ELENA GARRIDO

BIOQUMICA 5
7 HOJAS
J.E.Feliu )
LEHNINGER . ANDERSON

Enzimas en el plasma
INTRODUCCIN
Los enzimas son biocatalizadores que aceleran las reacciones del organismo.
Tienen un gran poder cataltico, con frecuencia muy superior al de los catalizadores sintticos.
Posee un alto grado de especificidad respecto a sus sustratos, aceleran las reacciones qumicas del orden
de 106 - 1012 veces sin alterar el equilibrio de la reaccin, y funcionan en soluciones acuosas en
condiciones muy suaves de temperatura y pH. Los enzimas no se alteran ni se consumen en las reacciones
en las que intervienen ; se requieren en cantidades muy pequeas del rango de concentraciones M.
Los enzimas constituyen una de las claves para conocer el modo de sobrevivir y proliferar las
clulas. Actuando en secuencias organizadas catalizan cientos de reacciones consecutivas en las rutas
metablicas mediante las que se degradan nutrientes, se conserva y se transforma energa qumica y se
fabrican las macromolculas biolgicas a partir de precursores sencillos.
El estudio de los enzimas tambin tiene una importancia prctica inmensa. En algunas
enfermedades, especialmente en las que son genticamente heredables, puede haber una deficiencia, o
incluso una ausencia total, de uno o mas enzimas en los tejidos. Ejemplos.
Sndrome de Lesch-Nyhan ----- hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa
Enfermedad de Gaucher ----- glucocerebrosiadsa
Raquitismo dependiente de vitamina D ----- 25-Hidroxicolecalciferol-1-hidroxilasa
Enfermedad de Tay-Sachs ----- hexosaminidasa A
Tambin se pueden producir situaciones anormales por la actividad excesiva de un enzima
especfico.
La medicin de la actividad enzimtica en el plasma sanguneo, eritrocitos, o muestra de tejido es
importante en el diagnstico de enfermedades.
A excepcin de un pequeo grupo de molculas de RNA cataltico, todos los enzimas son
protenas. Su actividad cataltica depende de la integridad de su conformacin proteica nativa. Si se
desnaturaliza o se disocia un enzima en subunidades, o se descompone en aminocidos pierde su
actividad cataltica. As, las estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de las protenas
enzimticas son esenciales para su actividad.
Algunos enzimas requieren un componente qumico adicional llamado cofactor. Los cofactores
pueden ser :
Uno o varios iones inorgnicos : Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+...
Un complejo orgnico o metaloorgnico llamado coenzima : NAD, NADH. FAD, FADH,
Coenzima A...
Algunos enzimas requieren tanto un coenzima como uno o ms iones metlicos ; si estos se unen de
forma covalente, se denomina grupo prosttico. Un enzima completo catalticamente activo junto con su
coenzima y/o iones metlicos se denomina holoenzima. La parte proteica de tal enzima se denomina
apoenzima o apoprotena.
Ejemplo :
Grupo psilon-amino de una Lisina + biotina piruvatocarboxilasa
1

holocarboxilasa sintetasa
La catlisis enzimtica de las reacciones es esencial para los sistemas vivos. La mayora de las
molculas biolgicas son muy estables al pH neutro, temperatura suave y ambiente acuoso presente en el
interior de las clulas. Muchas reacciones comunes suponen situaciones desfavorables o poco probables
en el ambiente celular. Un enzima soluciona estos problemas al proporcionar un ambiente dentro del cual
una reaccin determinada es, energticamente, ms favorable. El rasgo distintivo de una reaccin
catalizada enzimticamente es que tiene lugar dentro de los confines de una bolsa del enzima denominada
sitio activo. La molcula fijada en el sitio activo y sobre la que acta el enzima se denomina sustrato.
E + S ES EP E + P

E= enzima. S= sustrato. P= producto

La energa de los sistemas biolgicos se describe en funcin de la energa libre, G. En su estado

basal ( forma estable ) cualquier molcula contiene una cantidad caracterstica de energa libre. El
equilibrio entre S y P refleja la diferencia de energa libre de sus estados basales. En el ejemplo de la
figura 1, la energa libre del estado basal de P es inferior al de S,, por lo que la variacin de energa libre
estndar de la reaccin es negativa, con lo que el equilibrio favorece a P. Este equilibrio no es afectado
por ningn catalizador. No obstante el equilibrio favorable no indica que la conversin S P sea rpida.
Existe una barrera energtica entre S y P que representa la energa requerida para el alineamiento de los
grupos reactivos, formacin de cargas inestables transitorias, reordenamiento de enlaces y otras
transformaciones que se requieren para que la reaccin tenga lugar en cualquiera de las dos direcciones.
Para que haya reaccin las molculas han de superar esta barrera por lo que se deben llevar a un nivel
energtico superior. El estado de transicin es un momento molecular fugaz en el que acontecimientos
tales como rotura de enlace, formacin de enlace y desarrollo de carga han llegado al preciso instante en
el que el colapso a sustrato o producto es igualmente probable. La diferencia entre los niveles de energa
del estado basal y del estado de transicin se denomina energa de activacin. La velocidad de una
reaccin refleja esta energa de activacin, a una energa de activacin ms elevada corresponde una
reaccin ms lenta. Los enzimas mediante la catlisis disminuyen la energa de activacin, de forma que
aumenta la velocidad de reaccin.
Las energas de activacin son barreras energticas para las reacciones qumicas, estas barreras
son cruciales para la propia vida. La estabilidad de una molcula aumenta con la altura de su barrera de
activacin. Sin tales barreras energticas, las molculas complejas revertiran espontneamente a formas
mas sencillas, no podran existir ni las estructuras complejas y altamente ordenadas ni los procesos
metablicos que tienen lugar en cada clula.
Los enzimas son especficos, discriminando fcilmente entre sustratos con estructuras muy
similares : ejemplos de distinta especificidad :
Hexoquinasa : fosforila la glucosa, la manosa y la fructosa ( as que no es especfico de un slo
sustrato ).
Glucoquinasa : fosforila slo a la glucosa.
Fosfatasa alcalina : acta sobre cualquier ester fosfrico ( tiene especificidad de enlace ).
El poder cataltico de los enzimas proviene en ltimo trmino de la energa libre emitida al
formarse los mltiples enlaces dbiles e interacciones que se producen entre el enzima y su sustrato. Esta
energa de fijacin proporciona tanto especificidad como catlisis. La especificidad se refiere a la
capacidad de discriminar entre dos sustratos competitivos.
FACTORES QUE INFLUYEN
ENZIMTICA ( CINTICA ) :

EN

LA

VELOCIDAD

DE

LA

REACCIN

1.- Concentracin de sustrato :

A concentraciones de sustrato relativamente bajas, la velocidad inicial aumenta casi linealmente
con el incremento en la concentracin de sustrato. A mayores concentraciones de sustrato, la velocidad
2

aumenta incrementos cada vez menores en respuesta a incrementos de concentracin de sustrato.

Finalmente se alcanza un punto mas all del cual se dan incrementos pequesimos de velocidad con el
incremento de concentracin de sustrato. Esta meseta se denomina velocidad mxima. La grfica
corresponde a una hiprbola rectangular. La concentracin de sustrato a la que la velocidad inicial es la
mitad de la mxima es la constante de Michaelis- Menten ( Km ).Un ejemplo de enzima con este
comportamiento es la hexoquinasa. ( figura 2 )
Partiendo de la hiptesis bsica de que el paso limitante de velocidad en las reacciones
enzimticas es la descomposicin del complejo ES para formar el producto y el enzima libre, Michaelis y
Menten desarrollaron la siguiente frmula :
Vo = Vmax S / Km + S

Vo = velocidad inicial
Vmax = velocidad mxima
S = concentracin

sustrato
Vmax = 10 Km
Cuando la velocidad inicial es la mitad de la velocidad mxima, Km = S.
La ecuacin de Michaelis-Menten se puede transformar algebraicamente en formas ms tiles para
representar los datos experimentales. Una transformacin comn se deduce simplemente tomando los
inversos en ambos miembros de la ecuacin, esta es la ecuacin denominada de Linerwear-Burk, que da
lugar a la grfica doble recproca ( figura 3 ).
Los enzimas alostricos son aquellos que funcionan a travs de la unin reversible, no covalente,
de un metabolito regulador denominado modulador. Estos enzimas muestran una relacin entre Vo y S
que difiere del comportamiento normal de Michaelis-Menten : aunque se satura con el susutrato cuando S
es suficientemente elevada, algunos enzimas alostricos dan lugar a una curva de saturacin sigmoidea, a
diferencia de la forma hiperblica de los enzimas no reguladores. En esta curva se utiliza el smbolo S 0,5 o
K0,5 para representar la concentracin de sustrato que se necesita para alcanzar la mitad de la velocidad
mxima de la reaccin catalizada por un enzima alostrico. En este tipo de grficas, cuando la velocidad
es aproximadamente la mitad de la mxima, la variabilidad de la velocidad es muy grande ante
oscilaciones pequeas de S. un ejemplo de enzima al que corresponde esta grfica es la glucoquinasa
( K0,5 = 7mM ).
2.- Concentracin del enzima :
La velocidad de la reaccin aumenta cuando la concentracin de enzima es mayor, y disminuye
cuando la concentracin es menor ; sin embargo la Km es independiente de la concentracin de enzima.
En una cintica hiperblica, se pueden distinguir dos partes en la grfica :
Cintica de primer orden : corresponde a la primera parte donde la velocidad ser
proporcional a S , porque existe mayor cantidad de enzima libre ( el enzima no est saturado )
Cintica de orden cero : cuando la velocidad ya es mxima y no vara aunque aumentemos
S ; esto indica que todo el enzima est virtualmente como complejo ES, el enzima se encuentra saturado.
Al realizar anlisis enzimticos en el laboratorio es fundamental que S sea suficientemente elevada
para favorecer la saturacin enzimtica, as todas las reacciones deben tener cintica de orden cero para
permitir una determinacin enzimtica precisa.
3.- Temperatura :
-Normalmente los enzimas funcionan a 37 C
-El aumento de temperatura favorece las colisiones entre molculas y el enzima trabaja mejor.
-Si se realiza un aumento de 10 C, la velocidad se multiplica por dos. Cada aumento de 1 C,
provoca un aumento del 10% de la actividad enzimtica, as que es necesario controlar los anlisis
enzimticos para evitar fluctuaciones de temperatura mayores de 1 C.
3

-A partir de 40 C los enzimas se desnaturalizan y dejan de funcionar.

-Un enzima puede soportar aumentos de temperatura durante un breve periodo de tiempo sin
desnaturalizarse.
4.- pH :
Los cambios de ionizacin de los enzimas o del sustrato explican los efectos del pH.
Los enzimas tienen un pH ptimo o un intervalo de pH en el que su actividad es mxima, a valores
superiores o inferiores de pH la actividad disminuye.
Los enzimas citoslicos actan a pH = 7,2-7,3 ; los enzimas lisosomales actan a pH 7,5. Si
queremos obtener las propiedades reguladoras de un enzima, trabajaremos a pH fisiolgico ; si por el
contrario lo que queremos es sacar el mximo rendimiento, trabajaremos a pH ptimo.
Para evitar que el pH vare considerablemente se aaden soluciones amortiguadoras al determinar
la actividad enzimtica en la muestra.
5.- Metabolitos reguladores :
- Inhibidores :
Competitivos : son parecidos a las molculas de sustrato. Esta inhibicin se invierte
aumentando la concentracin de sustrato.
No competitivos : se enlazan al enzima en un sitio distinto al sitio activo provocando un
cambio en la configuracin de la estructura alterando el sitio activo, sin que ste sea ya receptivo. Puede
ser una inhibicin reversible ( uniones dbiles ) o irreversible ( enlaces covalentes )
Sin competencia : el inhibidor se une al complejo ES, as se forma un complejo I-ES, y al
aumentar S se aumenta la inhibicin ya que se forman mas complejos a los cuales se une el inhibidor.
- Activadores :
Aumentan la velocidad de la reaccin. En general son molculas o iones
pequeos ( por ejemplo iones metlicos ) que tienen diferentes mecanismos de accin :
- Proporcionan un sitio activo electropositivo que atrae a los grupos con
carga negativa del sustrato.
- Tienen funcin estructural ayudando a estabilizar la estructura terciaria y cuaternaria del
enzima.
Puede ocurrir que al diluir la muestra la velocidad de la reaccin aumente, esto indica la existencia
de un inhibidor, y que gracias a la dilucin se favorece la disociacin Enzima- Inhibidor. Si ocurre lo
contrario, y la velocidad disminuye con la disolucin, indica que hay un activador.
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA :
El origen de los enzimas que se encuentran en la sangre puede ser variado :
Enzimas propios del plasma
Enzimas que trabajan en el plasma
Enzimas liberados en el plasma desde la clula ( la vida media de estos enzimas depende de su
liberacin, del sistema retculo endotelial, de su secrecin renal... )
Un enzima ptimo presenta las siguientes caractersticas :
1.- Especificidad de tejido.
2.- Medicin automatizable.
3.- Estabilidad.
A+B C+D
4

Las opciones de medicin seran : la desaparicin de A o B ; o la aparicin de C o D, esto ltimo

mas fcil.
Tcnicas colorimtricas :
C o D mas un reactivo, dan un color determinado
Tcnicas de absorcin de luz a una determinada longitud de onda :
Muy til en la deshidrogenadas, por ejemplo :
piruvato + NADH + H+ L- lactato + NAD +
lactato deshidrogenasa

A 340nm el NADH absorbe y el NAD+, el lactato y el piruvato no. As medimos la desaparicin de

NADH ( medicin de la cada de absorbancia ) ( figura 4 )
Una solucin 1 M de una sustancia, absorbe en funcin de una constante (), de la longitud de la
trayectoria luminosa (l) y de una concentracin (c).
A=c l
A = variacin de absorbancia de la muestra en un determinado periodo.
3
-1
-1
340nm = 6,22 x 10 M cm ( coeficiente de absortividad molar del NADH )
As una solucin 1M a 25 C en una cubeta de 1 cm de paso de luz, absorbe 6,22 x 10 3 unidades
pticas.
Otro ejemplo : para medir la actividad de la hexoquinasa, se acopla la reaccin a la de una
deshidrogenasa :
hexoquinasa

Glucosa + ATP Glucosa 6-P + ADP

Glucosa 6-P + NADP+ 6-P- Gluconato + NADPH + H +
glucosa 6-P deshidrogenasa

Definimos unidad de actividad enzimtica a la cantidad de enzima que transforma 1 mol de

sustrato en producto por minuto en determinadas condiciones de pH, temperatura y S ( una unidad puede
estar en litro de plasma o en kg de tejido ).
El sistema internacional propone como unidad el katal, un katal es la cantidad cataltica de enzima
que cataliza una reaccin con una velocidad de 1mol/segundo.
1.- Curva de progreso : ( figura 5 )
La curva de progreso que representa la formacin de producto tiene 3 etapas.
1.- Retraso : el enzima tiene que adaptarse al medio, dura de segundos a unos minutos.
2.- Velocidad inicial : velocidad de crucero ( lineal ) que es constante ; es la fase donde se debe
determinar la actividad enzimtica. Dura hasta alcanzar el equilibrio.
3.- Velocidad reducida : cintica de orden cero. Se debe a distintos factores :
-Disminucin de S.
-Alcance del equilibrio
-Efectos de la inhibicin del producto e inactivacin progresiva del enzima a medida que la
solucin amortiguadora se hace insuficiente para regular el pH.
2.- Mtodos de velocidad de reaccin: ( figura 6 )
2.1.- Mtodo de punto final ( tambin llamado de incubacin fija o anlisis en dos puntos ) :

Medimos la absorbancia en dos momentos distintos ( A1 y A2 ), y restamos la absorbancia en A2

menos la de A1. A partir de la absorbancia se calcula la actividad. Sus inconvenientes es que se supone
que la reaccin es progresiva linealmente y tiene cintica de orden cero.
2.2.- Mtodo de puntos mltiples :
Se hace midiendo la absorbancia en mltiples momentos, lo que permite verificar si la reaccin es
lineal. Es ms prctico ; hoy en da los microprocesadores te hacen la medicin cada 20 segundos.
2.3.- Mtodo de vigilancia contnua :
Se utiliza un espectrofotmetro con registrador para trazar el progreso de la reaccin durante un
periodo de varios minutos. La pendiente de la porcin lineal de la curva se utiliza para determinar la
actividad enzimtica. Cualquier desviacin de la linealidad ( que indica que la actividad enzimtica es
muy alta y que se agota con rapidez el sustrato ) se observa de inmediato en la grfica de registro, y se
corrige.
3.- Reacciones acopladas :
Normalmente acopladas a deshidrogenasas para medir la aparicin o desaparicin de NADH con
ptica ultravioleta.
Ejemplo :
Creatina + ATP E1 Creatina-P + ADP ( Reaccin primaria )
ADP + PEP E2 Piruvato + ATP ( Reaccin auxiliar )
Piruvato + NADH + H+ E3 L- Lactato + NAD+ ( Reaccin indicadora )
E1 = CK ; E2 = PK ; E3 = LDH.
E2 = 5 E1 ( para que no exista enzima limitante )
E3 = 10 E1 ( para que no exista enzima limitante )
( las grficas y la tabla de clasificacin de enzimas se encuentran en la taquilla de comisin de apuntes de
sexto )