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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CINCIAS NATURAIS E EXATAS


PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

ESTUDO FOTOQUMICO DA AO
ANTI-RADICALAR DE COMPOSTOS
POLIFENLICOS EMPREGANDO
ESPECTROFOTOMETRIA E HPLC-UV

DISSERTAO DE MESTRADO

Fernanda Oliveira Lima

Santa Maria, RS, Brasil


2010

ESTUDO FOTOQUMICO DA AO ANTI-RADICALAR DE


COMPOSTOS POLIFENLICOS EMPREGANDO
ESPECTROFOTOMETRIA E HPLC-UV

por

Fernanda Oliveira Lima

Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de PsGraduao em Qumica, rea de Concentrao em Qumica Analtica,
da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito
parcial para obteno do grau de Mestre em Qumica Analtica

Orientador: Prof. Dr. Leandro Machado de Carvalho

Santa Maria, RS, Brasil


2010

___________________________________________________________________
2010
Todos os direitos autorais reservados a Fernanda Oliveira Lima. A reproduo de
partes ou do todo deste trabalho s poder ser feita com autorizao por escrito do
autor.
Endereo: Rua Dezenove de Outubro, n. 439, apto 206, Bairro Centro, Iju, RS,
98700-000
Fone (0xx)55 33338813; End. Eletr: quimica.fernandalima@gmail.com
___________________________________________________________________

Universidade Federal de Santa Maria


Centro de Cincias Naturais e Exatas
Programa de Ps-Graduao em Qumica Analtica

A comisso Examinadora, abaixo assinada,


aprova a Dissertao de Mestrado

ESTUDO FOTOQUMICO DA AO ANTI-RADICALAR DE


COMPOSTOS POLIFENLICOS EMPREGANDO
ESPECTROFOTOMETRIA E HPLC-UV
Elaborada por
Fernanda Oliveira Lima

Como requisito parcial para obteno do grau de


Mestre em Qumica Analtica

COMISO EXAMINADORA:

Leandro Machado de Carvalho, Dr.


(presidente/orientador)

Maurcio Reis Bogo, Dr. (PUC-RS)

Ricardo Andrade Rebelo, Dr. (FURB)

Santa Maria, 22 de fevereiro de 2010

Dedico este trabalho

minha me Carmen Marilia,


pela dedicao incansvel,
pelo suporte, amor, carinho,
pela fora, amizade, compreenso,
pelo companheirismo, apoio e pacincia,
enfim, por acreditar em mim,
minha av Geny,
pelo amor, carinho e apoio.
aos meus Tios e Primos,
pelo suporte, apoio,
e por acreditar em mim,
e s to queridas Amigas,
pela fora e compreenso.

Muito Obrigada por tudo!

Eu amo vocs!

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo qual recebi o dom da vida e que me deu fora e coragem diante
s dificuldades;
A minha me, Carmen Marilia, sempre maravilhosa!!! Pela compreenso,
ensinamentos, apoio, pacincia e amor incondicional, por dedicar a sua vida pela
minha formao, e por sempre me dar o apoio de que precisei, acreditando fielmente
em meus sonhos. Sem voc eu no teria chegado at aqui... Obrigada! AMO VOC,
por certo, a melhor pessoa do mundo;
Universidade Federal de Santa Maria e ao Programa de Ps-Graduao em
Qumica pela oportunidade de realizao do curso.
Ao CNPq pela concesso da bolsa.
Ao professor Dr. Paulo Ccero do Nascimento, pela oportunidade, auxlio,
disponibilidade de tempo, ateno e pacincia.
Ao meu professor orientador, Dr. Leandro Machado de Carvalho, pelo auxlio,
pela disponibilidade de tempo, pela ateno dispensada, pela pacincia e pelo
conhecimento compartilhado durante a realizao deste trabalho.
Ao professore Dr. Marcelo Barcellos da Rosa pela co-orientao, apoio,
transmisso de conhecimentos e pela colaborao neste trabalho e na banca de
qualificao.
Ao professor Dr. Marcos Antonio Villette, membro da banca de qualificao,
pelas contribuies para o aprimoramento deste trabalho.
Aos professores Dr. Maurcio Reis Bogo e Dr. Ricardo Andrade Rebelo,
membro da comisso examinadora, pelas contribuies para o aprimoramento deste
trabalho.
A todos colegas do LACHEM, pelo apoio, incentivo e conselhos. Um
agradecimento especial as colegas e amigas Simoni Da Rs e Ana Paula Moreira,
pelo apoio experimental, e Alice Raabe, pelo carinho.
A Mariele Martini e Luis Ferras, pessoas importantssimas na minha vida
profissional e pessoal, companheiros e conselheiros para todos os momentos sendo
eles de alegria ou tristeza no enfrentamento das dificuldades. Adoro vocs!!!

A minha amiga e irm por afinidade Greice Franciele Fehy dos Santos
Montagner, pelo amor, carinho, dedicao, apoio e conselhos. Adoro voc!!!
A todos os professores e funcionrios que colaboraram indiretamente para o
desenvolvimento deste trabalho. Em especial ao Ademir e a Valeria, pelo incentivo e
disponibilidade sempre que precisei.
E, a todos que me ajudaram, direta ou indiretamente, na concretizao deste
trabalho.
A todos o meu muito obrigado!

"O futuro no um lugar onde estamos indo, mas um lugar que estamos
criando. O caminho para ele no encontrado, mas construdo e o ato de faz-lo
muda tanto o realizador quanto o destino". (Antoine de Saint-Exupery)

RESUMO
Dissertao de Mestrado
Programa de Ps-Graduao em Qumica
Universidade Federal de Santa Maria

ESTUDO FOTOQUMICO DA AO ANTI-RADICALAR DE COMPOSTOS


POLIFENLICOS EMPREGANDO ESPECTROFOTOMETRIA E HPLC-UV
AUTORA: FERNANDA OLIVEIRA LIMA
ORIENTADOR: LEANDRO MACHADO DE CARVALHO
Santa Maria, 22 de fevereiro de 2010.

O interesse por substncias antioxidantes aumentou consideravelmente nos


ltimos anos, pois molculas que diminuem a peroxidao de lipdeos podem
minimizar ou inibir os danos oxidativos causados ao DNA, protenas e carboidratos.
Os flavonides, um grupo de metablitos secundrios, amplamente
distribudos

no

reino

vegetal,

apresentam

propriedades

antiinflamatrias,

antibacterianas, antivirais, antialrgicas e antitumorais, alm de possurem


propriedades antioxidantes sobre radicais livres de forma a inativ-los e a prevenir
os danos oxidativos em nvel celular. Acredita-se que a atividade biolgica dos
flavonides seja devido s suas propriedades antioxidantes.
Devido grande importncia dada atualmente aos radicais livres e
antioxidantes, existe uma forte demanda por tcnicas analticas capazes de
identificar e quantificar esses dois grupos de compostos.
Este trabalho descreve o estudo do poder anti-radicalar dos flavonides
canferol, fisetina, quercetina, quercitrina, miricetina e rutina frente radiao UV e

ao radical HO . O mtodo empregado baseou-se na gerao fotoqumica artificial do

radical HO pela fotodecomposio do H2O2. Os flavonides estudados foram

fotoestveis frente radiao UV e eficientes no combate ao radical HO . A


quercitrina foi o flavonide com maior ao anti-radicalar, seguida da rutina, canferol,
fisetina, quercetina e miricetina. A metodologia proposta possibilita a comparao
quantitativa da ao anti-radicalar de antioxidantes com base na cintica de reao

das espcies com o radical HO . Da mesma forma, o estudo in vitro da interao

entre radicais HO e extratos de plantas com carter antioxidante pode ser realizado
pelo mtodo proposto.

Palavras-chave: flavonides; radical HO ; poder anti-radicalar.

ABSTRACT
Master Dissertation in Chemistry
Postgraduate in Chemistry
Federal University of Santa Maria

ESTUDO FOTOQUMICO DA AO ANTI-RADICALAR DE COMPOSTOS


POLIFENLICOS ESPECTROFOTOMETRIA E HPLC-UV
AUTHOR: FERNANDA OLIVEIRA LIMA
ADVISOR: LEANDRO MACHADO DE CARVALHO
Santa Maria, February 22th, 2010.

The interest in antioxidants has increased considerably in recent years as


molecules that reduce lipid peroxidation may minimize or inhibit the oxidative damage
caused to DNA, proteins and carbohydrates.
Flavonoids, a group of secondary metabolites widely distributed in the plant
kingdom, have properties of anti-inflammatory, antibacterial, antiviral, anti-allergic
and anti-tumor, in addition to possessing antioxidant and free radicals to inactivate
them and prevent oxidative damage at cell level. It is believed that the biological
activity of flavonoids is due to its antioxidant properties.
Due to the great importance given today to free radicals and antioxidants,
there is a strong demand for analytical techniques able to identify and quantify these
two groups of compounds.
This work describes the study of anti-radical power of the flavonoids
kaempferol, fisetin, quercetin, quercitrin, myricetin and rutin against UV radiation and

HO radical. The method used was based on artificial photochemical generation of

HO radicals by photolysis of H2O2. The flavonoids studied were photpstable towards

UV radiation and efficient in the fight against HO radical. The flavonoid quercitrin
was the most active compound, followed by rutin, kaempferol, fisetin, quercetin and
myricetin. The proposed methodology allows for quantitative comparison of the
antiradical action of the antioxidants based on the reaction kinetics of the species

with the HO radical. Similarly, the study in vitro the interaction between HO radicals

and plant extracts with antioxidant character can be accomplished by the proposed
method.

Keywords: flavonoids; HO radical, anti-radical power.

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 Reduo tetravalente do oxignio molecular (O2) na mitocndria at a


formao de gua (H2O). Vrias espcies reativas de O2 so formadas no processo
[FERREIRA & MATSUBARA, 1997]................................................................................27
Figura 2 Reao direta dos antioxidantes com os radicais livres hidroxil (HO) e
peroxil (ROO) [DENISOV & AFANASEV, 2005]...........................................................30
Figura 3 Estrutura qumica do cido ascrbico [LEHNINGER, 2005]. .....................31
Figura 4 Reao entre um antioxidante e com radicais livres e com on frrico
[DENISOV & AFANASEV, 2005]. ...................................................................................31
Figura 5 Estrutura qumica do -tocoferol [LEHNINGER, 2005]...............................32
Figura 6 Reao do -tocoferol com os radicais livres hiroperoxil e peroxil
[DENISOV & AFANASEV, 2005]. ...................................................................................32
Figura 7 Estrutura qumica da Glutationa (Lglutamil-L-cisteinil-glicina (GSH))
[LEHNINGER, 2005]. ........................................................................................................ 33
Figura 8 Percursos de formao de EROs, o processo de peroxidao lipdica e do
papel da glutationa (GSH) e outros antioxidantes (vitamina E, vitamina C, cido
lipico) na gesto do estresse oxidativo (equaes no esto balanceadas). [VALKO
et al., 2007]. .......................................................................................................................34
Figura 9 Estrutura bsica dos flavonides [ACKER ET al., 1996; PIETTA, 2000;
HEIM, TAGLIAFERRO & BOBILYA, 2002; HAVSTEEN, 2002; DENISOV &
AFANASEV, 2005]. .......................................................................................................... 36
Figura 10 Principais rotas biossintticas dos flavanides [ACKER ET al., 1996;
PIETTA, 2000; FORKMANN & MARTENS, 2001; HEIM, TAGLIAFERRO &
BOBILYA, 2002; HAVSTEEN, 2002; DENISOV & AFANASEV, 2005]. .....................38
Figura 11 Estrutura qumica dos flavonides estudados neste trabalho..................39

Figura 12 Reao dos flavonides com os radicais livres peroxil (ROO) e hidroxil
(HO) [DENISOV & AFANASEV, 2005]. ......................................................................... 40
Figura 13 Reao de Fenton [ACKER et al., 1996; DENISOV & AFANASEV,
2005]. ..................................................................................................................................40
Figura 14 Reao do lumino com radicais alquil-peroxilas em meio alcalino para
gerao de luz. ..................................................................................................................43
Figura 15 Reao do DPPH com espcies antioxidantes [MOLYNEUX, 2004]......43
Figura 16 Reao do trolox com espcies antioxidantes [PANNALA, 2001; HUANG
et al., 2005]. .......................................................................................................................44
Figura 17 Representao esquemtica dos sistemas de irradiao UV
desenvolvidos: (A) reator com fonte de radiao lmpada de Hg; (a) lmpada de Hg
(80 W); (b) caixa de madeira revestida com papel alumnio; (c) cooler; (d) suporte
para os tubos de quartzo; (e) tubos de quartzo; (B) reator com fonte de irradiao
lmpada de W; (f) lmpada de W (150 W); (g) projetor; (h) caixa de madeira
revestida com papel alumnio; (i) cooler; (j) suporte para os tubos de quartzo. ......... 47
Figura 18 Lei de velocidade de uma reao de primeira ordem. ..............................50
Figura 19 Determinao da constante cintica aparente dos flavonides frente ao
radical HO. ........................................................................................................................50
Figura 20 Determinao do tempo de meia-vida de uma reao de primeira ordem.
............................................................................................................................................. 51
Figura 21 Reao de fotodecomposio do H2O2 [HALLIWELL; CLEMENTB;
LONG, 2000]......................................................................................................................52
Figura 22 Curva de calibrao do perxido de hidrognio, utilizada para
quantificao da fotodecomposio do H2O2. ................................................................ 53
Figura 23 Quantificao da fotodecomposio do H2O2 frente fotlise nos
reatores fotoqumicos desenvolvidos com fonte radiao de W (150 W) e de Hg (80
W); [H2O2]inicial = 0,29 mmol L-1.........................................................................................53

Figura 24 Quantificao da gerao do radical HO e fotodecomposio do H2O2


frente fotlise no reatore fotoqumico com fonte radiao de Hg (80 W); [H2O2]inicial
= 0,29 mmol L-1..................................................................................................................54
Figura 25 Estudo do decaimento do sinal dos flavonides fisetina, quercetina e
rutina frente fotlise direta no reator fotoqumico (A) com fonte radiao de Hg
(80 W). ................................................................................................................................ 56
Figura 26 Estudo do decaimento do sinal dos flavonides fisetina, quercetina e
rutina frente fotlise direta no reator fotoqumico (B) com fonte radiao de W
(150 W)...............................................................................................................................56
Figura 27 Estudo do decaimento do sinal dos flavonides fisetina, quercetina e
rutina frente a fotlise na presena de H2O2 no reator fotoqumico (A) com fonte
radiao de Hg (80 W); [H2O2] = 0,29 a 2,90 mmol L-1. ................................................58
Figura 28 Estudo do decaimento do sinal dos flavonides fisetina, quercetina e
rutina frente a fotlise na presena de H2O2. Reator fotoqumico (B) com fonte
radiao de W (150 W); [H2O2] = 0,29 a 2,90 mmol L-1.................................................58
Figura 29 Decaimento cintico dos flavonides quercitrina, rutina, canferol, fisetina,
quercetina e miricetina frente fotlise na presena de H2O2, no reator com fonte de
radiao lmpada de Hg (80 W); anlise por espectrofotometria UV-Vis; [H2O2] =
0,29 mmol.L-1; [flavonides] = 50 mol.L-1. (A) fotlise direta e (B) fotlise na
presena de H2O2.............................................................................................................. 60
Figura 30 Decaimento cintico dos compostos polifenlicos rutina, quercitrina,
canferol, fisetina, quercetina e miricetina frente fotlise na presena de H2O2, no
reator com fonte de radiao lmpada de Hg (80 W); anlise por HPLC; [H2O2] =
0,29 mmol.L-1; [flavonides] = 50 mol.L-1. (A) fotlise direta e (B) fotlise na
presena de H2O2.............................................................................................................. 60
Figura 31 Decaimento espectrofotomtrico da reao anti-radicalar dos
antioxidantes em estudo frente aos radicais HO...........................................................61
Figura 32 Decaimento cromatogrfico dos compostos polifenlicos estudados
frente a fotlise na presena de H2O2; [H2O2] = 0,29 mmol L-1. Condies de anlise:

fase estacionria C18 Dionex (4,6 mm x 150 mm x 5 m), fase mvel acetonitrila
30 % (v/v), pH 4,00, com fluxo de 0,5 ml min-1, injeo de 20 L e presso varivel.
............................................................................................................................................. 62
Figura 33 Constante cintica em funo da concentrao de flavonide em estudo
frente fotlise na presena de H2O2, determinada por HPLC-UV.............................64
Figura 34 Constante cintica em funo da concentrao de flavonide,
determinada por espectrofotometria UV-Vis dos flavonides em estudo frente
fotlise em presena de H2O2. .........................................................................................64
Figura 35 Constante cintica verus concentrao de flavonide, determinada por
HPLC-UV dos flavonides em estudo frente fotlise em presena de H2O2. .......... 65
Figura 36 Regies estrutura com maior atividade antioxidante [AMIC et al., 2003].
............................................................................................................................................. 66

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 EROs e os antioxidantes. ....................................................................... 33


Tabela

Constantes

cinticas

dos

favonides

determinadas

por

espectrofotometria UV-Vis........................................................................................ 63

LISTA DE ANEXOS

ANEXO A CARACTERSTICAS QUMICAS DOS COMPOSTOS POLIFENLICOS


ESTUDADOS .................................................................................................................................... 74
ANEXO B ESPECTROS DE ABSORTIVIDADES MOLAR DOS COMPOSTOS
POLIFENLICOS EM ESTUDO ................................................................................................. 75
ANEXO

DADOS

CINTICOS

DOS

COMPOSTOS

POLIFENLICOS

ESTUDADOS FRENTE AO RADICAL OH .............................................................................. 76

LISTA DE ABREVIATURAS

ABTS

cido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfnico)

ALA

cido -lipico

Asc-

Ascorbato

CAT

Catalase

DHLA

cido dihidrolipoico

DNA

cido desoxiribonuclico

DPPH

1,1-difenil-2-picrilhidrazil

EDTA

cido etilenodiaminotetractico

EROs

Espcies reativas de oxignio

GPx

Glutationa peroxidase

Gred

Glutationa redutase

GSH

Glutationa reduzida

GSSG

Glutationa oxidada

H2O

gua

H2O2

Perxido de hidrognio

HO

Hidroxila

HO2

Hidroperoxila

HPLC

Cromatografia liquida de alta eficincia

Constante cintica

kOH

Constantes cinticas aparentes

Radical lipdico

LDL

lipoprotena de baixa densidade

LH

cidos graxos poliinsaturados

LO

Lipdicos alcoxil

LOO

Radical peroxil lipdico

NAD(P)H

Nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato

O2

Oxignio

O2-

Superxido

ROO

Peroxil

SOD

Superxido dismutase

TO

Vitamina E

T-OH

Vitamina E reduzida

UV

Radiao ultravioleta

Vis

Radiao visvel

SUMRIO

INTRODUO ............................................................................................................................. 23

REVISO BIBLIOGRFICA...................................................................................................... 25

2.1

RADICAIS LIVRES E DEFESAS ANTIOXIDANTES ......................................................................... 25

2.1.1 Espcies Reativas de oxignio (EROs) .......................................................................... 26


2.1.1.1

Radical superxido (O2) .................................................................................................. 27

2.1.1.2

Radical hidroxil (HO)......................................................................................................... 28

2.1.1.3

Radical hidroperoxil (HO2-)............................................................................................... 28

2.1.1.4

Perxido de hidrognio (H2O2) ......................................................................................... 29

2.1.2 Defesas antioxidantes......................................................................................................... 29


2.2

FLAVONIDES COMO CAPTADORES RADICALARES .................................................................. 35

2.3

MTODOS PARA AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE .................................................... 41

2.3.1 Cintica qumica ................................................................................................................... 41


2.3.1.1

Reduo do -caroteno..................................................................................................... 42

2.3.1.2

Quimioluminescncia do luminol ..................................................................................... 42

2.3.2 Transferncia de eltrons .................................................................................................. 43


2.3.2.1

Reduo do radical DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) ......................................... 43

2.3.2.2

Oxidao do ABTS (2,2-azinobis(3-ethylbenzothiaziline-6-sulfonate)...................... 44

MATERIAL E MTODOS........................................................................................................... 45

3.1

REAGENTES E SOLUES .......................................................................................................... 45

3.2

REATORES FOTOQUMICOS ........................................................................................................ 45

3.3

ENSAIOS POR ESPECTROFOTOMETRIA UV-VIS ....................................................................... 48

3.4

ENSAIOS POR CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (HPLC)............................... 48

3.5

FOTODECOMPOSIO DO H2O2 E GERAO DO RADICAL OH ................................................ 49

3.6

ATIVIDADE ANTI-RADICALAR FRENTE AO RADICAL OH............................................................ 49

4
4.1

RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................................ 52


ENSAIOS DE FOTLISE DIRETA NOS REATORES FOTOQUMICOS DESENVOLVIDOS ................ 52

4.1.1 Fotodecomposio do H2O2 .............................................................................................. 52


4.1.2 Fotoestabilidade dos flavonides.................................................................................... 55
4.2

CINTICA ANTI-RADICALAR DOS FLAVONIDES........................................................................ 57

4.2.1 Perfil cintico reacional do radical OH frente aos flavonides................................ 57


4.2.2 Perfil cintico reacional dos flavonides frente ao radical OH................................ 59
4.2.2.1

Determinao das constantes cinticas reacionais por Espectrofotometria UV-Vis e

por Cromatogrfica Lquida de Alta Eficincia (HPLC)................................................................. 63


CONCLUSES ................................................................................................................................... 68
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................................... 70
ANEXOS .............................................................................................................................................. 73

23

1 INTRODUO

O interesse pela ao de compostos antioxidantes tem aumentado nos


ltimos anos, principalmente pela preocupao na preveno ao envelhecimento e
s doenas degenerativas relacionadas aos danos causados ao organismo pelos
radicais livres, como cncer, doenas cardiovasculares, catarata, doenas
degenerativas e disfunes cerebrais, como Alzheimer e Parkinson [FERREIRA &
MATSUBARA, 1997; BIANCHI & ANTUNES, 1999; HAVSTEEN, 2002; VALKO et al.,
2007, VELLOSA et al., 2007].
Os

compostos

amplamente

polifenlicos,

distribudos

no

um

reino

grupo

de

vegetal,

metablitos

secundrios,

apresentam

propriedades

antiinflamatrias, antibacterianas, antivirais, antialrgicas e antitumorais, alm de


possurem propriedades antioxidantes e inibirem a atividade de muitas enzimas
como as xantinas-oxidases. Acredita-se que a atividade biolgica dos compostos
polifenlicos seja devido s suas propriedades antioxidantes [PIETTA, 2000;
HAVSTEEN, 2002; SIMES et al., 2004; VALKO, 2007].
Considerando a grande variedade de compostos com propriedades
antioxidantes, alguns mtodos in vitro foram desenvolvidos para a avaliao da
atividade anti-radicalar destas espcies. Estes mtodos empregam espcies
radicalares estveis em que a deteco do ponto final da reao se realiza,
geralmente, por medida da absorvncia no UV. Entre as metodologias mais
conhecidas para determinao da atividade antioxidante de alimentos, bebidas e de
plasma sanguneo, esto os ensaios de captura de radicais livres DPPH (1,1-difenil2-picrilhidrazina) e o ABTS [2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolin) 6-cido sulfnico]
[MOLYNEUX, 2004; PERES-JIMENEZ & SAURA-CALIXTO, 2008].
No entanto, ainda so modestamente descritos mtodos que determinem a

cintica de reao de espcies antioxidantes com o radical HO .

O radical HO um dos mais reativos radicais conhecidos. A combinao

extremamente rpida do radical HO com metais ou outros radicais no prprio stio

onde foi produzido, confirma sua alta reatividade. Assim, se o radical HO for
produzido prximo ao DNA, podero ocorrer modificaes de bases nitrogenadas,

levando inativao ou mutao do DNA. Alm disso, o radical HO pode inativar

24

vrias protenas ao oxidar seus grupos sulfidrlicos formando pontes dissulfeto e


iniciar a oxidao dos cidos graxos polinsaturados (lipoperoxidao) das
membranas celulares [FERREIRA & MATSUBARA, 1997; VELLOSA et al., 2007].
Esta pesquisa teve como objetivo medir a cintica reacional dos compostos
polifenlicos canferol, fisetina, quercetina, quercitrina, miricetina e rutina frente ao

radical HO . Uma vez que, quanto mais lenta for a reao (antioxidante + radical),
maior ser a ao antioxidante do composto polifenlico.
As constantes cinticas obtidas da reao de compostos polifenlicos +

radical HO foram comparadas entre os compostos polifenlicos, uma vez que os


comportamentos so diferentes para cada composto polifenlico, em funo de seus
poderes antioxidantes/anti-radicalares diferenciados. Portanto, procurou-se com este
estudo, reunir informaes de forma comparativa, com base em constantes cinticas

e tempos de meia-vida, dos compostos polifenlicos frente ao radical HO , por ser


este uma das espcies radicalares mais importantes do ponto de vista fisiolgico.
Com isso, este trabalho descreve o estudo da fotoestabilidade e da atividade
anti-radicalar

(antioxidante)

dos

compostos

polifenlicos

canferol,

fisetina,

quercetina, quercitrina, miricetina e rutina, atravs da reao entre as espcies, a

radiao UV e o radical HO gerado artificialmente pela fotodecomposio do


perxido de hidrognio.

25

2 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1

Radicais livres e defesas antioxidantes

Nas ultimas dcadas, pesquisas apontam os radicais livres como principais


responsveis pelo envelhecimento e por doenas degenerativas [FERREIRA &
MATSUBARA, 1997; BIANCHI & ANTUNES, 1999; HAVSTEEN, 2002; REN et al.,
2003; VALKO et al., 2007; VELLOSA, BARBOSA & OLIVEIRA, 2007].
Os radicais livres podem ser definidos como espcies que contm um ou mais
eltrons no pareados em orbitais atmicos ou moleculares, ou seja, que
apresentam um nmero mpar de eltrons em sua ltima camada eletrnica. Este
eltron no pareado, geralmente, confere um considervel grau de reatividade aos
radicais livres [FERREIRA & MATSUBARA, 1997; RIBEIRO et al., 2005; VALKO et
al., 2007].
As reaes de oxi-reduo so o meio de formao de radicais livres, uma
vez que eles provocam ou resultam deste tipo de reao. O radical livre pode ceder
o eltron desemparelhado, oxidando-se, ou receber um eltron, reduzindo-se. Nesta
tentativa de se estabilizar quimicamente, os radicais livres propiciam reaes em
cadeia que terminam alterando a conformao, a estrutura ou as funes de
diversos componentes celulares [FERREIRA & MATSUBARA, 1997; VALKO et
al.2007].
Para limitar os nveis de radicais livres e impedir a induo de danos, defesas
antioxidantes agem frente produo contnua deles durante os processos
metablicos com o objetivo de equilibrar a formao e a remoo de espcies
radicalares no organismo. O efeito prejudicial dos radicais livres ocorre quando eles
esto em quantidade excessiva no organismo, ultrapassando a capacidade do
sistema de defesa antioxidante de neutraliz-los [FERREIRA & MATSUBARA, 1997;
BIANCHI & ANTUNES, 1999; VALKO et al.2007].

26

2.1.1 Espcies Reativas de oxignio (EROs)

Radicais livres derivados do oxignio, chamados de Espcies Reativas de


Oxignio (EROs) (em ingls, reactive oxygen species (ROS)) representam a classe
mais importante de espcies de radicais gerados em sistemas vivos [VALKO et al.,
2007]. O oxignio o ltimo aceptor de eltrons no sistema de produo de energia
aerbico, por isso representa uma parte essencial do metabolismo aerbico
[PIETTA, 2000].
A terminologia, EROs, inclui as espcies de radicais livres de oxignio e
outras que, apesar de no possurem eltrons desemparelhados, so muito reativas
em decorrncia de sua instabilidade [FERREIRA & MATSUBARA, 1997; RIBEIRO
et al., 2005].
As EROs so onipresentes e derivadas do metabolismo do oxignio. Em
condies fisiolgicas do metabolismo celular aerbio, o O2 sofre reduo
tetravalente, com aceitao de quatro eltrons, resultando na formao de H2O
(Figura 1). Durante esse processo so formados intermedirios reativos, como os
-

radicais superxido (O2 ), hidroperoxila (HO2 ) e hidroxila (HO ), e o perxido de


hidrognio (H2O2). Essas espcies desempenham papis importantes na biologia
celular, j que em baixos nveis as EROs so indispensveis em muitos processos
bioqumicos, incluindo mensagens intracelulares, diferenciao celular, apoptose,
imunidade e defesa contra microorganismos [FERREIRA & MATSUBARA, 1997;
VALKO et al., 2007; ROBERTS & SINDHU, 2009].
Alm das EROs serem geradas por processos fisiolgicos internos, tambm
so geradas por patologias e por fontes externas como prtica de exerccios fsicos
extenuantes,

leses

isqumicas,

oxidao

de

LDL

colesterol,

reaes

inflamatrias, radiaes (UV, raios-X), e xenobiticos diversos como fumaa do


cigarro, ingesto de bebidas alcolicas, medicamentos como morfina e alucingenos
(cocana), contaminao por metais como chumbo alumnio, mercrio e ferro.
[PIETTA, 2000; VALKO et al., 2007].
O estresse oxidativo, tambm referido na literatura como um desequilbrio
antioxidante dos radicais livres, ocorre quando o valor lquido destas molculas
excede a capacidade antioxidante, que resulta na induo de danos celulares pelos

27

radicais livres. Assim, o estresse oxidativo pode ocorrer como conseqncia de um


aumento geral na gerao de EROs, uma diminuio do sistema antioxidante, ou
ambos [BIANCHI & ANTUNES, 1999;].

O2 ( O O )
e
(H O O ) HO-2

O-2 ( O O )2H+

e-

H2O2 (H O O H)
H+

H2O
OH ( O H)

H2O (H O H)
Figura 1 Reduo tetravalente do oxignio molecular (O2) na mitocndria at a formao de gua
(H2O). Vrias espcies reativas de O2 so formadas no processo [FERREIRA & MATSUBARA, 1997].

2.1.1.1 Radical superxido (O2 )

Considerado como pouco reativo em solues aquosas, o radical superxido

(O2 ) formado aps a primeira reduo do O2 pela adio de um eltron, pode


reagir como oxidante ou como redutor dando origem a outras espcies reativas. Em
meio aquoso, sua reao principal a dismutao, na qual se produz uma molcula
de perxido de hidrognio e uma molcula de oxignio. Ele tambm uma base
fraca cujo cido conjugado, o radical hidroperxido (HOO) mais reativo
[FERREIRA & MATSUBARA, 1997; RIBEIRO et a., 2005; VALKO et al., 2007].

O radical O2 , Apesar dos efeitos danosos, tem importncia vital para as


clulas de defesa e sem ele o organismo est desprotegido contra infeces

causadas por vrus, bactrias e fungos. A formao do radical O2

ocorre de forma

28

espontnea, por exemplo, na membrana mitocondrial, atravs da cadeia respiratria


e por fagcitos ou linfcitos e fibroblastos durante o processo inflamatrio, para
combater corpos estranhos. Alm disso, tambm pode ser produzido por
flavoenzimas, lipoxigenases e cicloxigenases [FERREIRA & MATSUBARA, 1997;
RIBEIRO et a., 2005; VALKO et al., 2007].

2.1.1.2 Radical hidroxil (HO )

O radical hidroxil, teoricamente, o mais reativo das EROs, com um curto


tempo de meia-vida, de aproximadamente 10-9 s. Ele pode oxidar qualquer molcula

biolgica. Assim, quando produzidos, in vivo, os HO reagem no prprio stio onde


foram gerados [FERREIRA & MATSUBARA, 1997; RIBEIRO et a., 2005; VALKO et
al., 2007].

As principais vias de formao do HO so pela reao de perxido de


hidrognio (H2O2) com metais de transio e pela homlise da gua por exposio
radiao ionizante [RIBEIRO et a., 2005; VALKO et al., 2007].

Para se estabilizar, o HO promove, principalmente, a abstrao de hidrognio


e/ou a adio a insaturaes de molculas prximas. Assim, este radical pode
modificar bases purnicas e pirimidnicas, inativar vrias protenas e iniciar a
oxidao de cidos graxos poliinsaturados das membranas celulares [FERREIRA &
MATSUBARA, 1997; VALKO et al., 2007].

2.1.1.3 Radical hidroperoxil (HO2 )

O HO2 representa a forma protonada do radical O2 . Evidncias indicam que


-

o radical hidroperoxil (HO2 ) mais reativo que o radical O2

por sua maior

facilidade em iniciar a destruio de membranas biolgicas [FERREIRA &


MATSUBARA, 1997; VALKO et al., 2007].

29

2.1.1.4 Perxido de hidrognio (H2O2)

O perxido de hidrognio (H2O2), apesar de no ser considerado um radical


livre verdadeiro, pela ausncia de eltrons desemparelhados na ltima camada,
um metablito do oxignio extremamente deletrio, porque participa da reao que

produz o HO . (Figura 1). Formado pela converso espontnea e enzimtica de dois


radicais superxido, o H2O2 mais estvel do que o radical HO e tem a capacidade
de atravessar camadas lipdicas. Estas propriedades possibilitam que o H2O2, reaja
com alvos biolgicos distantes do seu local de formao e provoque danos, por
exemplo, na molcula do DNA por meio de reaes enzimticas [FERREIRA &
MATSUBARA, 1997; BIANCHI & ANTUNES, 1999; RIBEIRO et al., 2005].

2.1.2 Defesas antioxidantes

A exposio aos radicais livres tem levado os organismos a desenvolverem


uma srie de mecanismos de defesa. Os mecanismos de defesa contra os radicais
livres, induzidos pelo estresse oxidativo envolvem: mecanismos preventivos,
mecanismos de reparo, defesas fsica, e as defesas antioxidantes [RIBEIRO et al.,
2005; VALKO et al., 2007].
Antioxidante um antigo termo, que no incio era aplicado para a descrio
de inibidores de processos oxidativos, os quais so capazes de reagir com radicais
peroxil. Atualmente, este termo freqentemente aplicado a todos os inibidores de
radicais livres [DENISOV & AFANASEV, 2005]. Os antioxidantes so substncias
que, mesmo presentes em baixas concentraes em relao ao substrato oxidante,
podem atrasar ou inibir as taxas de oxidao [BIANCHI & ANTUNES, 1999].
Existem trs grandes tipos de defesas antioxidantes. Os antioxidantes diretos,
varredores de radicais livres e quelantes, podem suprimir diretamente a formao
de radicais livres. Alm dos antioxidantes diretos, existem outros dois grupos
importantes de inibidores de radicais livres: as enzimas antioxidantes e os
compostos que possuem propriedades antioxidantes, que so considerados

30

antioxidantes indiretos. Compostos com propriedades de antioxidao indireta


podem afetar a formao de radicais livres, por exemplo, inibindo a atividade de
enzimas pr-oxidantes [DENISOV & AFANASEV, 2005].
Inibidores diretos promovem a supresso da formao de radicais livres,
atravs da reao direta com os radicais livres (Figura 2) para formar novos radicais
inativos ou quelar metais de transio cataliticamente ativos para formar complexos
inativos [DENISOV & AFANASEV, 2005]:

HO + AntH H 2 O + Ant
ROO + AntH ROOH + Ant

Figura 2 Reao direta dos antioxidantes com os radicais livres hidroxil (HO ) e peroxil (ROO )
[DENISOV & AFANASEV, 2005].

Antioxidantes enzimticos incluem, principalmente, as enzimas superxido


dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), catalase (CAT). A SOD catalisa a
dismutao do radical superxido em H2O2 e O2, na presena de prton H+. A GPx
catalisa a reduo do H2O2 e perxidos orgnicos a seus correspondentes alcois
pela converso da glutationa reduzida (GSH) para glutationa oxidada (GSSG). E a
CAT uma hemeprotena citoplasmtica que catalisa a reduo do H2O2 H2O e O2
[FERREIRA & MATSUBARA, 1997; VALKO et al., 2007].
Antioxidantes no enzimticos so representados, principalmente, pelo cido
ascrbico (vitamina C), -tocoferol (vitamina E), glutationa (GSH), flavonides e
outros antioxidantes.
O cido ascrbico (Figura 3), uma molcula usada na hidroxilao de vrias
reaes bioqumicas nas clulas. A sua principal funo a hidroxilao do
colgeno, a protena fibrilar que d resistncia aos ossos, dentes, tendes e paredes
dos vasos sanguneos. Alm disso, um poderoso antioxidante. Em valores de pH
normalmente encontrados no meio intracelular, o cido ascrbico encontra-se
predominantemente na sua forma ionizada, o ascorbato [LEHNINGER, 2005].

31

HO

CH(OH)CH2OH
OH

Figura 3 Estrutura qumica do cido ascrbico [LEHNINGER, 2005].

Uma das atividades mais importantes do ascorbato no organismo humano


na desidratao de resduos de prolina no colgeno. O colgeno, uma protena
estrutural fundamental, necessita ter determinados resduos de prolina na forma
hidroxiprolina para manter uma estrutura tridimensional correta. A hidroxilao feita
pela enzima prolil-4-hidroxilase; o ascorbato no intervm diretamente nesta
hidroxilao [LEHNINGER, 2005].
Por outro lado, o cido ascrbico pode atuar como catalisador na reao de
Fenton, promovendo a reduo de ons frricos em ons ferrosos (Figura 4). Assim, o
cido ascrbico pode ser tanto um antioxidante, quanto um pr-oxidante
dependendo das condies [DENISOV & AFANASEV, 2005].

AH 2 + R AH + RH
AH 2 + Fe 3+ AH + Fe 2+ + H +
Figura 4 Reao entre um antioxidante e com radicais livres e com on frrico [DENISOV &
AFANASEV, 2005].

Em plantas, o ascorbato encontra-se em concentraes relativamente


elevadas (2 a 25 mM) e atua na desintoxicao do perxido de hidrognio. A enzima
ascorbato peroxidase catalisa a reduo do perxido de hidrognio a gua, usando
o ascorbato como agente redutor. Tambm precursor dos ons tartarato e oxalato
[LEHNINGER, 2005].
Este antioxidante reage, muito lentamente e somente por desprotonao, com
o radical superxido (k = 0,32 0,08 l mol-1s-1), porm reage de forma relativamente
rpida com o radical hidroperoxil (K =1,6x104 l mol-1s-1) [DENISOV & AFANASEV,
2005].

32
O -tocoferol, tambm conhecido como vitamina E, (Figura 5) um derivado
fenlico lipossolvel, que apresenta um grupo hidroxila muito ativo que
responsvel pela grande capacidade antioxidante desta vitamina [PIETTA, 2000;
DENISOV & AFANASEV, 2005].

Me
HO

Me

Me
Me

O
3

Me
Figura 5 Estrutura qumica do -tocoferol [LEHNINGER, 2005].

Segundo DENISOV & AFANASEV (2005), as constantes de velocidade para

as reaes de -tocoferol com os radicais HOO e ROO so suficientemente


elevadas, sendo estimadas em 2 x 105l.mol-1.s-1 (Figura 6).

HOO + TocH HOOH + Toc


ROO + TocH ROOH + Toc
Figura 6 Reao do -tocoferol com os radicais livres hiroperoxil e peroxil [DENISOV &
AFANASEV, 2005].

Outro importante antioxidante a glutationa (Figura 7). A glutationa um


tripeptdeo (L-glutamil-L-cisteinil-glicina (GSH), que desempenha vrias funes
no organismo, por exemplo, no metabolismo, transporte, catlise, manuteno de
protenas, etc. Como composto redox, a glutationa atua como um varredor de
radicais livres e como um doador de eltrons no ciclo redox da glutationa peroxidase
e da glutationa redutase que catalisa a reduo de perxidos. [FERREIRA &
MATSUBARA, 1997; RIBEIRO et a., 2005; VALKO et al., 2007; DENISOV &
AFANASEV, 2005].

33

Figura 7 Estrutura qumica da Glutationa (Lglutamil-L-cisteinil-glicina (GSH)) [LEHNINGER, 2005].

O cido ascrbico e GSH so os mais importantes antioxidantes solveis em


meio aquoso encontrados nos organismos vivos. A atividade antioxidante da
glutationa especialmente importante no crebro, que contm nveis relativamente
baixos de SOD, catalase e glutationa peroxidase. Neste caso, a alterao do
metabolismo

de

GSH

pode

contribuir

para

patognese

de

doenas

neurodegenerativas como a doena de Parkinson [DENISOV & AFANASEV, 2005].


Em condies normais, existe um equilbrio entre os nveis de radicais livres e
os de espcies antioxidantes. Este equilbrio essencial para a sobrevivncia e
sade dos organismos [VALKO et al., 2007].
Na Tabela 1 esto relacionadas s ERO com os respectivos antioxidantes e
na Figura 8 mostrado um esquema de inter-relao entre os radicais livres e as
defesas antioxidantes.

Tabela 1 EROs e os antioxidantes.

Antioxidantes
Endgenos
Exgenos
Superxido dismutase (SOD): Vitaminas, zinco, cobre,
Superxido (O2-)
a) citoplasmtica: Zinco-Cobre mangans, picnogenol,
b) mitocondrial: Mangans
EDTA
Glutationa peroxidase, selnio,
Vitamina E, selnio
Radical peroxil (ROO)
cistena
Vitamina C, picnogenol,
dimetil sulfxido, EDTA,

Radical hidroxila (HO )


No relatado na literatura
cido dimercapto succnico e
manitol
Perxido de hidrognio (H2O2) Catalase Fe2+
No relatado na literatura
ERO

Fonte: VALKO et al., 2007.

34

Figura 8 Percursos de formao de EROs, o processo de peroxidao lipdica e do papel da


glutationa (GSH) e outros antioxidantes (vitamina E, vitamina C, cido lipico) na gesto do estresse
oxidativo (equaes no esto balanceadas). [VALKO et al., 2007].

Na Figura 8, a reao (1) mostra que o radical nion superxido formado


pelo processo de reduo do oxignio molecular, mediada por NAD(P)H oxidase e
xantina oxidase ou no-enzimaticamente por reaes redox de compostos reativos
como o composto semi-ubiquinona da cadeia mitocondrial de transporte de eltrons.
Na reao (2), o radical superxido dismutado pela superxido dismutase (SOD) a
perxido de hidrognio. Na reao (3), o perxido de hidrognio oxidado pela
enzima glutationa peroxidase (GPx), que requer GSH como doador de eltrons. Na
reao (4), a glutationa oxidada (GSSG) reduzida de volta para GSH pela enzima
glutationa redutase (Gred), que utiliza NADPH como doador de eltrons. Na reao
(5), alguns metais de transio (por exemplo, Fe2+, Cu+ e outros) podem reagir com
o perxido de hidrognio, pela reao de Fenton, e formar radical hidroxil. Na reao
(6), o radical hidroxila pode abstrair um eltron de cidos graxos poliinsaturados (LH)
para dar lugar a um radical lipdico (L). Na reao (7), o L pode continuar a interagir
com o oxignio molecular para formar um radical peroxil lipdico (LOO). Se o LOO
no for reduzido em antioxidante, ocorre o processo de peroxidao lipdica. Na

35

reao (8), o LOO reduzido dentro da membrana pela forma reduzida da vitamina
E (T-OH), resultando na formao de um hidroperxido lipdico e um radical da
vitamina E (TO). Na reao (9), ocorre a regenerao da vitamina E pela vitamina C:
Na reao (10), a regenerao da vitamina E por GSH. Na reao (11), a glutationa
oxidada (GSSG) e do radical ascorbil (Asc-) so reduzidos de volta para GSH e
ascorbato mononion, Asch, respectivamente, pelo cido dihidrolipico (DHLA), que
convertido ao cido -lipico (ALA). Na reao (12), ocorre a regenerao da
DHLA da ALA usando NADPH. Na reao (13), os hidroperxidos lipdicos so
reduzidos a lcoois e dioxignio pela GPx usando GSH como doador de eltrons. Na
reao (14), radicais hidroperxidos lipdicos podem reagir rapidamente com Fe2+
para formar os radicais lipdicos alcoxil (LO), ou muito mais lento com Fe3+ para
formar os radicais lipdicos peroxil, ocorrendo, por fim, o processo de peroxidao
lipdica. [VALKO et al., 2007].

2.2

Flavonides como captadores radicalares

Atualmente, so conhecidos mais de 4200 flavonides diferentes [HEIM,


TAGLIAFERRO & BOBILYA, 2002; REN et al., 2003; SIMES et al., 2004]. Os
flavonides so substncias fenlicas e/ou polifenlicas, derivadas de benzo- pirona e isoladas de uma vasta gama de plantas vasculares. Eles atuam em plantas
como antioxidantes, antimicrobianos, fotorreceptores, atratores visuais, repelentes
herbvoros, e para a seleo de luz. [PIETTA, 2000; HEIM, TAGLIAFERRO &
BOBILYA, 2002; HAVSTEEN, 2002; REN et al., 2003; YAO et al., 2004; DENISOV &
AFANASEV, 2005].
Alm de vrios vegetais, os flavonides so encontrados em sementes, frutos
secos, gros e especiarias, bem como nas bebidas, como vinho (sobretudo vinho
tinto), ch, e cevada (em nveis mais baixos) [PIETTA, 2000; HAVSTEEN, 2002;
SIMES et al., 2004; DENISOV & AFANASEV, 2005].
Os flavonides so membros de uma classe de compostos naturais que
recentemente tem sido objeto de considervel interesse cientfico e teraputico, uma
vez que tm sido relatadas importantes atividades biolgicas, tais como, aes
antialrgicas, antivirais, antiinflamatrias e vasodilatadoras. Entretanto, o maior

36

interesse, realmente, tem sido na atividade antioxidante dos flavonides, que


devido a sua capacidade de inibir e/ou reduzir a formao de radicais livres e na
capacidade de quelar metais [HARBORNE & WILLIAS, 1992; PIETTA, 2000;
HAVSTEEN, 2002; REN et al., 2003; DENISOV & AFANASEV, 2005].
O termo fenlico ou polifenlico pode ser definido como sendo uma
substncia que tem um ou mais ncleos aromticos contendo substituintes
hidroxilados e/ou seus derivados funcionais (steres, teres metlicos, glicosdeos e
outros) [SIMES et al., 2004].
A estrutura bsica dos flavonides o ncleo que consiste de 15 tomos de
carbono, composto do tipo C6-C3-C6, dispostos em dois anis aromticos, que so
denominados A e B, conectados por uma ponte de trs carbonos, que contm um
tomo de oxignio (anel C) (Figura 9) [PIETTA, 2000; HAVSTEEN, 2002; REN et al.,
2003; SIMES et al., 2004].

3'
8
7

1
O

2'
1'
2

4'
B
5'
6'

Figura 9 Estrutura bsica dos flavonides [ACKER ET al., 1996; PIETTA, 2000; HEIM,
TAGLIAFERRO & BOBILYA, 2002; HAVSTEEN, 2002; DENISOV & AFANASEV, 2005].

Do ponto de vista biossinttico, os flavonides so derivados do cido


cinmico (trans-4-cumarato), o qual deriva do metabolismo dos aminocidos
fenilalanina e tirosina. O cido cinmico age como precursor na sntese de um
intermedirio, ao qual so adicionados trs resduos de malonato e, posteriormente,
a estrutura ciclizada. Subseqentes hidroxilaes e redues formam diferentes
flavonides (Figura 10) [ACKER ET al., 1996; PIETTA, 2000; FORKMANN &
MARTENS, 2001; HEIM, TAGLIAFERRO & BOBILYA, 2002; HAVSTEEN, 2002;
DENISOV & AFANASEV, 2005].
A grande diversidade de flavonides decorrente das variaes estruturais,
tais

como:

flavonas,

flavanis,

flavonis,

diidroflavonis,

antocianidinas

37

isoflavonides. A figura 11 apresenta a estrutura qumica dos flavonis estudados


neste trabalho, ressaltando que destes o canferol, a fisetina, a miricetina e a
quercetina so no-glicosilados e a quercitrina e a rutina so glicosilados.
De modo geral, a grande variabilidade dos flavonides apresenta: 1)
diferenas na estrutura do anel C e no seu estado de oxi-reduo; 2) diferenas no
grau de hidroxilao e nas posies dos grupos hidroxila; 3) diferenas na
derivatizao dos grupos hidroxila, por exemplo, com grupos metila, hidratos de
carbono, ou isoprenides [PIETTA, 2000; HAVSTEEN, 2002; SIMES et al., 2004;
DENISOV & AFANASEV, 2005]. Os flavonides so classificados em grupos pelo
nvel de oxidao e no padro de substituio do anel C. Enquanto os compostos
individuais, dentro de um mesmo grupo, so diferenciados pelo padro de
substituio dos anis A e B. [PIETTA, 2000; HAVSTEEN, 2002; HEIM,
TAGLIAFERRO & BOBILYA, 2002; YAO et al., 2004; SIMES et al., 2004].

38

.
Figura 10 Principais rotas biossintticas dos flavanides [ACKER ET al., 1996; PIETTA, 2000;
FORKMANN & MARTENS, 2001; HEIM, TAGLIAFERRO & BOBILYA, 2002; HAVSTEEN, 2002;
DENISOV & AFANASEV, 2005].

39

O
H

O
H

Canferol

Fisetina
H

O
H

O H
H

O
H

O
O

Miricetina

Quercetina
H

O
O H

O H
H

O
H

O
H

O
O

Quercitrina
Figura 11 Estrutura qumica dos flavonides estudados neste trabalho.

Rutina

40

Os flavonides so, geralmente, hidroxilados nas posies 3, 5, 7, 3, 4 e 5.


Alguns desses grupos hidroxila podem ser metilados, acetilados ou sulfatados.
Quando glicosdeos so formados, a ligao glicosdica normalmente localizada na
posio 3. Os glicosdeos mais comuns so L-ramnose, D-glicose, glucorhamnose,
galactose, ou arabinose [HAVSTEEN, 2002].
Os efeitos antioxidantes dos flavonides podem ser explicados por sua
preveno a peroxidao lipdica atravs do aprisionamento de radicais de iniciao
lipdica (Figura 12), tais como, superxido, hidroxil e hidroperoxil [HAVSTEEN, 2002;
DENISOV & AFANASEV, 2005].

ROO + FlOH ROOH + FlO


HO + FlOH H 2 O + FlO

Figura 12 Reao dos flavonides com os radicais livres peroxil (ROO ) e hidroxil (HO ) [DENISOV
& AFANASEV, 2005].

Outro efeito, muito importante, a quelao de ons metlicos, por exemplo, a


complexao com ons ferro, suprimindo a reao de Fenton (Figura 13) [ACKER et
al., 1996; DENISOV & AFANASEV, 2005].

O2 + Fe 3 + O2 + Fe 2 +
Fe 2 + + H 2 O2 Fe 3 + + HO + HO
Figura 13 Reao de Fenton [ACKER et al., 1996; DENISOV & AFANASEV, 2005].

Muitos autores tm tentado elucidar a relao estrutura-atividade dos


flavonides quanto ao poder antioxidante. No entanto, isso uma tarefa difcil, j
que o potencial antioxidante pode ser determinado por vrios fatores, dos quais a
lipofilicidade, a quelao de ferro, e a limpeza de radicais livres so os mais
importantes.

41

As principais aplicaes dos flavonides so na indstria como corantes,


aromatizantes e flavorizantes. Alm disso, o interesse pela indstria farmacutica
crescente, e justifica-se pelo fato dos flavonides apresentarem uma srie de
vantagens em relao a outros frmacos, principalmente em termos de no
apresentar efeitos colaterais, como ulcerogenicidade. Assim, parece claro que os
antioxidantes naturais so bem indicados para atenuar os efeitos deletrios do
estresse oxidativo celular. Entretanto, estudos mais aprofundados e rigorosos devem
ser conduzidos para determinar a concentrao destas espcies em diferentes tipos
de plantas medicinais e o seu real poder antioxidante frente a sistemas radicalares.

2.3

Mtodos para avaliao da atividade antioxidante

Diversas metodologias para medio da atividade antioxidante total so


descritas na literatura, principalmente, para amostras de fluidos biolgicos, extratos
de alimentos e plantas, e compostos puros. Cada mtodo varia quanto ao tipo de
radical gerado, ao indicador de oxidao empregado e ao mtodo de deteco e
quantificao usado. [RE et al. 1999; SILVA; BORGES; FERREIRA, 1999; HUANG
et al., 2005].
Os ensaios antioxidantes podem ser classificados em duas categorias:
ensaios baseados em estudos de cintica qumica, tambm denominados de
mtodos diretos e ensaios mediados pela transferncia de eltrons, tambm
denominados de mtodos indiretos [RE et al. 1999; SILVA; BORGES; FERREIRA,
1999; HUANG et al., 2005]..
Os radicais livres podem ser gerados por processos fsico-qumicos, qumicos
ou enzimticos. Os mtodos fsico-qumicos envolvem tcnicas como fotlise ou
oxidao fotodinmica. J os mtodos qumicos utilizam sistemas, por exemplo, de
Fenton, que contm um agente redutor e um on metlico. E, por fim, os mtodos
enzimticos empregam as reaes principalmente as reaes da xantina oxidase e
da NAD(P) oxidase na gerao de radicais livres [RE et al. 1999; SILVA; BORGES;
FERREIRA, 1999; HUANG et al., 2005].
Segue abaixo a descrio dos mtodos mais empregados na avaliao da
atividade antioxidante dos flavonides.

42

2.3.1 Cintica qumica

2.3.1.1 Reduo do -caroteno

Este ensaio est baseado na capacidade de substncias antioxidantes em


retardar a oxidao do -caroteno na presena de luz. A soluo de -caroteno em
CH2Cl2, de colorao amarelada, atua como um revelador em cromatografia em
camada delgada sendo que quando aplicada em uma corrida cromatogrfica e
exposta luz inicia-se o processo de oxidao do -caroteno ocasionando a
descolorao da placa. Substncias antioxidantes sero evidenciadas atravs de
manchas amareladas demonstrando o efeito antioxidante da amostra [DENISOV &
AFANASEV, 2005].

2.3.1.2 Quimioluminescncia do luminol

De forma geral, este mtodo est baseado na habilidade do luminol e de


compostos relacionados em gerar luminescncia sob um fluxo de radicais livres. A
produo de espcies reativas de oxignio gera certa luminescncia, a qual pode
ser aumentada atravs da insero do luminol no sistema [FERREIRA & ROSSI,
2002].
A adio de um antioxidante no sistema, como um seqestrador de radicais,
resulta numa extino da quimiluminescncia num pronunciado perodo de induo,
conforme Figura 14. Outras verses do mtodo diferem no tipo de radical livre ativo
produzido e no modo como este produzido [FERREIRA & ROSSI, 2002].

43

O
C
ROO

+
C

O
NH pH>9
NH

C
C

NH2 O

OO-

NH2 O

OO-

+ Luz

NH2 O

Figura 14 Reao do lumino com radicais alquil-peroxilas em meio alcalino para gerao de luz.

2.3.2 Transferncia de eltrons

2.3.2.1 Reduo do radical DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil)

O radical DPPH estvel, de colorao prpura, porm quando reduzido


passa a ter colorao amarela. Com isso, pode ser facilmente detectado por
espectroscopia devido a sua intensa absoro na regio visvel [SNCHEZMORENO, 2002; MOLYNEUX, 2004].
O mtodo est baseado na capacidade do DPPH em reagir com doadores de
hidrognio (Figura 15). Na presena de substncias antioxidantes o mesmo recebe
H sendo ento reduzido. O ensaio iniciado pela adio do DPPH amostra, ento
a capacidade da amostra de reduzir o DPPH, ou seja, evitar sua oxidao,
evidenciada pela porcentagem de DPPH restante no sistema. Com isso, a
porcentagem de DPPH restante proporcional concentrao de antioxidante (AH)
[SNCHEZ-MORENO, 2002; MOLYNEUX, 2004].

N
O2N

NO2

NO2
DPPH (max=517nm)

NH
A-H

O2N

NO2

NO2
DPPH-H (incolor)

Figura 15 Reao do DPPH com espcies antioxidantes [MOLYNEUX, 2004].

44

2.3.2.2 Oxidao do ABTS (cido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfnico))

O ensaio TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) tem como objetivo


+

monitorar o decaimento do ction-radical ABTS* , produzido pela oxidao do ABTS


(cido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfnico)), gerado pela adio de uma
+

amostra contendo antioxidantes. Na ausncia de fenis, ABTS* estvel, mas


reage energeticamente com um doador de tomo de hidrognio, como fenis, sendo
convertido em uma forma no colorimtrica do ABTS, conforme reao apresentada
+

na Figura16. A quantificao determinada pela quantidade de ABTS* consumida,


devido reao deste com a amostra contendo fenis, sendo expressa em Trolox
equivalente [HUANG et al., 2005].

-O S
3

N*

H5 C2

C2 H5
(max=734nm)

N
+ antioxidante

-K2SO5

SO3-

ABTS

-O S
3

*+

SO3-

H5C2

C2 H5
ABTS (incolor)

Figura 16 Reao do trolox com espcies antioxidantes [PANNALA, 2001; HUANG et al., 2005].

45

3 MATERIAL E MTODOS

3.1

Reagentes e solues

Todas as solues foram preparadas com gua ultrapura, destilada e


deionizada em sistema Milli Q (Millipore) e todos os reagentes utilizados foram de
grau analtico. As solues padro dos compostos polifenlicos canferol, fisetina,
quercetina, quercitrina, miricetina e rutina (Sigma-Aldrich) foram preparadas em
solvente hidroetanlico 50 % (v/v). O perxido de hidrognio (H2O2) foi obtido da
Vetec. As solues foram armazenadas a 4 C e ao abrigo da luz, quando
necessrio.

3.2

Reatores fotoqumicos

Reaes radicalares podem ser geradas em reatores fotoqumicos, os quais


tm sido desenvolvidos principalmente para a decomposio de amostras e o
tratamento de resduos industriais, visto que promovem a degradao da matria
orgnica [CARVALHO et. al., 2008].
Carvalho e colaboradores (2008) desenvolveram um reator fotoqumico,
baseado num modelo comercial, que possibilita a irradiao simultnea de 12
amostras, as quais so mantidas temperatura controlada por um termo-regulador
durante o processo de mineralizao sob circulao de ar. O sistema provido de
uma lmpada de mercrio de alta presso (400 W) utilizada em iluminao pblica,
cujo bulbo externo foi removido para total exposio das amostras radiao UV.
No entanto, a construo de sistemas de irradiao, com o objetivo especfico
de induzir a formao lenta de radicais livres para estudo da ao anti-radicalar de
espcies antioxidantes, ainda no foi descrita na literatura. Os sistemas de
irradiao j desenvolvidos para a destruio de matria orgnica no podem ser
utilizados para o estudo da ao anti-radicalar de espcies antioxidantes, uma vez

46

que empregam lmpadas de alta potncia que provocam uma alta velocidade
reacional de formao do radical OH, alm de degradar o antioxidante em pouco
segundos por fotlise direta e por reaes secundrias.
Portanto, neste trabalho foram construdos dois sistemas de irradiao,
denominados

reatores

fotoqumicos,

diferenciados

pela

fonte

de

radiao

empregada: lmpadas comerciais de mercrio e de tungstnio.


Os sistemas consistem dos seguintes componentes bsicos: uma fonte de
radiao; um sistema de resfriamento por circulao forada de ar; um termmetro
para controle de temperatura; um suporte para tubos de quartzo e uma caixa de
madeira forrada com papel alumnio. A Figura 17 ilustra a composio dos dois
sistemas de irradiao construdos em laboratrio, onde se emprega fonte de
irradiao de mercrio (A) e de tungstnio (B).
No reator fotoqumico (A), uma lmpada de mercrio de alta presso com
potncia nominal de 80 W foi empregada como fonte de radiao (a) (marca GE). A
lmpada com o bulbo exposto foi afixada na parte central do sistema onde est
posicionado o soquete da lmpada. A caixa de madeira forrada com papel alumnio
(b) que envolve o sistema na forma de cubo e apresenta 21,5 cm de aresta. O
sistema de resfriamento constitudo de um cooler (c) (marca Ruilian Science
Tecnology), igual ventiladores usados em computadores, posicionado na parte
superior do sistema, o qual acionado, durante todo o funcionamento da lmpada. A
temperatura mxima de operao do sistema foi de 25 C com variao de 1 C,
sendo que, o estudo foi realizado aps estabilizao do sistema. O suporte para 12
tubos de quartzo (d) foi construdo e moldado em madeira, com dimenses precisas,
de modo que os tubos permaneam dentro do sistema circundando o bulbo da
lmpada.

47

Figura 17 Representao esquemtica dos sistemas de irradiao UV desenvolvidos: (A) reator


com fonte de radiao lmpada de Hg; (a) lmpada de Hg (80 W); (b) caixa de madeira revestida com
papel alumnio; (c) cooler; (d) suporte para os tubos de quartzo; (e) tubos de quartzo; (B) reator com
fonte de irradiao lmpada de W; (f) lmpada de W (150 W); (g) projetor; (h) caixa de madeira
revestida com papel alumnio; (i) cooler; (j) suporte para os tubos de quartzo.

J no reator fotoqumico (B), uma lmpada de tungstnio com potncia


nominal de 150 W foi empregada como fonte de irradiao (f) (marca Xelux). A
lmpada foi afixada em um refletor retangular (marca Xelux) (g), onde est
posicionado o soquete da lmpada, e este posicionado na parte lateral o sistema. A
caixa de madeira forrada com papel alumnio (h) que envolve o sistema na forma
retangular e apresenta 35 cm de comprimento e 18,6 cm de largura e altura. O
sistema de resfriamento foi constitudo de dois coolers (i) posicionados um em cada

48

lado do reator, e so acionados automaticamente, durante todo o funcionamento da


lmpada. A temperatura mxima de operao do sistema foi de 60 C com variao
de 5 C, sendo que, o estudo foi realizado aps estabilizao do sistema. O
suporte para 6 tubos de quartzo (j) foi construdo e moldado em madeira, com
dimenses precisas, de modo que os tubos permaneam dentro do sistema a uma
distncia de 25 cm da lmpada contida no refletor.
Os tubos de quartzo (e), utilizados nos dois reatores fotoqumicos, foram
obtidos comercialmente (Metrohm) e possuem dimenses de 12,5 cm de
comprimento e 1,5 cm de dimetro interno, com capacidade mxima para 10 mL de
amostra. Os dois sistemas operam em 220V.

3.3

Ensaios por Espectrofotometria UV-VIS

Os espectros de absoro molecular no UV-VIS foram obtidos entre 200 e


380 nm, no comprimento de onda com mxima absortividade molar de cada
flavonide. As medidas foram realizadas em um espectrofotmetro com arranjo de
diodos HP 8453 (Hewlett Packard), utilizando uma clula de quartzo de 10 mm de
espessura do caminho ptico.

3.4

Ensaios por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)

As medidas por HPLC foram realizadas, nos comprimentos de onda


especficos de cada composto estudado, entre 200 e 380 nm, em um cromatgrafo
P680 (Dionex) acoplado detector UV-Vis UVD170 (Dionex), com coluna de
separao C18 de dimenses 4,6 mm x 150 mm x 5 m (Dionex). Como fase mvel
foi utilizada acetonitrila 30 % (v/v) (Tedia) grau HPLC em gua destilada e
deionizada com pH ajustado em 4,00 com uma soluo de cido fosfrico 10%
(Vetec), e fluxo de 0,5 mL.min-1.

49

3.5

Fotodecomposio do H2O2 e gerao do radical HO

Para quantificao da fotodegradao do H2O2 e gerao do radical HO , foi


construda uma curva de calibrao, em que a concentrao de H2O2, durante o
processo de fotlise direta, foi calculada pela equao da reta, obtida atravs do
grfico da curva de calibrao.
Para construo da curva de calibrao, preparou-se por diluio do reagente
perxido de hidrognio em solvente hidroetanlico 50 % (v/v) solues de
concentraes 0,11; 0,21; 0,29; 0,37; 0,46 mmol.L-1. A quantificao foi feita em
triplicata e a anlise espectrofotomtrica foi realizada nos comprimentos de onda
220, 230 e 240 nm.
O procedimento de fotlise direta empregado para quantificao da
fotodecomposio do H2O2 decorreu da mesma forma que os ensaios realizados
para a determinao da atividade anti-radicalar dos flavonides em estudo frente ao

radical HO .

3.6

Atividade anti-radicalar frente ao radical HO

O estudo cintico da atividade anti-radicalar dos compostos polifenlicos


canferol, fisetina, quercetina, quercitrina, miricetina e rutina, baseou-se na anlise
temporal por espectrofotometria UV-Vis e Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

(HPLC) da reao entre alguns compostos antioxidantes e o radical HO .


Os primeiros ensaios foram realizados por espectrofotometria UV-Vis somente
com uma soluo de cada antioxidante para a investigao da influncia da ao da
fotlise direta sobre os compostos polifenlicos. Da mesma forma, foi investigada a
fotodecomposio do H2O2, bem como, a ao do perxido de hidrognio frente
soluo de cada antioxidante, sem a incidncia de irradiao UV.

Para o estudo da atividade anti-radicalar frente ao radical HO , foi empregada

a gerao fotoqumica do radical HO na presena de H2O2 nos reatores fotoqumico

50

desenvolvidos. Os ensaios foram realizados por espectrofotometria UV-Vis com


adio de diferentes concentraes de perxido de hidrognio (0,29 a 2,90 mmol.L-1)
em uma soluo padro de cada antioxidante, para investigar a influncia da
concentrao inicial de perxido de hidrognio sobre o decaimento do sinal dos
compostos polifenlicos, totalizando 7 ensaios para cada antioxidante polifenlico.
Por fim, foram realizados dois ensaios para determinao da constante

cintica dos compostos polifenlicos frente ao radical HO . No primeiro, a anlise foi


espectrofotomtrica e, no segundo, cromatogrfica. Nestes experimentos, foi
adicionado 0,29 mmol.L-1 de perxido de hidrognio em diferentes concentraes de
cada flavonide (25, 50 e 75

M).

As constantes cinticas de primeira ordem dos flavonides frente radiao

UV e frente ao radical HO , gerado pela fotodecomposio do perxido de


hidrognio, foram calculadas conforme equao da Figura 18:

[A]
= kt
ln

[A0 ]
Figura 18 Lei de velocidade de uma reao de primeira ordem.

Onde, k a constante cintica de primeira ordem. No instante inicial a espcie


antioxidante apresenta uma absorvncia [A0], e num instante t qualquer, aps
fotlise, a absorvncia [A]. Ao plotar um grfico de ln ([A]/[A0]) em funo do tempo
(min), no caso de uma reao de primeira ordem, como a dos compostos

polifenlicos em estudo com radical HO , o coeficiente angular da reta o k.


Para

determinao

da

constante

cintica

aparente

dos

compostos

polifenlicos frente ao radical HO , a contribuio da fotlise direta das espcies


antioxidantes foi descontada da constante cintica radicalar (Figura 19).

kOH + h k h = kOH

Figura 19 Determinao da constante cintica aparente dos flavonides frente ao radical HO .

51

Aps

determinao

da

constante

cintica

aparente

dos

compostos

polifenlicos frente ao radical HO possvel calcular o tempo de meia-vida (t),


para a reao de primeira ordem para cada flavonide na atividade anti-radicalar

frente ao HO (Figura 20).

t1 / 2 =

ln 2
k OH

Figura 20 Determinao do tempo de meia-vida de uma reao de primeira ordem.

52

4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1

Ensaios de fotlise direta nos reatores fotoqumicos desenvolvidos

Sabe-se que o perxido de hidrognio, quando exposto a radiao

ultravioleta, se decompe em radical HO [HALLIWELL; CLEMENTB; LONG, 2000],


de acordo com a seguinte reao (Figura 21):

uv

H 2 O2 2 HO
Figura 21 Reao de fotodecomposio do H2O2 [HALLIWELL; CLEMENTB; LONG, 2000].

Como a concentrao gerada de radical HO varia no tempo, um primeiro


estudo envolveu o acompanhamento desta reao na presena de H2O2 nos
reatores construdos em laboratrio. A determinao da concentrao de radical HO

formada numa janela de tempo de 1 hora foi baseada na determinao de H2O2


remanescente no meio, aps um determinado tempo de irradiao UV. Pelo
monitoramento do decrscimo da concentrao de H2O2 e de acordo com a reao
acima, pode-se calcular a concentrao de radical HO

formada durante os

experimentos cinticos subseqentes.

4.1.1 Fotodecomposio do H2O2

A curva de calibrao para quantificao da fotodecomposio do H2O2


(Figura 22) por determinao espectrofotomtrica no UV apresentou linearidade,
com coeficiente de correlao superior a 0,99.

53

Os ensaios de fotodecomposio do H2O2 demonstraram que o reator


fotoqumico (A) com fonte radiao de Hg (80 W) mais eficiente na gerao de

radical HO que o reator fotoqumico (B) com fonte de radiao W (150 W), conforme
Figura 23.

1,8
220nm
230nm
240nm

1,6

r=0,99841

1,4

Abs (uA)

1,2
1,0

r=0,99990

0,8
0,6

r=0,99992

0,4
0,2
0,0
0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

Concentrao (mM)

Figura 22 Curva de calibrao do perxido de hidrognio, utilizada para quantificao da


fotodecomposio do H2O2.

Concentrao de H2O2 (mM)

0,30
0,25

0,20
0,15

0,10
0,05
ReatorA - Lmpada de Hg (80 W)
ReatorB - Lmpada de W (150 W)

0,00
0

10

20

30

40

50

60

Tempo (min)

Figura 23 Quantificao da fotodecomposio do H2O2 frente fotlise nos reatores fotoqumicos


desenvolvidos com fonte radiao de W (150 W) e de Hg (80 W); [H2O2]inicial = 0,29 mmol L-1.

54

No reator fotoqumico (A), a fotodecomposio do H2O2 inicia-se aps 10


minutos de irradiao, sendo que em 30 minutos de irradiao a concentrao de
H2O2 reduz a, aproximadamente, 50% em relao concentrao inicial. E a
fotodecomposio completa do H2O2 se d com, aproximadamente, 60 minutos de

irradiao. Neste reator, a gerao de radical HO gradual, ou seja, aumenta com o


tempo de irradiao. J no reator fotoqumico (B) com fonte de radiao de W
(150 W), no observada a fotodegradao do H2O2, durante os ensaios.
Essa diferena de eficincia na gerao de radical HO

a partir da

fotodecomposio do H2O2, entre os reatores fotoqumicos desenvolvidos, pode ser


explicada pelos espectros de emisso de lmpadas de tungstnio e de mercrio,
uma vez que a lmpada de Hg apresenta linhas espectrais de emisso de alta
intensidade que coincidem com os comprimentos de onda de mxima absoro do
H2O2 (190 a 225 nm). J a lmpada de W apresenta uma banda espectral de
emisso que difere do comprimento de onda de mxima absoro do H2O2.

A Figura 24 mostra o aumento da concentrao de radical HO , calculada a


partir da concentrao de H2O2 disponvel, no reator de Hg com o aumento do tempo
de irradiao da soluo de H2O2 0,29 mmol.L-1.

0,60
Perxido de Hidrognio (H2O2)

0,55

Radical OH

0,50

Concentrao (mM)

0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0

10

20

30

40

50

60

Tempo (min)

Figura 24 Quantificao da gerao do radical HO e fotodecomposio do H2O2 frente fotlise no


-1
reatore fotoqumico com fonte radiao de Hg (80 W); [H2O2]inicial = 0,29 mmol L .

55

Como a concentrao de radical HO varia no tempo, os estudos cinticos que


sero apresentados a seguir tratam do clculo de constantes cinticas aparentes

(kOH). Como todas as outras variveis do sistema so mantidas constantes


(temperatura, presso, geometria do reator, etc.), os ensaios propostos permitem a

comparao das espcies antioxidantes quando reagindo com o radical HO . A

variao da concentrao do radical HO passa, portanto, a ser considerada tambm


uma constante.

4.1.2 Fotoestabilidade dos flavonides

A radiao UV, por conveno, dividida em trs faixas de comprimento de


onda, designadas de UVA (400 a 320 nm), UVB (320 a 290 nm) e UVC (290 a
100 nm), sendo que a radiao UVB apenas parcialmente absorvida pelo oznio,
chegando, portanto, com mais incidncia na Terra do que as outras.
Segundo Harborne & Williams (2000), HAVSTEEN (2002) e YAO et al. (2004),
os flavonides, geralmente, absorvem na regio de 280 315 nm e, portanto, so
capazes de agir como filtros UV, protegendo assim os tecidos subjacentes de danos
fotossintticos.
Os ensaios realizados para investigao da fotodegradao por ao da
fotlise direta, ou seja, sem adio de H2O2 como precursor radicalar sobre os
flavonides, demonstraram que as espcies antioxidantes so relativamente
fotoestveis nas condies empregadas, nos dois reatores desenvolvidos (Figuras
25 e 26). Isto corrobora com o mencionado na literatura [HARBORNE & WILLIAMS,
2000; HAVSTEEN, 2002; e YAO et al., 2004].

56

0,0
-0,5
-1,0

ln (A/A0)

-1,5
-2,0
-2,5
-3,0

Rutina - 18,1 M
Fisetina - 38,4 M
Quercetina - 9,8 M

-3,5
-4,0
0

10

20

30

40

50

60

Tempo (min)

Figura 25 Estudo do decaimento do sinal dos flavonides fisetina, quercetina e rutina frente
fotlise direta no reator fotoqumico (A) com fonte radiao de Hg (80 W).

0,0
-0,5
-1,0

ln(A/A0)

-1,5
-2,0
-2,5
-3,0
Rutina - 15,9 M
Fisetina - 34,9 M
Quercetina - 29,8 M

-3,5
-4,0
0

10

20

30

40

50

60

Tempo (min)

Figura 26 Estudo do decaimento do sinal dos flavonides fisetina, quercetina e rutina frente
fotlise direta no reator fotoqumico (B) com fonte radiao de W (150 W).

No estudo da interao direta dos flavonides com o H2O2 sem incidncia da


radiao de Hg e W, no foi observado o decaimento de absorvncia para os

57

flavonides em estudo, uma vez que sem a influncia da radiao no ocorre a

fotodecomposio do H2O2 para a formao do radical HO .


Os estudos demonstrados at aqui indicam a aplicabilidade do mtodo

cintico proposto, o qual se baseia na gerao fotoqumica do radical HO e na


fotoestabilidade dos antioxidantes irradiados nos reatores com lmpadas de W e Hg.

4.2

Cintica anti-radicalar dos flavonides

Aps os estudos sistemticos da gerao do radical HO nos reatores


fotoqumicos, o trabalho seguiu para o estudo cintico da reao dos flavonides de

interesse frente o radical HO gerado. Aqui, investigou-se num primeiro momento a


influncia da variao da concentrao do prprio H2O2 inicializador da reao no
decaimento do sinal dos antioxidantes. Logo aps estabelecida a concentrao de
H2O2 a ser utilizada nos tubos reacionais dispostos no reator, investigou-se o
decaimento cintico dos antioxidantes frente a uma concentrao de H2O2 e,

conseqentemente, de radical HO ao longo do tempo de experimento no reator.


Aqui, chega-se por fim ao clculo da constante cintica de reao e, portanto, ao
estudo comparativo da ao anti-radicalar dos compostos polfenlicos frente ao

radical HO .

4.2.1 Perfil cintico reacional do radical HO frente aos flavonides

Os ensaios com adies de diferentes concentraes de H2O2 na faixa de


0,29 a 2,90 mmol.L-1 demonstraram que a concentrao de H2O2 no altera o
decaimento observado para os flavonides durante 1 hora de irradiao. Os
pequenos desvios observados nos decaimentos das Figuras 27 e 28 comprovam
este efeito. Tal resultado pode ser explicado pelo fato de que a potncia da lmpada

o limitante na gerao de radical HO . Ou seja, a baixa radiao emitida pelas

58

lmpadas de Hg (80 W) e W (150 W) no fotolisa todo o H2O2 adicionado ao meio


em excesso.

0,0
-0,5
-1,0

ln(A/A0)

-1,5
-2,0
-2,5
-3,0

Rutin - 18,1 M
Fisetin - 38,4 M
Quercetin - 9,8 M

-3,5
-4,0
0

10

20

30

40

50

60

Tempo (min)

Figura 27 Estudo do decaimento do sinal dos flavonides fisetina, quercetina e rutina frente a
fotlise na presena de H2O2 no reator fotoqumico (A) com fonte radiao de Hg (80 W); [H2O2] =
-1
0,29 a 2,90 mmol L .

0,0
-0,5
-1,0

ln(A/A0)

-1,5
-2,0
-2,5
-3,0

Rutin - 15,9 M
Fisetin - 34,9 M
Quercetin - 29,8 M

-3,5
-4,0
0

10

20

30

40

50

60

Tempo (min)

Figura 28 Estudo do decaimento do sinal dos flavonides fisetina, quercetina e rutina frente a
fotlise na presena de H2O2. Reator fotoqumico (B) com fonte radiao de W (150 W); [H2O2] =
0,29 a 2,90 mmol L-1.

59

Como pode ser observado na Figura 27, no reator fotoqumico (A) com a fonte
de radiao lmpada de Hg o decaimento do sinal de absorvncia foi mais
acentuado do que no reator com fonte de radiao lmpada de W (Figura 28). Isto
pode ser explicado pelo fato de que a lmpada de Hg apresenta uma eficincia
maior na fotodecomposio do H2O2 do que a lmpada de W, como discutido
anteriormente no item 4.1.1.
Com isso, a concentrao de H2O2 adicionada foi fixada em 0,29 mmol.L-1, j
que o decaimento das espcies antioxidantes independe da concentrao de H2O2
adicionada (Figura 27 e 28) nos reatores fotoqumicos.

4.2.2 Perfil cintico reacional dos flavonides frente ao radical HO

As constantes cinticas dos compostos polifenlicos foram determinadas por


espectrofotometria e HPLC. Em ambas as determinaes, a ordem de decaimento
dos flavonides foi mantida, e os decaimentos cinticos dos antioxidantes foram
lineares quando plotados ln([A]/[A0]) em funo do tempo (Figura 29 e 30),

caracterizando, assim, a reao dos flavonides frente ao radical HO como uma


reao de primeira ordem [ATKINS, 1999].

60

0,0

0,0

Quercitrina

-0,2
-0,4

-0,2

-0,6

-0,4

Rutina

ln(A/A0)

-0,8
-1,0
-1,2
-1,4
-1,6

-0,6

-1,8

(A)

-2,0
-2,2

ln(A/A0)

-0,8

10

20

Canferol

30

40

50

60

Tempo (min)

-1,0
-1,2
-1,4

Fisetina

-1,6

Quercetina

-1,8
-2,0

(B)

Miricetina

-2,2
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 110

Tempo (min)
Figura 29 Decaimento cintico dos flavonides quercitrina, rutina, canferol, fisetina, quercetina e
miricetina frente fotlise na presena de H2O2, no reator com fonte de radiao lmpada de Hg (80
-1
-1
W); anlise por espectrofotometria UV-Vis; [H2O2] = 0,29 mmol.L ; [flavonides] = 50 mol.L . (A)
fotlise direta e (B) fotlise na presena de H2O2.

0,0

0,0
-0,2
-0,4

Quercitrina

-0,2

-0,6

ln(A/A0)

-0,8

-0,4

-1,2
-1,4

Rutina

-0,6

-1,0

-1,6
-1,8

(A)

-2,0
-2,2

ln(A/A0)

-0,8

10

20

Canferol

30

40

50

60

Tempo (min)

-1,0
-1,2
-1,4

Fisetina

-1,6

Quercetina

-1,8
-2,0

(B)

Miricetina

-2,2
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 110

Tempo (min)
Figura 30 Decaimento cintico dos compostos polifenlicos rutina, quercitrina, canferol, fisetina,
quercetina e miricetina frente fotlise na presena de H2O2, no reator com fonte de radiao
-1
-1
lmpada de Hg (80 W); anlise por HPLC; [H2O2] = 0,29 mmol.L ; [flavonides] = 50 mol.L . (A)
fotlise direta e (B) fotlise na presena de H2O2.

61

Na

Figura

31

32

so

apresentados,

respectivamente,

os

espectrofotogramas e os cromatogramas dos decaimentos de absorvncia da

reao anti-radicalar dos flavonides frente ao radical HO com o passar do tempo.

1,50

1,50

-1

L*mol *cm )

1,25

-1

1,00

/ (10

0,75

0,50

0min
10min
20min
30min
40min
50min
60min

1,25

Absorvncia / a.u.

0min
10min
20min
30min
40min
50min
60min

0,25

1,00

0,75

0,50

0,25

Canferol 49,98 M

Fisetina 50,32 M

0,00

0,00
250

300

350

400

450

250

300

/ nm

1,50

-1

1,00

-1

-1

0,75

/ (10

0,75

L*mol *cm )

-1

L*mol *cm )

1,00

/ (10

450

0min
10min
20min
30min
40min
50min
60min

1,25

0,50

0,25

0,50

0,25

Miricetina 50,05 M

Quercetina 50,01 M

0,00

0,00
250

300

350

400

450

250

300

/ nm

350

400

450

/ nm

1,50

1,50

-1

0,75

/ (10

0,75

1,00

-1

-1
-1

1,00

0min
10min
20min
30min
40min
50min
60min

1,25

L*mol *cm )

0min
10min
20min
30min
40min
50min
60min

1,25

L*mol *cm )

400

1,50

0min
10min
20min
30min
40min
50min
60min

1,25

/ (10

350

/ nm

0,50

0,25

0,50

0,25

Quercitrina 50,10 M

Rutina 49,99 M

0,00

0,00

250

300

350

/ nm

400

450

250

300

350

400

450

/ nm

Figura 31 Decaimento espectrofotomtrico da reao anti-radicalar dos antioxidantes em estudo

frente aos radicais HO .

62

120

35

Fisetina 49,94 M

Canferol 49,98 M
30

0min
10min
20min
30min
40min
50min
60min

20
15

0min
10min
20min
30min
40min
50min
60min

80

Abs (mAU)

Abs (mAU)

25

100

60

40

10

20

0
0

12

15

18

21 24

27

30

33 36

39

1
0,5

0,0

42

2
1,0

3
1,5

5
2,5

2,0
4

6
3,0

7
3,5

8
4,0

4,5
9

10
5,0

11
5,5

Tempo (min)

Tempo (min)

100

Miricetina 50,05 M

100

60

40

60

40

20

20

0
0

0min
10min
20min
30min
40min
50min
60min

80

Abs (mAU)

80

Abs (mAU)

Quercetina 50,01 M

0min
10min
20min
30min
40min
50min
60min

10

Tempo (min)

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Tempo (min)

180

Quercitrina 50,10 M

160

Abs (mAU)

120
100
80

0min
10min
20min
30min
40min
50min
60min

80

Abs (mAU)

140

Rutina 49,99 M

100

0min
10min
20min
30min
40min
50min
60min

60

40

60
40

20

20
0

0
0

Tempo (min)

Tempo (min)

Figura 32 Decaimento cromatogrfico dos compostos polifenlicos estudados frente fotlise na


presena de H2O2; [H2O2] = 0,29 mmol L-1. Condies de anlise: fase estacionria C18 Dionex (4,6
-1
mm x 150 mm x 5 m), fase mvel acetonitrila 30 % (v/v), pH 4,00, com fluxo de 0,5 ml min , injeo
de 20 L e presso varivel.

63

4.2.2.1 Determinao das constantes cinticas reacionais por Espectrofotometria


UV-Vis e por Cromatogrfica Lquida de Alta Eficincia (HPLC)

Nas determinaes tanto espectrofotomtricas quanto cromatogrficas, a


ordem de atividade anti-radicalar dos flavonides foi a mesma, em que o mais

eficiente no combate ao radical HO foi a quercitrina, seguido da rutina, canferol,


fisetina, quercetina e miricetina (tabela 2 e grfico 33). No entanto, as constantes
cinticas determinadas foram um pouco diferentes. Isso se deve, principalmente,
separao cromatogrfica dos possveis produtos de decomposio (radicais ou
intermedirios estveis radicais fenoxilas) formados na reao dos compostos

polifenlicos com os radicais HO , que na anlise espectrofotomtrica, no so


separados e pode interferir no sinal de absorvncia medida.

Tabela 2 Constantes cinticas dos favonides determinadas por espectrofotometria UV-Vis.

Flavonides

Quercitrina

Rutina

Canferol

Fisetina

Quercetina

Miricetina

HPLC-UV
Concentrao Espectrofotometria UV-Vis
-1
(M)
kOH (min )
tOH (min)
kOH (min-1)
tOH (min)
-3
-3
25,05
3,13 x10
221,45
4,65 x10
149,06
-3
-3
50,10
2,07 x10
334,85
2,72 x10
254,83
-3
-3
0,98 x10
707,29
1,43 x10
484,72
75,15
-3
-3
24,97
7,14 x10
97,08
13,80 x10
50,23
-3
-3
49,99
4,11 x10
168,65
5,81 x10
119,30
-3
-3
1,02 x10
679,56
2,67 x10
259,61
70,93
-3
-3
24,99
11,58 x10
59,86
16,77 x10
41,33
-3
-3
49,98
8,55 x10
81,07
11,28 x10
61,45
-3
-3
8,08 x10
85,79
5,96 x10
116,30
74,97
-3
-3
25,00
31,04 x10
22,33
39,78 x10
17,42
-3
-3
49,94
19,06 x10
36,37
18,56 x10
37,35
-3
-3
10,46 x10
66,27
12,77 x10
54,28
75,04
-3
-3
25,00
40,88 x10
16,96
54,94 x10
12,62
-3
-3
50,01
21,63 x10
32,05
24,09 x10
28,77
-3
-3
9,930 x10
69,80
10,97 x10
63,19
75,06
-3
-3
25,03
48,86 x10
14,19
102,04 x10
6,79
-3
-3
50,05
23,64 x10
29,32
41,00 x10
16,91
-3
-3
9,120 x10
76,00
16,76 x10
41,36
75,03

64

Quercitrina
Rutina
Canferol
Fisetina
Quercetina
Miricetina

-1

Constante cintica (min )

0,10

0,08

0,06

0,04

0,02

0,00
25

50

75

Concentrao de flavonide (M)

Figura 33 Constante cintica em funo da concentrao de flavonide em estudo frente fotlise


na presena de H2O2, determinada por HPLC-UV.

As determinaes foram desenvolvidas em 25, 50 e 75

M para cada

flavonide com adio de 0,29 mmol.L-1 de perxido de hidrognio. Como as


constantes cinticas anti-radicalares dos compostos polifenlicos frente ao radical

HO so de primeira ordem, estas se mostraram lineares (Figura 34 e 35) quando foi


plotada a concentrao de flavonide em funo da constante cintica determinada
neste estudo.

Miricetina (r=0,9858)
Quercetina (r=0,9910)
Fisetina (r=0,9944)
Canferol (r=0,9628)
Rutina (r=0,9990)
Quercitrina (r=0,9987)

0,06

-1

Constante cintica (min )

0,05
0,04

0,03
0,02

0,01
0,00
20

30

40

50

60

70

80

Concentrao de flavonide (M)

Figura 34 Constante cintica em funo da concentrao de flavonide, determinada por


espectrofotometria UV-Vis dos flavonides em estudo frente fotlise em presena de H2O2.

65

Miricetina (r=0,9858)
Quercetina (r=0,9910)
Fisetina (r=0,9944)
Canferol (r=0,9999)
Rutina (r=0,9990)
Quercitrina (r=0,9987)

0,06

-1

Constante cintica (min )

0,05
0,04

0,03

0,02

0,01
0,00
20

30

40

50

60

70

80

Concentrao de flavonide (M)

Figura 35 Constante cintica verus concentrao de flavonide, determinada por HPLC-UV dos
flavonides em estudo frente fotlise em presena de H2O2.

A maior ao anti-radicalar da quercitrina deve-se reao lenta (menor

constate cintica) deste flavonide frente mesma concentrao do radical HO e


tempo de irradiao, em comparao aos outros.
A velocidade de uma reao quantifica a rapidez com que esta ocorre. Por
isso, uma maior ao anti-radicalar esta relacionada a uma reao mais lenta com o
radical OH, j que o antioxidante permanece mais tempo no meio.
Estudos apontam que, alm das aes j mencionadas neste trabalho, os
antioxidantes tm um papel fundamental no mecanismo de reparo de danos
causados por EROs. Se os mecanismos antioxidantes no conseguem impedir os
danos ao DNA, ocorrem injrias oxidativas, que incluem a modificao de bases, de
acares e a formao de ligaes cruzadas entre fitas duplas e simples [RIBEIRO
et. al., 2005], com isso a maior permanncia do antioxidante no meio possibilita um
alcance maior de sua ao.
Estudos mostram que a ao dos flavonides frente a radicais livres se d
pela rpida doao de um tomo de hidrognio dos compostos polifenlicos aos
radicais livres, e depende, principalmente, da possibilidade de estabilizao dos
radicais fenoxilas formados via ligao com hidrognio e/ou do deslocamento
expandido de eltrons, e da estabilizao dos radicais fenoxilas formados, quando
os compostos polifenlicos apresentam grupos hidroxilas nas posies 3 e 4 do
anel B e/ou na posio 7 e 8 do anel A [JOVANOVIC et al., 1994; PANNALA et al.,

66

2001; BURDA & OLESZEK, 2001; TAGLIAFERRO & BOBILYA, 2002; HAVSTEEN,
2002; AMIC et al. 2003; DENISOV, 2005; SEYOUM et al., 2006].
Os flavonides hidroxilados estudados se diferem pela localizao dos grupos

HO . Destes, o canferol foi o mais eficiente no seqestro dos radicais HO . Isto,

provavelmente, se deve presena de apenas um grupo HO nas posies 4 (anel

B). De acordo com a literatura, flavonides que tm apenas um HO no anel A ou B


so mais antioxidantes [JOVANOVIC et al., 1994; AMIC et al. 2003; DENISOV,
2005].
O fato de apresentar somente um grupo hidroxila, tambm, observado para

a fisetina que possui um grupo HO na posio 7 (anel A). Este resultado corrobora
com publicaes que afirmam a diminuio da atividade antioxidante em flavonides
que apresentam grupos hidroxila nas posies 5 e/ou 6 do anel [PIETTA, 2000;
PANNALA et al., 2001]
Alm disso, quando comparamos o caso do canferol com o da fisetina,

podemos deduzir que a presena nica de um grupo HO no anel B, mais


importante, do ponto de vista anti-radicalar, que no anel A, nas condies testadas.
Diversos estudos com espectrofotometria UV-Vis tm revelado que a maioria
dos flavonides apresenta duas Bandas de absoro: Banda I (320-385 nm) que
representa a absoro do anel B e a Banda II (250-285 nm) que corresponde
absoro do anel A, conforme figura 36 [JOVANOVIC, 1994; AMIC et al. 2003, YAO
et al., 2004].

Figura 36 Regies estrutura com maior atividade antioxidante [AMIC et al., 2003].

67

Com isso, possvel afirmar que a atividade anti-radicalar dos flavonides em


estudo se deu, principalmente, no anel B, porque conforme acompanhamento

espectral da reao deste com os radicais HO , gerados pela fotodecomposio do


H2O2, a Banda I apresentou um decaimento de absorvncia com passar do tempo, o
que no foi observado na Banda II (Figura 31).
A quercetina e a miricetina, que tambm so flavonides hidroxilados,

possuem em sua estrutura mais de um grupo HO nos anis A e B. No entanto, a

miricetina tem um grupo HO na posio 5 (anel B) que a quercetina no apresenta.


Quanto eficincia anti-radicalar, a quercetina foi mais eficaz do que a miricetina.

Possivelmente, o aumento de grupos HO no anel B prejudica o seqestro de

radicais HO .
Neste trabalho foram estudados dois flavonides glicosilados, a quercitrina e
a rutina. A nica diferena entre estes flavonides o grupamento glicosdico, em
que a quercitrina possui um ramnopiranosil e a rutina um rutinosdeo-quercetina.
Com relao capacidade anti-radicalar, a quercitrina apresentou maior eficincia
do que a rutina. Este fato leva deduo de que a rutina, em relao quercitrina,
sofre um maior impedimento estereoqumico, e por isso foi menos eficiente no
combate ao radical livre. importante destacar, no entanto, que estudos sobre a
relao estrutura-atividade antioxidante de flavonides glicosdicos so ainda
bastante controversos [HOPIA & HEINONEN, 1999].

68

CONCLUSES

Os reatores desenvolvidos possibilitam o estudo da atividade anti-radicalar de


espcies antioxidantes na medida em que proporcionam o acompanhamento

cintico da reao entre o radical HO gerado pela fotodecomposio do H2O2 e os


compostos polifenlicos.

Este estudo mostrou que o flavonide mais eficiente no combate ao radical

HO , gerado pela fotodecomposio do H2O2, foi a quercitrina. Com base nos


estudos realizados, a ordem de ao radical dos compostos polifenlicos a
seguinte:
Quercitrina > Rutina > Canferol > Fisetina > Quercetina > Miricetina

O sistema pode ser empregado para o estudo da cintica de reao dos

compostos polifenlicos frente ao radical HO e o clculo das constantes de reao


para cada composto. Da mesma forma, o estudo in vitro da interao entre radicais

HO e extratos de plantas com carter antioxidante pode ser realizado pelo mtodo
proposto.

Para uma caracterizao do perfil de ao de compostos polifenlicos frente a


radicais livres, destaca-se a necessidade de estudos interdisciplinares comparativos
realizados em sistemas qumicos (no enzimticos), sistemas bioqumicos
(enzimticos), sistemas ex-vivo (celulares) e sistemas in vivo.

Por fim, o presente trabalho sugere a correlao dos estudos realizados in


vitro com estudos in vivo com as mesmas espcies antioxidantes, com o objetivo de
se ter uma comparao dos dados cinticos obtidos com resultados de outros
mtodos clssicos in vitro de determinao do poder antioxidante, como DPPH,
ABTS, etc.

69

Por fim, este trabalho abre a possibilidade de obteno de constantes de

reao universais para o radical HO frente a espcies antioxidantes, atravs de


novos clculos cinticos que venham a considerar a variao da concentrao de

radical HO no tempo, dados estes ainda inexistentes na literatura. Estes dados


seriam de grande importncia para estudos fisiolgicos in vivo, bem como para
estudos farmacolgicos com substncias antioxidantes (naturais e sintticas)
capazes de reagir diretamente com EROs no organismo com uma eficcia suficiente
para atuarem como candidatos a frmacos com elevada ao anti-radicalar.

70

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ACKER, S. B. E. V. et al. Structural aspects of antioxidant activity of flavonoids. Free

Radical Biology and Medicine. v. 20, p.331-342, 1996.


AMIC, D. et al. Structure-Radical Scavenging Activity Relationships of Flavonoids.

Croatica Chemica Acta, n. 76, v. 1, p. 55-61, 2003.


BIANCHI, M. L. P.; ANTUNES, L. M. G. Radicais livres e os principais antioxidantes
da dieta. Revista de Nutrio. v. 12, n. 2, p. 123-130, 1999.
BURDA, S.; OLESZEK, W. Antioxidant and Antiradical Activities of Flavonoids.

Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 49, n. 6, p. 27742779, 2001.


DENISOV, E. T. Oxidation and antioxidants in organic chemistry and biology.
Boca Raton: CRC Taylor & Francis Group, 2005. 981p.
FERREIRA, A. L. A.; MATSUBARA, L. S. Radicais Livres: conceitos, doenas
relacionadas, sistema de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associao

Mdica Brasileira. v. 43, p. 61-68, 1997.


FERREIRA, E. C.; ROSSI, A. V. A quimiluminescncia como ferramenta analtica: do
mecanismo a aplicaes da reao do luminol em mtodos cinticos de anlise.

Qumica Nova. v. 25, n. 6, p.1003-1011, 2002.


FORKMANN, G.; MARTENS, S Metabolic engineering and applications of flavonoids.

Current Opinion in Biotechnology. n. 12, p. 155-160, 2001.


HALLIWELL, B.; CLEMENTB, M. V.; LONG, L. H. Hydrogen peroxide in the human
body. FEBS Letters. n. 486, p. 10-13, 2000.
HARBORNE, J. B.; WILLIAMS, C. A. Advances in flavonoid research since 1992.

Phytochemistry. n. 55, p. 481-504, 2000.


HAVSTEEN, B. H. The biochemistry and medical significance of the flavonoids.

Pharmacology & Therapeutics. v. 96, p. 67202, 2002.

71

HEIM, K. E.; TAGLIAFERRO, A. R.; BOBILYA, D. J. Flavonoid antioxidants:


chemistry, metabolism and structure-activity relationships. Journal of Nutritional

Biochemistry. v. 13, p.572-584, 2002.


HOPIA, A.; HEINONEN, M. Antioxidant Activity of Flavonol Aglycones and Their
Glycosides in Methyl Linoleate. JAOCS, v. 76, n. 1, 1999.
HUANG, D.; OU, B.; PRIOR, R. L. The Chemistry behind Antioxidant Capacity
Assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 1841, n. 53, p. 1841-1856,
2005.
JOVANOVIC, S. V. et al. Flavonoids as antioxidants. Journal of the American

Chemical Society. v. 116, p. 48464851, 1994.


LEHNINGER, L.A. Bioqumica. 6.ed. Edgard Blcher, 2005.
MOLYNEUX, P. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for
estimating

antioxidant

activity.

Songklanakarin

Journal

of

Science

and

Technology. v. 26, n. 2, p. 211-219, 2004.


PANNALA, A. S. et al. Flavonoid B-ring chemistry and antioxidant activity: fast
reaction kinetics. Biochemical and Biophysical Research Communications. v.
282, p.1161-1168, 2001.
PERES-JIMENEZ, J. & SAURA-CALIXTO, F. Anti-oxidant capacity of dietary
polyphenols determined by ABTS assay: a kinetic expression of the results.

International Journal of Food Science and Technology. v. 43, p. 185191, 2008.


PIETTA, P. Flavonoids as antioxidants. Journal of Natuarl Products. v. 63, p.
10351042, 2000.
RE, R. et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation
decolorization assay. Free Radical Biology & Medicine. v. 26, n. 9/10, p. 1231
1237, 1999.
RIBEIRO, S. M. R. et al. A formao e os efeitos das espcies reativas de oxignio
no meio biolgico. Bioscience Journal. v. 21, n. 3, p. 133-149, 2005.

72

ROBERTS, C. K.; SINDHU, K. K. Oxidative stress and metabolic syndrome. Life

Sciences. n. 84, p. 705712, 2009


SANCHEZ-MORENO, C. Review: Methods Used to Evaluate the Free Radical
Scavenging Activity in Foods and Biological Systems. Food Science and

Technology International. v. 8, n.3, p. 121137, 2002.


SEYOUM, A.; ASRES, K.; EL-FIKY, F. K. Structure-radical scavenging activity
relationships of flavonoids. Phytochemistry. v. 67, p. 2078-2070, 2006.
SILVA, F. A. M.; BORGES, M.F.M.; FERREIRA, M. A. Mtodos para avaliao do
grau de oxidao e da capacidade antioxidante. Qumica Nova. v. 22, n. 1, p. 94103, 1999.
SIMES, C. M. O. et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5 edio, ver.
ampl. Porto Alegre/Florianpolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 2004.
VALKO et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and
human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. v. 39,
p. 4484, 2007.
VELLOSA J. C. R.; BARBOSA, V. F.; OLIVEIRA, O. M. M. F. Pesquisa de produtos
naturais: plantas e radicais livres. Revista Eletrnica de Farmcia. v. 5, n. 2, p.
119-130, 2007.
YAO, L. H. et al. Flavonoids in food and their health benefits. Plant Foods for

Human Nutrition. v. 59, p.113-122, 2004.

73

ANEXOS

74

ANEXO A Caractersticas qumicas dos compostos polifenlicos


estudados

Tabela 1 Caractersticas qumicas dos compostos polifenlicos estudos.


Compostos Massa
Frmula
Nomenclatura
pKa
polifenlic molecular
qumica
(IUPAC)
(g/mol)
os

Canferol

286,24

C15H10O6

3,5,7-trihidroxi-2-(4hidroxifenil)cromen-4-one

6,93 0.60

Fisetina

286,24

C15H10O6

2-(3,4-dihidroxifenil)-3,7dihidroxicromen-4-one

()

Miricetina

318,24

C15H10O8

3,5,7-trihidroxi-2-(3,4,5trihidroxiphenil)cromen-4-one

6,88 0.60

Quercetina

302,24

C15H10O7

2-(3,4-dihidroxifenil)-3,5,7trihidroxicromen-4-one

6,89 0.60

C21H20O11

2-(3,4-dihidroxifenil)-5,7-dihidroxi3-[(2S,3R,4R,5R,6S)-3,4,5trihidroxi-6-metiloxan-2il]oxicromen-4-one

()

C27H30O16

2-(3,4-dihidrofenil)-5,7-dihidroxi-3[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihidroxi6-[[(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,56,83 0.60
trihidroxi-6-metiloxan-2il]oximetil]oxan-2-il]oxicromen-4one

Quercitrina

Rutina

448,38

610,52

() No encontrado na literatura.
Fonte: PubChem Publi Chemical Database.

Estrutura qumica

75

ANEXO B Espectros de absortividades molar dos compostos


polifenlicos em estudo

30

30
O

25

267

367

20

25
H

/ (10

10

249

15

10

Fisetina

0
250

300

350

400

250

300

350

/ nm

30
O

49,8 M
pH6,32
2
T=303K
376 pKa=6,88

H
O

-1

L*mol *cm )

1
20

255

O
O H

256
H

375

50,5 M
pH6,32
T=303K
pKa=6,89

20
H

-1

-1

D)
25
-1

25

L*mol *cm )

C)

15

/ (10

15

/ (10

400

/ nm

30

10

10

Miricetina

Quercetina

0
250

300

350

400

250

300

350

/ nm

30

48,8 M
pH6,32
T=303K

O
O H

O
O
O

-1

15

O
O
H

20

354

360

O
O
H

15

O
H

/ (10

1
258

-1

-1

257

50,0 M
pH6,32
T=303K
pKa=6,83

O
O H

25

-1

25

F)

L*mol *cm )

E)

20

400

/ nm

30

L*mol *cm )

364

Canferol

/ (10

20

50,3 M
pH6,32
T=303K

15

/ (10

B)

-1

-1

44,0 M
pH6,32
T=303K
pKa=6,93

-1

-1

L*mol *cm )

L*mol *cm )

A)

10

10

Rutina

Quercitrina
0

0
250

300

350

/ nm

400

250

300

350

/ nm

Figura 1 Espectros de absortividade molar dos compostos polifenlicos estudados.

400

450

76

ANEXO C Dados cinticos dos compostos polifenlicos estudados


frente ao radical HO

Tabela 1 Dados cinticos do radical HO frente aos compostos polifenlicos estudados


determinados por espectrofotometria UV-Vis; [H2O2] = 0,29 a 2,90 mmol L-1.

Flavonide

Lmpada Conc.
do reator (M)

W (150 W)
Hg (80 W)
W (150 W)
Fisetina
Hg (80 W)
W (150 W)
Quercetina
Hg (80 W)
Rutina

15,87
18,05
34,94
38,43
28,97
29,55

kOH
(min-1)

k h
(min-1)

kh+OH
(min-1)

0,64x10-3
3,38x10-3
2,59x10-3
3,51x10-3
1,08x10-3
3,82x10-3

3,05x10-3
29,92x10-3
9,50x10-3
45,12x10-3
10,58x10-3
48,96x10-3

th
(min)

2,41x10-3 1083,04
26,54x10-3 205,07
6,910x10-3 267,62
41,61x10-3 197,48
9,50x10-3 641,80
45,14x10-3 181,45

th+OH tOH
(min) (min)
227,26
234,05
72,96
8,66
65,51
13,05

287,61
307,33
100,31
9,55
72,96
14,34

Tabela 2 Dados cinticos dos compostos polifenlicos estudados frente a fotlise e ao radical HO ;
determinados por espectrofotometria UV-Vis; [H2O2] = 0,29 mmol L-1.

Flavonide
Quercitrina

Rutina

Canferol

Fisetina

Quercetina

Miricetina

Conc.
(M)
25,05
50,10
75,15
24,97
49,99
70,93
24,99
49,98
74,97
25,00
49,94
75,04
25,00
50,01
75,06
25,03
50,05
75,03

k h
th
-1
(min )
(min)
0,98 x10-3 707,29
0,39 x10-3 1777,30
0,10 x10-3 6931,47
1,38 x10-3 502,28
1,09 x10-3 635,91
0,93 x10-3 745,32
2,24 x10-3 309,44
1,79 x10-3 387,23
1,01 x10-3 686,28
4,82 x10-3 143,81
2,91 x10-3 238,19
1,86 x10-3 372,66
4,05 x10-3 171,15
2,95 x10-3 234,97
1,99 x10-3 348,32
7,65 x10-3 90,61
4,10 x10-3 169,06
2,98 x10-3 232,60

r
0,9768
0,9871
0,9990
0,9904
0,9956
0,9903
0,9940
0,9973
0,9971
0,9947
0,9910
0,9997
0,9865
0,9891
0,9972
0,9971
0,9995
0,9943

kh+OH
(min-1)
4,11 x10-3
2,46 x10-3
1,08 x10-3
8,52 x10-3
5,20 x10-3
1,95 x10-3
13,82 x10-3
10,34 x10-3
90,90 x10-3
35,86 x10-3
21,97 x10-3
12,32 x10-3
44,93 x10-3
24,58 x10-3
11,92 x10-3
56,51 x10-3
27,74 x10-3
12,10 x10-3

th+OH
(min)
168,65
281,77
641,80
81,36
133,30
355,46
50,16
67,04
76,25
19,33
31,55
56,26
15,43
28,20
58,15
12,27
24,99
57,28

kOH/kh

0,9701
0,9820
0,9994
0,9842
0,9936
0,9989
0,9964
0,9951
0,9954
0,9893
0,9949
0,9992
0,9841
0,9972
0,9887
0,9993
0,9974
0,9891

4,19
6,31
10,80
6,17
4,77
2,10
6,17
5,78
9,00
7,44
7,55
6,62
11,09
8,33
5,99
7,39
6,77
4,06

-1

Miricetina

Quercetina

Fisetina

Canferol

Rutina

Quercitrina

Flavonide

Conc. (M)
25,05
50,10
75,15
24,97
49,99
70,93
24,99
49,98
74,97
25,00
49,94
75,04
25,00
50,01
75,06
25,03
50,05
75,03

kh (min-1)
(1,680,07) x10-3
(1,260,04) x10-3
(0,960,02) x10-3
(2,020,05) x10-3
(1,670,03) x10-3
(0,960,03) x10-3
(1,940,10) x10-3
(1,550,06) x10-3
(0,860,05) x10-3
(4,940,17) x10-3
(3,280,12) x10-3
(1,950,09) x10-3
(5,790,08) x10-3
(3,580,05) x10-3
(2,240,03) x10-3
(10,140,17) x10-3
(4,120,09) x10-3
(2,940,06) x10-3
th (min)
412,59
550,12
722,03
343,14
415,06
722,03
357,29
447,19
805,99
140,31
211,33
355,46
119,71
193,62
309,44
68,36
168,24
235,76

r
0,9966
0,9863
0,9982
0,9990
0,9966
0,9972
0,9833
0,9885
0,9955
0,9818
0,9929
0,9921
0,9959
0,9986
0,9984
0,9980
0,9999
0,9846

kh+OH (min-1)
(6,330,64) x10-3
(3,980,41) x10-3
(2,390,37) x10-3
(15,820,78) x10-3
(7,480,53) x10-3
(3,630,46) x10-3
(18,710,52) x10-3
(12,830,37) x10-3
(6,820,28) x10-3
(44,720,32) x10-3
(21,840,26) x10-3
(14,720,20) x10-3
(60,730,80) x10-3
(27,671,07) x10-3
(13,211,16) x10-3
(112,180,09) x10-3
(45,120,86) x10-3
(19,700,69) x10-3
th+OH (min)
109,50
174,16
290,02
43,81
92,67
190,95
37,05
54,03
101,63
15,50
31,74
47,09
11,41
25,05
52,47
6,18
15,36
35,19

r
0,9864
0,9906
0,9896
0,9985
0,9991
0,9947
0,9981
0,9938
0,9955
0,9858
0,9964
0,9560
0,9944
0,9986
0,9991
0,9892
0,9996
0,9861

Tabela 3 Dados cinticos dos compostos polifenlicos estudados frente ao radical HO ; determinados por HPLC; [H2O2] = 0,29 mmol L .

kOH/kh
3,77
3,16
2,49
7,83
4,48
3,78
9,64
8,28
7,93
9,05
6,66
7,55
10,49
7,73
5,90
11,06
10,95
6,70

77