CINTICA

ENZIMTICA

Dra. Maria Mercedes Sobern Lozano

Concepto - Cintica

Estudia:
Las velocidades de
reaccin
enzimtica.
Mecanismos de
reaccin de
enzimas.

Cmo se visualiza la accin

cataltica de una enzima ?
Concentracin de sustrato que
desaparece por unidad de tiempo.

Concentracin de producto que se forma

por unidad de tiempo.

Cmo se expresa la velocidad

enzimtica?

Unidad de actividad enzimtica (U)

Cantidad de enzima que cataliza la
conversin de 1 mol de sustrato en un
minuto.

Sistema Internacional de Unidades (SI)

katal (kat): Cantidad de enzima que
transforma 1 mol de sustrato por segundo.

1 katal = 60 x 106 U.
Esta unidad es muy grande, por lo que se
utilizan submltiplos como
el microkatal (kat, 10-6 kat), o
el nanokatal (nkat, 10-9 kat).

Hiptesis que intentaron explicar el

mecanismo de accin de las enzimas
(1) Condicin equilibrio rpido

Leonor Michaelis y Maud Menten (1913)

Hiptesis que intentaron explicar el

mecanismo de accin de las enzimas

(2) Condicin estado estacionario

George E. Briggs y
John B. S Haldane
(1925)
John B. S Haldane

Mecanismo cintico
E+S

k1

E-S

kcat

E+P

k-1
k1, k-1 y kcat constantes cinticas
individuales de cada proceso.
Tambin denominadas constantes
microscpicas de velocidad.

Hiptesis Michaelis-Menten
(Condicin equilibrio rpido)
k1

E +S

k-1

kcat

E-S

P + E (1)

Deduccin Ec. (1):

- Complejo E-S piedra angular de la cintica

enzimtica.
- Complejo E-S en equilibrio rpido con
respecto a E y S (kcat < k -1)

Hiptesis Michaelis-Menten
(Condicin equilibrio rpido)
k1

E +S

k-1

kcat

E-S

P + E

Velocidad de reaccin (v)

v = kcat E-S
kcat = constante cataltica de velocidad

k1

E +S

k-1

kcat

E-S

P + E

(1)

Pasos para resolver esquema (1):

- Constante de disociacin aparente (Ks):

[E][S]
k-1
Ks = ---------- = ------[ES]
k1

Velocidad de reaccin (2)

v = kcat [E-S]

Et = E + [E-S],

Conc. de S >> Et

Dividiendo ec (2) entre ec (3) (Et) :

v
kcat [E-S]
---- = -------------- (4)
Et [E] + [E-S]

(3)

Hiptesis Michaelis-Menten
Pero, kcat [Et] = Vmax
Ks = Km
Reordenando la ec. 4, se llega a la ec.

Michaelis- Menten:
v

----------- = -----------

Vmax

Ks + S

S Vmax

v = -------------Ks + S

Limitaciones de la Ec.
Michaelis-Menten
Vlida mayormente para sistemas
enzimticos uni-reactivos sencillos.

Para reacciones enzimticas con ms de un

complejo E-S, el significado REAL y EXACTO
de Km y Vmax cambia.

E +S

k1

k-1

(E-S

k2
k-2

E-S1

k3
k-3

E-P)

kcat

P + E

Hiptesis de Briggs-Haldane
(Condicin estado estacionario)

E +S

k1
k-1

(E-S1

k2
k-2

E-S2

k3
k-3

kcat

E-P)

E-S
Como siempre,
v = kcat [E-S]

P+ E

k1

E +S

k-1

kcat

E-S

P + E

E-S permanece constante:

Vel. de formacin E-S = Vel. de desaparicin E-S
k1[E][S] = k-1[E-S] + kcat[E-S]
Reordenando:
k1[E][S] = (k-1 + kcat) [E-S]

(5)

Despejando E-S de ec (5):

E S
E-S = -----------------k-1 + k cat /k1
k-1

------------

k1

kcat

------------

k1

kcat

Ks + -----------k1

Km = Ks + kcat/k1

Km > Ks

Hiptesis de Briggs-Haldane
(Condicin estado estacionario)

----------- = -----------

Vmax

Km + S

S Vmax

v = -------------Km + S

E+S

k1

kcat
E-S P + E

k-1

Cuando kcat<<k-1, Km = Ks
Cuando [S] >> Km v = kcat Et

En la prctica...... Grfica
Michaelis-Menten
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Grfica de Lineweaver-Burk
1/v = Km/Vm x 1/[S] + 1/Vm
Pendiente de lnea

Por qu determinar Km?

Establece el valor aprox. de
concentracin de sustrato en la clula.
Identificacin de isoenzimas

Regulacin a nivel de enzimas por

cambios en Km, inducidos por ligandos.

Por qu determinar Km?

Conociendo Km podemos in vitro
trabajar la enzima en condiciones de
[S] > Km
Cuando [S] >100 Km Vmax, valor
que permite conocer la [E]total presente
en el sistema de reaccin.

Por qu determinar Km?

Si kcat << k-1, Km = Ks
Slo en esas condiciones Km mide GRADO
DE AFINIDAD de la enzima por el sustrato.

A mayor valor de Km, la afinidad de

la enzima por el sustrato es baja.

Glucosa
Hexoquinasa
Glucoquinasa

ATP Km hexoquinasa = 0.2 mM

Km glucoquinasa = 10 mM
ADP

Glucosa-6-P

[glucosa] sangre = 4 - 5 mM
[glucosa]intracelular = 0.2 2 mM
Despus de ingerir dieta rica en carbohidrato, [glucosa]
sangre, es alta.
Glucosa es transportada al hgado para ser convertida en
Glu-6-P.

Puede el significado de Km explicar el

tratamiento con etanol para casos de
intoxicacin con metanol?

Etanol y metanol compiten por la

enzima alcohol deshidrogenasa.

Km Et < Km Met
Esta enzima prefiere metabolizar el
etanol (afinidad 20 veces mayor que
metanol)

Puede el significado de Km explicar el

tratamiento con etanol para casos de
intoxicacin con metanol?
Tratamiento:
Administrar etanol para saturar la alcohol
deshidrogenasa y evitar que sta degrade al
metanol

Por qu determinar Vm?

Centros activos de enzima, saturados con
sustrato ( [S]>>Km).
Vara de una enzima a otra.
Si mecanismo de reaccin es de dos o
ms pasos, Vm ser SIEMPRE equivalente a
kcat[Et].
Permite calcular la [E]total presente en la
reaccin.

Significado de kcat
Constante de velocidad de primer
orden.
Denominada tambin nmero de
recambios (turnover number),
cantidad mxima de molculas (S, P)
transformadas / tiempo, por molcula
de enzima o por nmero de sitios
activos.

Valor kcat de Algunas Enzimas

Enzima
Catalasa

Sustrato
H2O2

Kcat (s-1)
40 000 000

Anhidrasa carbnica

HCO3 -

400 000

Acetilcolinoesterasa

Acetilcolina

14 000

Benzilpenicilina

2 000

-Lactamasa
Fumarasa

Fumarato

800

Eficiencia cataltica de algunas enzimas

Enzima

Sustrato

Kcat/Km
(M-1 S-1)

Acetilcolinoesterasa

Acetilcolina

1.6 x 108

CO2

8.3 x 107

Anhidrasa carbnica

HCO3-

1.5 x 107

Catalasa

H2O2

4 x 107

Crotonasa

Crotonil-CoA

2.8 x 108

Fumarato

1.6 x 108

Malato

3.6 x 107

Fumarasa

Caractersticas
Disminuir o bloquear la velocidad de
reaccin, unindose a la enzima.
Son especficos.
Alteran grupos importantes para la
funcin cataltica, o
Alteran ligeramente conformacin de
la enzima sin llegar a desnaturalizarla.

Aplicaciones
Identifica aminocidos presentes en el
sitio cataltico de la enzima y su
probable rol en catlisis.

Fundamento de frmacos antivricos,

antibacterianos y antitumorales

Tipos Inhibicin
1. Inhibicin Permanente
Unin irreversible por enlaces covalentes,
provocando modificacin qumica de
grupos en centros de fijacin y sitio
activo de la enzima.

Inhibicin permanente del gas sarn

Gas sarn
Compuesto organofosforado
que inhibe la actividad de
ACETILCOLINESTERASA

Los organofosforados forman un ster estable con el OH

de la SER del centro activo de la enzima y la reaccin no
prospera; la enzima queda bloqueada e inactiva.

2. Inhibicin reversible
Tipos:
Competitiva
Acompetitiva
No competitiva

Inhibicin Competitiva
I y S compiten por sitio
cataltico.
Anlogo o derivado
no metabolizable del
verdadero sustrato.
Acta slo
aumentando
el Km (Km app) para S.

Vm permanece
inalterable

Ks

k3

E + S E-S E + P
+
I
kI
EI

Fluorouracil

FdUMP

UMP

5, 10-metilen
tetrahidrofolato

dTMP
Timidilato
sintasa

DNA

7, 8
dihidrofolato

cido flico

NADPH + H+
Serina hidroximetil
transferasa

Glicina

Dihidrofolato
reductasa

Tetrahidrofolato
Serina

Metotrexato
NADP+
Inhibicin

Accin Bioqumica de Agentes Quimioteraputicos

8 7

Las posiciones 7 y 8 llevan

hidrgeno formando el
DIHIDROFOLATO

1968 Introduccin en mercado de BACTRIM (combinacin

de trimetoprim-sulfametoxasol).
Trimetoprim (TMP) y
sulfametoxazol (SMX) actan de
forma sinrgica.
Trimetoprim inhibe de forma
competitiva la dihidrofolato
reductasa.

TMP-SMX inhibe 50,000 veces

ms la dihidrofolato reductasa
bacteriana que la de los
mamferos

Inhibicin No Competitiva
I se une tanto a la enzima
Ks
k3
como al complejo E-S.
E + S E-S E + P
Km no se altera (KI = Km ).
+
+
Vm vara. Disminuye a
medida que aumenta [I].
I
I
I, podra impedir la

conformacin de centro
EI + S ESI
cataltico.
Ks
No puede ser superada
aumentando [S].

Inhibicin Acompetitiva
I slo se une al
complejo E-S.
I no se une al centro
activo sino a cualquier
otro sitio.
No se puede superar
la inhibicin
aumentando la [S].
Km es ms pequeo
(aparente afinidad)

Ks
k3
E + S E-S E + P
+
I
kI
ESI

Entendieron
la cintica de
las enzimas?