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PRACTICA N 11

PRUEBAS TREPONEMICAS PARA EL DIAGNOSTICO DE SIFILIS.


(PRUEBA CONFIRMATORIA DE SIFILIS FTA-ABS)

Introduccin

La Sfilis es una enfermedad crnica con periodos de agudizacin,


causada por una espiroqueta Treponema pallidum subespecie
pallidum. Debido al fracaso en el cultivo de T. pallidum se han
desarrollado distintos mtodos para diagnosticar la infeccin en los
distintos estadios de la Sfilis.
Los mtodos se clasifican en
cuatro categoras: a) Examen
microscpico
Directo
(en
campo oscuro) del material
de la lesin; b) Pruebas no
treponmicas usadas para
tamizaje;
c)
Pruebas
treponmicas que detectan
anticuerpos
especficos,
utilizados
como
confirmatorios; y d) pruebas
para la deteccin directa del antgeno: ELISA, PCR.
La primera prueba treponmica fue desarrollada por Nelson y Mayer
en 1949. Prueba de Inmovilizacin del Treponema pallidum (TPI)
consiste en enfrentar suero inactivado del paciente con complemento
de cobayo y una suspensin de treponemas vivos obtenidos por
inoculacin en testculos de conejo con cepa Nichols. La lectura se
realiza en campo oscuro evalundose el porcentaje de inmovilizacin.
Los inconvenientes tcnicos que implican el uso de los treponemas
vivos fueron solucionados con el desarrollo en 1957 de la prueba por
inmunoflourescencia para anticuerpos anti- treponema pallidum (FTA)
donde una dilucin 1:5 del suero del paciente se hace reaccionar con
una suspensin de treponemas muertos fijados en un porta-objeto,
luego se revela la presencia de anticuerpos con anti gamma globulina
humana conjugada con Isotiocianato de fluorescena. Esta tcnica
daba falsos positivos en un 25% de sueros normales, esto se debe a
antgenos comunes al treponema pallidum y treponemas banales.
Para solucionar esto se trata previamente el suero con un extracto
proteico de treponemas de Reiter (sorbente) para absorber los

anticuerpos de grupos presentes (banales) con el que se diluye 1:5 el


suero de all el nombre de FTA-ABS.
Objetivo
La FTA-ABS, es una prueba especfica y frecuentemente es empleada
para confirmar los casos reactivos a las pruebas de tamizaje.
FUNDAMENTO
Esta tcnica de Inmunoflourescencia Indirecta (IFI), descrita por
Walter y Coons (1954); se basa en la capacidad de los anticuerpos de
unirse a ciertos fluorocromos sin alterar sus propiedades
inmunolgicas. En un primer paso el suero problema se pone en
contacto con el sustrato antignico. Si los anticuerpos estn
presentes en el suero, stos se unen al antgeno, formando el
complejo Ag-Ac. Si el suero no contiene anticuerpos anti-treponema
no se formara el complejo Ag-Ac y todos los componentes del suero
sern eliminados en la etapa de lavado. En el siguiente paso se
agrega anti gammaglobulina humana marcada con isotiocianato de
fluorescena (FITC). Si se form el complejo AG-Ac en el primer paso,
la anti gammaglobulina marcada con el isotiocianato de fluorescena
se adhiere al anticuerpo. La reaccin positiva se evidencia por
fluorescencia verde brillante
MATERIALES
1. Sustrato: Portaobjetos con reas reactivas. Cada rea reactiva
contiene Treponemas pallidum fijados, cepa de Nichols.
2. Cubreobjetos
3. Matraz de 1 litro.
4. Vasos Coplin
5. Cmara hmeda.
6. Micropipetas.
EQUIPOS
1. Microscopio de fluorescencia, con filtro de excitacin a 495 nm y
de emisin para visualizacin de FITC a 525 nm.
2. Bao Mara a 56C
3. Centrifuga.
REACTIVOS
1.
2.
3.
4.
5.

Anti-Ig (G, A, M) humana conjugada con FITC


Buffer fosfato salino (PBS)
Suero humano Control Reactivo
Suero humano Control No Reactivo
Medio de Montaje: Glicerina tamponada con PBS (V/V) pH 8.0
+/- 0,5
6. Sorbente: Preparado de treponema cepa Reiter para remover
los anticuerpos treponmicos no sifilticos.

MUESTRA
Emplear suero (Puede ser inactivado) o plasma sin inactivar. No
emplear muestras hemolizadas, contaminadas o lipemicas. Si el
anlisis no se va a realizar en el momento, se pueden conservar las
muestras a -20 C durante un mximo de 4 6 semanas.

PROCEDIMIENTO

1.

P
r
e
p
a
r
a
el PBS buffer: disolver el sobre proporcionado en un litro de
agua destilada.
2. Preparar una dilucin 1:5 de los sueros controles y las muestras
con el sorbente ( Ejm. 10 uL de muestra + 40 uL del sorbente).
Dejar reaccionar +/- 15 minutos.
3. Sacar los portaobjetos (substrato), emplear las improntas
necesarias.
4. Cubrir las reas reactivas con las diluciones de controles y
muestras problema.
5. Incubar en cmara hmeda por 30 minutos a temperatura
ambiente.
6. Lavar con PBS, usando pizeta. Luego realizar 2 lavados de 5
c/u, colocando el portaobjetos en el vaso Coplin, conteniendo
PBS, agitarlo suavemente en forma rotatoria.
7. Diluir la Anti gammaglobulina humana conjugada. Teniendo en
cuenta la dilucin sugerida por el fabricante.
8. Sacar las improntas del PBS, sacudir el exceso con un papel
toalla, pero manteniendo hmedas las reas reactivas.
9. Cubrir cada rea reactiva
con la dilucin de anti
gammaglobulina humana, e incubar en cmara hmeda 30 a
temperatura ambiente.
10.
Lavar como en el paso 6. Secar como en el paso 8.
11.
Colocar medio de montaje en las reas reactivas y
cubrirlas con el cubre-objetos presionando suavemente y
evitando la formacin de burbujas de aire.
12.
Se recomienda leer inmediatamente en el microscopio de
fluorescencia o dentro de las 24 horas conservados entre 2 8
C en oscuridad.
INTERPRETACION DE RESULTADOS
SUEROS REACTIVOS: Los treponemas se observan teidos en
forma homognea con una tpica fluorescencia verde manzana
brillante.
SUEROS NO REATIVOS: Ausencia total de fluorescencia o coloracin
verde amarilla muy dbil opaca y no fluorescente.

REACCION INDETERMINADA: Cuando una muestra no puede


interpretarse como reactivo ni como no reactivo. Si se diera este
caso, el examen deber repetirse con una segunda muestra.

ESQUEMA
DEL
FLUORESCENCIA.
Profesora Encargada del Curso de
Acasiete.

MICROSCOPIO

DE

Inmunologa II: TM Mirtha Hernndez