BIOTRANSFORMACIN

MICROBIAL BIOTRANSFORMATION OF (R)-(+)- LIMONENE BY

PENICILLIUM DIGITATUM DSM 62840 FOR PRODUCING (R)-(+)TERPINEOL

PRESENTADO POR:

JUAN RICARDO RINCN

CHRISTIAN SUAREZ
MAYRA ALEJANDRA URIBE

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE INGENIERAS FSICO QUMICAS
ESCUELA DE INGENIERA QUMICA
2016

BIOTRANSFORMACIN

MICROBIAL BIOTRANSFORMATION OF (R)-(+)- LIMONENE BY

PENICILLIUM DIGITATUM DSM 62840 FOR PRODUCING (R)-(+)TERPINEOL

PRESENTADO A:
MICROBIOL. MABEL JULIANA QUINTERO

PRESENTADO POR:

JUAN RICARDO RINCN

CHRISTIAN SUAREZ
MAYRA ALEJANDRA URIBE

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE INGENIERAS FSICO QUMICAS
ESCUELA DE INGENIERA QUMICA
2016

INTRODUCCIN

En los ltimos aos los procesos de biotransformacin han adquirido una

importancia creciente a nivel mundial, debido a la posibilidad de obtener un
producto natural de alto valor agregado y de forma inocua para el medio
ambiente (Castellanos, 2007).
aromticos

travs

de

considerablemente, debido

Actualmente la generacin de productos

procesos

biotecnolgicos

ha

aumentado

a que las legislaciones de USA y Europa han

definido como sustancias naturales nicamente a las que pueden producirse

por procesos fsicos, enzimticos o microbianos a partir de precursores
aislados de la naturaleza. Esta clasificacin ha originado una competencia en
el mercado, ya que los compuestos etiquetados como naturales presentan
alta demanda, mientras que otros compuestos producidos por mtodos
qumicos, a pesar ser denominados como idnticos al natural son menos
apreciados por los consumidores.

Mundialmente numerosos procesos

comerciales emplean enzimas o microorganismos como catalizadores, lo que

demuestra la importancia de las reacciones de biotransformacin aplicadas a la
industria (Marstica & Pastore, 2006)
La biotransformacin implica una serie de reacciones limitadas, que se pueden
llevar a cabo por medio de sistemas biolgicos, denominados biocatalizadores,
en donde una molcula precursora es convertida en otra diferente (Garcia , et
al., 2004).

Los biocatalizadores, en la mayora de los casos, funcionan

correctamente bajo condiciones suaves de reaccin, poseen alta actividad

cataltica y permiten una mayor regio y estereoselectividad. Cuando se utilizan
con microorganismos completos puede haber una menor selectividad, debido a
que las clulas contienen diferentes grupos de enzimas capaces de transformar
el sustrato, sin embargo la selectividad puede ser alterada variando el medio,
adicionando solventes orgnicos o inhibidores de enzimas no deseadas, entre
otros. La quiralidad tambin es importante en perfumera ya que el olor y el
sabor dependen de la conformacin absoluta del estereoismero presente
(Castellanos, 2007) Los terpenos representan un grupo abundante de
sustancias quirales que pueden ser transformadas en componentes bioactivos
de gran valor tales como saborizantes, fragancias y frmacos

el R-(+)-

limoneno es el monoterpeno monocclico que se encuentra ms ampliamente

distribuido en la naturaleza (de Caravalho & da Fonseca, 2006), constituyendo
cerca de un 90% del aceite de la cascara de naranja, lo que lo convierten en un
precursor abundante y barato para la sntesis de productos qumicos finos; el
-terpineol, uno de los derivados oxigenados del R-(+)-limoneno, es un alcohol
estable y es aplicado principalmente en productos para el hogar, cosmticos,
pesticidas y como parte de productos aromatizantes (Lemos, et al., 2010). En
este

trabajo

se

biotransformacin

profundizara
por

medio

en
de

los
un

temas
anlisis

relacionados
al

artculo

con

la

Microbial

Biotransformation of (R)-(+)-Limonene by Penicillium digitatum DSM 62840 for

Producyng (R)-(+)--Terpineol (Prieto, et al., 2011)

TABLA DE CONTENIDO
1

Introduccin................................................................................................. 3

Fundamentacin ......................................................................................... 5

objetivos en la investigacin........................................................................ 7
3.1

Objetivo general .................................................................................... 7

3.2

Objetivos especficos ............................................................................ 7

Estudios relacionados ................................................................................. 9

Marco terico ............................................................................................ 10

5.1

BIOTRANSFORMACIN .................................................................... 10

5.2

LIMONENO ......................................................................................... 11

5.3

Penicillium digitatum............................................................................ 12

5.4

Terpineol ............................................................................................. 13

MATERIALES Y MTODOS USADOS ..................................................... 15

6.1

Microorganismo, medio de cultivo y reactivos ..................................... 15

6.2

Crecimiento microbiano de Penicillium digitatum DSM 62840 en medio

slido 15
6.3

Evaluacin de la actividad antifngica del sustrato ............................. 16

6.4

Preparacin de la suspensin de esporas .......................................... 17

6.5

Cintica de crecimiento microbiano de Penicillium digitatum DSM

62840 en medio lquido ................................................................................ 17

6.6

Proceso general de biotransformacin de (R)-(+)-limoneno a escala de

laboratorio ..................................................................................................... 18

6.6.1

Efecto del tipo de medio de cultivo .............................................. 18

6.6.2

Efecto del pH ................................................................................ 19

6.6.3

Evaluacin

de

las

fases

de

crecimiento

durante

la

biotransformacin del limoneno ................................................................ 19

6.6.4

Efecto de la concentracin del sustrato ........................................ 19

6.6.5

Efecto inductivo de (R)-(+)-limoneno ............................................ 20

6.6.6

Extraccin, identificacin y cuantificacin de (R)-(+)-limoneno y -

terpineol durante la biotransformacin del limoneno ................................. 20

7

ANLISIS E INTERPRETACIN DE RESULTADOS ............................... 22

7.1

Crecimiento microbiano de Penicillium digitatum DSM 62840 en medio

slido 22
7.2

Evaluacin de la actividad antifngica del sustrato ............................. 23

7.3

EVALUACIN DEL PROCESO DE BIOTRANSFORMACIN DEL (R)-

(+)-LIMONENO ............................................................................................. 25
7.3.1

Efecto del tipo de cultivo ............................................................... 25

7.3.2

Efecto del pH ................................................................................ 26

7.3.3

Evaluacin de las fases de crecimiento ........................................ 29

7.3.4

Efecto de la concentracin del sustrato ........................................ 30

7.3.5

Efecto inductivo del (R)-(+)-limoneno en la capacidad de

biotransformacin ...................................................................................... 32
8

CONCLUSIONES ..................................................................................... 35

Bibliografa ................................................................................................ 36

FUNDAMENTACIN

La implementacin de biotransformacin en procesos industriales representa

una alternativa econmica, con una buena fuente de disponibilidad y de fcil
obtencin en materias primas, requisitos necesarios para asegurar la
rentabilidad de los productos procesados, adems los productos obtenidos a
travs de la bioconversion de sustratos por microorganismos pueden ser
clasificados como naturales, condicin que se est imponiendo cada vez ms
entre los consumidores (Schrader, et al., 2004); sin embargo, las bajas tasas
de produccin hacen que no se haya materializado en una opcin aceptable a
escala industrial, y por esto es conveniente profundizar la investigacin en este
tpico.

OBJETIVOS EN LA INVESTIGACIN

3.1

Objetivo general

Determinar las caractersticas qumicas que optimizaran la produccin de terpineol en un cultivo de Penicillium digitatum DSM 62840 teniendo como
sustrato el (R)-(+)-limoneno.
3.2

Objetivos especficos

Determinar el medio de cultivo slido que permita la mayor tasa de

crecimiento para la pre-incubacin de la solucin de esporas de P.
digitatum DSM 62840.

Determinar la concentracin del sustrato que permita una mayor

produccin de -terpineol, y que a su vez presente un efecto inhibitorio
mnimo en el crecimiento de Penicillium digitatum DSM 62840.

Evaluar el medio de cultivo liquido de P. digitatum DSM 62840 en la

produccin de -terpineol.

Evaluar el pH del medio de cultivo para optimizar la produccin de terpineol.

Determinar la fase de crecimiento del cultivo de P. digitatum DSM 62840

en la que se presente la mayor tasa de produccin de -terpineol.

Analizar el posible efecto inductor del (R)-(+)-limoneno en el P.

digitatum DSM 62840.

Cuantificar la biotransformacin obtenida en la investigacin.

ESTUDIOS RELACIONADOS

Aunque no se tiene una evidencia clara en todos los casos, las

biotransformaciones de R-(+)-limoneno en las que intervienen hongos y
levaduras al parecer inician por la accin de la P-450 monooxigenasa. En la
bioconversin

de R-(+)-limoneno a -terpineol realizada por Penicillium

digitatum DSM 62840 primero se pens en una hidratasa como catalizador, lo

cual hubiese favorecido un proceso biocataltico ya que no habra sido
necesario ningn cofactor.

Sin embargo ms adelante se encontr que el

primer paso de la reaccin era la epoxidacin del doble enlace presente en los
carbonos C8-C9, luego se afirm que la reaccin deba implicar un
rompimiento reductor del epxido, pero no se proporcionaron mayores detalles
sobre las enzimas implicadas (Duetz, et al., 2003).

La formacin de un

terpineol se inform por primera vez en un resumen de un simposio realizado

por Kraidman en 1969. La cepa utilizada fue Cladosporium sp. T12, pero no se
compartieron mayores detalles experimentales (Duetz, et al., 2003) y no parece
haberse realizado un seguimiento de esta cepa. Desde el 2001 en trabajos
realizados por Demyttenarae, et al., 2001 se comenz a utilizar cepas de P.
digitatum DSM 62840, encontrando que estas transformaban el R-(+)-limoneno
principalmente, pero no exclusivamente a -terpineol. Un trabajo interesante
fue el realizado por Demyttenaere et al. 2001 con ms de 60 cepas de hongos
que produjo la formacin de 1,2-dioles y R-(+)-limoneno en donde una de las
cepas usada para la obtencin de -terpineol fue el P. digitatum con la cual
obtuvo un rendimiento del 100% luego de ocho horas. En los ltimos aos se
han estudiado otros microorganismos para la produccin de -terpineol tales
como: Fusarium oxysporum 152B, con el cual se obtuvo una concentracin de
cerca de 4(g/L) en un tiempo de 48 horas y con una eficiencia de extraccin del
36% (Molina, et al., 2015), adems se puede encontrar la literatura
correspondiente con la optimizacin de ciertos parmetros, tales como: efectos
de la composicin del medio, la presencia de un co-sustrato y la concentracin
del sustrato

(Lemos, et al., 2008); tambin se han utilizado

clulas de

Sphingobium sp. Obteniendo una produccin de aproximadamente 10-12(g/L)

luego de 72 horas, con una selectividad de cerca del 80% y con una tasa
mxima de produccin cercana a 0.25(gh-1/L) (Lemos, et al., 2010), entre otros.

MARCO TERICO

5.1

BIOTRANSFORMACIN

Segn

Mariano

Garca

en

su

libro

biotecnologa

alimentaria,

una

biotransformacin se puede llevar a cabo por cualquiera de los siguientes

mtodos:

Mediante el uso de clulas en crecimiento. En este caso la molcula

precursora se incorpora al medio de cultivo desde la inoculacin o bien
durante el transcurso de etapas posteriores en donde el crecimiento
celular an no ha terminado.

Mediante el uso de clulas cosechadas.

La primera etapa de este

mtodo consiste en permitir un crecimiento celular abundante en un

medio de cultivo especial, llamado de crecimiento.

Despus estas

clulas se separan por centrifugacin o filtracin para incorporarlas a un

segundo medio; el de biotransformacin, que contiene los precursores.
Un ejemplo de este tipo de procesos es el uso de esporas microbianas
como biocatalizadores.

Mediante el uso de clulas inmovilizadas. Aqu es necesario producir las

clulas

en

un

medio

apropiado,

para

despus

separarlas

inmovilizarlas. Esto ltimo puede realizarse con el uso de cualquiera de

las siguientes tcnicas: atrapamiento en polmeros porosos, adsorbiendo
a los microorganismos sobre la superficie de soportes insolubles,
induciendo ligaduras covalentes a los soportes o bien induciendo una
agregacin fsica o qumica.

Mediante el uso de enzimas purificadas. En algunos casos es necesario

emplear enzimas con un alto nivel de purificacin, esto puede deberse a
que o bien hay una buena difusin, apropiada de las molculas
precursoras a travs de la membrana microbiana, o que el producto de
la transformacin no se difunda una vez producido.

Una condicin

indispensable para recurrir a este tipo de mtodo es que la enzima debe

separarse y purificarse con cierta facilidad o bien estar disponible en
forma comercial. El uso de estas enzimas debe puede ser en su forma
libre o tambin inmovilizada.

Mediante el uso de sistemas multifase. En el caso de los precursores y

productos, al menos uno de ellos, insoluble en agua pero lipoflicos, por
lo general se trabaja en dos fases, una acuosa que contiene la enzima o
los microorganismos y un solvente no miscible en agua.

Mediante el uso de sistemas de multiconversin. Para el caso en el que

la biotransformacin requiera de dos o ms pasos secuenciales.

5.2

LIMONENO

El limoneno posee una estructura qumica similar a los principales compuestos

oxigenados usados en la industria de los biosabores (carveol, carvona, alcohol
perlico, terpineol, etc.)

En su estructura presenta un centro quiral y diez

tomos de carbono, de los cuales seis pertenecen a un ciclo, lo que lo clasifica

como un monoterpeno monocclico (Bicas , et al., 2010). La presencia de
enlaces dobles entre los carbonos C1-C2 y C8-C9, lo que hace ms probable la
oxidacin (hidroxilacin) en las posiciones allicas (C3, C6) y la epoxidacin en
los dobles enlaces por razones de estabilidad y reactividad qumica, sin
embargo puede oxidarse en carbonos menos reactivos.

Debido a que la

reactividad en los metilos y metilenos allicos es muy similar, se pefiere el uso

de biocatalizadores, ya que estos no see ven afectados por la selectividad
(Castellanos, 2007). En la Figura 1. Se indican los posibles sitios de oxidacin
y algunos de los compuestos oxidados ms importantes.

Como se ha indicado anteriormente la mayor parte de los aceites esenciales de

la naranja estn constituidos por limoneno (Tackenberg, et al., 2014), lo que
hace del limoneno, gracias a su amplia distribucin en la naturaleza, un
precursor abundante y econmico en la sntesis de productos de qumicos
finos. (Castellanos, 2007) Uno de los principales productos obtenidos luego de
su biotransformacin es el -terpineol, el cual es un monoterpeno oxigenado de
importante uso comercial, sin embargo la biotransformacin de limoneno a terpineol como producto principal presenta algunos inconvenientes tales como:
inestabilidad qumica, alta volatilidad y alta citotoxidad tanto de los precursores
como de los productos, adems de baja tasa de solubilidad de los solutos y

bajas tasas de transformacin (Schewe, et al., 2006).

El uso de sistemas

bifsicos ha demostrado ser una excelente tcnica, ya que aumenta los

rendimientos de la recuperacin de productos y disminuye las perdidas por
volatilizacin mediante la reduccin del sustrato. (Lemos, et al., 2010)
Figura 1. Principales compuestos derivados del (R)-(+)-limoneno

5.3

Penicillium digitatum

Es un hongo mesfilo causante de cerca del 90% de las cosechas de ctricos,

hiere la superficie de los ctricos y crece en forma de filamentos (Shukui, et al.,
2016), se clasifica como un hongo necrotrfico patgeno (Marcet-Hauben, et
al., 2012), se reproduce asexualmente por la produccin de conidias, adems
tiene un gran parecido morfolgico con el P. itallicum, pero se diferencian por la
forma cilndrico-elptica en las conidias del P. digitatum (Stolk, et al., 1990), tal
como se ve en la Figura 1.

Figura 2. Naranja en descomposicin debido a Penicillium digitatum

(izquierda) y conidias del P. digitatum vistas desde el microscopio
electrnico de barrido (derecha)

Tomada de: http://img.interempresas.net/fotos/446212.jpeg

Desde hace varios aos se tiene conocimiento que el P. digitatum DSM 62840
que se encuentra en la cscara de naranjas descompuestas tiene la capacidad
de transformar el (R)-(+)-limoneno rpidamente a -terpineol

(Yoshiaki &

Yoshinori, 2016),como se ve en la , adems se sabe de la formacin de

epxidos como sustancias intermedias en las reacciones de biotransformacin
por especies de Penicillium (Borges, et al., 2009).
Figura 3.
digitatum

5.4

Biotransformacin de (R)-(+)-limoneno a -terpineol por P.

Terpineol

El terpineol es el monoterpeno que constituye una gran parte de los aceites

esenciales de las plantas (Marstica & Pastore, 2007), en la industria es usado
principalmente en perfumera, productos de limpieza, productos cosmticos,
como saborizante y como fungicida (Bathia, et al., 2008). Sus propiedades
quirales se traducen sobre todo es sus caractersticas aromticas: el (R)-(+)-terpineol tiene un olor tpicamente floral, mientras que el (S)-(-)--tiene el olor
caracterstico de las conferas (Marstica & Pastore, 2007). Como fungicida
tiene efecto en una amplia variedad de especies de hongos, entre las que se

incluye Penicillium (Pinto, et al., 2014). Algunos estudios han reportado que el
terpineol puede inducir cambios morfolgicos importantes en el Penicillium
digitatum que pueden inhibir el crecimiento micelar (Guo-xing, et al., 2015)
Figura 4. Aplicaciones del -terpineol en la industria

6
6.1

MATERIALES Y MTODOS USADOS

Microorganismo, medio de cultivo y reactivos

Penicillium

digitatum

DMS

62840

se

obtuvo

de

la

coleccin

de

microorganismos y cultivos de clulas (DSMZ) en Alemania (Braunschweig).

Se utilizaron tres medios de cultivo solidos: PDA, agar papa dextrosa; MEA,
agar extracto de malta; y se usaron materiales puros para preparar algunos de
los medios de cultivo complejos. Medio de cultivo YGA, el cual contena 3.0 g/L
de extracto de levadura, 20 g/L de extracto de malta, 20 g/L de glucosa, 1.0 g/L
de peptona bacteriolgica y 20 g/L de agar; adems se usaron tres medios de
cultivo en estado lquido: YMPG, que contena 5.0 g/L de extracto de levadura,
10 g/L de extracto de malta, 10 g/L de glucosa y 5.0 g/L

de peptona

bacteriolgica; MYB, que contena 3.0 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de

extracto de malta, 10 g/L de glucosa y 10 g/L de peptona bacteriolgica y el
medio YG, que contena 3.0 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de extracto de
malta, 20 g/L de glucosa y 1.0 g/L de peptona bacteriolgica. Los medios de
cultivo se compraron en OXOID (Hampshire, Inglaterra), mientras que el (R)(+)-limoneno (98%) y -terpineol (98%) se compraron en Merck (Darmstadt,
Alemania).

6.2

Crecimiento microbiano de Penicillium digitatum DSM 62840 en

medio slido

Penicillium digitatum DSM 62840 creci en los medios de cultivo PDA, MEA y
YGA, los cuales fueron descritos anteriormente, a una temperatura de 23C
durante 10 das, en los tres casos el dimetro de la colonia fue medido en
orden con el fin de determinar la cintica de crecimiento de los
microorganismos. La tasa de crecimiento radial (mm/h) se determin segn el
mtodo descrito por (Trinci, 1969), el cual consiste en hacer un seguimiento de
las etapas de crecimiento de la colonia y la germinacin de esporas con el fin
de fotografiar el crecimiento del cultivo en una cmara de cultivo o portaobjetos
bajo el microscopio (Figura 5 y Figura 6) en intervalos de 15 minutos y a
temperatura constante, para despus registrar el dimetro de las colonias en

dos direcciones separadas por ngulos rectos con un ShadowMaster tomando

la media de por lo menos seis repeticiones, las tasas de crecimiento se
calculan con las medidas realizadas en intervalos de nueve horas, mientras
que las colonias crecen a un ritmo constante. El mayor tamao de crecimiento
del cultivo microbiano fue seleccionado de acuerdo a los valores para las tasas
de crecimiento radial y este valor fue usado para el mantenimiento del
microorganismo. Todas las pruebas fueron realizadas tres veces.

6.3

Evaluacin de la actividad antifngica del sustrato

Diferentes concentraciones (0 a 280 mM) de (R)-(+)-limoneno se aadieron en

el medio PDA antes de realizar la gelificacin, en todos los casos la dispersin
de (R)-(+)-limoneno fue llevada a cabo por medio de agitacin. Despus los
medios de cultivo se inocularon con 20 L de esporas en suspensin (1 x 10 7
esporas/mL).

El crecimiento microbiano (a una temperatura de 23C) se

control por medio de la medicin del cambio en el dimetro de las colonias

luego de 8 das.

Los porcentajes de inhibicin se calcularon usando la

ecuacin 1, donde Dt es el dimetro medio de la colonia de hongos usada

como testigo y Dp es el dimetro promedio de las colonias de hongos de
prueba. Los resultados fueron usados para realizar graficas de inhibicin. La
concentracin ms pequea del (R)-(+)-limoneno que inhiba el crecimiento del
P. digitatum fue

llamada concentracin de mnima inhibicin (CIM), y la

concentracin que inhiba el 100% de crecimiento fue llamada concentracin

letal (CL)

(%) =

100

Figura 5. Crecimiento del cultivo en cmara

Tomada de (Trinci, 1969) modificada

Figura 6. Crecimiento del cultivo en portaobjetos para observarse bajo el
microscopio

Tomada de (Trinci, 1969) modificada

6.4

Preparacin de la suspensin de esporas

Las esporas que haban sido previamente seleccionadas en medio slido de

nuevo se suspendieron en 10 mL de solucin salina con 0.85% NaCl y 0.1%
Tween 80 (por lo general las superficies de las placas son limpiadas de forma
peridica con detergentes y/o desinfectantes, los cuales tienen actividad
antimicrobiana y pueden inhibir el crecimiento del cultivo, para lo cual es
necesario usar un medio de cultivo que contenga Tween 80, el cual neutraliza
compuesto fenlicos, aldehdos y amonios cuaternarios, as se evitan
interferencias en la lectura e interpretacin de resultados), se hizo un recuento
del nmero de clulas (N) por mL en una cmara de Neubauer obtenindose
que la concentracin inicial fue de 1x107 esporas/ml

6.5

Cintica de crecimiento microbiano de Penicillium digitatum DSM

62840 en medio lquido

El Penicillium digitatum DSM 62840 creci en frascos equipados con tapones

de tefln de 22 mL que contenan 5 mL de YMPG, MYB o YG, segn fuese el
caso, en medio lquido a una temperatura de 27C y agitacin de 150 rpm
usando un agitador orbital (Heidolph, Vibramax 100, Schwabach, Alemania). El
medio fue inoculado con 50 L de esporas en suspensin. La concentracin
de la biomasa fue determinada a travs del mtodo de clulas en peso seco,
tomando muestras cada 24 h durante 15 das.

6.6

Proceso general de biotransformacin de (R)-(+)-limoneno a escala

de laboratorio

Los ensayos se llevaron a cabo en de frascos equipados con tapones de tefln

de 22 mL, los cuales contenan 5 mL del medio de cultivo lquido estril. El
medio de cultivo fue inoculado con 50 L esporas en suspensin y se preincubaron a 27 C por 72 horas y con una agitacin de 150 rpm utilizando un
agitador orbital.

Despus de la pre-incubacin el (R)-(+)-limoneno puro se

aadi en concentraciones especficas, que fueron establecidas para cada

experimento que se iba a llevar a cabo. La biotransformacin microbiana se
monitorizo durante todo el experimento. Al mismo tiempo se realizaron dos
controles: biomasa en blanco (esporas suspendidas en el medio de reaccin
sin sustrato) y sustrato en blanco (medio de reaccin y sustrato sin suspensin
de esporas).

Los productos de la reaccin y el sustrato restante fueron

extrados y analizados por medio de cromatografa de gases y espectrometra

de masas, la bioconversion fue evaluada en todos los casos por medio de la
ecuacin 2.

(%) =

()
100
()

6.6.1 Efecto del tipo de medio de cultivo

Los experimentos de biotransformacin

fueron llevados a cabo en medio de

cultivo lquido, usando YMPG, YG o MYB disueltos en 0.1 M en un buffer (pH

3.5) de citrato-fosfato y bajo las condiciones ambientales que fueron descritas
anteriormente. El (R)-(+)-limoneno fue aadido con una concentracin de 14.7
mM. La cintica de la transformacin microbiana fue monitoreada luego de 0,
24, 48,72 y 96 h despus de aadir el sustrato. El medio de cultivo con el valor
ms alto en la bioconversion fue seleccionado para evaluar los parmetros de
biotransformacin adicionales.

6.6.2 Efecto del pH

El efecto del pH en la biotransformacin del limoneno fue estudiado disolviendo
el medio de cultivo MYB en un buffer de citrato-fosfato de 0.1 M para los
siguientes valores de pH: 3.0, 3.5, 4.5 y 6.0. Los ensayos fueron llevados a
cabo en 22 mL de frascos equipados con tapn de tefln que contenan 5 mL
de medio lquido estril.

El medio de cultivo fue inoculado con 50 L de

esporas en suspensin y fue pre-incubado a 27C por 72 h con una agitacin

de 150 rpm utilizando un agitador orbital. El (R)-(+)-limoneno fue aadido con
una concentracin de 14.7 mM. La transformacin microbiana fue monitoreada
0 y 48 h despus de aadir el sustrato. El medio de cultivo con los valores ms
altos en la bioconversion y concentracin especfica del producto deseado fue
seleccionado para los parmetros adicionales de la biotransformacin.

6.6.3 Evaluacin

de

las

fases

de

crecimiento

durante

la

biotransformacin del limoneno

Los ensayos fueron llevados a cabo en frascos equipados con tapn de tefln
de 22 mL, que contenan 5 mL del medio liquido MYB (pH 3.5). El medio de
cultivo fue inoculado con 50 L de esporas en suspensin pre-incubadas a
27C por 24, 72, 120, 168 y 216 h de acuerdo con las fases: lag; exponencial
temprana, exponencial media y exponencial final y las fase estacionaria, con
una agitacin de 150 rpm utilizando un orbital agitador, una vez el P.digitatum
alcanzaba la fase correspondiente, (R)-(+)-limoneno fue aadido al medio de
cultivo (pH 3.5) con una concentracin final de 14.7mM. La cintica de la
transformacin microbiana para cada bioconversin fue monitoreada 0, 24, 48 y
96 h despus de la reaccin.

La fase de crecimiento con la mayor

bioconversion fue seleccionada para evaluar parmetros adicionales.

6.6.4 Efecto de la concentracin del sustrato

Diferentes concentraciones de (R)-(+)-limoneno (5-100) mM fueron usadas.
Los ensayos fueron llevados a cabo en frascos equipados con tapn de tefln

de 22 mL en medio de cultivo lquido MYB (pH 3.5). El medio de cultivo fue

inoculado con 50 L de esporas en solucin y pre-incubadas a 27C durante 72
h (fase exponencial temprana) con una agitacin de 150 rpm. (R)-(+)-limoneno
fue aadido con una concentracin final de 5-100 mM.

La transformacin

microbiana fue monitoreada luego de 0 y 48 h de aadir el sustrato.

La

concentracin ptima fue seleccionada de acuerdo a ambos requisitos: alta

bioconversion y alta especificidad.

6.6.5 Efecto inductivo de (R)-(+)-limoneno

Con el objetivo de determinar un posible efecto inductivo del sustrato, los
experimentos de biotransformacin fueron llevados a cabo inoculando el medio
MYB (pH 3.5) con 50 L de esporas en solucin las cuales fueron obtenidas
previamente de un cultivo de crecimiento en presencia del inductor ((R)-(+)limoneno 14.7 mM). Las biotransformaciones fueron llevadas a cabo por 72 h a
27C Y 150 rpm, con (R)-(+)-limoneno 14.7 mM en el medio de cultivo, y
fueron monitoreados luego de 0, 8, 24 y 48 h.

6.6.6 Extraccin, identificacin y cuantificacin de (R)-(+)-limoneno y terpineol durante la biotransformacin del limoneno
Los productos y sustratos restantes de la biotransformacin fueron extrados en
dos ocasiones con acetato de etilo (2 x 2.5 mL) seguido por una centrifugacin
a 4000 rpm durante 5 min. La fase orgnica fue recogida y secada con anhidro
de Na2SO4 y a continuacin se concentr con una corriente de N 2.
Posteriormente se aadieron 3 L de n-tetradecano (estndar interno) y se
diluyo a 1 mL. El sustrato y los productos oxigenados fueron identificados y
cuantificados con una cromatografa de gases junto a un espectrmetro de
masas. La temperatura fue programada a 45C y mantenida por 10 min, luego
la temperatura se aument a una velocidad de 3C/min hasta alcanzar los
220C, manteniendo esta temperatura final durante 30 min. La identificacin de
los compuestos se llev a cabo mediante la comparacin de los espectros de

masa de las muestras con los con los siguientes espectros de los compuestos
de la base de datos ADAMS: NSB 75K, 138K NIST 05 y Wiley.
concentraciones

de

limoneno

-terpineol

en

cada

extracto

Las
fueron

cuantificadas por curvas de calibracin individuales, usando las relaciones de

rea de picos vs relaciones de cantidades de referencia de las muestras
autnticas. La eficiencia de recuperacin de producto en la extraccin lquidolquido de acetato de etilo fue previamente determinada para cinco
extracciones diferentes con cantidades conocidas de -terpineol y limoneno en
un medio de crecimiento celular fresco y en un caldo de cultivo envejecido. Se
extrajeron las cantidades de referencia, y las cantidades extradas de terpineol y limoneno fueron previamente determinadas.

Cada prueba fue

realizada tres veces y se calcul la tasa promedio de recuperacin.

7
7.1

ANLISIS E INTERPRETACIN DE RESULTADOS

Crecimiento microbiano de Penicillium digitatum DSM 62840 en
medio slido

Se compar el crecimiento del microorganismo en los tres medios de cultivo

mencionados anteriormente: PDA, MEA y YGA, como se puede observar en la
Figura 7. la tasa de crecimiento del P. digitatum en los medios de cultivo PDA
y YGA durante toda la evaluacin fue muy parecida, mientras que la tasa de
crecimiento en el medio de cultivo de YGA, fue muy lenta en la mayora del
tiempo monitoreado, aunque en la parte final de la evaluacin el dimetro de
las colonias en los tres medios de cultivos observados fue muy similar, lo cual
hace pensar en un tiempo de fase lag bastante mayor en el medio YGA que en
los otros cultivos observados; como se mencion en la metodologa, para la
evaluacin de los parmetros restantes se utiliz el medio de cultivo con el
mayor valor en la en la tasa de crecimiento del radio en la colonia del P.
digitatum DSM 62840, el cual se obtuvo en el medio PDA con una tasa de
crecimiento de (0.35 0.01 mm/h).
Figura 7. Cintica de crecimiento de P. digitatum DSM 62840 en
diferentes medios de cultivo en placas de agar a 23C

Tomada de: (Prieto, et al., 2011) modificada

7.2

Evaluacin de la actividad antifngica del sustrato

Con el objetivo de determinar la inhibicin del (R)-(+)-limoneno en el

crecimiento del cultivo de P. digitatum DSM 62840

la concentracin del

sustrato vario entre 0 y 280 mM. La actividad inhibitoria del (R)-(+)-limoneno

en el cultivo de P. digitatum en medio de cultivo PDA se muestra en la Tabla 1
y como se puede observar el valor de

la concentracin de 0.73 mM

corresponde a la mnima concentracin de inhibicin (MIC), mientras que la

concentraciones por encima de 257 mM fueron consideradas como
concentraciones letales (CL). Este efecto puede ser atribuido a la toxicidad del
(R)-(+)-limoneno, adems en la Figura 8 se puede observar como la relacin
entre la tasa de crecimiento del cultivo y la concentracin de (R)-(+)-limoneno
presenta una tendencia

inversamente proporcional, por lo que

investigacin se hizo necesario el uso de

porcentaje de inhibicin.

Se encontr

en la

la ecuacin 1 para calcular el

que la concentracin de (R)-(+)-

limoneno que produca una inhibicin promedio corresponda a 14.7 mM,

adems este valor tambin corresponda con un cambio abrupto en la tasa de
crecimiento del radio en el cultivo, tal como se observa en la Tabla 1.
Tabla 1 Actividad inhibitoria del (R)-(+)-limoneno en el medio de cultivo
PDA para el P. digitatum DSM 62840 a 23C

Concentracin de limoneno Porcentaje

de

TCR (mm/h)

(mM )

inhibicin (%)

0.47 0.01

0.73

0.41 0.02

1.46

6.7

0.41 0.02

3.65

13.3

0.41 0.02

7.35

17.3

0.40 0.02

14.7

22.7

0.31 0.02

25

28.2

0.30 0.07

36.75

30.7

0.27 0.04

73.4

34.7

0.23 0.05

88.08

40

0.17 0.02

110.1

46.7

0.13 0.03

132.12

58.7

0.12 0.02

185.5

80

0.09 0.03

220.2

85.3

0.08 0.01

256.9

100

0.00 0.00

280

100

0.00 0.00

Tasa de crecimiento del radio en la colonia

(mm/h)

Figura 8. Relacin entre la concentracin del (R)-(+)-limoneno y el

crecimiento del P. digitatum DSM 62840 en medio PDA a 23C
Efecto de la concentracin del sustrato en el cultivo de P.
digitatum DSM 62840
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

Concentracin de (R)-(+)-limoneno (mM)

7.3

EVALUACIN DEL PROCESO DE BIOTRANSFORMACIN DEL (R)(+)-LIMONENO

7.3.1 Efecto del tipo de cultivo

Los medios de cultivos que fueron usados en la investigacin contenan
compuestos nutritivos similares con concentraciones diferentes, para los
medios MYB y YG el (R)-(+)-limoneno era transformado solo en -terpineol. No
obstante, luego de 48 h de reaccin la concentracin de (R)--terpineol fue
aproximadamente 3 veces ms alta en el medio de cultivo MYB (1,585 19,59
mg/L) que en YG, como se muestra en la Figura 9, en el medio de cultivo
YMPG los productos de la biotransformacin solo aparecieron luego de 96 h y
se encontr que nicamente se haba formado trans-carveol, lo que lleva a
concluir que el medio de cultivo puede afectar tanto la especificidad como la
concentracin de los productos.

Figura 9. Efecto del medio de cultivo en la produccin de -terpineol a

partir de (R)-(+)-limoneno por P. digitatum DMS 62840. Condiciones del
medio de cultivo: pH 3.5, Temperatura 27C 150 rpm

Tomada de (Prieto, et al., 2011) modificada

En 48 h el contenido de -terpineol fue de 880,6 2,64 (mg de -terpineol / g
de clula seca). Una posible explicacin para el tiempo y el producto obtenido
en el medio de cultivo YG puede ser que la cantidad de la glucosa presente en
el medio fue suficiente para la alimentacin del P. digitatum, ya que como todos
los hongos tiene como fuente de carbono la glucosa, lo que se traducira en la
produccin de trans-carveol como un metabolito secundario.

Tal como se

indic en la metodologa y de acuerdo a los resultados el medio de cultivo MYB

fue utilizado para la evaluacin de los parmetros adicionales.
7.3.2 Efecto del pH
El efecto del pH en la capacidad de biotransformacin del P. digitatum fue
evaluado para diferentes valores de pH en el medio de cultivo MYB las clulas
de P. digitatum mostraron especificidad hacia la produccin de (R)-(+)limoneno para valores de 3.0 y 3.5 en el pH, como se puede observar en la
Tabla 2, mientras que para niveles de pH mayores a 4.5 la especificidad
disminuyo debido a la formacin de otros productos, sin embargo la produccin
de -terpineol fue mayor en todos los casos, valores de pH mayores a 4.5
promovan la formacin de otros compuestos oxigenados por medio de
reacciones

de hidroxilacin, isomerizacin oxidacin y ruptura cclica en

diferentes carbonos de (R)-(+)-limoneno como se muestra en la Figura 10

Tabla 2. Metabolitos producidos durante la biotransformacin de (R)-(+)limoneno por P. digitatum DSM 62840 a diferentes niveles de pH en medio
de cultivo MYB luego de 48 h de reaccin
pH de la biotransformacin
Concentracin (mg/L)
3

3.5

4.5

1061

439.1

67.1

28.2

982

1537

-Terpineol

40.5

34.9

1352 23.2 20.7

Linalool

n.d1

n.d

27.8 1.3

28.6 2.0

Trans-p-menta-2,8-dien-1-ol n.d

n.d

23.6 1.5

23.9 1.5

cis-p-menta-2,8-dien-1-ol

n.d

n.d

19.5 0.9

42.9 2.1

trans-carveol

n.d

66.9 3.4 20.1 1.2

30.1 1.9

cis-carveol

n.d

n.d

42.1 1.9

32.2 1.6

Carvona

n.d

n.d

27.3 1.0

23.0 1.2

Limoneno restante

Concentracin
productos

n.d: no detectado

total

de

1604
98 40.5 37.3

1641

530.6 21.9 39.5

288.1

1512.4

468.8

31.03

19.7

Figura 10. Productos de la biotransformacin de (R)-(+)-limoneno por

Penicillium digitatum DSM 62840 obtenidos en pH 4.5 y 6.0 en medio de
cultivo MYB a una temperatura de 27C y a 150 rpm

Para valores de pH entre 4.5 y 6.0 se presentan derivados oxigenados que no

se haban encontrado durante la investigacin, ni haban sido reportados en la
literatura para la biotransformacin de (R)-(+)-limoneno, lo que puede sugerir
que para valores ligeramente cidos de pH se ve favorecida la produccin de
metabolitos secundarios, adems del producto principal, el cual solo es posible
obtener a travs del rompimiento en el enlace de los carbonos 8 y 9 del
epxido obtenido. Tal como se muestra en la Tabla 2 y de acuerdo con la
metodologa de la investigacin el valor de pH con el cual se obtuvo la mayor
concentracin del producto principal (-terpineol) fue usado para la evaluacin
de los parmetros adicionales.

7.3.3 Evaluacin de las fases de crecimiento

Para estos experimentos se aadi limoneno en diferentes fases de
crecimiento del cultivo, la biotransformacin fue monitoreada cada 24 h durante
96 h, la tasa ms alta de produccin de -terpineol (1667 49,70 mg/L) fue
obtenida, tal como se esperaba en la fase temprana de crecimiento
exponencial la produccin de -terpineol fue bastante mayor que en las otras
fases de crecimiento como se muestra en la Figura 11, adems durante las
primeras 48 h todas las cantidades de -terpineol crecieron con bastante
rapidez, tambin en estas 48 primeras horas la produccin de -terpineol fue
muy parecida en la fase lag y en la fase estacionaria y para el final de las 48 h
las cantidades obtenidas en los productos en las fases lag, estacionaria y
exponencial final fue muy similar y luego de 48 h los productos obtenidos en
todas las fases se mantuvieron constantes
Figura 11. Efecto de la adicin de limoneno en diferentes fases de
crecimiento de Penicillium digitatum DSM 62840 en la concentracin de terpineol. Condiciones del cultivo: medio de cultivo MYB, temperatura
27C, pH 3.2 y 150 rpm

Tomada de (Prieto, et al., 2011) modificada

Es necesario sealar que si bien la biotransformacin de (R)-(+)-limoneno a terpineol ocurre principalmente en la fase exponencial y que en la Figura 11
se puede observar un cambio abrupto entre la fase exponencial inicial y final
(50-60%), pero no se encontraron registros en la literatura que permitieran una

transicin entre la fases de crecimiento exponencial inicial, media y final, por lo

que la fase exponencial media no fue mostrada en la Figura 11

7.3.4 Efecto de la concentracin del sustrato

En la mayora de los casos altas concentraciones de disolventes orgnicos
pueden llegar a ser txicos para sistemas biolgicos, por lo que se probaron
concentraciones del sustrato que variaron en un rango de 10-100 mM con el
objetivo de optimizar la bioconversion del (R)-(+)-limoneno a -terpineol y como
se puede ver en la Tabla 3 las concentraciones entre 10 y 15 mM favorecen la
formacin del producto principal mientras que concentraciones ms elevadas
no solo afectan la obtencin de -terpineol, sino que tambin la especificidad,
lo que traduce en la aparicin de otros productos que pueden observarse en la
Figura 12
Tabla 3 Produccin de metabolitos durante la biotransformacin de (R)(+)-limoneno, usando P. digitatum DSM 62840, en medio MYB a 27C, 150
rpm y pH 3.5

Concentracin de (R)-(+)-limoneno (mM)

Sustrato

productos (mg/L)

10

Limoneno

964.7

restante

40.70

-Terpineol

Otros productos

357
15.34

15

30

50

75

100

317

2319

4866

7432

10566

56.98

50.82

57.89

25.50

44. 67

1537

1039

34.95

37.36

67
3.43

484
16.26

634
26.26

704
19.97

697

496

23.75

18.84

1477

1745

24.73

32.23

Biotransformacin 357
total

15.34

1604

1523

1338

2174

2241

37.33

29.98

22.28

20.76

31.19

Biotransformacin (%)

26.20

75.21

25.42

1.13

1.71

0.91

9.31

6.82

3.64

0.39

0.23

0.14

Adems los resultados concuerdan con el valor obtenido en la concentracin

de limoneno que permita una tasa de crecimiento del Penicillium digitatum
DSM 62840 en el medio de cultivo PDA que a su vez produca un valor
aceptable en el porcentaje de la inhibicin por parte del sustrato al P. digitatum,
por lo que se puede afirmar que en este caso la concentracin del sustrato se
encuentra fuertemente relacionada con la tasa de crecimiento del cultivo y con
la biotransformacin del sustrato al producto principal, adems de corroborar
que el -terpineol es un metabolito primario del P. digitatum DSM 62840
En la Figura 12 se muestran los productos de la biotransformacin a una
concentracin de 10 mM (B) y 100 mM (A) y se puede notar que con una
concentracin de 10 mM la produccin de -terpineol es mucho mayor que una
concentracin de 100 mM del sustrato, adems con 10 mM no se presenta la
obtencin en grandes cantidades de otros productos tales como: cis / trans
carveol, carvona, 1,2 - diol limoneno, cis-p-ment-2,8-dien-1-ol, fenil etanol
(picos 5, 6,7, 8, 9 y 12, respectivamente), -pineno, sabineno, mirceno (picos 1,
2 y 3), y dos no identificados (Picos 11 y 14) que aparecen a una concentracin
de limoneno de 100 mM, y en general luego de concentraciones del sustrato
mayores a 30 mM.

Figura 12 Cromatograma obtenido en la biotransformacin de (R)-(+)limoneno por Penicillium digitatum DSM 62840 en medio de cultivo MYB a
27C, 150 rpm y pH 3.5. A: limoneno 100 mM; B: limoneno 15 mM

Tomada de (Prieto, et al., 2011)

7.3.5 Efecto

inductivo

del

(R)-(+)-limoneno

en

la

capacidad

de

biotransformacin
La adicin previa del (R)-(+)-limoneno al medio de cultivo utilizado en la
investigacin (MYB) produjo un aumento en la produccin de -terpineol del
14.58%, de acuerdo con el control realizado luego de 48 h (a partir de 48 h la
produccin de -terpineol decae considerablemente), como se puede observar
en la Tabla 4 y en las figuras Figura 13 y Figura 14, los resultados sugieren
que las enzimas involucradas en la biotransformacin son inducidas por el (R)(+)-limoneno, ya que en presencia del limoneno la concentracin obtenida de terpineol y por tanto la bioconversion aumentan, adems algunos estudios han
determinado que la enzima involucrada es una monooxigenasa cytochromo P450 (Tan, et al., 1998)

Tabla 4. Biotransformacin de (R)-(+)-limoneno por P. digitatum DSM

62840 de acuerdo con la presencia y ausencia de un inductor
Concentracin
Tiempo

(mg

- Bioconversin

terpineol/L)

del

limoneno

(%)

(h)
sin inductor

con inductor

sin inductor

con inductor

0.00

0.00

0.00

0.00

492 10.90

763 15.90

24.07 0.53

37.34 0.78

24

1154 18.81

1308 22.21

56.47 0.92

64.00 1.09

48

1585 19.51

1835 42.43

77.40 1.32

89.79 2.66

Concentracin de terpineol (mg/L)

Figura 13. Efecto inductivo del (R)-(+)-limoneno en la produccin de terpineol por Penicillium digitatum DSM 62840

Efecto inductivo del sustrato en en la produccin de terpineol

2000.00
1000.00

sin inductor

0.00

con inductor
0

10

20

30
Tiempo (h)

40

50

60

Figura 14. Efecto inductivo del (R)-(+)-limoneno en la bioconversion de

(R)-(+)-limoneno por Penicillium digitatum DSM 62840

Bioconversin (%)

Efecto inductivo del sustrato en la bioconversin

100.00
80.00
60.00
40.00

sin inductor

20.00

con inductor

0.00
0

10

20

30
tiempo (h)

40

50

60

CONCLUSIONES

Los resultados de la investigacin llevados a cabo por (Prieto, et al., 2011) para
obtener la mayor cantidad de -terpineol a partir de (R)-(+)-limoneno por
Penicillium digitatum DSM 62840 fueron: medio de cultivo lquido MYB a pH
3.5 inoculado con esporas inducidas y crecidas en el inicio de la fase
exponencial, con una concentracin de limoneno de 14.7 mM, el sustrato se
transform

de

manera

especfica

(R)-(+)--terpineol.

La

mxima

concentracin alcanzada fue de 1835 (mg/L), adems se determin que el

limoneno tena un efecto inductor en el Penicillium digitatum DSM 62840, con el
que se alcanz una tasa de biotransformacin del 89.79%

BIBLIOGRAFA

Abraham , W. y otros, 1985. Microbial transformation of some monoterpenoids

and sesquiterpenoids. En: Pitman, ed. Enzymes in organic synthesis. London:
Ciba Foundation symposium, pp. 146-160.
Bathia, S. y otros, 2008. Fragance material review on terpineol. Food and
Chemical Toxicology, Volumen 46, pp. 275-279.
Bicas , J., Silva , J., Dionsio, A. & Pastore , G., 2010. Biotechnological
production of bioflavors and functional sugars. Cincia e Tecnologia de
Alimentos, Volumen 30, pp. 7-18.
Borges, K. y otros, 2009. Stereoselective biotransformations using fungi as
biocatalysts. Tetrahedron: Asymmetry, Volumen 20, pp. 385-397.
Castellanos, F., 2007. Biotransformacin de limoneno, a-terpineol y aceites
esenciales

de

naranja

mandarina

empleando

Aspergillus

niger.

Bucaramanga: s.n.
de Caravalho, C. & da Fonseca, M., 2006. Biotransformation of terpenes.
Biotechnology Advances, Volumen 24, pp. 134-142.
Demyttenarae, J., van Belleghem, K. & De Kimpe, N., 2001. Biotransformation
of (R)-(+)- and (S)-(-)-limonene by fungi and the use of solid phase
microextraction for screening. Phytochemistry, Volumen 57, pp. 199-208.
Duetz,

W.,

Bouwmeester,

H.,

van

Beilen,

J.

& Witholt,

B.,

2003.

Biotransformation of limonene by bacteria, fungi, yeasts, and plantes.

Microbiology Biotechnolgy, Volumen 61, pp. 269-277.
Garcia , M., Quintero , R. & Lopez-Munga, A., 2004. Biotecnologa alimentaria.
5 ed. Mxico: Limusa.

Guo-xing, J., Neng-guo, T., Lei, J. & Hai-en , Z., 2015. Influence of a-terpineol
on the growth and morphogenesis of penicillium digitatum. Botanical Studies,
Volumen 56, pp. 1-6.
Lemos, J. y otros, 2008. Optimization of R-(+)-a-terpineol production by the
biotransformation of R-(+)-limonene. Microbiology Biotechnology, Volumen 35,
pp. 1061-1070.
Lemos, J., Fontanille, P., Pastore, G. & Larroche, C., 2010. A bioprocess for the
production of high concentrations of (R)-(+)-a-terpineol from (R)-(+)-limonene.
Proccess Biochemistry, Volumen 45, pp. 481-486.
Marcet-Hauben, M. y otros, 2012. Genome sequence of the necrotrophic
fungus Penicillium digitatum, the main postharvest pathogen of citrus. BMC
Genomics, Volumen 13, pp. 1471-1264.
Marmann, A., Thommes, M., Schuchmann, H. & Tackenberg, M. W., 2014.
Orange terpenes, carvacrol and a-tocopherol encapsulated in maltodextron and
sucrose matrices via batch mixing. Journal of Food Engineering, Volumen 135,
pp. 44-52.
Marstica, M. & Pastore, G., 2006. Biotransformao de limoneno: uma reviso
das principais rutas metablicas. Quimica Nova, 30(2), pp. 1-6.
Marstica, M. & Pastore, G., 2007. production of (R)-(+)-a-terpineol by the
transformation of limonene from orange essential oil, using cassava waste
water as medium. Food Chemistry, Volumen 101, pp. 345-350.
Molina, G. y otros, 2015. Comparative study of the bioconversion process using
R-(+)- and S-(-) limonene as substrates for Fusarium oxysporum 152B. Food
Chemistry, Volumen 174, pp. 606-613.
Pinto, E. y otros, 2014. Activity of Thymus caespititius essential oil and aterpineol against yeasts and filamentous fungi. Industrial Crops and Products,
Volumen 62, pp. 107-112.

Prieto, G., Perea, J. & Ortiz, C., 2011. Microbial Biotransformation of (R)-(+)Limonene by Penicilliium digitatum DSM 62840 for Producyng (R)-(+)-aterpineol. Vitae, Volumen 18, pp. 163-172.
Schewe, H., Pescheck, M., Sell, D. & Shrader, J., 2006. Biotechnological
production of terpenoid flavour and fragrance compounds in tailored
bioprocesses. Flavour Science: Recent Advances and Trends, pp. 45-48.
Schrader, J. y otros, 2004. Applied biocatalysis for the synthesis of natural
flavour compounds current industrial processes and future prospects.
Biotechnology letters, Volumen 26, pp. 463-472.
Shukui, H. y otros, 2016. Microemulsification of clove essential oil improves its
in vitro and in vivo control of penicillium digitatum. Food Control, Volumen 65,
pp. 106-11.
Stolk, C., Samsom, R., Frisvad, J. & Filtenborg, O., 1990. The systematics of
the terverticillate Penicillia. En: R. Samson & J. Pitt, edits. Modern concepts in
Penicillium and Aspergillus Classification. New York: Plenum press, p. 127.
Tackenberg, M. y otros, 2014. Orange terpenes, carvacrol and a-tocopherol
encapsulated in maltodextrin and sucrose matrices via batch mixing. Journal of
Food Engineering, Volumen 135, pp. 44-52.
Tan, Q., Day, F. & Cadwallader, K., 1998. Bioconversion of (R)-(+)-limonene by
P. digitatum (NRRL 1202). Process Biochemistry, Volumen 33, pp. 29-37.
Trinci, A., 1969. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and other
fungi. Gen Microbiol., Volumen 57, pp. 11-24.
Yoshiaki , N. & Yoshinori, A., 2016. Biotransformation of Monterpenoids by
Microorganisms, Insects, and Mammals. En: Handbook of Essential Oils:
Science, Technology, and Applications. Boca ratn: Taylor and Francis, p. 769.