UNIVERSIDADE DE SO PAULO

ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA LUIZ DE QUEIROZ

Departamento de Cincias Biolgicas

BIOQUMICA LCB 208

ROTEIRO DE AULAS PRTICAS

DOCENTES:
Prof. Dr. Daniel Sherer de Moura
Profa. Dra. Helaine Carrer
Prof. Dr. Luiz Antnio Gallo
Prof. Dr. Luiz Carlos Basso
Tcnica Responsvel: Aline Borges

Piracicaba - SP
2015

SUMRIO

AULAS

pg

1. Colorimetria e Espectrofotometria

03

2. Determinao de Lactose no leite

07

3. Cromatografia em Papel de Filtro

11

4. Determinao do Teor de Casena no leite (Reao do Biureto)

16

5. Determinao da Constante de Michaelis (Km) e da Velocidade mxima (Vm)

para a Invertase de Levedura
19
6. Reao de Hill (Fotlise da gua)

23

COLORIMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA
1. OBJETIVOS
Dosagens de espcies qumicas mediante a absoro de luz.
2. FUNDAMENTOS DO MTODO
A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento
analtico atravs do qual se determina a concentrao de espcies qumicas mediante a
absoro de energia radiante (luz).
A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatria,
caracterizada pelos diversos comprimentos de onda (, expressos em m ou nm) (Figura 1) e
que apresenta a propriedade de interagir com a matria, sendo que parte de sua energia
absorvida por eltrons da eletrosfera dos tomos constituintes das molculas.

Figura 1. Espectro de absoro de luz em diversos comprimentos de onda ().

Uma soluo quando iluminada por luz branca, apresenta uma cor que resultante da
absoro relativa dos vrios comprimentos de onda que a compem, que pode ser analisados
por um espectrofotmetro (Figura 2). Esta absoro, em cada comprimento de onda, depende
da natureza da substncia, de sua concentrao e da espessura da mesma que atravessada pela
luz.

Figura 2. Componentes e funcionamento de um espectrofotmetro para anlise da absoro de um determinado

comprimento de onda especfico de uma soluo.

A Lei de Lambert-Beer: a absorbncia proporcional concentrao da espcie

qumica absorvente, sendo constante o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo
feixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relao linear entre absorbncia ou densidade
tica e concentrao, e de uma relao logartmica entre transmitncia e concentrao.

c = concentrao da espcie qumica absorvente

b = espessura atravessada pelo feixe luminoso
Io= intensidade de luz incidente
I = intensidade de luz emergente (transmitida)
I < Io
Io
Ab = D.O. = K.b.c =

log

(absorbncia ou densidade tica)

I
A Transmitncia ou Transmisso (T%) corresponde a:
I
Io
I
T = 100 x
Io
100
T
I

como,

Io
, temos que :

Io

Io

100
=

I
logo,

100

portanto, log

100

log
T

Ab = log 100 - log T

Ab = 2 log T

3. MATERIAL

Espectrofotmetro com cubetas

Micropipetas de 1 mL
Estante com tubos de ensaio
Alaranjado de Metila (10g/mL)
Azul de Bromofenol (10g/mL)

4. PRTICA
A. Coleta de dados para a construo do espectro de absoro:
Alaranjado de Metila ou do Azul de Bromofenol (um composto para cada grupo).
Usando gua destilada como referncia, efetuar as leituras de Absorbncia (ou D.O.) do
Alaranjado de Metila (nos seguintes comprimentos de onda: 400, 420, 440, 460, 480, 500,
520, 550, 600, 650 e 700 nm) ou Azul de Bromofenol (nos seguintes comprimentos de onda:
400, 440, 490, 520, 540, 565, 580, 590, 620, 660 e 700 nm)
Tabela 1. Dados de Transmitncia e Absorbncia do

Corante:

corante analisado pelo grupo

Alaranjado de Metila
(10 g/mL)

T
Ab
(nM)
(%)
(2-logT)
400
440
460
480
500
520
550
600
700

Azul de Bromofenol
(10 g/mL)

T
Ab
(nM)
(%)
(2-logT)
400
490
520
540
560
580
590
620
700

Grfico 1. Espectro de absoro do corante

analisado.

B. Demonstrao da Lei de Lambert-Beer:

Preparar 6 tubos de ensaio (enumerados de 0 a 5) conforme o quadro que se segue. O
tubo n 6 estar contendo soluo do corante com concentrao desconhecida, a qual dever ser
determinada atravs da Lei de Lambert-Beer.
o

Tabela 2. Preparo dos padres de corante e dados de Transmitncia e Absorbncia.

Tubo
(No)
0
1
2
3
4
5
6

gua
Corante*
(mL)
(mL)
5
0
4
1
3
2
2
3
1
4
0
5
5 mL da soluo de
concentrao desconhecida

[Corante]
(g/mL)

Transmitncia
(T%)**

Absorbncia
(Abs Ou D.O.)

Encontrar no grfico
X =

* Alaranjado de Metila ou Azul de Bromofenol na concentrao de 10 g/mL.

** Leituras efetuadas no comprimento de onda que corresponde ao pico de absoro do composto ( mximo).

Questionrio:

1) Construir os grficos do espectro de absoro do outro corante avaliado (Azul de

Bromofenol ou Alaranjado de Metila). Utilizar os dados obtidos em aula e do grupo ao lado
da bancada.
2) Explicar a importncia de se obter este o pico de absoro de um composto qumico para
quantificao por espectrofotometria.
3) Construir o grfico com os dados da Tabela da 2 Etapa da aula prtica (observado pelo seu
grupo) utilizando papel milimetrado. Com o grfico, considere que foram testadas em aula
mais trs solues de concentraes desconhecidas do corante analisado e foram obtidos os
seguintes valores de Transmitncia (Tabela abaixo). Defina as concentraes desconhecidas
e indicar qual das amostras tem maior concentrao de corante. (Indicar no Grfico, no eixo
x, os pontos X, Y e Z).

Tubos
6
7
8

Corante
gua destilada
(mL)
(mL)
5 mL de soluo X de corante
5 mL de soluo Y de corante
5 mL de soluo Z de corante

T% no max.

Ab. max.

Conc. Final
(g/mL)

32,7
34,5
50,4

DETERMINAO DE LACTOSE NO LEITE

(MTODO DE SOMOGY & NELSON)
1. OBJETIVO
Determinar a concentrao de lactose (acar redutor) no leite conservado em geladeira e
mantido temperatura ambiente empregando o mtodo de Somogyi &Nelson.
2. FUNDAMENTOS DO MTODO
Carboidratos que apresentam em sua estrutura molecular os grupos aldedo ou cetona
livres (no carbono 1), possuem poder redutor e so por isso denominados aucares redutores.
Geralmente, estes acares so monossacardeos ou dissacardeos que podem ser oxidados por
agentes oxidantes relativamente suaves, tais como os ons frricos (Fe3+) e cprico (Cu2+). Estes
ons, por sua vez, so reduzidos pela ao dos acares redutores (agentes redutores). No
acar, o carbono do grupo carbonila oxidado a carboxila. possvel determinar a
concentrao de um acar redutor pela medida da quantidade de agente oxidante que
reduzido pela soluo desse mesmo acar.
A lactose (Figura 1A) o principal carboidrato do leite, produzida pela glndula
mamria, sendo ainda a principal fonte de energia dos recm nascidos. Alm disso, a lactose
um dissacardeo redutor, que reduz o on cprico do Reativo de Somogyi a xido cuproso, em
meio alcalino e a quente. Em seguida, o xido cuproso reage com o nion arseno-molibdato do
Reativo de Nelson produzindo um composto de colorao azul - xido de molibdnio, Mo2O3,
com mx.= 540 nm (Figura 1B).
Dentro de certos limites, a intensidade da colorao azul diretamente proporcional
quantidade de lactose no leite. Essa intensidade de colorao pode ser medida utilizando-se um
espectrofotmetro, que detecta a absoro de luz pelo xido de molibdnio.

Figura 1. (A) Estrutura molecular do dissacardeo lactose (-galactose 1,4 -glicose), evidenciando o
carbono 1 contendo o grupo aldedo da glicose, envolvido em ligao hemiacetal (regio redutora). (B)
Reaes envolvidas no mtodo de Somogyi & Nelson, mostrando a formao do xido de molibdnio,
Mo2O3, um composto de colorao azul, com mx.= 540 nm.

Antes da reao quantitativa, a amostra de leite deve ser desproteinizada e clarificada,

mediante precipitao de interferentes com Ba(OH)2 e ZnSO4.

3. MATERIAL

Espectrofotmetro
Centrfuga de mesa
Banho-maria (ebulio)
Balo volumtrico de 100 mL
Estante com 8 tubos de ensaio e 2 tubos de centrfuga
Micropipetas de 1mL
Hidrxido de brio 0,3N
Sulfato de zinco 5%
Reativo de Somogyi: dissolver 28 gramas de fosfato de sdio dibsico ou monocido e
40 gramas de tartarato duplo de sdio e potssio em 700 ml de gua. Adicionar 100 ml de
NaOH 1N. Gotejar, sob agitao constante, 80 ml de CuSO4.5H2O a 10%. Adicionar 180
gramas de sulfato de sdio anidro e completar a 1 litro. Deixar em repouso por 2 dias e
filtrar. Guardar em frasco escuro a cerca de 37C. Filtrar antes do uso.

Reativo de Nelson: dissolver 50 gramas de molibdato de amnio em 900 ml de gua

destilada. Cuidadosamente, adicionar 52 ml de cido sulfrico concentrado. Adicionar 3
gramas de arseniato dibsico de sdio dissolvido em 50 ml de gua. Completar para 1
litro e manter em repouso em frasco escuro durante 2 dias antes de uso e filtrar.
Padro de lactose: dissolver 0,1 gramas de lactose pura em um litro de gua. Esta soluo
conter 100 g/mL.
4. PRTICA
a) Preparar 5 tubos, adicionando lactose (100 g/mL) e gua destilada conforme quadro
abaixo. Em seguida, acrescentar em cada tubo 1 mL do Reativo de Somogyi e agitar.
Deixar em banho-maria fervente por 5 minutos. Esfriar em gua corrente.
b) Adicionar 1 ml do Reativo de Nelson e agitar. Completar o volume a 10 mL,
adicionando 7 ml de gua destilada.
c) Fazer leitura em espectrofotmetro em 540 nm. Preencher a tabela abaixo:
Tabela 1. Preparo dos padres de Lactose e obteno dos dados de Transmitncia, Absorbncia e
Absorbncia.
GUA
(ml)

0
1
2
3

1,0
0,7
0,4
0,1

Lactose
100
g/mL
(mL)
0
0,3
0,6
0,9

1,0

[Lactose]
(g/mL)

Reat.
Somogy
(mL)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0

Banho
Maria
Incubar a 100C
por 5 min

TUBO
(No)

Reat.
Nelson
(mL)

Compl.
Vol.
(10 mL)

1,0
1,0
1,0
1,0

7 mL
7 mL
7 mL
7 mL

1,0

7 mL

Transmit.
(T%)

Absorb.
nm

Absorb.
nm

A. Preparo das Amostras de Leite

Cada grupo receber 2 amostras de leite: uma armazenada em geladeira e outra mantida
temperatura ambiente.
a) Transferir 2 mL da amostra de leite para balo volumtrico de 100 mL e completar o
volume com gua destilada. Agitar bem.
b) Transferir 1 mL (com pipeta volumtrica) da soluo diluda de leite para tubo de
centrfuga. Efetuar a remoo dos interferentes pela adio de 1,0 mL de ZnS0 4 a 5% (agitar) e
acrescentar 1,0 mL de hidrxido de brio 0,3N. Agitar. Completar a 10 mL adicionado 7 mL de
gua destilada. Agitar. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos (3.000 rpm).
B. Determinao do Teor de Lactose no Leite
Determinar os teores de lactose nas duas amostras de leite, preparando as amostras como
segue na tabela abaixo:
Reat.
Somogy
(mL)

Leite
Ambiente

1,0

1,0

Leite
Geladeira

1,0

1,0

Banho
Maria
(min.)
5 min100C por

Volume
(mL)

Tubo

Reat.
Nelson
(mL)

gua
destilada
(mL)

1,0

7 mL

1,0

7 mL

Transmit.
(T%)

Absorb.

nm

Absorb.
nm

Grfico 2. Correlao dos valores de Absorbncia (Eixo Y) e Concentrao de

Lactose (Eixo X).

10

[lactose]
(g/mL)

QUESTIONRIO:

1) Determine:
A) Concentrao de Lactose no Leite Ambiente................... (g/mL)
Leite Geladeira................ (g/mL)
B) Teor de lactose no Leite ambiente: .....................% (m/v)
Leite geladeira: ......................% (m/v)
Demonstrar clculo:

2) Por que a lactose considerada um acar redutor?

3) Por que necessrio calcular o Absorbncia para cada tubo?
4) Comparar os teores de lactose no leite ambiente e geladeira.

11

CROMATOGRAFIA EM PAPEL DE FILTRO

1. OBJETIVO
Identificao de aminocidos numa soluo desconhecida por cromatografia em papel
filtro.
2. FUNDAMENTOS DO MTODO
Nesta aula prtica a tcnica de cromatografa em papel filtro ser utilizada para anlise
de aminocidos em soluo. De um modo geral, o termo cromatografa pode ser definido como
um procedimento bioqumico em que uma mistura de substncias separada pela carga,
tamanho, solubilidade ou outra propriedade de seus componentes, atravs de sua partio entre
uma fase mvel e uma fase estacionria.
O mtodo de cromatografia em papel filtro ser utilizado nesta aula para separao e
identificao de aminocidos. Para entendermos tais fundamentos devemos considerar a
solubilidade dos aminocidos num determinado solvente (variando em funo da temperatura)
e a propriedade dos aminocidos de se tornarem coloridos aps reagirem com substncias
especficas. Dependendo da estrutura molecular da cadeia lateral dos aminocidos, estes
apresentaro diferentes solubilidades no solvente empregado, mantida a temperatura constante.
A capacidade de um determinado solvente (contido num recipiente) subir contra a fora da
gravidade atravs de um papel absorvente muito importante nesta tcnica de cromatografia
em papel filtro, como mostrado na Figura 1. Conforme o solvente sobe pelo papel absorvente,
ele pode levar consigo diferentes aminocidos a diferentes distncias separando-os a partir de
uma mistura inicial de aminocidos.

Figura 1. A migrao da fase mvel (solvente) pelo papel filtro (fase estacionria) de modo ascendente
(representado por setas vermelhas) importante na tcnica cromatogrfica. Solues de aminocidos
colocadas sobre a linha bsica atravs de micropipetas sero transportadas pelo solvente a diferentes
alturas. Aps pulverizao com ninhidrina, o papel filtro apresentar manchas coloridas em diferentes
alturas, que representam os aminocidos separados.

A partir da distncia percorrida pelos aminocidos desde a linha bsica at o centro da

mancha formada aps a pulverizao com ninhidrina, podemos calcular o chamado fator de
reteno (Rf). Este pode ser definido como a relao existente entre a distncia percorrida pelo
soluto aminocido (at o centro da mancha), pela distncia total percorrida pelo solvente
(Figura 2). O valor de Rf revela a solubilidade de cada aminocido no solvente empregado.
12

Figura 2. Solues de aminocidos a, b e c foram colocadas sobre a linha bsica e percorreram as distncias a, b
e c, respectivamente. A distncia d refere-se distncia percorrida pelo solvente. Assim, os fatores de
reteno para cada soluo de aminocido so: Rfa=a/d; Rfb=b/d; Rfc=c/d.

A. Teoria sobre Rf (Equao de Martin e Synge)

Chama-se de Rf a relao:

onde: a = coeficiente de partio

As = rea ocupada pelo soluto na fase estacionria
Al = rea ocupada pelo soluto na fase mvel

3. MATERIAL

Papel Filtro (Whatmann);

Cmara cromatogrfica;
Solvente (butanol, cido actico e gua na proporo de 4:1:1);
Soluo de aminocidos padro (arginina, leucina e prolina);
Soluo desconhecida (problema);
Secador de cabelo;
Lpis;
Soluo alcolica de ninhidrina a 0,3%;
Estufa.

13

4. PRTICA
1) Montar o cromatograma, ou seja, papel filtro (Whatmann) devidamente tratado
(adaptado ao tamanho da cmara cromatogrfica) constituindo a fase estacionria.
2) Traar uma linha horizontal a dois centmetros do bordo inferior do papel (linha bsica)
sobre a qual, posteriormente, sero distribudas manchas de solutos (aminocidos).
3) Manter os cromatogramas dentro de recipientes hermeticamente fechados, denominados
cmaras cromatogrficas (Figura 3).
4) Adicionar o solvente especfico para cromatografia de aminocidos (butanol, cido
actico e gua na proporo de 4:1:1), a uma altura menor do que dois centmetros.
5) Pipetar sobre a linha bsica do cromatograma as solues de aminocidos padro
(arginina, leucina e prolina) e a soluo
problema (contendo uma mistura de
aminocidos desconhecidos) (Figura 3).

Figura 3. Distribuio das solues de aminocidos no

cromatograma sobre a linha bsica (dois
centmetros acima do bordo inferior do papel).

Arg

Leu

Pro

Mistura

6) Secar o cromatograma atravs da utilizao de um secador de cabelo antes de ser

colocado na cmara cromatogrfica. Este processo permite que o excesso das solues
de aminocidos colocadas no papel seja removido.
7) Manter o cromatograma por 15 minutos dentro da cmara cromatogrfica, para que o
solvente suba contra a ao da gravidade.
8) Retirar o cromatograma da cmara e marcar com um lpis a altura que o solvente
atingiu;
9) Secar o cromatograma com um secador de cabelo por 5 min para a remoo do
solvente;
10) Pulverizar o papel com o reagente revelador ninhidrina a 0,3% em soluo alcolica;
11) Levar o cromatograma a uma estufa (temperatura de 60-65C) por 5 minutos, at o
aparecimento das manchas coloridas, que representam os aminocidos separados.
12) Calcular os fatores de reteno (Rf) para cada aminocido separado no papel filtro.
Cada aminocido apresenta um Rf especfico para um determinado solvente numa dada
temperatura. Como, cada aminocido se desloca a uma determinada distncia no
cromatograma, baseado em sua solubilidade no solvente. A determinao da
solubilidade de um determinado aminocido depende diretamente da estrutura qumica
de sua cadeia lateral (R).

14

QUESTIONRIO:

1) Em relao Aula Prtica, responder:

A) Indicar ao lado o posicionamento dos
aminocidos aps a cromatografia.
B) Qual a colorao dos aminocidos estudados em
classe na reao com a ninidrina? Por que ocorre
diferena na colorao da prolina?

Arg

Leu

Pro

Mistura

C) No sistema cromatogrfico em sala, (fase mvel: butanol: cido actico: gua; fase
estacionria: celulose), qual o motivo de um aminocido possuir maior Rf ou menor
Rf?

15

DETERMINAO DO TEOR DE CASENA NO LEITE

(PELA REAO DO BIURETO)

1. OBJETIVO
Quantificar a concentrao da protena do leite utilizando Reativo de Biureto.
2. FUNDAMENTOS DO MTODO
A importncia em se estudar a protena casena presente no leite, se relaciona com o fato
desta ser uma protena bastante completa (alto valor biolgico), pois ela possui todos os
aminocidos essenciais (aqueles que sua sntese no organismo inadequada para satisfazer as
necessidades metablicas e que devem ser fornecidos como parte da dieta). Os aminocidos
essenciais para os seres humanos so: treonina, triptofano, histidina, lisina, leucina, isoleucina,
metionina, valina e fenilalanina. Ausncia ou inadequada ingesto de alguns desses
aminocidos resulta em balano nitrogenado negativo, perda de peso, crescimento menor em
crianas e pr-escolares e sintomatologia clnica.
A metodologia da Reao do Biureto, que utilizada para a caracterizao de protenas,
pode ser empregada para a quantificao das mesmas mediante a colorimetria. O mtodo se
baseia no fato de que as protenas (nesse caso, a casena) formam um complexo violeta com o
on cprico (Cu2+) em meio alcalino, e tal complexo apresenta um pico de absoro a 540 nm.
A colorao violeta apresentada pelo complexo proporcional concentrao das protenas na
amostra (leite). Essa reao positiva para peptdeos constitudos de no mnimo trs
aminocidos; assim, a Reao do Biureto ser negativa para dipeptdeos e aminocidos livres.
Tal complexao tambm ocorre com o Biureto (H2N-CO-NH-CO-NH2), da o nome da reao.
A Figura 1 apresenta a formao do complexo violeta, pela interao do on cprico com duas
cadeias polipeptdicas.

Figura 1. Formao do complexo violeta, pela interao do on cprico com duas cadeias polipeptdicas.

16

3. MATERIAL

Espectrofotmetro (540 nm)

Balo volumtrico com leite diludo (1 mL de leite desnatado e 9 mL de gua
destilada 1:10)

Estante com 6 tubos de ensaio (Reta Padro) e 1 tubo de ensaio para amostra de leite
diludo (1:10)
1 erlenmeyer com gua destilada
1 micropipeta de 1 mL
1 Tubo de centrfuga de 15 mL (Tipo Falcon)
Reagente do Biureto: Pesar 1.5 g de CuSO4.5H2O e 6g de tartarato duplo de sdio e
potssio, dissolv-los em gua destilada completando o volume a aproximadamente 500
ml. Juntar, sob agitao, 300 mL de NaOH 10% e completar a 1 litro.
Padro de Casena (5 mg/mL) - dissolver 2,5g de casena em 500 mL de NaOH 0,1 N.

4.

PRTICA
1. Com a micropipeta transferir 1 ml do leite (1:10) para um tubo de centrfuga (Tipo
Falcon)
2. Em 7 tubos de ensaio, enumerados de 0 a 6, pipetar os componentes conforme o quadro
abaixo.
3. Aps a adio do Reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em repouso por 30
minutos. A colorao prpura formada indicativo da presena de protenas.
4. Fazer leitura de Transmitncia a 540 nm em espectrotofmetro e converter em
Absorbncia com auxlio de tabela (Ab = 2 - log T).
5. Com os dados obtidos dos tubos 0 a 5, obter funo da Reta na anlise de correlao em
planilha eletrnica (Excel), utilizando os valores de Absorbncia (Y) e concentraes
de casena expressas em mg/tubo (X).
6. Calcular a concentrao de casena no leite diludo (1:10) e concentrao de casena no
leite desnatado longa vida em g/100 mL de leite ( % ).

Tubo
(No)

0
1
2
3
4
5

gua
Destilada

Casena
(10 mg/mL)

1,0
0
0,7
0,3
0,4
0,6
0,1
0,9
0
1,0
1 mL leite diludo (1:10)

Casena
(mg/tubo)

Reativo
Biureto

4
4
4
4
4
4

Transmitncia
(%)

Absorb.
540 nm

Absorb.
540 nm
0

17

5. QUESTIONRIO - PROTENA
1) Em relao Aula Prtica, responder:
a) Determinar o valor da concentrao de casena no leite atravs da equao da funo
Reta Padro em planilha eletrnica, dando o resultado em g/100 mL (m/v) (%) de leite.
b) Discutir o valor encontrado em relao ao valor nutricional do leite.
c) O que ocorre com a casena do leite quando o valor de pH fica abaixo de 6,5?
2) Representar a ligao peptdica.
3) O que vem a ser a estrutura primria, secundria, terciria e quaternria de uma protena?
4) Citar os tipos de ligao responsveis pelas estruturas secundria e terciria de uma
protena?
5) O que vem a ser desnaturao de uma protena, e que agentes causam esta desnaturao?
6) Definir protena simples e conjugada. D exemplos.

18

DETERMINAO DA CONSTANTE DE MICHAELIS (Km)

E DA VELOCIDADE MXIMA (Vm) PARA A INVERTASE DE
LEVEDURA
1. OBJETIVO
Determinar os parmetros Km e Vm da enzima invertase utilizando a sacarose como
substrato, mediante o estudo cintico da reao.
2. FUNDAMENTOS DO MTODO
As reaes qumicas conduzidas pelos organismos vivos so, na sua grande maioria,
catalisadas enzimaticamente, tornando a velocidade das mesmas compatveis com as
exigncias metablicas.
A levedura (Saccharomyces cerevisiae), por intermdio da "invertase" hidrolisa a
sacarose resultando numa mistura equimolecular de glicose e frutose (Figura 1), acares esses
que so absorvidos pela clula. A membrana plasmtica impermevel sacarose, e a levedura
acaba excretando a invertase (sendo, pois, uma exoenzima) para a hidrlise ocorrer fora da
clula de levedura.

Figura 1. A molcula de sacarose hidrolisada pela enzima invertase da levedura produzindo acares
redutores (Glicose e Frutose).

No presente experimento a invertase ser obtida de levedura de panificao (fermento

Fleischmann) e adicionada sacarose (acar no redutor), cuja hidrlise resulta na formao
de acares redutores (glicose e frutose) que sero estimados pela Reao de SomogyiNelson.
Para tal se colocar a enzima frente diferentes concentraes de substrato (sacarose),
resultando em diferentes velocidades de reao enzimtica, permitindo, mediante um
tratamento matemtico adequado, determinar graficamente os valores de Km e Vm.

19

3. MATERIAL

Espectrofotmetro
Estante com 8 tubos de ensaio (por grupo)
2 pipetas graduadas de 2 mL (por grupo)
1 pipeta graduada de 1 mL (por grupo)
1 pipeta volumtrica de 1 mL (por grupo)
Centrfuga e banho-maria para dosagem de acares redutores
4 g de fermento prensado tipo Fleischmann
Reagente de Somogyi
Reagente de Nelson
Padro de acar redutor (100 ug de glicose por 2,5 mL)
Substrato (sacarose 12,5 mM = 4,27 g/L)

4. PRTICA

A. Extrao da enzima
Transferir 4 g de fermento de panificao para tubo de centrfuga, adicionar 20 mL de
gua destilada e deixar em estufa a 37C por 30 minutos agitando casualmente. Centrifugar a
1.000 x g por 15 minutos recolhendo o sobrenadante que contm a enzima invertase. Fazer
uma diluio adequado para leitura (1:100; 1:200).

B. Ensaio enzimtico

0
1
2
3
4
5

gua
dest.
(mL)
1,00
0,90
0,80
0,60
0,20
0,00

Sacarose
(mL)
(75 mM)
0,00
0,10
0,20
0,40
0,80
1,00

[S]
mM

Invertase
Diluda
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

1,5 mL de padro contendo 60 g de glicose

Reat.
Somogy
(mL)
1
1
1
1
1
1
1

MININCUBAR A 100C POR 5

Tub
o

MININCUBAR A 37C POR 10

1 ETAPA: A) Ensaio Enzimtico e Reao de Dosagem de Acares Redutores

Reat.
Nelson
(mL)
1
1
1
1
1
1

gua
dest.
(mL)
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5

4,5

T (%)
=530nm

Abs
=530nm

2 ETAPA: Clculo do 1/v e 1/[S]

Tubo
(No)
0
1
2
3
4
5
6

[S]*
mM

60 ug de glicose

1
[S]
mM
-

1
V
(ug AR/h)
-

Abs.
530 nm

V
(ug AR/10min)

V**
(ug AR/h)

*[S] = Concentrao de Substrato (sacarose) no meio de reao enzimtica expressa em milimolaridade (mM);
**V = Velocidade de Reao Enzimtica expressa em g (micrograma) de glicose (acar redutor) formado por hora.

3 ETAPA: Obter os Grficos abaixo, indicando os Valores de Vm e Km da Invertase

20

Figura 1. Efeito da concentrao do substrato

sobre a velocidade da reao.

Figura 2. Grfico representando a recproca da

hiprbole.

Reao para dosagem de acares redutores

To logo termine o perodo de incubao acrescentar 1 mL do Reativo de Somogy (a
reao enzimtica paralisada pela desnaturao da invertase, quer pela ao do Cu ++ ou pela
alcalinidade do reagente).
Ferver os tubos em banho-maria por 10 minutos, resfri-los e juntar 1 mL do Reativo
de Nelson. AGITAR BEM OS TUBOS.
Em seguida, completar o volume a 10 mL (adicionando 5,5 mL de gua destilada),
agitar novamente a fazer leitura a 530 nm.

C. Coletar os dados, organizando-os conforme o quadro que se segue.

TUBO
(NO)

T%
530 nm

Abs. (2-logT)
530 nm

0
1
2
3
4
5
6

Abs.
530 nm

[S]*

V**

1
[S]

1
V

* [S] = concentrao de substrato (sacarose) no meio de reao enzimtica expressa em milimolaridade mM.
** V = velocidade de reao enzimtica expressa em g (micrograma) de glicose (acar redutor) formado por
hora.

5. QUESTIONRIO - ENZIMAS
21

1) Em relao Aula Prtica, responder:

a) Completar a Tabela acima e utilizar os valores de Abs. para calcular a velocidade da
reao enzimtica em ug de acar redutor (AR) por hora, completando a Tabela
abaixo:
Tubo
(No)

[S]
mM

0
1
2
3
4
5
6

0
2
4
6
8
10
100 ug de
glicose

Abs.
530 nm

V
(ug AR/15min)

V
(ug AR/h)

1
[S]
mM

1
V
(ug AR/h)

b) Calcular as velocidades de reao (V) para cada tubo, utilizando os dados de 1/V (eixo
Y) em funo de 1/[S] (eixo X), obtendo a equao da Reta Padro em planilha
eletrnica.
c) Com base na equao inversa da equao de Michaelis-Mentes, determinar
analiticamente os valores de Km e Vmax e discutir os seus significados bioqumicos.
2) Qual o conceito de sitio ativo?
3) O que vem a ser velocidade de uma reao enzimtica?
4) Qual a explicao de Michaelis-Menten para o modo de ao de uma enzima?
5) Escreva graficamente a comparao entre as energias de ativao de uma reao
catalisada e de uma reao no catalisada.
6) A aldolase apresenta K-equilibrio 9 x 10 4. Porm na clula a reao se desloca no sentido
da degradao da frutose. Por qu?
7) Que vem a ser inibidor competitivo e no competitivo?
8) O que uma enzima alostrica?
9) Qual o efeito da temperatura e do pH em uma reao enzimtica?
10) O que cofator enzimtico?
11) O que so coenzimas? D exemplos.

22

REAO DE HILL (FOTLISE DA GUA)

1. OBJETIVO
Avaliar a habilidade metablica do cloroplasto de promover a fotlise da gua, o
primeiro passo na sequncia de reaes da fotossntese.
2. FUNDAMENTOS DO MTODO
O processo fotossinttico, que ocorre no interior do cloroplasto, compreende 2 etapas:
a) Fase luminosa: dependente de luz, ocorrendo a fotlise da gua acoplada com as
produes de NADPH + H+ (fotorreduo) e de ATP (fotofosforilao), conforme a equao
abaixo.
luz
NADP+ + ADP + Pi + H20

NADPH + H+ + ATP +O2

cloroplastos

b) Fase escura: no depende de luz e corresponde reduo do CO2 ao nvel de

carboidrato utilizando NADPH + H+ e ATP.
escuro
NADPH + H+ + ATP + CO2

NADP+ + ADP + Pi + C(H20)

cloroplastos

Hill, em 1937, tentando desvendar o processo fotossinttico empregando cloroplastos

isolados de espinafre pretendia a reduo do CO2 ao nvel de carboidrato. Por dificuldades
tcnicas, limitadas pela poca, no conseguiu o seu intento, mas chegou a demonstrar a
habilidade de cloroplastos isolados de reduzir outros compostos em um processo acoplado
fotlise da gua com evoluo de O :
2
luz
2Fe+3 + H2O

2Fe+2 +H+ +1/2O2

cloroplastos

Assim a produo fotoqumica de oxignio exige a presena de um aceptor de H + e/ou

eltrons, que necessariamente no precisa ser o CO2.
No presente experimento ser utilizado como aceptor de eltrons (reagente de Hill) um
indicador de xido-reduo, o 2,6-diclorofenolindofenol, que na forma oxidada azul (com
max. ao redor de 540 nm) e na forma reduzida incolor (Figura 1), o que permite o
acompanhamento da reao fotoqumica mediada por cloroplastos isolados de espinafre.
23

Figura 1. Reduo do 2,6 diclorofenolindofenol na Reao de Hill.

3. MATERIAL

Espectrofotmetro
Tubos de ensaio (4 por grupo)
Centrfuga de mesa para tubos de centrfuga (15 ml)
Almofariz com pistilo (1 para cada grupo)
Lmpada de 100 W (2 por aula)
Micropipeta de 1mL
Tubos de centrfuga tipo Falcon
Algodo
Funil pequeno de plstico
Pipeta volumtrica (Pasteur)
Folha de alumnio
Banho maria (100oC)
Folhas de espinafre
Sacarose 0,35M
Tampo fosfato 0,05 M (pH = 6,5) contendo sacarose 0,35 M
2,6-diclorofenollindofenol (16 mg/100 ml)
cido ascrbico (cristais)

4. PRTICA

A. Extrao dos Cloroplastos

a) Picar 5 g de folhas de espinafre e homogeneizar em almofariz usando areia lavada
como abrasivo e 10 ml de sacarose 0,35 M (adicionados aos poucos) como extrator.
b) Filtrar o homogeneizado em algodo.
c) Centrifugar por 2 minutos a 200 x g, (1300 rpm) desprezar o precipitado e
centrifugar novamente o sobrenadante por 7 minutos a 1000 x g. (3000 rpm)

24

d) Ressuspender os cloroplastos lavados em 10 ml de tampo fosfato 0,05 M (pH= 6,5)

contendo sacarose 0,35 M.

B. Ensaio
Preparar 4 tubos de colormetro conforme o quadro que se segue:

TUBOS
1

SUSPENSO
CLOROPLASTO
(mL)

TAMPO
FOSFATO
(mL)

2,6-DCF
(mL)

OBSERVAES

1,5
(+ c.ascrbico)

0,5

ajustar o zerodo
aparelho

1,5

0,5

ler imediatamente
ler imediatamente e
cobrir com folha de
Alumnio

1,5

0,5

1,5
(ferver 3)

0,5

Os tubos 2, 3 e 4 so expostos luz de lmpada (100 W) durante 1 minuto (o tubo no 3

protegido da luz) e faz-se a leitura de absorbncia (Abs.) repetindo a operao 3 vezes.
5. QUESTIONRIO FOTOSSNTESE
1) Em relao Aula Prtica, anotar as leituras obtidas e fazer um grfico:
TUBOS
1
2

SUSPENSO
CLOROPLASTO
(mL)

ABS.
(=540 nm)
1 LEITURA

ABS.
(=540 nm)
2 LEITURA

ABS.
(=540 nm)
3 LEITURA

1,5
(+ cido ascrbico)
1,5

1,5

1,5
(ferver 3)

Discutir os resultados:
a) Qual a funo do cido ascrbico?
b) Qual a funo do 2,6 DCF?
c) Descreva o observado nos tubos 2, 3 e 4 durante as leituras.
d) Em quais tubos ocorrem fotossntese? Por qu?

25

e) Em quais tubos no ocorre a fotossntese? Por qu?

2) Quais os eventos que dependem e quais os que no dependem da luz quanto formao
de glicose por uma planta fotossintetizadora?
3) Por que os comprimentos de onda na faixa de 450 e 650 nm so mais eficientes para a
realizao de fotossntese pelas plantas superiores?
4) Quais as funes dos carotenides no processo fotossinttico conduzido pelas plantas?
5) Como se explicam a essencialidade do Cl, Mn e Mg para o processo fotossinttico?
6) Como so estruturados os sistemas de pigmentos para a captao da energia radiante
para a conduo da fotossntese?
7) Qual a funo da gua no processo fotossnttico?
8) O que fica demonstrado quando se observa a reduo do 2,6-diclorofenolindofenol por
cloroplastos iluminados (reao de Hill)?
9) Como os herbicidas que bloqueiam o transporte de eltrons no processo fotossinttico
matam a planta?
10) Como que os herbicidas que bloqueiam o transporte de eltrons na fase luminosa da
fotossntese (2,4-DNP e DCMU) matam a planta?
11) O que vem a ser foto-reduo do NADP+ e fotofosforilao do ADP?
12) Qual o primeiro composto formado pela assimilao do CO 2 mediante a via C3 de
fixao? Idem para a via C4. Quais as enzimas envolvidas nesta etapa e suas afinidades
para com o CO2?

ABS.
=540 nm

LEITURAS

26

13) Que adaptaes ocorreram nas crassulceas que lhes permitem a melhor sobrevivncia
em ambientes quentes e ridos?
14) O que vem a ser fotorrespirao? Qual o seu substrato e porque pouco intensa nas
plantas C4? Qual a importncia da luz e do O2 neste processo?
15) Cite quatro diferenas entre plantas C3 e C4 (exceto foto-respirao).
16) Porque as plantas C4 fazem fotossntese com boa eficincia mesmo em temperaturas
mais elevadas?
17) Porque a fotossntese nas plantas C4 no atinge a saturao mesmo com grande
intensidade luminosa?
18) O que vem a ser ponto de compensao e por que menor para as plantas C4?

27

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

AVRON, M. "Mechanism of photoinduced electron transport in isolated chloroplasts", in D.R.

Sanadi (ed.), Current Topics of Bioenergetics, 12, Academic Press, New York, 1967,
p.1.
JACOBS, M.B. The Chemical Analysis of Foods and Food Products. Van Nostrand, New
York, 1958, 970p.
LITWACK, G. Experimental Biochemistry - A Laboratory Manual. John Wiley & Sons,
Inc., New York, 1960, 313p.
MARTELLI, H.L.; PANEK, A.D. Bioqumica Experimental. Ao Livro Tcnico, Rio de
Janeiro, 1968, 112p.
NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger Princpios de Bioqumica. 3a. Ed., Sarvier, So
Paulo, 2002, 975p.
VILLELA, G.G.; BACILA, M.; TASTALDI, H. Tcnicas e Experimentos de Bioqumica.
Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1972, 522p.
VILLELA, G.G.; BACILA, M.; TASTALDI, H. Tcnicas e Experimentos de Bioqumica.
Koogan, Rio de Janeiro, 1973, 552p.
WHARTON, D.C.; MC CARTY, R.E. Experiments and Methods in Biochemistry. McMillan
Publishing Co, Inc., New York, 1972, 350p.

28

Tabela de Converso
T em A x 1.000
00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49

2.000
1.699
1.523
1.398
1.301
1.222
1.155
1.097
1.048
1.000
959
921
886

854

824
796
770
745
721
699
678
658
638
620
602
585
569
553
538
523
509
495
481
469
456
444
432
420
409
398
387
377
367
357
347
337
328
319
310

01
3.000
1.959
1.678
1.509
1.387
1.292
1.215
1.149
1.092
1.041
0.996
955
917
883
851
821
793
767
745
719
697
676
656
636
618
600
583
567
551
536
521
507
493
480
467
455
442
431
419
408
397
386
376
366
356
346
336
327
318
309

02
2699
1.921
1.658
1.495
1.377
1.284
1.208
1.143
1.086
1.036
0.991
951
914
879
848
818
790
764
742
717
695
674
654
635
616
599
582
565
550
535
520
506
492
479
468
453
441
429
418
407
396
385
375
365
355
345
335
328
317
308

~
2.523
1.886
1.638
1.481
1.387
1.276
1.201
1.137
1.081
1.032
0.987
947
910
876
845
815
788
762
738
714
693
672
652
633
614
597
580
564
548
533
519
504
491
478
465
452
440
428
417
406
395
384
374
364
354
344
334
326
316
307

04
2.398
1.854
1.620
1.469
1.357
1.268
1.194
1.131
1.076
1.027
0.983
943
907
873
842
812
785
759
735
712
690
670
650
631
613
595
578
562
547
532
517
503
489
476
463
451
439
427
416
405
394
383
373
363
353
343
333
325
315
306

05
2.301
1.824
1.602
1.458
1.347
1.260
1.187
1.125
1.071
1.022
0.979
939
903
870
839
810
783
757
733
710
688
688
648
629
611
503
577
561
545
530
516
502
488
475
462
450
438
426
415
403
393
382
372
362
352
342
333
324
314
305

06
2.222
1.796
1.585
1.444
1.337
1.252
1.180
1.119
1.066
1.018
0.975
938
900
866
836
807
780
764
730
708
686
666
646
627
609
592
575
559
544
529
514
500
487
474
461
449
437
425
413
402
391
381
371
361
351
341
332
323
313
305

07
2.155
1.770
1.569
1.432
1.328
1.244
1.174
1.114
1.060
1.013
0.971
932
896
863
833
804
777
752
728
706
684
664
644
625
607
590
573
558
542
527
513
499
485
472
460
447
435
424
412
401
390
380
370
360
350
340
331
322
312
304

08
2.097
1.745
1.553
1.420
1.319
1.237
1.167
1.108
1.056
1.009
0.967
928
893
860
830
801
775
750
726
703
682
662
642
623
606
588
572
556
541
528
511
498
484
471
458
446
334
423
411
400
389
379
369
359
349
339
330
321
312
303

09
2.046
1.721
1.538
1.409
1.310
1.229
1.161
1.102
1.051
1.004
0.963
924
889
857
827
799
772
747
724
701
680
660
640
622
604
587
570
554
539
524
510
495
483
470
457
445
433
421
410
399
388
378
368
358
348
338
329
320
311
302

Cont.
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99

00
301
292
284
278
268
250
252
244
237
229
222
215
208
201
194
187
180
174
167
161
155
149
143
137
131
125
119
114
108
102
097
092
086
081
076
071
066
060
056
051
046
041
036
032
027
022
018
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