, with or without clinical
symptoms from the control group.
Keywords: BPV, chromosome aberrations, chromatin, papillomatosis.
Introduction
Papillomaviruses (PV) are oncogenic agents that infect epithelium, present DNA
genome and are described as specie-specific, causing warts, benign lesions that can lead
to cancer when exposed to environmental co-factors (Campo, 1997, 2003).
In cattle, the bovine papillomaviruses have been described as presenting 10 types
included in different groups, Xi-Papillomavirus, Delta-Papillomavrus and EpsilonPapillomavirus: BPV-1, BPV-2, BPV-3, BPV-4, BPV-5, BPV-6, BPV-8, BPV-9, BPV10 and BPV7 in one distinct group and although the related extensive studies, further
investigations are needed in order to understand the interactions between virus and host
cells (Tomita, et. al, 2007; Hatama et. al., 2008).
77
TC, Melo
PV can act on host chromatin in mainly two different ways, integration into
chromatin, in specific chromosome sites, as described in humans (Kalantari et. al., 2001)
and linked to the chromatin through specific virus proteins (E2), remaining in episomal
form, as reported in bovines (McBride et. al., 2006). In both cases, the vrus action on
chromatin is due to viral oncogene expression causing specific changes in host cell cycle
leading to chromosome instability (Duensing et. al., 2000).
The clastogenic action of papillomavirus, mainly BPV, has been discussed and
investigated regarding environmental co-factors: the more extensively investigated cofactor related to BPV is a bracken fern, Pteridium aquilinum , that feed the cattle during
dry season in poor pastures and it is included in the human diet of specific regions [as
Ouro Preto (Minas Gerais), Brazil and Japan]. The first reports about clastogenic BPV
effect and co-factors described increase of rates of chromosome aberrations in peripheral
lymphocytes obtained from bovines affected by enzootic haematuria, exposed to bracken
fern and bovines experimentally infected by BPV, without exposition to co-factors
(Moura et al., 1988; Stocco dos Santos et al., 1993 and 1998). The interaction virus-host
chromatin related to co-factors was evaluated in in vitro and in vivo: Leal et. al., 2003
analyzed the presence, frequency and type of chromosome aberrations in a calf palate
fibroblast cell line (Palf) and its derivated lineages, respectively transfected with BPV
oncogenes and exposed to quercetin (bracken fern compound). Recouso et al, 2003 have
studied the levels of chromosome aberrations in peripheral lymphocytes of humans that
included bracken in their diet, not infected by HPV. In both reports higher levels of
chromosome aberrations were described. The principal conclusion from the related
studies is that the host chromatin can be a target for the virus, for co-factors and for the
combined action of them.
The present study discuss the evaluation of chromosome aberrations in
lymphocytes collected from bovines infected by BPV, not exposed to bracken, affected or
not by cutaneous papillomatosis compared to normal control, not infected, analysing the
most frequent type of aberrations and the eventual differences among the animal groups.
Material and Methods
Animal selection
Sixty one females, Bos taurus, Holstein, mean age 6 years were selected for the
development of this study: 28 animals represented the control group, kept in the Hospital
Veterinrio da Universidade de So Paulo and 33 in a herd of a dairy farm of
Pernambuco, Brazil. The group of Pernambuco included 17 females presenting cutaneous
papillomatosis and 16 without BPV related diseases.
Sample collection
Peripheral blood samples were collected from the 61 animals and submitted to
BPV detection procedures. Samples were collected using appropriate precautions to avoid
contamination. All the procedures were undertaken using disposable gloves that were
changed at each step. After cleaning the skin with iodinated alcohol, 10mL of blood were
collected for each analysis using disposable syringes and needles and stored in
vacutainers tubes with anticoagulant (with EDTA for molecular analysis and with
heparin for cytogenetical procedures).
DNA Extraction and BPV detection
78
TC, Melo
The venous blood samples collected with EDTA and part of the lymphocyte
cultures were evaluated in order to identify BPV1, 2 and 4 presence (Diniz et al., 2009 in
press).
Cytogenetical Analysis
Cytogenetic studies were carried out using short term peripheral lymphocyte
cultures of collected samples corresponding to those used in molecular analysis,
according to previously described protocols (Stocco dos Santos et al., 1998). The analysis
was performed in blind test. The slides were stained in 5% Giemsa, 50 to 100 cells
were analyzed for each bovine. C banding and NOR (nucleolar organizer regions)
localization were performed according to Leal et al., 2003 and Guerra & Souza, 2002,
respectively. The analysis was done in Axiophot Zeiss (documented in 1000X).
Statistical analysis
The frequencies of chromosome aberrations were verified in three animal groups:
control, cutaneous papillomatosis afflicted and the group of animals selected in the same
herd without clinical symptoms. The results were statistically compared: Kruskal-Wallis
(test H) and Mann Whitney (test U), P> 0.05.
Results
The BPV detection procedures confirmed the presence of BPV1 and 2 DNA
sequences in the collected samples from the animals of the herd localized in Pernambuco,
Brazil. BPV4 was not detected. The control group did not present BPV infection.
The cytogenetic results are summarized in Table 1, 3603 cells were examined:
1400 in the control group, 1275 in the group with papillomatosis and 928 in the group
without clinical symptoms. The data were analyzed using Kruskal-Wallis followed by
Mann Whitney statistical tests. The tests demonstrated significant differences comparing
the control group and the infected group (P < 0.0001). Comparing the infected animals,
the differences were not significant between the group with papillomatosis and the group
without clinical symptoms (P>0.05). Table 2. The observed chromosome aberrations
included centric associations (CA), acentric fragments (AF), telomeric associations (TA),
telomeric association only by one chromatid (TAcr), chromatid break (CtB), chromosome
breaks (CmB), gaps (G), aneuploidy, poliploidy, gain or deletion of chromosome
segments (add. or del.) and precocious chromatid segregations (EcrS) (Figure 1 and 2).
The detected frequencies of each type of chromosome aberrations were also compared
analyzing the three groups of animals. The same statistical testes were used. The
comparison revealed significant differences between the control group and the two
groups presenting BPV, symptomatic and asymptomatic, considering the frequency of
EcrS (precocious chromatid segregation) (P= 0.003), (P= 0.002). Comparing control
group and the group without clinical symptoms (P=0.02) (Table 2).
The centromeric associations were analyzed by C banding showing the fusion of
the centromere heterochromatin of the involved chromosome. The NOR banding
identified the localization of the active NORs confirming that they were not close to the
regions included in centromeric associations (data not shown).
Discussion
The blood cells have been described as presenting BPV DNA sequences (Stocco
dos Santos et. al., 1993, 1998) eventually virus latent site (Campo et al., 1994). The
description of chromosome aberrations in these cells strongly suggests virus action on
host chromatin, and significant differences related to gaps frequency were found (P =
79
TC, Melo
0.02) (Moura et. al., 1988; Stocco dos Santos et. al., 1998; Lioi et. al.; Yaguiu et. al.,
2008). The data presented in this study are the first reporting the possibility of distinction
of infected and not infected animals regarding the levels of chromosome aberrations in
the peripheral lymphocytes. The animals were not examined regarding other eventual
clinical aspects, not externally visualized. So, it is not possible to eliminate the possible
presence of other clinical aspects. The infected animals, with and without papillomatosis,
included in this study, were analyzed by Diniz et al., 2009 (in press), verifying only the
presence of BPV DNA in blood stream and lymphocyte cultures.
The level of aneuploid cells was not significant different comparing animals with
and without symptoms, respectively 5.24 (3.51) and 6.44 (4.97). The levels of
structural aberrations were significant different between the control and the infected
group, but not between afflicted infected and infected but clinically normal group.
Regarding the characteristics of the structural chromosome aberrations,
specifically centromeric associations, some aspects must be discussed: the Nucleolar
Organizer Regions display associations in the cell cycle in order to allow the organization
of nucleolus. In some species, as human, these genes are distributed in pericentromeric
regions of the acrocentric autosomes that can be visualized in associations during the
mitosis. However, in bovines, the NORs are described close to the distal telomeric
regions of the chromosomes pairs 2,3,4,11 and 28 (Mayr et. al., 1987), thus, not related to
the centric fusions discussed in this report.
Telomeric associations have been demonstrated using FISH techniques in HPV
positive transfected human cells (White et. al., 1994, Crabbe et. al., 2007) and in BPV
positive cells confirming that telomeric alterations are related to PV oncoprotein and can
cause centric fusions (Campos et al., 2009 in press). It is relevant to emphasize that in
vitro assays, Leal et. al., 2003 showed the action of E7, in this case specifically BPV4
oncoprotein E7, on the telomeres of bovine cultivated fibroblasts resulting in
chromosome markers derived from centric fusions.
The viral oncoproteins E6 and E7 modify the cell cycle repressing cell tumor
supressors, as p53 and p105 (Talis et. al.,1998; Narechania et. al., 2004). HPV-16
positive human cells presented numerical and structural chromosome alterations related
to the oncoprotein action (E6 e/ou E7) (White et. al., 1994; Duensing & Mnger, 2002).
Duensing & Mnger (2002) discussed the action of HPV-16 E7 in the duplication of
centrosomes of mouse fibroblasts, which could result in alteration in chromosome
segregation and consequent aneuploid cells. In a similar way, E6 an E7 expression can
cause alterations in anaphase, with anaphasic bridges and eventually chromosome
structural aberrations (Duensing & Mger 2002).
The conclusions obtained in this study could be sumarized in the following points:
- the animals selected in this specific farm were verified as infected by BPV 1 and 2; - it
was possible to distinguish the control group from the infected group regarding the levels
of chromosome aberrations; BP4 was not detected in any studied sample. Further detailed
studies are necessary for viral prevalence evaluation to support the development of
efficient vaccine procedures for BPV related diseases.
These results corroborate the previous reports of interaction virus-host chromatin
in lymphocytes, supporting the hypothesis of lymphocytes acting as carriers of virus.
Acknowledgments
The authors thank Carolina da Paz Sabino for her editorial support, MCT/CNPq,
DECIT/MS, Fundo Setorial de Biotecnologia (CT-Biotecnologia) e Sade (CT-Sade)
and FAPESP for the fellowships (project Nos. 554816/2006-7, 559043/2008-2 and
2006/02439-6, respectively).
80
TC, Melo
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and bovine leukemia vrus in different tissues: in situ hybridization and cytogenetic
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Figure Legends:
Figure 1:
A. Peripheral lymphocyte methaphases: (A) and (B): cell obtained from animal
presenting cutaneous papillomatosis; (C): cell obtained from BPV infected animal
without clinical symptoms. X chromosomes are indicated by black arrows; (AF): acentric
fragments, (CtB): chromatid break, (CmM): chromosome break; (CA) centric
association.
B. Structural chromosome aberrations detected in peripheral lymphocytes obtained from
BPV infected animals. 1C-2C: centric association (CA), 3C: chromatid breaks (CtB), 1:
centric association (CA), 2: telomeric association by a unique chromatid (TAcr), 3:
acentric fragment (AF), 4-5: chromatid breaks (CtB), 6: chromosomic breaks (CmB), 7:
gap, 8: addition or loss of gene segments (add or del)
83
TC, Melo
84
TC, Melo
Table 1: Cytogenetic study performed in peripheral lymphocytes from bovine females infected by BPV compared to control group
Group
Control
C(1)
As (2)
S (3)
Sex/
age/Breed
Female/2- 6
years
Holstein
Female/4-6
years
Holstein
Female/4- 6
years
Holstein
Animals
Analyzed
cells
Cells with
aberrations
% cells with
aberrations
P (Teste H)
P (Teste U)
28
1400
55
4 2
(P< 0.0001)
1 e 2;3
(P< 0.0001)
1 e 2; 1 e 3
16
928
374
40 10
(P= 0.62)
2e3
(P= 0.18)
2e3
17
1275
544
42.77.8
H-Test : Kruskal-Wallis Test; U-Test; Mann Whitney Test. C (1) Control Group; As (2) subgroup without symptoms (S) group with
papillomatosis
85
TC, Melo
Table 2: Chromosome alterations in the bovine groups and statistical analyzes differences.
Numerical aberrations
Structural aberrations
% cells presenting each type of aberrations
Aneuploid
cells
-
Poliploid
cells
AC
--
--
--
As (2)
6.444,97
1.311.78
S (3)
5.243.51
P=0.29
Animals
C (1)
P (U Test
(As x S )
ATcrT
GAP
--
--
2.712.19
8.814.83
1.752.05
2.8673,66
0.591.23
17.538.39
1,181,81
P=0.10
P= 0.002
P= 0.1567
AT
FA
QT
QM
--
0.711.24
8.259.1
11.947.18
4.593,74
3.473.84
P= 0.1245
P= 0.0373
add. or del.
EcrS
--
--
0.570.92
10.317.07
1.693.4
2.132.75
4.254.02
10.297.85
5.066.41
0.350.7
2.242.73
6.064.79
P= 0.20
P= 0.0047
P=0.175
P= 0.39
P= 0.161
Boldface: Values presenting significant difference.

Centric association (CA); acentric fragment (AF); telomeric association (TA); telomeric association by a unique chromatid (TAcr); chromatid
breaks (CtB); chromossomic breaks (CmB); gaps (G); aneuploidy; polyploidy; addition or loss of gene segments (add or del) and early
chromatid separation (EcrS).
86
TC, Melo
Anexo 5
Regras para submisso do
Artigo
Submission
dermatology
information:Veterinary
Ontent of Author Guidelines:

1. General, 2. Ethical Guidelines, 3.
Submission
of
Manuscripts,
4.
Manuscript
Types
Accepted,
5.
Manuscript Format and Structure, 6.
After Acceptance.
Relevant
Documents:
Exclusive
Licence Form, Author Statement
Useful Websites: Submission Site,
Articles published in Veterinary
Dermatology, Digital Photographic
Guidelines, General Principles and
Guidelines for Biomedical Research and
Publication, Publication Ethics
1. GENERAL
Veterinary Dermatology is a bi-monthly,
peer-reviewed, international journal
which publishes papers on all aspects of
the skin of mammals, birds, reptiles,
amphibians and fish. Scientific research
papers, clinical case reports and reviews
covering the following aspects of
dermatology will be considered for
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Skin structure (anatomy, histology,
ultrastructure)
Skin
function
(physiology,
biochemistry,
pharmacology,
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Dermatopathology
Pathogenesis, diagnosis and treatment
of skin diseases
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Acknowledgements.
87
TC, Melo
Acknowledgements:
Under
Acknowledgements
please
specify
contributors to the article other than the
authors accredited.
Note to NIH Grantees: Pursuant to NIH
mandate, Wiley-Blackwell will post the
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2.2. Ethical Approvals
When experimental animals are used the
methods section must clearly indicate
that adequate measures were taken to
minimize
pain
or
discomfort.
Experiments should be carried out in
accordance with the Guidelines laid
down by the National Institute of Health
(NIH) in the USA regarding the care and
use of animals for experimental
procedures or with the European
Communities Council Directive of 24
November 1986 (86/609/EEC) and in
accordance with local laws and
regulations.
General principles and guidelines for
biomedical research and publication may
be
found
at
http://www.publicationethics.org.uk/.
The Journal reserves the right to reject
any paper where there is reason to
believe that animals have been subjected
to unnecessary or avoidable pain or
distress. Where animals have been used
in a study, the relevant research ethical
or animal welfare or institutional review
authority, under which the work was
conducted, must be stated. Furthermore,
manuscripts describing prospective
studies involving client-owned animals
should also include documentation of
informed client consent.
Ethics of investigation: Papers not in
agreement with the guidelines of the
Helsinki Declaration as revised in 1975
will not be accepted for publication.
2.3 Clinical Trials
Clinical trials: randomised clinical trials

(RCTs) and systematic reviews should
be reported according to the CONSORT
guidelines available at www.consortstatement.org A CONSORT checklist
should be used as a guide before
submission of material (CONSORT
statement).
2.4
DNA
Sequences
and
Crystallographic
Structure
Determinations
Papers reporting protein or DNA
sequences will not be accepted without a
Genbank accession number. Other
supporting data sets must be made
available on the publication date from
the authors directly.
2.5 Conflict of Interest and Source of
Funding
Conflict of Interest: Authors are required
to disclose any possible conflict of
interest. These include financial (for
example patent, ownership, stock
ownership, consultancies, speaker's fee).
Author's conflict of interest (or
information specifying the absence of
conflicts of interest) will be published
under a separate heading entitled
Conflict of Interest.
Veterinary Dermatology requires that
sources of institutional, private and
corporate financial support for the work
within the manuscript must be fully
acknowledged, and any potential
conflicts of interest noted. This
information is a requirement for all
manuscripts submitted to the Journal and
will be published in a highlighted box on
the title page of the article. Please
include this information under the
separate headings of "Source of
Funding" and "Conflict of Interest"
immediately after the abstract section of
your manuscript.
If the author does not include a conflict
of interest statement in the manuscript
then the following statement will be
included by default: "No conflicts of
interest have been declared".
2.6 Appeal of Decision
88
TC, Melo
Authors who wish to appeal the

reviewers' decision and/or comments on
their submitted paper may do so by emailing the editor with a detailed
explanation for why they find reasons to
appeal the decision.
The editors' decision on a paper is final
and cannot be appealed.
2.7 Permissions
If the whole or part(s) of previously
published
illustrations
are
used,
permission must be obtained from the
copyright holder concerned. It is the
author's responsibility to obtain these in
writing and provide copies to the
Publishers.
2.8 Copyright Assignment
Authors submitting a paper do so on the
understanding that the work and its
essential substance have not been
published before and is not being
considered for publication elsewhere.
Presentation or publication of part or all
of the data in, for instance, congress
proceedings, should be clearly declared
when the paper is submitted.
The submission of the manuscript by the
authors means that the authors
automatically agree to assign exclusive
licence/copyright
to
Blackwell
Publishing if and when the manuscript is
accepted for publication. The work shall
not be published elsewhere in any
language without the written consent of
the publisher. The articles published in
this journal are protected by copyright,
which covers translation rights and the
exclusive right to reproduce and
distribute all of the articles printed in the
journal. No material published in the
journal may be stored on microfilm or
videocassettes, in electronic databases
and
the
like,
or
reproduced
photographically without the prior
written permission of the publisher.
Correspondence to the journal is
accepted on the understanding that the
contributing
author
licences
the
publisher to publish the letter as part of
the journal or separately from it, in the
exercise of any subsidiary rights relating

to the journal and its contents.
Upon acceptance of a paper, authors are
required to assign the exclusive licence
to publish their paper to Blackwell
Publishing. Assignment of the exclusive
licence is a condition of publication and
papers will not be passed to the publisher
for production unless a licence has been
assigned. (Papers subject to government
or Crown copyright are exempt from this
requirement; however, the form still has
to be signed). A completed Exclusive
Licence Form must be sent to the
address specified on the form, before any
manuscript can be published. Authors
must send the completed original
Exclusive Licence Form by regular mail
upon receiving notice of manuscript
acceptance, i.e., do not send the form at
submission. Faxing or e-mailing the
form does not meet the requirements.
For questions concerning copyright,
please visit Copyright FAQs.
3.
SUBMISSION
AND
ACCEPTANCE OF MANUSCRIPTS
Manuscripts should be submitted
electronically via the online submission
site
https://www.editorialmanager.com/vetde
rm/. The use of an online submission and
peer review site expedites the review and
decision-making processes and allows
authors to track the status of their own
manuscripts. If assistance is needed (or
if, for some reason, online submission is
not possible) the Editorial Office can be
contacted
at
VDERM@oxon.blackwellpublishing.co
m (Tel: +44 (0) 1865 476540) and will
readily provide any help users need to
upload their manuscripts.
3.1 Online Submission
To submit a manuscript, please follow
the instructions below.
Getting Started
1. Manuscripts should be submitted
online
at
https://www.editorialmanager.com/vetde
rm. Full instructions and support are
89
TC, Melo
available on the site and a username and

password can be obtained on the first
visit.
2. Log in, or click the "Register" option
if you are a first-time user of Editorial
Manager and follow the onscreen
instructions.
Submitting Authors will be required to
complete an Author Statement upon
submission. This may be downloaded
from here. Submissions will not be
accepted without completion of this
statement, which covers authorship,
conflicts of interest, ethics, copyright
assignment etc. If you are unable to
submit electronically, please contact the
Journal
Editorial
Office
(VDERM@oxon.blackwellpublishing.co
m, Tel: +44 (0)1865 476540).
3.2 Submitting Your Manuscript
1. To submit a manuscript log in and
click on "Submit New Manuscript".
2. Follow the step-by-step instructions
(you may copy and paste directly from
your manuscript).
3. Click the "Next" button on each
screen to save your work and advance to
the next screen.
4. After attaching your manuscript files,
click on the "Build PDF for my
Approval" button and then click on
"Submissions Waiting for Author's
Approval". Under "Actions" click on
"View Submission" and then, if you're
ready to submit your manuscript, click
on "Approve Submission" and click
"OK".
5. You will receive an automated
acknowledgment of submission and,
after the Editorial Office has processed
your manuscript; you will receive
another automated email confirming
your manuscript's reference number.
Please quote this number when
contacting the Editorial Office regarding
your manuscript.
3.3. Manuscript Files Accepted
Manuscripts should be uploaded as
Word (.doc) or Rich Text Format (.rft)
files (not write-protected) plus separate
figure files. GIF, JPEG, PICT or Bitmap

files are acceptable for submission, but
only high-resolution TIF or EPS files are
suitable for printing. The files will be
automatically converted to HTML and
PDF on upload and will be used for the
review process. The text file must
contain the entire manuscript including
title page, abstract, text, references, and
figure legends, but no embedded figures.
Figure legends should be included in the
file. Manuscripts should be formatted as
described below.
Please note that any manuscripts
uploaded as Word 2007 (.docx) will be
automatically rejected. Please save any
.docx file as .doc before uploading.
3.4. Blinded Review
All manuscripts submitted to Veterinary
Dermatology will be reviewed by at least
two experts in the field. Veterinary
Dermatology uses single-blinded review.
The names of the reviewers will thus not
be disclosed to the author submitting a
paper.
3.5. Suspension of Submission Midway in the Submission Process
You may suspend a submission at any
point before finally submitting it. To
return to a manuscript already in process
click on "Incomplete Submissions".
3.6. Manuscript Status
You can access Editorial Manager
(https://www.editorialmanager.com/vetd
erm/) at any time to check the status of
your manuscript. The Journal will
inform you by e-mail once a decision has
been made.
3.7.
Submission
of
Revised
Manuscripts
Revised manuscripts should be uploaded
within 1 month of authors receiving a
decision of minor or major revision.
Locate
your
manuscript
under
"Submissions Needing Revision" and
then click on "Revise Submission" under
"Actions".
4.
MANUSCRIPT
TYPES
ACCEPTED
90
TC, Melo
Papers are invited in the following

categories: Reviews, Scientific Papers,
Brief Communications, Case Reports,
Book Reviews and Letters to the Editor.
Scientific Papers are experimental or
observational, ideally hypothesis-driven
prospective studies.
Brief Communications are brief reports
and, including illustrations, tables, and
references, must not exceed 2.5 printed
pages - usually six manuscript pages.
References should be limited to ten.
Case Reports will be subjected to the
same careful review and editing that
larger papers receive. Single case reports
will be considered for publication if they
describe a new finding, a never reported
condition, or a new idea (including new
treatments). Cases of rare diseases that
have already been published and the first
report of a disease in a new species of
animal or breed may be considered. The
more novel or new the report is, the
more likely it is to be considered and
authors should state in the paper the
rational for their case report being
published.
Letters to the Editor should be sent
directly to the Editor for approval.
Books for review should be sent to the
Veterinary Dermatology Editorial Office
at:
Wiley-Blackwell,
9600
Garsington
Road, Oxford OX4 2DQ, UK.
5. MANUSCRIPT FORMAT AND
STRUCTURE
5.1. Format
The manuscript (including references
and figure legends) must be A4 or
8.5x11 inch format with 2.5cm margins,
single-spaced typed, sans serif, 12 point
font, Helvetica (Swiss) style e.g. Arial or
Verdana), left justified. Each line and
page of the manuscript text should be
numbered consecutively from the title
page.
Review Articles
The structure will vary depending on
content. Authors should study the format
used in previous issues of the journal for
further
guidance.
Authors
are
encouraged to discuss prospectively the
format and content of a review article
with one of the editors prior to
submission.
Scientific
Papers
and
Brief
Communications
Manuscripts should be arranged as
follows: title; abstract; text with
subdivisions
as
given
below;
acknowledgements; references; legends
for illustrations.
Case Reports
These are usually a chronological
description of the case describing the
history, physical findings, differential
diagnoses, diagnostic tests, specialist
diagnostic
procedures,
diagnoses,
treatments, and outcome. When multiple
cases are described (case series), these
may be described separately or as a
group. The Editors may recommend that
the format is changed if, in their opinion,
it would improve the content of the final
manuscript.
Authors are requested to write with the
minimum of formatting and NOT to
write over previous versions, which may
contain hidden formatting. Do not
enhance text and tables with unnecessary
formatting (e.g., small capitals, headers).
Software programs that automatically
create endnotes and footnotes should not
be used. To remove the field formats for
any reference manager software, save
the final draft then click EDIT SELECT ALL and press CRTL-SHIFTF9 together.
Title
The title of the article should be concise
but informative. If information in the
text has been presented at a scientific
meeting, this should be indicated. The
first name, middle initial(s), and last
name of each author must be given. .
Professional affiliations of the authors at
the time of the study should be indicated.
If an author's affiliation has changed
since the study was performed, the
91
TC, Melo
author's new affiliation should be

identified.
The name of the corresponding author,
any conflicts of interest and sources of
funding (see section 2.5) should be
stated. A short running head of no more
than 40 characters (counting letters and
spaces) should also be included.
Keywords are NOT required.
Abstract
The abstract should be no more than 250
words.
The abstract should state the purposes of
the study or investigation, basic
procedures, selection of study subjects or
experimental animals, observational and
analytical methods, main findings (give
specific data and their statistical
significance, if applicable), and the
principal conclusions. Emphasise new
and important aspects of the study or
observations.
Optimizing Your Abstract for Search
Engines
Many students and researchers looking
for information online will use search
engines such as Google, Yahoo or
similar. By optimizing your article for
search engines, you will increase the
chance of someone finding it. This in
turn will make it more likely to be
viewed and/or cited in another work. We
have compiled some guidelines to enable
you to maximize the web-friendliness of
the most public part of your article; these
can
be
found
at
http://authorservices.wiley.com/bauthor/
seo.asp.
Introduction
State the purpose of the article.
Summarise the rationale for the study or
observation. Give only strictly pertinent
references and do not review the subject
extensively. Do not include data or
conclusions from the work being
reported.
Materials and Methods
These should be described in sufficient
detail to allow other workers to
reproduce the results. References for
study design and statistical methods

should be to standard works (with pages
stated) when possible rather than to
papers where designs or methods were
originally reported. Specify any statistics
computer programs used. Report losses
to observation (such as dropouts from a
clinical trial).
The methods of data collection and use
of statistical analysis will be checked by
the referees, editors and, if necessary, a
statistician. It is highly recommended
that authors consult a professional
statistician for advice on complex
statistical
analyses.
It
is
also
recommended that authors provide
details of which statistical methods and
the p-value, if relevant, have been used
for each component of the data set (e.g.
P=0.08; ANOVA).
Drugs and therapeutic agents should be
given in the format: drug ingredient
(trade name; manufacturer name), e.g.
fenbendazole (Panacur; Intervet).
Drug names should follow the
recommended
International
NonProprietary Names (rINN) - for more
information see the Medicines and
Healthcare Products Regulatory Agency
(MHRA) website.
Products such as equipment or methods
should be given as: Product name
(Company name; town or city and
country). e.g. Datex CD 200-02 (Datex;
Hatfield, UK).
The detailed information about drugs,
therapeutic agents and products need
only be given once.
Results
Present your results in a logical sequence
in the text, tables, and illustrations. Do
not repeat in the text data in the tables or
illustrations. In manuscripts describing
more than one animal, all animals should
be assigned a case number.
Discussion
The discussion should emphasise the
new and important aspects of the study
and the conclusions that follow from
them. Include the implications of the
92
TC, Melo
findings and their limitations, including

implications for future research. Relate
the observations to other relevant
studies. Link the conclusions with the
goals of the study but avoid unqualified
statements
and
conclusions
not
completely supported by your data.
Avoid claiming priority and alluding to
work that has not been completed. State
new hypotheses when warranted, but
clearly indicate them as such.
Recommendations, when appropriate,
may be included.
Acknowledgements
These are to indicate support, advice or
technical help that does not justify
authorship.
Language and style: The language of
publication is English. Authors for
whom English is a second language must
have their manuscript professionally
edited by an English speaking person
before submission to make sure the
English is of high quality. It is preferred
that manuscripts are professionally
edited prior to submission. A list of
independent suppliers of editing services
can
be
found
at
english_language.asp. All services are
paid for and arranged by the author, and
use of one of these services does not
guarantee acceptance or preference for
publication.
Voice
Active or passive voice can be used as
long as it is consistent within the
manuscript. Authors should be careful of
the use of passive voice in the
Discussion, as it can sometimes be
unclear whether the authors are talking
about their own work or that of other
people. You may need to use phrases
such as 'in the present study, it was
found that ' to clarify this.
Tense
Methods used and results obtained by
the authors should be referred to in the
past tense:
mice were given two types of grain
mice in group A ate 50 mg of grain

The past tense will therefore generally
be employed in the Abstract, Methods
and Results sections. The past tense
should also be used to talk about specific
findings of previous work:
Smith (1990) found that yield
decreased by 50%
Interpretation of results should be in the
present tense:
the results for groups A and B are
significantly different
The present tense will therefore
generally be employed in the
Introduction (except, for example, when
the authors are stating what their
hypothesis and aims were before the
study commenced). The present tense
should also be used in the Discussion
when the results are being interpreted:
Our study shows that a significant
number of Finnish people speak Finnish
Findings of previous studies should also
be referred to in the present tense if they
have become generally accepted 'facts':
treatment X results in Y, as
demonstrated by Jones (1978)
the expression of class I genes varies
amongst haplotypes
5.2.
Units,
Abbreviations
and
Nomenclature
All units of measurement must follow
the SI system. Concentrations of
solutions should be given as molar
concentrations (e.g. mmol/L). All other
concentrations should be expressed as
percentages. Drug dosages should be
given as: e.g. mg/kg; g/kg; also use
'once daily', 'twice daily' etc..
Spell out numbers one to ten, keep 11
onwards as numerals. However, use
Arabic numerals for numbers used with
units of measure (e.g. 9 kg, 5 h, 10
mmol/L). Use h, min, s, for hour,
minute, second, respectively.
Abbreviations of biological, medical,
chemical, and other terms should only be
used when such abbreviations are both
internationally
recognized
and
unambiguous. The first use of an
93
TC, Melo
abbreviation must be explained by also

giving the unabbreviated term.
All biological, medical, chemical, and
other names should be given in keeping
with
the
latest
international
nomenclature. If an animal is being
mentioned in the text for the first time,
the binomial name should be given, e.g.
carp (Cyprinus carpio L.). Thereafter,
this can be abbreviated to C. carpio.
5.3. Illustrations and Tables
Figure legends must be given at the end
of the manuscript. Sufficient information
should be included to allow the figure to
be understood without reference to the
text. Authors wishing to use any
previously published figures must
submit written permission from the
copyright holder. Figure legends should
be written in the following style:
1. Organ or tissue; animal identification,
Case No. A sentence describing the
change that is visible in the print. (For
photomicrographs add: staining method
with names of stains and counter stains
and magnification, e.g., avidin biotin
peroxidase complex method, Mayer's
Haematoxylin counter stain, and Bar =
m)
2. Graph or Table: statement of how data
is expressed. Identification of symbols in
table, graph, or photo: e.g., N = nucleus.
Examples:
1. Photo: Hind limb of dog with deep
pyoderma, Case 5. Multifocal areas of
exudate and crust are visible on the skin
over the lateral surface of the stifle.
2. Photomicrograph: Intra-epidermal,
intact sub-corneal pustule showing small
numbers of acantholytic cells and
numerous neutrophils. H&E. Bar = 25
mm.
3. Table: Comparison of eosinophil
counts over time between the control and
treatment groups. Error bars indicate the
mean the standard deviation
Tables and Figures
These should be limited to those
containing
data
important
to
understanding and interpreting results

and reducing or clarifying the text.
Type each table (single line spacing) into
a separate document. Number tables
consecutively in the order of the first
citation in the text and supply a brief title
for each. Give each column a short or
abbreviated heading. Place explanatory
material in footnotes, not in the heading.
Explain in the footnotes all non-standard
abbreviations that are used in each table.
Identify statistical measures of variations
such as standard deviation and standard
error of the mean.
Ensure that each table is cited in the text.
If you use data from another published
or unpublished source obtain written
permission and acknowledge fully.
Poor quality images may be removed
from a manuscript and where critical to
the content may lead to rejection of a
manuscript.
Figures should be initially saved in a
neutral data format such as TIFF or EPS
(JPEG format can be accommodated but
must fulfil the format criteria given
below). PowerPoint and Word graphics
are unsuitable for reproduction. Please
do not use any pixel-oriented
programmes. Scanned figures (only in
TIFF format) should have a resolution of
300 dpi (halftone) or 600 to 1200 dpi
(line drawings) in relation to the
reproduction size. Photographic material
should be of such quality that highcontrast reproductions can be made;
photostats
of
photographs
are
unacceptable.
Graphics created in the CMYK colour
palette (print colours) are preferable to
those created in RGB (screen colours) to
maximise
consistency
of
print
reproduction. Images supplied in RGB
will be converted to CMYK for printing;
this may lead to some variations in
colour representation.
Graphs
To ensure high-quality reproduction,
symbols should be clear and even
throughout and of sufficient size, that
94
TC, Melo
when reduced for publication, each item

will still be legible. Graph axes should
be labelled in sans serif (Helvetica or
Arial) font. Letters, Numbers and Titles
belong in the legends for illustrations,
not on the illustrations themselves.
When symbols, arrows, numbers or
letters are used to identify parts of the
illustrations, identify and explain each
one clearly in a key.
Clinical Photographs
Limit figures to those that reduce or
clarify the text. These should be free of
extraneous material, and if portions of
the handler, for example, fingers or
hands are to be included, particularly
adjacent to lesions, they must be gloved.
Extraneous material should be removed
by a program such as Adobe
Photoshop. Backgrounds should be
unobtrusive, preferably uncoloured and
of a medium tone such as a light grey
untextured background. Conventionally,
in ventral recumbency, the photograph is
vertical, with the head to the top of the
frame and in lateral recumbency, the
photograph is horizontal and so is the
subject. A light source should be from
the top of the frame.
Photomicrographs
For lower power objectives, thicker
histological sections are preferable.
Thinner sections are advisable for higher
power objectives. Optimal Haematoxylin
& Eosin staining ensures the differential
eosinophilia of tissue components.
Harris's Haematoxylin is preferred as it
produces a bluish-black, nuclear stain.
The microscope must be set up for
Koehler illumination. In general, the 10x
or 20x objective provides the best
contrast and visibility of the subject in
most sections. The 4x objective should
be used only when necessary to show the
overall pattern.
Photomicrographs
and
electron
micrographs must have an internal scale
marker. To express magnification with
an internal scale marker, divide the
length of the marker by the original
magnification.
Magnification
bars
should be approximately 1cm long and
placed in the lower right corner; 5mm
above the lower margin and with the
right end 5mm from the right margin.
For figures that consist of multiple parts,
individual parts of the figure should be
identified by capital letters embedded in
the figure, rather than by describing the
location of the part in the legend (e.g.,
top right).
For more information about formatting
images
please
click
go
to
http://www.blackwellpublishing.com/pdf
/Digital-Photography_VDE.pdf.
Please ensure that individual figures files
are no larger than 5 MB, if your file is
substantially bigger than this please
contact
the
Editorial
Office
(VDERM@oxon.blackwellpublishing.co
m, Tel: +44 (0) 1865 476540) to discuss
file saving options.
5.4. References
These must be limited to those that are
necessary and must be cited in the text
by
superscript
Arabic
numerals
immediately after the word, period or
comma and in order of citation. Try to
avoid using conference proceedings and
abstracts not subjected to stringent peer
review as references; 'unpublished
observations'
and
'personal
communications' may not be used as
references, although references to
written, not oral, communications may
be inserted (in parentheses) in the text.
The references must be verified by the
author(s) against the original documents.
Journal titles in the References section
should not be abbreviated. For
references with more than three authors,
list only the first three and add et al.
Examples:
Article in Journal
You CH, Lee KY, Chey RY, Menguy
R. Electrogastrographic study of patients
with unexplained nausea, bloating and
vomiting. Gastroenterology 1980; 79:
311-4.
Book Chapter
95
TC, Melo
Weinstein L, Swartz MN. Pathogenic

properties of invading micro-organisms.
In: Sodeman WA. ed. Pathologic
Physiology: Mechanisms of Disease.
Philadelphia: W. B. Saunders, 1974:
457-72.
Proceedings
DuPont
B.
Bone
marrow
transplantation in severe combined
immunodeficiency with an unrelated
MLC compatible donor. In: White H J,
Smith R, eds. Proceedings of the third
annual meeting of the International
Society for Experimental Hematology.
Houston: International Society for
Experimental Hematology, 1974: 44-6.
Electronic Material
Animal and Plant Health Inspection
Service Web site. Bovine spongiform
encephalopathy (BSE). Available at:
www.aphis.usda.gov/lpa/issues/bse/bse.h
tml. Accessed Feb 18, 2003.
Software programs for creating reference
lists may be used but they should be set
up so that they generate in-text citations
and reference lists according to these
instructions. Authors bear primary
responsibility for the accuracy of all
references.
Software programs for creating reference
lists may be used but they should be set
up so that they generate in-text citations
and reference lists according exactly to
the author instructions. Please see
attached one file for use of Reference
Manager
software
(http://www.blackwellpublishing.com/pd
f/veterinary_dermatology.os) and one
file
for
EndNote
(http://www.blackwellpublishing.com/pd
f/veterinary_dermatology.ens)
formulated according to this journal
style. Authors are reminded to remove
the field formats for any reference
software: to do this save the final draft
then click EDIT - SELECT ALL and
press
CRTL-SHIFT-F9
together.
Authors must check the reference format
after use of such software. Authors bear
the primary responsibility for the

accuracy of all references.
5.5. Supporting Information
Publication in electronic format has
created opportunities for adding details
or whole sections to the electronic
version only. Authors need to work
closely with the editors in developing or
using
these
formats.
Supporting
Information, such as data sets, additional
figures, tables, video or audio files that
will not be published in the print edition
of the journal, but will be available via
the online edition, may be submitted.
Supporting information must be
important ancillary information that is
relevant to the parent article but which
does not or cannot appear in the printed
edition of the Journal. Supporting
information will be published as
submitted, and will not be corrected or
checked
for
scientific
content,
typographical errors or functionality.
Supporting information should be
uploaded at the time of manuscript
submission using the file designation
'Supplementary material for review'. It
should be clearly stated at the time of
submission
that
the
Supporting
Information is intended to be made
available through the online edition. The
content of the Supporting Information
must not be altered after the paper has
been accepted for publication.
Authors should note that the publishers
will not be held responsible for the
content or functionality of any
supporting materials supplied by the
authors. Any queries (other than missing
material) will be directed to the
corresponding author of the article.
The
availability
of
Supporting
Information should be indicated in the
main manuscript by a paragraph, to
appear after the References, headed
"Supporting Information" and providing
titles of figures, tables etc. In order to
protect reviewer anonymity, material
posted on the author's website cannot be
reviewed. The Supporting Information is
96
TC, Melo
an integral part of the article and will be

reviewed accordingly.
5.6. Animal Experiments
Animal experiments are to be undertaken
only with the purpose of advancing
knowledge and in a manner that avoids
unnecessary discomfort to the animals
by the use of proper management and
laboratory techniques. They shall be
conducted in compliance with federal,
state and local laws and regulations, and
in accordance with the internationally
accepted principles and guidelines for
the care and use of agricultural,
laboratory or experimental animals.
In the interests of the reproducibility of
results, accurate information about any
test animals used in the experiments
(origin, inbreeding etc.), as well as
information about the housing conditions
(diet, environment etc.), should be given.
6. AFTER ACCEPTANCE
Upon acceptance of a paper for
publication, the manuscript will be
forwarded to the Production Editor who
is responsible for the production of the
journal.
6.1 Proof Corrections
The corresponding author will receive an
e-mail alert containing a link to a
website. A working e-mail address must
therefore
be
provided
for
the
corresponding author. The proof can be
downloaded as a PDF (portable
document format) file from this site.
Acrobat Reader will be required in order
to read this file. This software can be
downloaded (free of charge) from the
following
website:
www.adobe.com/products/acrobat/readst
ep2.html This will enable the file to be
opened, read on screen, and printed out
in order for any corrections to be added.
Further instructions will be sent with the
proof. Hard copy proofs will be posted if
no e-mail address is available; in your
absence, please arrange for a colleague
to access your e-mail to retrieve the
proofs.
Proofs must be returned to the

Production Editor within one week of
receipt.
As changes to proofs are costly, we ask
that you only correct typesetting errors.
Other than in exceptional circumstances,
all illustrations are retained by the
publisher. Please note that the author is
responsible for all statements made in
their work, including changes made by
the copy editor.
6.2 OnlineEarly (Publication Prior to
Print)
Veterinary Dermatology is covered by
Blackwell Publishing's OnlineEarly
service. OnlineEarly articles are
complete full-text articles published
online in advance of their publication in
a printed issue. OnlineEarly articles are
complete and final. They have been fully
reviewed, revised and edited for
publication, and the authors' final
corrections have been incorporated.
Because they are in final form, no
changes can be made after online
publication. The nature of OnlineEarly
articles means that they do not yet have
volume, issue or page numbers, so
OnlineEarly articles cannot be cited in
the traditional way. They are therefore
given a Digital Object Identifier (DOI),
which allows the article to be cited and
tracked before it is allocated to an issue.
After print publication, the DOI remains
valid and can continue to be used to cite
and access the article.
6.3 Author Services
Online production tracking is available
for your article through Blackwell's
Author Services. Author Services
enables authors to track their article once it has been accepted - through the
production process to publication online
and in print. Authors can check the
status of their articles online and choose
to receive automated e-mails at key
stages of production. The author will
receive an e-mail with a unique link that
enables them to register and have their
article automatically added to the
97
TC, Melo
system. Please ensure that a complete email address is provided when

submitting the manuscript. Visit
http://authorservices.wiley.com for more
details about online production tracking
and for a wealth of resources including
FAQs and tips on article preparation,
submission and more.
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6.4 Author Material Archive Policy
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6.5 Offprints and Extra Copies
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7. BOOK REVIEWS
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that all authors observe carefully the
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98
TC, Melo
9. Memorial do aluno
Eu, Thatiana Corra de Melo, bolsista do CNPq pelo programa de Ps- graduao
Strictu Sensu em Gentica - Centro de cincias Biolgicas Departamento de GenticaUniversidade Federal de Pernambuco (2007- 2009), portadora do CPF: 046.406.70494 e
RG: 6570.524, sou bacharel em Cincias Biolgicas formada na Universidade de
Pernambuco (UPE) no ano de 2006. Tenho como linha de pesquisa, desde a graduao, a
Citogentica Animal.
No perodo de graduao desenvolvi meu estgio, extra- curricular e curricular, no
laboratrio de gentica e citogentica animal (Departamento de Gentica/ CCB /UFPE)
estando vinculada ao projeto Hibridizao in situ de genes de cpia nica, em
cromossomos meiticos do gafanhotos da famlia Acrididae e Romaleidae, coodenado
pela Prof Tania Tassinari Rieger e Prof Dr Jos Ferreira dos Santos.
Atualmente, tenho desenvolvido trabalhos em Citogentica de bovinos, avaliando
alteraes cromossmicas desencadeadas pela ao do Papilomavrus Bovino, projeto
coordenado pelo prof Dr Willy Beak e Dr Rita de Cssia Stocco, do Laboratrio de
Gentica do Instituto Butantan SP.
No ano de 2008, participei em Salvador- BA do 54 congresso Brasileiro de
Gentica, onde apresentei o trabalho intitulado como: Estudos citogenticos em
linfcitos perifricos e bovinos afetados por papilomatose em uma fazenda do estado
de Pernambuco.
Algumas informaes adicionais, sobre minha vida acadmica, esto disponveis na
pgina do currilum lates.
Thatiana Corra de Melo
E-mail: Thatianacmelo@yahoo.com.br
99

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1

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM GENTICA E BIOLOGIA

Avaliao de aberraes cromossmicas

Avaliao de aberraes cromossmicas em bovinos (Bos taurus taurus)...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

Avaliao de aberraes cromossmicas

THATIANA CORRA DE MELO

Orientador: Prof Dra. Rita de Cssia Stocco, Laboratrio de Gentica:

Avaliao de aberraes cromossmicas em bovinos (Bos taurus taurus)...

Avaliao de aberraes cromossmicas em bovinos (Bos taurus taurus)...

Avaliao de aberraes cromossmicas em bovinos (Bos taurus taurus)...

Dr. Antonio Carlos de Freitas

feliz quem tem no ntimo a confiana na fora da vida.

Avaliao de aberraes cromossmicas em bovinos (Bos taurus taurus)...

A Deus, por ter permitido a concluso deste

Avaliao de aberraes cromossmicas em bovinos (Bos taurus taurus)...

Avaliao de aberraes cromossmicas em bovinos (Bos taurus taurus)...

Avaliao de aberraes cromossmicas em bovinos (Bos taurus taurus)...

Avaliao de aberraes cromossmicas em bovinos (Bos taurus taurus)...

1.1 Papilomavrus (PV): aspectos gerais

1.1.1 Estrutura molecular dos papilomavrus (PV)

1.1.2 Transmisso e ciclo viral dos papilomavrus (PV)

1.2 Papilomavrus bovino (BPV)

1.3 Conseqncias da infeco pelo papilomavrus bovino

1.4 Interaes do BPV com co-fatores ambientais

1.5 Alteraes cromossmicas e interaes do vrus a

3.1 Grupo amostral

3.2 Coleta do material biolgico

3.3 Anlise citogentica

3.3.1 Cultura de linfcitos

3.3.2 Preparao das lminas

3.3.3 Parmetros para anlise citogentica

3.4 Anlise de Dados

Avaliao de aberraes cromossmicas em bovinos (Bos taurus taurus)...

5.1 Infeco viral vesos alteraes cromossmicas

5.2 PV em sinergismo com co-fatores ambientais podem desencadear

fragmentos acnticos (FA) e gaps

1.1: Valores absolutos e percentuais (%) do nmero de clulas

analisadas no grupo controle.

cromossmicas encontradas no grupo controle.

2.1: Valores absolutos e percentuais (%) do nmero de clulas

analisadas no grupo assintomtico.

cromossmicas no grupo assintomtico.

3.1: Valores absolutos e percentuais (%) do nmero de clulas

analisadas e tipos de aberraes cromossmicas do grupo sintomtico

cromossmicas do grupo sintomtico

Anexo 5. Regras para submisso do Artigo

Avaliao de aberraes cromossmicas em bovinos (Bos taurus taurus)...

Associao Telomrica por uma cromtide

Protena da famlia BET, relacionada ligao do genoma do papilomavrus

Vrus Epstein- Barr

Genes de expresso precoce

Hematuria enzotica crnica

Comit internacional de Taxonomia de vrus

Regio principal de controle de Transcrio

Genes de expresso tardia

Complexo de Histocompatibilidade Maior

Regio de incio de transcrio (open reading frame)

Linhagem celular de fibroblastos estabelecidas a partir de fragmentos do

Protena de ao supressora tumoral

Avaliao de aberraes cromossmicas em bovinos (Bos taurus taurus)...

Proto- oncogene relacionado ao Tumor de Wilmss