Gua para
la evaluacin
genotxica de
cuerpos de agua
utilizando clulas de
races de
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Telf. (591-2) 2124484 2117391
cebollines
Gua para la Evaluacin Genotxica en Cuerpos de Agua Utilizando Clulas de Races de Cebollines
Autor
Ministerio de Medio Ambiente y Agua (MMAyA)
Edicin y diseo
Viceministerio de Recursos Hidricos y Riego (VRHR)
Texto:
Gloria Rodrigo Lira
El presente documento fue elaborado en el marco del Programa Plurianual de Gestin Integrada de Recursos Hdricos y Manejo
Integral de Cuencas 2013 2017 y su impresin fue posible gracias al apoyo de la Cooperacin Suiza en Bolivia a travs de
HELVETAS Swiss Intercooperation, programa CONCERTAR miembro de GESTOR.
Est permitida la reproduccin del presente documento, siempre que se cite la fuente..
La Paz Bolivia
2014
Contenido
1
Recordando la divisin celular 1
2
Qu es genotoxicidad
? 5
11
4
Protocolo de evaluacin 15
4.1
Reactivos y material 18
4.2
Procedimiento de muestreo 19
4.3
Medicin de microncleos 22
4.4
Datos y clculos 26
4.5
Interpretacin de resultados 28
5
Glosario 30
6
Bibliografa consultada 31
Presentacin
Con el objetivo de facilitar la labor de vigilancia, control y monitoreo de la calidad de los cuerpos
de agua, en cumplimiento con los artculos 9, 10 y 11 del Reglamento en Materia de Contaminacin
Hdrica, de la ley del Medio Ambiente (Ley 1333), el Ministerio de Medio Ambiente y Agua (MMAyA),
a travs del Viceministerio de Recursos Hdricos y Riego (VRHR), elabor la presente cartilla que se
espera pueda ser difundida y aplicada de manera efectiva y concreta por tcnicos de medio ambiente
de los gobiernos municipales y departamentales, monitores comunales, empresas y cooperativas
prestadoras de servicios de agua potable y saneamiento bsico e instituciones u organizaciones
involucradas y comprometidas con este tema.
Como resultado de su aplicacin, se espera que se pueda mejorar y ampliar el presente documento,
por lo que ser de mucho valor toda observacin, sugerencia y comentario que se pueda hacer llegar
al VRHR para su incorporacin en sus prximas ediciones con los reconocimientos que correspondan.
Protozoo
Alga
Bacterias
Hongos
Estas clulas estn situadas en las gnadas de los aparatos reproductores femenino y masculino. Los gametos
contienen la mitad de la informacin gentica de un individuo, es decir 23 cromosomas, por lo que se dicen
que son clulas haploides. Estas clulas necesitan unirse
al gameto complementario, que ocurre en el proceso de
fecundacin, para completar as la informacin para dar
lugar a un individuo humano completo.
En la meiosis, a diferencia de la mitosis, slo se transmite a cada clula nueva un cromosoma de cada una
de las parejas de la clula original. Por esta razn, cada
gameto contiene la mitad del nmero de cromosomas
que tienen el resto de las clulas del cuerpo, es decir, 23
cromosomas.
Los gametos se originan mediante meiosis, proceso exclusivo de divisin de las clulas germinales o tambin llamadas clulas sexuales. La meiosis es un mecanismo de
divisin celular que, a partir de una clula diploide (2n),
permite la obtencin de cuatro clulas haploides (n) con
Cuando en la fecundacin se unen dos gametos, la clula resultante, llamada cigoto, contiene toda la dotacin
doble de cromosomas. Es decir, 46 cromosomas. La mitad de estos cromosomas proceden de un progenitor y la
otra mitad del otro. La meiosis, entonces, consiste en dos
divisiones sucesivas de una clula diploide acompaadas
por una sola divisin de sus cromosomas (Figura 2).
Meiosis
2n
2n
2n
2n
A nivel gentico
Reparto exacto del material
gentico
Meiosis I
Mitosis
A nivel celular
1n
1n
Meiosis II
2n
2n
1n
1n
1n
1n
A nivel orgnico
Se da este tipo de divisin en
los organismos unicelulares
para su reproduccin asexual y
en pluricelulares para su desarrollo, crecimiento y la reparacin y regeneracin de tejidos
y rganos.
Qu es genotoxicidad?
Copia mutada
Adenina
Timina
Citosina
Guanina
Cadena
azcar - fosfato
Mitocondria
Citoesqueleto
Ncleo
Ribosomas
Retculo
endoplasmtico
Centriolo
Membrana
plasmtica
Citoplasma
Peroxisoma
Aparato de Golgi
Nuclelo
Aparato de Golgi
Citoesqueleto
Reticulo
Endoplasmtico
Cloroplasto
Ncleo
Nucleolo
Mitocondria
Ribosomas
Vacuola
Citoplasma
Membrana
Plasmtica
Pared celular
Telofase
Anafase
Interfase
Metafase
Profase
Los ensayos de genotoxicidad estn diseados para detectar compuestos que inducen directa o indirectamente
a daos genticos por diferentes mecanismos. Generalmente, se considera que este dao produce efectos heredables y provocan la formacin de tumores.
Actualmente, se dispone de pruebas con las que se
puede determinar un dao gentico y as detectar compuestos genotxicos. Muchas de estas pruebas son
bioqumicas, in vivo o in vitro, con micro o macro organismos. Mediante estos ensayos se pueden determinar
daos microscpicos o moleculares, o bien la formacin
de aductos, es decir, complejos que se forman cuando
un compuesto qumico se une a una molcula biolgica,
como el ADN o a ciertas protenas.
11
Ante esto, los bioensayos ofrecen ventajas considerables debido a que un organismo puede metabolizar un
compuesto cualquiera y convertirlo en otro que puede
ser an ms txico que el original.
Actualmente, a nivel mundial, las agencias reguladoras
de medio ambiente exigen una batera o conjunto estndar de estudios de genotoxicidad antes de dar autorizacin para liberar productos de consumo humano,
entre ellos el agua potable debido a que el proceso de
potabilizacin requiere de cloro, el mismo que ha mostrado ser mutagnico en diferentes ensayos.
La batera estndar para determinar genotoxicidad incluye el llamado test de Ames, que es un ensayo biolgico
rpido utilizado para determinar el potencial mutagnico
y cancergeno de compuestos qumicos9. El procedimiento se describe en una serie de documentos de principios
de 1970, escritos por Bruce Ames y su grupo de investigacin de la Universidad de California, Berkeley. En este
Las pruebas estndar para la carcinogenicidad hechas sobre roedores toman aos para completarse y son caras de realizar.
12
13
Protocolo de evaluacin
Los microncleos son fragmentos de cromosomas o cromosomas completos que, espontneamente o por causa de agentes que rompen cromosomas o que alteran
el huso10 de divisin, quedan fuera del ncleo durante
la mitosis11. Entre estos agentes estn las radiaciones,
sustancias qumicas, plaguicidas, frmacos y otros contaminantes ambientales.
Los microncleos son conocidos, en el campo de la hematologa, como cuerpos de Howell-Jolly. Su forma es
generalmente redonda u ovalada, con un dimetro que
vara desde 0,4 a 1,6 micras. Su formacin ocurre en la
anafase de la mitosis12 donde el fragmento cromosDurante la divisin celular se forma una estructura especial para desplazar a los cromosomas
que recibe el nombre de huso acromtico. Despus de la divisin, el huso se desmonta porque
no es necesario.
11
La mitosis es la divisin de la clula en la que, previa duplicacin del material gentico, cada
clula hija recibe una dotacin completa de cromosomas.
12
Durante la anafase, los centrmeros se dividen, lo que permite que cada una de las cromtidas
idnticas que formaban el par se separen (cromosomas hijos) y se dirijan a los dos polos de la
clula arrastradas por los microtbulos del huso mittico.
10
mico que no posea centrmero o el cromosoma desorientado no podr integrarse a un ncleo por carecer
del elemento indispensable para orientarse en el huso
acromtico.
Luego, en la telofase, los cromosomas normales, as
como los fragmentos que posean centrmeros, dan origen a los ncleos de las clulas hijas. Sin embargo, los
elementos rezagados, que pueden ser fragmentos o cromosomas completos, quedan incluidos en el citoplasma
de las clulas hijas y una proporcin de ellos se transforma en uno o varios ncleos secundarios. Tales ncleos
son mucho ms pequeos que el ncleo principal, de
ah su nombre de microncleos (Figura 9, Figura 10). Si
el compuesto estudiado es un clastgeno, se formarn
microncleos pequeos, pero si es un aneuploidgeno,
lo que se observar ser la formacin de microncleos
grandes (Terradaset. al. 2010).
15
16
17
4.1
Reactivos y material
Cantidad
100 mL
50 mL
Etanol 70%
500 mL
Material
Bistur o gillete
Cantidad
3u
24 u*
Cubreobjetos
1 caja 100 u
1u
Jarra plstica de 1 L
1u
1u
Marcador indeleble 1 u
Masking de 1 pulgada
1u
1u
1u
1u
100 mL
Portaobjetos
1 caja 50 u
1 000 mL
Probeta de 100 mL
3u
H2O destilada
1 000 mL
Recipiente plstico de 5 L
1 u*
50 mL
1u
40 u
7u
10 u
1u
Colorante de color rojo violceo, extrado de lquenes y que tie con preferencia ncleos y cromosomas.
13
18
4.2
Procedimiento de muestreo
19
h) Los frascos deben ser llenados completamente y de manera rpida con la muestra y
luego resguardadas fuera del alcance de la
luz solar.
- Tiempo de bombeo,
- Tipo de bomba,
20
- Dilucin al 50%,
- Dilucin al 25%,
- Dilucin al 12,55%, y
- Dilucin al 6,25%.
21
4.3
Medicin de microncleos
22
23
24
25
4.4
Datos y clculos
26
x 100
Para el anlisis estadstico se puede hacer uso de Microsoft Excel y determinar medias y error estndar en cada
grupo experimental, as como el clculo de la varianza
de todos los tratamientos. Asimismo, se puede utilizar el
t-test Dunnett, que se aplica para determinar la diferencia significativa entre medias del control y los grupos de
tratamiento (Duan et al, 1999).
Interpretacin de
27
4.5
Resultados
hay un aumento significativo en la presencia de microncleos. Es decir, si en el agua evaluada el nmero de microncleos formados es menor al doble de microncleos
formados en el grupo de control negativo o blanco, se
dir que el agua no tiene riesgos genotxicos.
28
29
Glosario
Mutagenicidad: Propiedad de agentes fsicos o qumicos de inducir cambios en el material gentico que se
transmiten durante la divisin celular.
Clastognicos: Agente que causa rotura de los cromosomas y/o consecuentemente, ganancia, prdida o reordenamiento de los fragmentos cromosmicos
Genotxico: Txico o daino para el ADN. Las sustancias genotxicas pueden unirse directamente al ADN
o actuar indirectamente mediante la afectacin de las
enzimas involucradas en la replicacin del ADN y causando, en consecuencia, mutaciones que pueden o no
desembocar en un cncer. Las sustancias genotxicas no
son necesariamente cancergenas, pero la mayor parte
de los cancergenos son genotxicos.
Bibliografa consultada
Ascarrunz M, Rodrigo G. 2010 Manual de Gentica Toxicolgica. 1ra ed. Universidad Mayor de San Andrs La
Paz-Bolivia editor: Mercedes Morales. 252 pp. Captulo
8. La gentica toxicolgica desde el punto de vista analtico. 213-245
Duan CQ., Hu B., Jiang XH., Wen CH., Wang Z., Wang
YX. 1999 Genotoxicity of water samples from Dianchilake detected by the Vicia faba micronucleus test. Mutation Research 426:121-125
Fenech M. 2000 The in vitro micronucleus technique.
Mutation Research 455:81-95
Fiskesjo G. 1985 The Allium test as a standard in environmental monitoring. Hereditas 102:99-112
Kong ZM., Zang Y., Wu QL. 1998 Monitoring the genotoxicity of Lake Taihu, using two kinds of mi-cronucleus
tests. Environmental Pollution 99:279-283
31
32
33