BIOQUIMICA PRACTICA N 02

DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LA ENZIMA

CATALASA EN VEGETALES
INTRODUCCION
Las enzimas son la clase ms numerosa y especializada de las proteinas que
funcionana como catalizadores biologicos para las recciones celulares. Las enzimas
tienen enorme poder catalitico, gran especificidad y actividad regulada, intervienen
en la transformacin de la energia en diversas formas de trabajo. Las reacciones mas
simples como son la autolisis de los tejidos animales, de considerable inters para
la industria alimenticia, en lo que se refiere al ablandamiento de la carne durante el
sazonado, son catalizadas por las catepsinas, las cuales se liberan y activan luego de
ocurrida la muerte. El efecto acelerador es uno de los ms altos que se conocen,
multiplica la velocidad de la reaccin hasta un milln de veces.
Las enzimas son protenas que contienen los mismos aminocidos que se encuentran
en otras protenas. Al igual que otras protenas tambin tienen una estructura
tridimensional, que representa la conformacin de contenido de energa mnimo, y
pueden consistir de una sola o de varias cadenas polipeptdicas.
El objetivo del presente experimento es evidenciar que las enzimas son protenas
que gozan de las propiedades de estas y que son sensibles a todos los agentes fsicoqumicos que actan sobre los mismos, haciendo varias su comportamiento y
actividad.
II. OBJETIVOS
2.1 Obtener un extracto crudo de la enzima catalasa.
2.2 Demostrar cualitativamente el efecto de cidos, bases y sales sobre la actividad
de la catalasa.
III. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS
3.1 Equipos
- Centrifuga
- Estufa
3.2 Materiales
- Tomates inmadura
- Papa inmadura
- Tubos de ensayo
- Pipetas
- Gasa
- Embudos
3.3 Reactivos
- NaOH 1 N
- HCl 0,5 N
- Acido tricloroacetico 20%
- CuSO4 20 %
- Buffer fosfato 0,5 M y 0,1 M pH 6,5
- H2O2 3%
- NaCl 0,15 M

IV. FUNDAMENTO TERICO

A continuacin presentaremos un conjunto de conceptos bsicos para obtener un buen
panorama terico de lo que se quiere hacer en esta prctica de laboratorio.
Las enzimas: Son biocatalizadores imprescindibles para todos los organismos, que
dirigen en determinados sentidos las reacciones que lugar en su interior. Gracias a su
estructura pueden reconocer la sustancia sobre la que han de actuar y presentan gran
especificidad.
Algunos requieren la presencia de una sustancia acompaante (cofactor), un grupo
prosttico (coenzima) o la unin con otra enzima (formando un complejo enzimtico)
para ser activos. Su velocidad de accin depende de diversos factores (temperatura,
concentracin presente, etc,) pueden estar en el interior de las clulas o los tejidos o
bien ser excretados y bien aparecer libres.
Las catalasas: Enzima oxidante, es decir, es una sustancia que tiene la propiedad de
oxidar a otra (reductora) captando electrones de stas; y est presente en numerosos
tejidos vegetales y animales.
Se trata de una porfirina que descompone el agua oxigenada en agua y oxgeno.
Perxido: Nombre genrico que reciben los derivados disustituidos del agua oxigenada
su frmula es H2O2.
V. PROCEDIMIENTO
5.1. Obtencin del extracto crudo
1. Pelar el tomate verde y eliminar la cscara, el pericarpio almacenarlo a -70C.
2. Limar el pericarpio congelado, adicionar buffer fosfato 0,1 M pH 6.5.
3. Filtrar el extracto crudo a travs de 2 capas de gasa y centrifugar a 10000g por
15 minutos y guardar las alcuotas a -18C.
52. Demostracin de la naturaleza proteica
1. Armar el siguiente sistema (cuadro 1)
Componente
Enzima
NaOH 1N
HCl 0.5N
A.T.A. 20%
CuSO4 20%
Buffer fosfato
0.05M pH 6.5

I
1.0

II
1.0

Nmero de tubo
III
IV
1.0
1.0

V
1.0

VI
1.0

2.4
2.4
2.4
2.4
2.4

2. Dejar en reposo los 6 tubos durante 20 minutos a 30C.

3. Preparar el siguiente sistema (cuadro 2)
Componente
Buffer fosfato
0.05M pH 6.5
NaCl 0.15M
H2O2 3%

I
6.5

II
6.5

Nmero de tubo
III
IV
6.5
6.5

V
6.5

VI
6.5

1.5
1.5

1.5
1.5

1.5
1.5

1.5
1.5

1.5
1.5

1.5
1.5

4. Preincubar por 2 minutos a 25C, luego agregar a cada uno de los tubos la
enzima tratada en el paso 1.
5. Dejar en incubacin durante 2 minutos s a 25C y determinar la actividad
enzimtica cualitativamente de la siguiente manera.
- Presencia de actividad enzimatica = formacin de gas
- Ausencia de actividad enzimatica = ausencia de gas

VI. RESULTADOS
MANZANA
N de Tubo
I
II
III
IV
V
VI

Observacin (Actividad enzimtica)

SI
NO
NO
NO
NO
SI
TOMATE

N de Tubo
I
II
III
IV
V
VI

Observacin (Actividad enzimtica)

SI
NO
NO
NO
NO
SI

VII.

Diagrama de bloques
Pelar el tomate y la manzana; luego
desechar la cscara.

Limar el pericarpio y adicionar buffer

fosfato
Filtrar el extracto crudo con la gasa
Centrifugar a 10000 g por 15 minutos.
Fig 01: Diagrama de bloques para la obtencin del extracto crudo.

Armar el sistema que se encuentra en el

cuadro 1, con 6 tubos de ensayo

Dejar en reposo a los 6 tubos durante 20

minutos a 30C
Preparar el sistema que se muestra en el
cuadro 2
Preincubar por 2 minutos a 25C
Agregar a cada tubo la enzima tratada en el
paso 1
Dejar en incubacin durante 2 minutos a
25C y determinar la actividad enzimatica.
Fig 02: Diagrama de
bloques para la
demostracin de la naturaleza proteica de la enzima catalasa en vegetales

VIII. DISCUSION
Las enzimas son protenas que catalizan reacciones qumicas en los seres vivos.
La catalasa es una enzima que se encuentra en las clulas de los tejidos, su
funcin es descomponer el perxido de hidrgeno (H2O2) en agua y oxigeno.
La influencia del pH en la velocidad de las reacciones enzimticas indica que los
enzimas presentan un pH ptimo de actividad. El pH puede afectar de varias
maneras:

El centro activo puede contener aminocidos con grupos ionizados que

pueden variar con el pH.
La ionizacin de aminocidos que no estn en el centro activo puede
provocar modificaciones en la conformacin de la enzima.
El sustrato puede verse afectado por las variaciones del pH.

Por lo tanto es muy importante elegir un buffer adecuado para las pruebas que se
desarrollen y as evitar cambios de pH ya que la mayora de enzimas son
sensibles a los cambios de pH y esto podra provocar la desnaturalizacin de la
protena en si.
Por otro lado, la temperatura influye tambin en la actividad cataltica, ya que al
ser protenas a cierta temperatura se empiezan a desnaturalizar. Por ejemplo a
temperaturas altas el aumento de velocidad de la reaccin es contrarrestada por
la prdida de actividad cataltica y la actividad enzimtica decrece rpidamente
hasta anularse.
Es por eso que es recomendable utilizar en los experimentos vegetales
previamente congelados, para as evitar complicaciones al reconocer las
enzimas.

IX. CONCLUSIONES
Anotas las conclusiones de la prctica de acuerdo a los objetivos propuestos.
1. Logramos obtener un extracto crudo de la enzima catalasa, con la ayuda del
buffer fosfato (pH 6,5). Ya que la ruptura de clulas en un buffer adecuado libera
las enzimas al medio.
2. Comprobamos el efecto del pH en la actividad enzimatica. Las enzimas poseen un
PH caracterstico donde su actividad es mxima, por encima o debajo de ese PH
la actividad disminuye. Las catalasas dan como resultado oxgeno.

X. CUESTIONARIO
1. QU ES UN EXTRACTO CRUDO?
Es el extracto de algn compuesto biolgico, en el cual no se altera su composicin
qumica.
Generalmente para el aislamiento de protenas el primer paso es la obtencin del
extracto crudo, ya sea procedente de la ruptura total de un tejido, de un solo tipo de
clulas o de algn orgnulo subcelular previamente aislado.

2. A QUE CLASE DE ENZIMA CORRESPONDE LA CATALASA? SU

NOMBRE Y SU CDIGO EC.
H202: H202 oxidorreductasa (CAT, EC 1.11.1.6)
3. QU
OTROS
FACTORES
PUEDEN
CONSIDERARSE
PARA
DEMOSTRAR QUE LAS ENZIMAS SON PROTENAS?
Existen numerosas razones para afirmar que las enzimas son protenas. Las ms
importantes son las siguientes:
- Al analizar las enzimas obtenidas en forma ms pura, cristalizadas, demuestra
que son protenas.
- Las enzimas son inactivadas a altas temperaturas y, en general, la cintica de la
desnaturalizacin trmica de las enzimas da resultados muy parecidos a los de
la desnaturalizacin trmica de las protenas; por ejemplo el Q10 de la mayora
de las reacciones qumicas es de 2 a 3, y, en el caso de las enzimas, a
temperaturas elevadas, alrededor de 60 a 70 C, la actividad neta aumenta
varios cientos, como sucede con la velocidad de la desnaturalizacin trmica
de las protenas.
- Las enzimas son activadas en una zona muy restringida de pH, y presenta un
punto ptimo de pH donde su actividad es mayor. Las protenas en su punto
isoelctrico, muestran propiedades parecidas desde el punto de vista de
viscosidad, solubilidad, difusin, etc., que resulta del todo similares a las
propiedades de este tipo que muestran las enzimas.
- Todos los agentes que desnaturalizan a las protenas tambin destruyen o
inactivan a las enzimas, ya sea el calor, los cidos fuertes, o los metales
pesados que pueden combinarse con ellas.
- Los problemas de solubilidad y de precipitacin son comunes en las protenas
y las enzimas; en general, son solubles en agua o soluciones salinas, insolubles
en alcohol, precipitan con determinadas concentraciones de sales neutras, etc.
4. INDIQUE 04 ENZIMAS QUE PUEDEN EXTRAERSE DE VEGETALES.
- Bromelina (pia)
- Papana (papaya)
- Aliinasa (cebolla y ajo)
- Ficina (higo)
- Mirosinasa (rabano y mostaza)
5. IMPORTANCIA DE LAS ENZIMAS.
Las enzimas son catalizadores biolgicos, toda reaccin qumica del organismo es
catalizada por una enzima. Por ejemplo las enzimas que se relacionan con la
digestin de los alimentos como la ptialina en la saliva, la pepsina en el jugo
gstrico, la quimosina, la tripsina lipasa gstrica, lipasa pancretica, que se encargan
de romper las molculas grandes en molculas menores hasta llegar a los
monmeros como glucosa, cidos grasos y aminocidos; realmente son de gran
importancia, sin ellas no aprovecharamos los alimentos y no podramos vivir.
Por otro lado, la importancia de las enzimas en la industria alimenticia radica en lo
siguiente:
- Son indicadores de la eficiencia de los procesos trmicos utilizado en la
elaboracin de un producto.

Mejoran las propiedades sensoriales.

Mejoran y aumentan la calidad de un producto en cuanto su valor nutritivo.
Sirven como estabilizadores.
Son simuladores de sabor y color
Se utilizan para aprovechar subproductos agroindustriales.
En forma ms genrica se utilizan como indicadores las enzimas en la industria
de alimentos se utilizan como: Indicadores en los procesos trmicos, un ejemplo
claro es en la pasteurizacin de la leche. Coayudantes en la trasformacin de
los procesos trmicos.

XI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

- Base de datos de enzimas:
http://us.expasy.org/enzyme/
- Plantas medicinales:
sibdi.bldt.ucr.ac.cr/CIMED/cimed27.pdf
- http://www.qb.fcen.uba.ar/quimicabiologica/Trabajo%20con%20enzimas.htm
- http://www.ehu.es/biomoleculas/ENZ/ENZ1.htm