WESTERN BLOTTING: A TCNICA E APLICAES NA PESQUISA E ROTINA

DIAGNSTICA EM MEDICINA VETERINRIA

Marina Pacheco Miguel1, Liliana Borges de Menezes2, Eugnio Gonalves de
Arajo3
1. Professora Doutora de Patologia Geral do Curso de Biomedicina, Campus
Jata, Universidade Federal de Gois (UFG). Coordenao do Curso de
Biomedicina, Unidade Jatob, Campus Jata, Universidade Federal de Gois,
BR 364, Km 192, Parque Industrial, CEP: 75801-458, Jata, GO, Brasil.
(mapa_mi@hotmail.com)
2. Professora Doutora de Patologia Geral, Instituto de Patologia Tropical e
Sade Pblica, UFG
3. Professor Doutor de Patologia Animal da Escola de Veterinria e Zootecnia,
UFG
Recebido em: 06/10/2012 Aprovado em: 15/11/2012 Publicado em: 30/11/2012

RESUMO
Os avanos na biologia molecular tm contribudo significativamente para o
entendimento da etiopatognese das doenas. Protenas realizam diferentes
funes no organismo e so responsveis por manter sua homeostase. Mudanas
em sua composio podem desencadear processos patolgicos, sendo de grande
importncia, a aplicao de mtodos moleculares para identificao de marcadores
de doenas. partir do desenvolvimento da eletroforese em gel vrios estudos
foram conduzidos a fim de permitir a imunodeteco de diferentes protenas. O
advento da tcnica de Western blotting, na dcada de 70, possibilitou que protenas
separadas pela eletroforese fossem detectadas, caracterizadas e quantificadas. Este
mtodo determinou grande avano no estudo de diversas enfermidades animais,
principalmente por se tratar de um exame de alta sensibilidade e especificidade,
alm de ser um mtodo de rpida execuo, preciso e acessvel aos laboratrios
de pesquisa e de servio de rotina diagnstica. Esta abordagem tem por objetivo
revisar a tcnica e apontar possibilidades de aplicao da tcnica de Western
blotting para pesquisas e diagnstico de agentes infecciosos em medicina
veterinria, sendo esta uma rea em que os pesquisadores esto profundamente
envolvidos.
PALAVRAS-CHAVE: biologia molecular, imunodeteco, protein blotting, protenas.

ENCICLOPDIA BIOSFERA, Centro Cientfico Conhecer, Goinia, v.8, n.15; p. 1704 2012

WESTERN BLOTTING: THE TECHNIQUE AND APPLICATIONS ON THE

RESEARCH AND DIAGNOSTIC ROUTINE IN VETERINARY MEDICINE
ABSTRACT
Advances in molecular biology have contributed significantly to understanding the
genesis of diseases. The proteins perform different functions in the body and are
responsible for maintaining homeostasis. Changes in composition can trigger
pathological processes, so the application of molecular methods to identify disease
markers is of great importance. Various studies were conducted to allow
immunodetection of the different proteins since of the development of gel
electrophoresis. The advent of the Western blotting technique, in the 70s, allow
detection, characterization and quantified of the proteins by electrophoresis. This
method determined breakthrough in the study of various animal diseases, primarily
because it is a test of high sensitivity and specificity, and is a fast method of
execution, accuracy and accessible to research labs and diagnostic routine service.
This approach aims to review the WB technical and of application possibilities for
research and diagnosis of infectious agents in veterinary medicine, an area where
researchers are deeply involved.
KEYWORDS: imunodeteccion, molecular biology, protein blotting, proteins
INTRODUO
A separao de diferentes protenas pela eletroforese passou a ser
realizada no incio do sculo 20. A eletroforese em gel envolve a migrao de
partculas, em um determinado gel, de acordo com seu tamanho e carga eltrica
(PAGANO, 1999). A utilidade desta tcnica era limitada pelo fato de que as protenas
separadas presentes em uma matriz gelatinosa eram de difcil acesso para provas
moleculares. A partir do advento do procedimento que permitia a transferncia
destas protenas para uma membrana adsorvente, esta limitao foi sanada
(KURIEN & SCOFIELD, 2003). Desde o incio, em 1979, o protocolo para
transferncia de protenas de um gel de eletroforese para membrana tem evoludo
grandemente (KURIEN & SCOFIELD, 2006).
De acordo com alguns autores, a tcnica de Western blotting (WB) iniciou
uma nova era no imunodiagnstico, o qual reduziu significativamente as reaes
cruzadas que podiam ser encontradas em outras tcnicas moleculares de
diagnstico. Este mtodo foi inicialmente usado como teste de diagnstico de
infeces virais e bacterianas e mais tarde foi empregado no campo da parasitologia
(SARIMEHMETOLU, 2002).
Esta reviso tem por objetivo revisar a tcnica e apontar possibilidades de
aplicao da tcnica de Western blotting para pesquisas e diagnstico de agentes
infecciosos em medicina veterinria.
A TCNICA DE WESTERN BLOTTING
Western blotting (WB) tambm conhecido como protein blotting ou
immunoblotting, um poderoso e importante mtodo em biologia molecular utilizado
para imunodeteco de protenas aps a separao destas por eletroforese em gel e
transferncia para membrana adsorvente (KURIEN & SCOFIELD, 2006). Esta
tcnica permite detectar, caracterizar e quantificar mltiplas protenas,
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principalmente aquelas que esto em baixas quantidades em determinada amostra

(KURIEN & SCOLFIELD, 2003).
WB evoluiu da tcnica de DNA (Southern) blotting e RNA (Northern)
blotting. A denominao WB ao procedimento modificado superficialmente a partir da
tcnica proposta por Towbin e seus colaboradores, e foi dada a fim de manter a
nominao geogrfica tradicional destes mtodos, iniciado pelo Southern blotting
(KURIEN & SCOLFIELD, 2003; 2006).
A tcnica de WB oferece as seguintes vantagens: membranas midas so
maleveis e de fcil manuseio; as protenas imobilizadas na membrana so
rapidamente e uniformemente acessveis a diferentes ligantes; somente uma
pequena quantidade de reagentes so necessrios para a anlise de transferncia;
possvel fazer mltiplas rplicas do gel; o armazenamento da amostra transferida
pode ser prolongado, antes de ser usada e a mesma protena transferida pode ser
usada para mltiplas anlises sucessivas (KURIEN & SCOFIELD, 2006). Alm disso,
em estudos relacionados deteco de anticorpos e protenas de agentes
infecciosos, este mtodo considerado altamente sensvel e especfico, sendo o
mtodo de eleio para diagnstico de inmeras doenas dos animais (COOLEY et
al., 2001; TALMI-FRANK et al., 2006).
Desde seu incio, protein blotting tem evoludo constantemente e agora a
comunidade cientista est diante de mltiplos caminhos e significados da
transferncia e deteco de protenas. O protocolo bsico de WB pode ser resumido
nos seguintes passos: preparao das amostras e fracionamento de protenas,
execuo da eletroforese em gel, transferncia das protenas separadas do gel para
uma membrana adsorvente, bloqueio de ligaes inespecficas, adio de anticorpo
especfico e deteco da reao.
PREPARAO DAS AMOSTRAS E FRACIONAMENTO PROTICO
A preparao de amostras um dos passos cruciais do processo de
separao de protenas. Os resultados do experimento dependem das condies
iniciais do material. Por esse motivo, um modelo experimental adequado e uma
preparao cuidadosa de amostras so essenciais para se obter resultados
significantes e confiveis, particularmente em estudos comparativos de protenas,
em que normalmente existem diferenas mnimas entre as amostras experimentais e
as do grupo controle (FREEMAN & HEMBY, 2004; BODZON-KULAKOWSKA et al.,
2007).
Tecidos, culturas celulares e fludos corporais, como plasma ou liquido
cefalorraquidiano (LCR) so usados como fonte de protenas. Alm disso, podem ser
estudadas, tambm, protenas de bactrias, vrus e outros agentes infecciosos
(BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).
Cada tecido possui sua particularidade e alguns agentes acometem
rgos-alvo, os quais devem ser escolhidos para a realizao de um correto
diagnstico. Alm disso, a pureza e estabilidade da protena, a preveno da
degradao e modificaes durante a preparao das amostras tem importncia
crtica para o bom resultado do procedimento. Por esse motivo alguns aspectos
devem ser considerados no momento da obteno de amostras, conservao e
preparao do material (FREEMAN & HEMBY, 2004; BODZON-KULAKOWSKA et
al., 2007).
A remoo rpida do tecido, a disseco e o congelamento (em nitrognio
lquido ou a -80 C) so imperativos para manuten o do bom estado das protenas
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a serem estudadas no tecido selecionado (BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).

Tecidos frescos ou provenientes de biopsia devem estar livres de sangue, soro,
estroma indesejvel e gordura (AHMED & RICE, 2005). A preveno da degradao
e desfosforilao protica durante a preparao podem ser conseguidas com a
adio de proteases e inibidores de fosfatases (FREEMAN & HEMBY, 2004).
Aps a coleta e armazenamento adequado da amostra, esta deve ser
homogeneizada, at que nenhuma partcula de tecido seja visualizada. O lisado
deve ser centrifugado, a fim de permitir a remoo de cidos nuclicos, substncias
insolveis e protenas abundantes. Em muitos casos, recomendado o
fracionamento protico com a inteno de concentrar protenas menos abundantes e
de interesse para anlises futuras (BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).

Mtodos para promover a ruptura celular e homogeneizao

A homogeneizao um dos passos para a preparao de qualquer
amostra para anlise de protenas. O termo homogeneizao tem vrios sinnimos
tais como mistura, emulsificao e disperso, que em geral, significam a obteno
de amostras com mesma composio e estrutura em seu volume. Este processo
deve alterar as propriedades fsicas sem provocar qualquer mudana na composio
qumica da amostra (BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).
As foras aplicadas no processo de homogeneizao permitem a
fragmentao de protenas em pequenas partculas, facilitando o processo de
solubilizao (CABRAL et al., 1997). Os mtodos de homogeneizao usados
podem ser divididos em cinco categorias: por homogeneizao mecnica,
ultrassnica, por presso, por descongelamento e osmtica ou lise por detergentes
(BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).
Solubilizao de protenas
O processo de solubilizao de protenas afeta sobremaneira a qualidade
do resultado final e um determinante para o sucesso do processamento. A ruptura
das interaes que agregam protenas, como por exemplo, ligaes
dissulfido/hidrognio, foras de Van derWaals, ligaes inicas e interaes
hidrofbicas, permite a separao de protenas na soluo (BODZONKULAKOWSKA et al., 2007).
Considerando a heterogeneidade de protenas e presena de
contaminantes em extratos biolgicos, a separao simultnea dessas protenas
remanescentes um grande desafio. Na tentativa de impedir modificaes,
agregaes ou precipitaes proticas resultando em artefatos e subsequente perda
de protenas, o processo de solubilizao de amostras implica no uso de caotrpicos
(como uria e/ou tiouria), detergentes (como o 3-[(3-Colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propano sulfonado (CHAPS) ou Triton X-100), agentes redutores (como
ditiotreitol/ditioeritritol (DTT/DTE) ou tributilfosfina (TBP) e inibidores de proteases. O
uso destas substncias associado a um mtodo de ruptura celular adequado e
tcnicas de dissoluo e concentrao de protenas determina a efetividade da
solubilizao (BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).

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Remoo de contaminantes
Durante a preparao do tecido para anlise de protenas, importante
diminuir a heterogeneidade da amostra o mximo possvel. No SNC, por exemplo,
particularmente abundante a presena de lipdios e esses devem ser eliminados
juntamente com os cidos nuclicos, para obteno de resultados de alta qualidade.
O mtodo mais comumente usado a precipitao seletiva de protenas com
acetona ou cido tricloroactico (TCA) (FREEMAN & HEMBY, 2004).
O pH e a fora inica das amostras influenciam consideravelmente na
solubilidade de protenas. Por esse motivo, solues tampes, solues salinas e
detergentes so includos em amostras. Normalmente, estas solues tendem a
interferir nos passos posteriores separao de protenas, inibindo o processo de
digesto e, por conseguinte, complicando a anlise, razo pela qual precisam ser
removidos da anlise em tempo apropriado (BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).
Em muitos casos, o uso de protena pura no pode ser feito porque
protenas como IgGs ou albumina constituem a grande maioria do concentrado de
protenas na clula. A eliminao seletiva dessas protenas permite a melhor
deteco de protenas menos abundantes (LOLLO et al., 1999).
Mtodos de enriquecimento de protenas
Amostras biolgicas usadas como fonte para anlise de protenas so
usualmente muito heterogneas. Por isso, de prioridade para a anlise reduzir ao
mximo a complexidade das amostras por meio de um pr-fracionamento ou
promoo do enriquecimento das protenas de interesse (BODZON-KULAKOWSKA
et al., 2007).
A idia fundamental do pr-fracionamento isolar amostras em fraes
distinguveis contendo nmero restrito de molculas. As amostras podem ser
fracionadas usando uma variedade de mtodos incluindo a precipitao,
centrifugao, cromatografia lquida e mtodos baseados em eletroforese, filtrao e
sedimentao por velocidade e equilbrio. A seleo da tcnica depende
grandemente da natureza da amostra a ser analisada e do objetivo do estudo
(FREEMAN & HEMBY, 2004).
Os mtodos de enriquecimento permitem o aumento da concentrao das
protenas de interesse. Esta etapa possui grande importncia no estudo de
protenas, porque normalmente protenas pouco abundantes possuem valiosas
informaes diagnsticas e so responsveis por processos importantes na clula
(AHMED & RICE, 2005).
ELETROFORESE EM GEL
A eletroforese um processo analtico de separao de protenas e
outras molculas, em que a migrao de partculas acontece em um campo eltrico
(matriz). Para tal evento necessrio que essas partculas sejam dotadas de carga
eltrica (VESTERBERG, 1989). O fracionamento de protenas por eletroforese
comeou no incio do sculo 20 com a tcnica de eletroforese livre em soluo
tampo, criada por Arne Tiselius em 1937, a qual foi substituda pelo uso de gis de
poliacrilamida e agarose (PAGANO, 1999).
A escolha do material da matriz depende da resistncia necessria para a
separao efetiva dos fragmentos proticos. O gel de agarose possui poros com
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dimetro que permitem a separao de fragmentos que variam de 200 pares de

bases (pb) a 50 kilobases (kb). A poliacrilamida o material ideal para processos de
sequenciamento, pois permite a separao de fragmentos muito pequenos, de at
1.000 pb (SILVA & SOUSA, 2002).
A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) um mtodo simples e
rpido que separa pequenas protenas de tamanhos diferentes usando enzimas de
restrio. Quando submetidas a um campo eltrico em pH neutro, as molculas de
protena so atradas para o plo positivo e repelidas do plo negativo. Quando a
matriz apresenta resistncia migrao das molculas, os fragmentos menores
podem se mover com maior facilidade do que os maiores, havendo, ento, uma
migrao diferenciada dos fragmentos (Figura 1) (SILVA & SOUSA, 2002).

FIGURA 1: Esquema da eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). A amostra

colocada em uma canaleta confeccionada no gel. Sob corrente
eltrica, as protenas migram do lado de carga negativa para o lado
positivo. No gel, as protenas se posicionam de acordo com seu
tamanho e peso.
Fonte: http://www.nehmi-ip.com.br/imagens_servicos/bio_23_p.gif

A separao de protenas por tamanho obtida com o uso do gel de

sdio dodecil sulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE) (VESTERBERG, 1993). Esta
tcnica uma variao da tcnica de PAGE amplamente utilizada para separar
subunidades proticas e determinar suas massas moleculares (PAGANO, 1999). A
eletroforese SDS-PAGE um poderoso procedimento, pois pode ser usado para
separar todos os tipos de protenas incluindo protenas de membrana, do
citoesqueleto e agregados de protenas que normalmente so insolveis em gua,
alem de ser utilizado para separar protenas em pequena quantidade (BRNY et
al., 1998).
Nesta fase, cada componente de uma mistura de protenas determinado
pelo SDS-PAGE como bandas separadas, atravs da migrao de protenas. A
mobilidade das protenas no gel de poliacrilamida dependente do seu tamanho e
da concentrao de acrilamida. O gel age como uma peneira molecular. Pequenas
protenas movem atravs do gel mais rpido que protenas maiores. Quanto mais
alta a concentrao de acrilamina, menores so os poros do gel e as protenas se
movem mais lentamente. Entretanto, gis com alta concentrao de acrilamida so
usados para determinar protenas de tamanho pequeno, e gis com baixas
concentraes de acrilamida so usados na determinao de protenas grandes
(PAGANO, 1999).
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Antes da eletroforese, as amostras podem ser tratadas com uma soluo

de -mercaptoetanol e dodecil sulfato de sdio (SDS). O -mercaptoetanol um
agente de reduo que cliva as ligaes dissulfeto. O SDS um detergente aninico
que desnatura protenas e forma uma camada de cargas negativas, o qual as
protenas passam a ter uma carga intrnseca. Assim, as protenas tratadas assumem
uma forma de haste e carregadas por uma malha de carga negativa. Quando as
protenas tratadas so colocadas em eletroforese no SDS-PAGE, as protenas
migram para o eletrodo positivo. Desta forma, as protenas podem ser separadas
pelos seus pesos moleculares (PAGANO, 1999; GARCIA-RODRIGUEZ et al., 2003;
BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).

TRANSFERNCIA PARA MEMBRANA

A fim de tornar as protenas acessveis deteco por anticorpos realizase a transferncia destas de um gel para uma membrana adsorvente (PAGANO,
1999). A membrana de transferncia colocada face-a-face com o gel de
separao, e aplica-se uma corrente eltrica. Durante a transferncia, o gel esta na
face do eletrodo negativo e a membrana em sua face positiva. Ento, as protenas
contendo carga eltrica se movem do gel para a membrana mantendo a mesma
disposio do gel. Como resultado desse processo de transferncia e ligao
membrana, as protenas so expostas a uma fina camada para deteco. A ligao
das protenas membrana baseada tanto em interaes hidrofbicas quanto em
interaes de cargas entre a membrana e as protenas (KURIEN & SCOFIELD,
2003). A comunidade cientista tem confrontado uma variedade de caminhos e
significados para executar essa transferncia (SILVA & SOUSA, 2002).
A eficincia na transferncia de protenas do gel para uma membrana
slida depende grandemente da natureza do gel, massa molecular das protenas
que esto sendo transferidas e o tipo de membrana usada. Protenas com alto peso
molecular marcam pobremente aps SDS-PAGE, resultando em menores nveis de
deteco no WB. No entanto, a eficincia na transferncia de cada protena tem sido
facilitada com o aquecimento, tampes especiais e digesto proteoltica parcial antes
da transferncia (KURIEN & SCOFIELD, 2006).
Vrios tipos de membrana esto disponveis para a realizao do
processo. Membranas base de nitrocelulose, polivinildina difluorada (PVDF), papel
ativado ou nylon ativado tm sido utilizadas com sucesso para promover a ligao
protena/ membrana no momento da transferncia. A membrana mais comumente
usada a de nitrocelulose, por apresentar melhor eficincia na ligao de diferentes
tipos de protenas. Embora esta membrana apresente custo inferior que a de PVDF,
menos eficiente para protenas que promovam ligaes no-covalentes, somandose a isto o fato de apresentarem uma fragilidade ao manuseio antes da hidratao
(PAGANO, 1999; KURIEN & SCOFIELD, 2006).
Embora a transferncia de protenas do SDS-PAGE para uma membrana
de nitrocelulose ou de PVDF possa ser executada de diferentes maneiras tais como:
difuso simples; transferncia a vcuo; electroblotting, esta ltima a que
correntemente tem sido utilizada na atualidade. As principais vantagens do
Electroblotting so a velocidade e a transferncia completa quando comparada
difuso simples e transferncia a vcuo. O eletroblotting pode ser realizado por
imerso completa de um sanduche gel-membrana em uma soluo tampo
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(transferncia mida) ou colocando o sanduche gel-membrana entre papel filtro

absorvente em um tampo de transferncia (transferncia semi-seca). O mtodo
mais consagrado o de transferncia horizontal semi-seca (Figura 2) (PAGANO,
1999; KURIEN & SCOFIELD, 2006).

FIGURA 2: Transferncia de protenas de gel para membrana com o

mtodo de transferncia horizontal semi seca.
Fonte:http://www.fermentas.com/techinfo/Electrophoresi/pprot
eintransfer.htm

BLOQUEIO DE LIGAES INESPECFICAS

Uma grande quantidade de protenas indesejveis ligam-se fortemente
nitrocelulose em diferentes condies experimentais. No entanto, leite seco
desnatado, soro albumina bovina (BSA), Triton X-100, Nonidet P-40 e Tween 20 so
eficazes na remoo de ligaes proteicas. Leite seco desnatado e BSA so
rotineiramente utilizados em procedimentos de imunodeteco de protenas para
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evitar ligaes inespecficas (KURIEN & SCOFIELD, 2003; KURIEN & SCOFIELD,
2006).

ADIO DO ANTICORPO
Em mamferos, um complexo grupo do sistema celular est envolvido na
proteo do organismo contra substncias txicas e invaso por agentes
infecciosos. Como parte da resposta de defesa, clulas do sistema linftico podem
ser induzidas para produzir protenas especficas (anticorpos) que se ligaro s
substncias estranhas (antgenos) neutralizando seu impacto biolgico. Em resposta
a mudana imunolgica h sintetizao de um simples anticorpo que reconhece, e
possui uma alta afinidade, uma regio discreta chamada eptopo ou determinante
antignico, imunizando o antgeno. Devido um antgeno geralmente possuir vrios
eptopos diferentes, normalmente cada uma das vrias clulas do sistema imune
produzem um diferente anticorpo contra um dos vrios eptopos do antgeno. De tal
modo que um grupo de anticorpos, dos quais todos reagem com os diferentes
antgenos, so designados como anticorpo policlonal. Mais tarde os anticorpos
passaram a ser utilizados como diagnstico de agentes para determinar a presena
de protenas em amostras biolgicas (GLICK & PASTERNAK, 1998).
Normalmente, esses anticorpos (monoclonais ou policlonais) so
utilizados para detectar uma protena (antgeno ou eptopo) especfica, ligando-se
diretamente a ela, sendo o anticorpo primrio da tcnica de immunoblotting.
Anticorpos monoclonais so melhores imunodetectores, entretanto, anticorpos
secundrios antipeptdicos especficos devem ser usados (PAGANO, 1999).
Posteriormente, esta reao antgeno/ anticorpo primrio ser exposta a
um anticorpo secundrio direcionado pores espcie-especficas do anticorpo
primrio (PAGANO, 1999). Normalmente, o anticorpo secundrio est ligado uma
enzima reveladora, por exemplo biotina, que gera uma mudana de colorao ou um
sinal fotomtrico (Figura 3) (KURIEN & SCOFIELD, 2003).

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FIGURA 3: Tcnica de Western blotting evidenciando a adio de anticorpos.

Fonte: http://www.chemicon.com/resource/ANT101/a2B.asp
DETECO DE ANTGENOS
A imunomarcao de protenas mais sensvel que os mtodos de
deteco convencionais (PAGANO, 1999). O protein blotting somente eficiente
quando um mtodo de deteco apropriado aplicado (KURIEN & SCOFIELD,
2003).
As protenas no immublotting tm sido detectadas diretamente por uso de
corantes orgnicos (Ponceaus red, amido negro, fast green), marcadores
fluorescentes (fluorescamina, Coumarin), vrios mtodos com colorao de prata e
partculas coloidais como ouro, prata, cobre, ferro ou Indian ink. O tipo de colorao
a ser utilizado deve ser compatvel com a membrana usada para a transferncia de
protenas (PAGANO, 1999; KURIEN & SCOLFIED, 2003).
Aps a adio do anticorpo primrio e anticorpo secundrio, de acordo
com KURIEN & SCOLFIELD (2006) dois mtodos de deteco de antgenos so
comumente usados: radioativo e imunoenzimtica.
O mtodo radioativo promove a ionizao e subseqente autoradiografia
para visualizao da interao antgeno-anticorpo. A importncia deste mtodo de
deteco est em franco desuso, por apresentar um alto custo e riscos sade
(KURIEN & SCOLFIED, 2006).
A quimioluminescncia preconiza a incubao de um substrato
fluorescente que ao ser exposto a uma enzima reveladora associada ao anticorpo
secundrio gera uma colorao. Esta florescncia detectada por um
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filme fotogrfico ou cmeras especias que capturam uma imagem digitalizada do

WB. A imagem analisada por densitometria, a qual avalia a quantidade de protena
colorida e quantifica os resultados em termos de intensidade ptica (KURIEN &
SCOLFIED, 2006).
Atualmente, a quimioluminescncia o mtodo imunoenzimtico de
eleio em WB. Normalmente, horseadish peroxidase ou fosfatase alcalina ligados
anticorpos so usados com inmeros substratos solveis que produzem produtos
coloridos insolveis. Esses mtodos so de simples execuo e no requerem
equipamentos sofisticados, alm de conferirem resultados rpidos. As desvantagens
do mtodo compreendem na dificuldade de obteno de fotografias com qualidade,
diferetemente do mtodo radioativo, pois a colorao da reao apresenta baixo
contraste, somando-se a isto, o fato de no produzir resultados quantitativos
(PAGANO, 1999; KURIEN & SCOLFIED, 2006).
APLICAES DO WB NO DIAGNSTICO DAS ENFERMIDADES ANIMAIS
O emprego da tcnica de WB teve incio nos anos 70 com o advento da
transferncia de protenas de uma matriz gelatinosa para uma membrana
adsorvente. A partir disso, o emprego de anticorpos marcados com enzimas foi
possvel, o que permitiu a deteco e quantificao de protenas previamente
separadas (KURIEN & SCOFIELD, 2003). O WB uma tcnica recente, que possui
alta sensibilidade e especificidade e seu emprego em diagnstico das doenas dos
animais crescente (TALMI-FRANK et al., 2006).
Algumas enfermidades infecciosas de animais podem ser diagnosticadas
por western blotting. Um exemplo o diagnstico de encefalopatias espongiformes
transmissveis (EETs), desordens neurodegenerativas crnicas fatais provocadas
por prons, que podem acometer animais e seres humanos (NEVES, 2003;
THOMZIG et al., 2007). O diagnstico confirmatrio dado ps-morte, por meio de
exames histolgicos e deteco da isoforma prinica, por meio de microscopia
eletrnica, imuno-histoqumica e WB (COOLEY et al., 2001; BARROS et al., 2006).
Entre os mtodos imunolgicos utilizados para deteco do pron, a tcnica de WB
tem sido amplamente utilizada por permitir o diagnstico rpido e preciso, pois
possui alta sensibilidade e especificidade, alm de possibilitar novos estudos sobre
patognese e etiologia da enfermidade. Alm disso, o WB associado ao anticorpo
monoclonal 6H4 o mtodo de escolha para exames de sistema nervoso de bovinos
com BSE em vrios pases da Europa. Desde janeiro de 2000, esta tcnica vem
sendo utilizada conjuntamente com o exame histopatolgico e imuno-histoqumica
para diagnstico de BSE e Scrapie (COOLEY et al., 2001; MIGLIORE et al., 2012).
Outra doena importante na medicina veterinria a leishmaniose
visceral americana (LVA), causada pela Leishmania chagasi. Esta enfermidade de
grande importncia em sade pblica por sua natureza zoontica, sendo o co
reconhecido como um importante reservatrio. O vetor da leishmaniose visceral no
Brasil a fmea do inseto Lutzomyia longipalpis (STRAUSS-AYALI & BANETH,
2000; LINHARES et al., 2005). Uma medida de controle da leishmaniose canina a
eliminao de ces soropositivos em tcnicas sorolgicas, como imunofluorescncia
indireta (IFA) e ELISA (SILVA et al., 2005). No entanto, este mtodo tem
apresentado resultados conflitantes, principalmente, de falsos-positivos (DE PAULA
et al., 2003). Desta forma, estudos demonstraram que a tcnica de WB mostrou-se
mais sensvel e precoce quando comparada s tcnicas de IFA e ELISA, sugerindo
a possibilidade de sua utilizao como preditora da infeco no co (AISA et al.,
ENCICLOPDIA BIOSFERA, Centro Cientfico Conhecer, Goinia, v.8, n.15; p. 1714 2012

1998; SILVA et al., 2005). SILVA et al., (2005) em estudo para reconhecimento
antignico de LVA em 120 ces demonstrou que 26% dos ces que eram negativos
para o teste de IFA tiveram o reconhecimento de fraes antignicas de L. chagasi
no WB. Os autores sugerem que os ces positivos para o WB e negativos para o IFA
eram animais resistentes que apresentavam baixos nveis de anticorpos, dessa
maneira no detectveis pelo IFA.
A mieloencefalite equina por protozorio (MEP) uma doena neurolgica
infecciosa de equinos e outros equdeos das Amricas, frequentemente fatal, que
tem como agente etiolgico primrio o protozorio Sarcocystis neurona (ROSSANO
et al., 2003; BARROS, 2007). Recentemente, outro microrganismo, Neospora
caninum/ Neospora hughesi, foi implicado na etiologia de alguns casos de MEP
(BARROS, 2007). Esta enfermidade tem sido diagnosticada no Brasil, porm no
existem dados sobre a prevalncia de casos. Ainda hoje, a quantidade de equdeos
com sintomatologia nervosa que so necropsiados com diagnstico de MEP
diminuta, portanto a prevalncia pode ser maior do que imaginada anteriormente
(BARROS, 2007).
O diagnstico de MEP dado por meio da realizao de exame clnico
neurolgico e pela realizao de WB para deteco de anticorpos de S. neurona em
amostras de sangue e lquido cefalorraquidiano (LCR) (ROSSANO et al., 2003).
Estudos de soroprevalncia tm mostrado que anticorpos contra S. neurona esto
presentes em grande proporo no soro de equinos aparentemente normais, por
isso recomendado a clnicos veterinrios a obteno de LCR para determinao de
anticorpos contra o agente, indicando sua presena no SNC (FURR et al., 2002).
A salmonelose uma infeco grave e de grande importncia na
medicina e na veterinria. A Salmonella enteritidis possui protenas de membrana e
lipolissacardeos que tem importante papel na virulncia e nas propriedades
imunolgicas do agente, o que pode gerar quadros de intoxicao alimentar de
diferentes intensidades. Estudos utilizando WB so realizados para caracterizao
dessas protenas de membrana, principalmente para possibilitar o desenvolvimento
de vacinas, que so importante mtodo para evitar a doena (MARIPANDI & AlSALAMAH, 2010).
Em sunos, a infeco por Mycoplasma hyopneumoniae responsvel por
grandes perdas econmicas na suinocultura, por apresentar alta morbidade e baixa
mortalidade. O diagnstico precoce e confirmatrio tem grande relevncia para
eliminao do agente em uma granja acometida. Assim, o WB tem sido usado para
diminuir resultados os erros e resultados discrepantes dos testes sorolgicos
(AMERI et al., 2006).
Na pesquisa, a tcnica muito empregada para entendimento de
mecanismos de neoplasias (ZHANG et al., 2012; CATTELANI et al., 2012), no
estudo de doenas hereditrias (SETA et al., 1996), para descoberta de protenas
para produo de vacinas (MARIPANDI & Al-SALAMAH, 2010).
CONSIDERAES FINAIS
A tcnica de eletroforese permite a separao de protenas de cargas
eltricas diferentes, mas limitada por no produzir a quantificao e deteco de
protenas especficas. As tcnicas de blotting abriram portas para novos estudos
acerca da patognese e etiologia de inmeras enfermidades animais, garantindo o
avano da cincia. O Western blotting permitiu que protenas especficas fossem
detectadas, se firmando como um mtodo de diagnstico de eleio de inmeras
ENCICLOPDIA BIOSFERA, Centro Cientfico Conhecer, Goinia, v.8, n.15; p. 1715 2012

doenas, por ser altamente sensvel e especfico e de rpido resultado.

O uso do WB na rotina diagnstica ainda insipiente, por se tratar de uma
tcnica que necessita mo-deobra qualificada e por apresentar custo relativamente
superior quando comparado a mtodos convencionais e mtodos alicerados em
base da biologia molecular. Porm, vrios estudos demonstram que a utilizao de
tcnicas convencionais j consagradas, em determinadas doenas, no apresentam
resultados totalmente confiveis e satisfatrios, sendo a tcnica de immunoblotting
preferencial para confirmao diagnstica.

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