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Anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas

Cuando se realiza una inmunización con el objeto


de producir anticuerpos frente a un antígeno, se
produce una gran variabilidad de
inmunoglobulinas que poseen función de
anticuerpo frente a los diferentes epítopos del
antígeno. Esta producción de inmunoglobulinas
es de tipo policlonal debido a que son muchos y
muy diversos clonos linfocitarios los que se
activan y diferencian para la producción de
anticuerpos (Figura 10). Este fenómeno es de
gran utilidad biológica por cuanto ofrecen una
amplia barrera de protección del organismo al
formarse una gran variabilidad de anticuerpos.

Sin embargo, los antisueros así obtenidos,


aunque se han utilizado ampliamente y han sido
de gran interés en el conocimiento de la biología monoespecíficos, conocidos como anticuerpos
y la bioquímica de las inmunoglobulinas monoclonales (AcMo).
(inmunoprecipitaciones e inmunoblotting),
ofrecen serias dificultades para su uso, por Con ello se abrió un amplio campo en la
ejemplo, en la identificación de sustancias u otros Inmunología y la Biología Molecular en general
fines análogos, debido a la gran heterogeneidad puesto que estos anticuerpos son de una gran
estructural y funcional que poseen. Este utilidad por cuanto tienen la capacidad de
problema se ha obviado desde que Georges reaccionar frente a un solo epítopo del antígeno
Kholer y Cesar Milstein en 1975 (Figura 11) y son entre si homogéneos.
consiguieron la producción de anticuerpos

Fundamentos de la producción de anticuerpos monoclonales

El método seguido para de síntesis proteica al tiempo que puede


la producción de estos multiplicarse tanto in vivo como in vitro
anticuerpos consiste en indefinidamente, propiedades estas últimas que
la unión (fusión) de una son aportadas por la célula mielomatosa (Figura
célula B productora de 12).
anticuerpos, con una
célula de gran De esta manera, se pueden producir
capacidad de innumerables tipos de hibridomas de acuerdo con
crecimiento (células de el tipo de anticuerpo que interesa. Al ser cada
mieloma) con lo cual se uno de los anticuerpos así producidos
forma un híbrido ( homogéneos, ofrecen patrones de reacción de
hibridoma) que posee la gran especificidad con los antígenos utilizados en
información genética la inmunización. Kholer y Milstein para la puesta
necesaria para la a punto de esta técnica escogieron eritrocitos de
síntesis del anticuerpo oveja como inmunógenos, ya que el anticuerpo
deseado, que le es contra tales células se detectaba fácilmente
aportada por la célula B, y una activa capacidad mediante la técnica de placas hemolíticas de
Jerne. Esta técnica se basa en la detección de la segregaban inmunoglobulinas de ambos
formación de anticuerpos frente a glóbulos rojos progenitores. Algunas segregaban anticuerpos
de carnero, comprobando la capacidad lítica de contra los eritrocitos. Habían logrado por tanto,
los glóbulos frente al complemento. aislar clones que segregaban una sola especie
molecular de anticuerpo y que, además, podían
mantenerse en cultivo.

Por primera vez se habían desarrollado cultivos


continuos de células híbridas que segregaban un
anticuerpo monoclonal de especificidad
predefinida. Una vez seleccionado el hibridoma
adecuado, éste puede conservarse largo tiempo
congelado. En cualquier momento el clon puede
hacerse crecer para la producción de anticuerpos
por inyección a ratones o siembra en cultivo.
Generalmente el clon se inyecta
intraperitonealmente generándose ascitis
Así, mezclando células de mieloma de ratón con extraordinariamente ricas en anticuerpos, de
células de bazo procedentes de ratones donde son fácilmente purificables. Cuando el clon
inmunizados con glóbulos rojos de carnero en se ha cultivado in vitro el anticuerpo se recolecta
presencia de un agente promotor de la fusión a partir del sobrenadante del cultivo.
celular, identificaron con éxito las células híbridas
en un medio selectivo y observaron que

Tecnología de la obtención de AcMo

Generalmente se comienza por inmunizar a sensibilizados frente al antígeno correspondiente


ratones de la cepa BALB/C con el antígeno frente aportan al híbrido los genes que codifican las
al cual se desea obtener el anticuerpo. El cadenas ligeras y pesadas de las
protocolo de inmunización suele ajustarse a tres inmunoglobulinas, la línea mielomatosa dota al
dosis del material antigénico que se administran híbrido de la capacidad de crecimiento ilimitado
intraperitonealmente, con intervalos de unas dos propia de las células tumorales y, por tanto, de la
semanas. Aproximadamente a los veinte días de posibilidad de desarrollarse tanto in vitro como in
la primera dosis, se comprueba la presencia de vivo.
anticuerpos dirigidos frente al antígeno en el
suero del ratón. Comprobada la presencia de Esta línea mielomatosa se ha hecho resistente a
anticuerpos se procede al aislamiento de las la 8- azaguanina porque carece de la enzima
células B productoras de los mismos del bazo de HGPRT (hipoxantin-guanidin-fosforibosil-
los animales, en condiciones de esterilidad. transferasa). La síntesis de su DNA la tiene que
realizar a través de la vía de novo que obtiene
Las células así obtenidas serán utilizadas para su nucleótidos a partir de aminoácidos y azúcares.
fusión con células mielomatosas, generalmente La aminopterina bloquea la síntesis de novo de
del tipo NSI. La línea mielomatosa NSI procede nucleótidos, por lo que las células de la línea NSI
de un mieloma inducido en la cepa BALB/C que no sobrevivirán en presencia de este fármaco.
ha perdido la capacidad de secretar Esta característica permitirá eliminar las células
inmunoglobulinas, por lo que no interferirá en la NSI que no se han podido fusionar en el medio
producción de anticuerpos con los hibridomas que rico en aminopterina. Las células NSI no
se obtengan. Mientras los linfocitos B, fusionadas morirán, mientras que los híbridos
podrán seguir creciendo porque poseen la enzima cultivos añadiéndose medio HT (hipoxantina-
HGPRT, aportada por los esplenocitos. timidina) y, por último, durante la cuarta semana
las células se mantienen sólo en medio de
La fusión celular entre los esplenocitos del ratón cultivo.
inmunizado y la línea mielomatosa NSI se realiza
en el medio de cultivo adecuado que contiene, Terminado este proceso se estudian los
además de los nutrientes necesarios para un sobrenadantes de los híbridos para determinar si
cultivo celular, polietilén glicol (PEG) que es un producen anticuerpos. Los hibridomas
detergente capaz de disolver parte de la productores de anticuerpos se expanden y si
membrana celular permitiendo así la formación siguen siendo positivos se clonan cuando se
de células que contienen dos núcleos (fusión estabilizan en cultivo. La clonación tiene como
celular). Posteriormente se procede a la selección objetivo aislar el hibridoma productor del
de los híbridos que se inicia a partir de las 24 anticuerpo deseado y que todas las células que lo
horas después de la fusión. constituyen procedan de la misma célula
progenitora, dado que los hibridomas productores
Para ello se añade medio de cultivo con HAT de anticuerpos se encuentran mezclados en
(mezcla de hipoxantina aminopterina y timidina), cultivo con otros hibridomas que, o bien no son
a cada uno de los pocillos de las placas en donde productores o sintetizan anticuerpos que no
se encontraban las células en cultivo. Hacia la interesan.
tercera semana, se retira la aminopterina de los

Utilidad de los anticuerpos monoclonales

subpoblaciones celulares, sino también su


Un anticuerpo monoclonal es un reactivo
fraccionamiento y aislamiento. En este sentido
biológico homogéneo en su actividad, en
cabe destacar el empleo de equipos conocidos
contraste con los antisueros convencionales que
como clasificadores de células activados por
son una mezcla variable de inmunoglobulinas. El
fluorescencia" (FACS, Fluorescence Activated Cell
uso más generalizado de los AcMo se centra:
Sorter)

• En trasplantes de órganos y enfermedades


autoinmunes en donde los AcMo dirigidos contra
los linfocitos T se utilizan frecuentemente en
casos de amenaza de rechazo agudo.

• En oncología para la localización de células


tumorales y/o su destrucción. Para ello los
anticuerpos específicos frente a antígenos
tumorales tales como el antígeno
carcinoembrionario pueden ser marcados con
• En la caracterización y cuantificación de
sustancias radioactivas, como por ejemplo In111 o
sustancias de interés biológico que se encuentran
Tc99, y así localizar su situación en el organismo
en cantidades muy pequeñas, tales como
mediante una gammacamara especial cuando
hormonas, enzimas, interferones, etc (Tabla 1).
son administrados a individuos afectos de
tumores. También los AcMo pueden ser utilizados
• En la identificación de antígenos presentes en
en la destrucción de células tumorales en
las membranas celulares, tales como las
oncología, para lo cual los anticuerpos son
moléculas CD3, CD4, CD8 y otras muchas. Esto
marcados con drogas citostáticas y citotóxicas.
ha permitido no solamente la cuantificación de
En esta panorámica general de la utilización de conlleva y en tanto que pueden producirse
los anticuerpos monoclonales, asistimos hoy a industrialmente. Se expone un esquema del
una impresionante dispersión hacia otros muchos procedimiento seguido para la producción de
campos, lo cual permite vislumbrar AcMo para su posterior utilización tanto en el
esperanzadores horizontes a partir de una técnica laboratorio como en la clínica como medio
que en principio surgió simplemente de la terapéutico y diagnostico (Figura 13).
pretensión de desvelar la organización y
expresión genética de las inmunoglobulinas, lo Sin embargo, sería deseable que, para su
que acabo constituyendo un verdadero hito en la aplicación terapéutica, los anticuerpos
historia de la medicina y las ciencias biológicas. procedieran de linfocitos humanos y no de ratón
o rata. Contrariamente a lo que se esperaba en
un comienzo, la utilización de linfocitos humanos
ha resultado difícil, en tanto que los intentos de
inmortalizar hibridomas humanos mediante su
fusión con células mielómicas de ratón o rata,
han sido, hasta la fecha, decepcionantes.

El problema reside en que, cuando se fusionan


células humanas con células animales, hay una
rápida pérdida preferencial de los cromosomas
humanos en las células híbridas interespecies
resultantes. En la actualidad se comienza a
producir AcMo humanos empleando linfocitos B a
los que se transforma en tumorales mediante su
infección con el virus de Epstein Barr,
obteniéndose así linfocitos B productores de AcMo
que pueden ser clonados y, por consiguiente,
Así pues, paulatinamente, los anticuerpos anticuerpos monoclonales homogéneos en su
monoclonales van sustituyendo a los antisueros composición y especificidad.
convencionales en base a las ventajas que su uso

AcMo quiméricos humanizados

Como se ha comentado con anterioridad, uno de anticuerpos humanizados de tipo quimérico.


los problemas del uso de AcMo en medicina es Estos anticuerpos se preparan mediante la
que al ser en su mayoría de origen murino, creación de una molécula híbrida en la que se
cuando son administrados a individuos, éstos mantienen las partes del anticuerpo monoclonal
producen anticuerpos frente a los mismos que de ratón que le confieren la especificidad
disminuyen su eficacia o bien pueden presentar (regiones V, D y J), y sustituir la región constante
problemas de tipo alérgico cuando se usan del anticuerpo de ratón por una región
reiteradamente. igualmente constante del mismo isotipo pero de
procedencia humana.
Para evitar este problema se están ya obteniendo
mediante técnicas de ingeniería genética
anticuerpo humanizado, y que este posea una
adecuada glicosilación.

De acuerdo con esto, es posible eliminar de un


anticuerpo de ratón (al menos parcialmente) sus
regiones más inmunógenas, de manera que no
sea reconocido como extraño por la persona que
es inyectada el organismo humano (Figura 14).
Un paso más adelante en la humanización de los
anticuerpos monoclonales producidos en ratón ha
sido ya dado mediante la realización de los
llamados anticuerpos hiperquiméricos.

En este caso se rediseña la parte variable del


anticuerpo, de manera que los aminoácidos
Para ello, es necesario disponer previamente del correspondientes a la secuencia del anticuerpo de
cDNA que codifica la inmunoglobulina de ratón de ratón que codifican las partes hipervariables para
nuestro interés. Las regiones del DNA de ratón el sitio de unión se introducen en el constructor
que contienen la especificidad del anticuerpo han que codificará la parte variable dentro del marco
de ser unidos a otro cDNA de humano que de la región variable de un anticuerpo humano.
codifica para la región constante de una Es decir, el anticuerpo humano va a servir
inmunoglobulina del mismo isotipo. Una vez que únicamente como vehículo o vector de las
se han ligado las diferentes regiones de DNA de regiones de determinantes complementarios
ratón y humano, esta construcción ha de ser (CDR) murinas, que son en realidad las
subclonada en un vector apropiado y transfectada responsables de la unión específica del anticuerpo
a una célula B a fin de que ésta produzca el con el antígeno.