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Departament de Biotecnologia

PRACTICA N 1. La tcnica histolgica (1): Obtencin y fijacin del material.


(Joaqun De Juan Herrero)
1. INTRODUCCIN:
En cualquier estudio de Biologa Celular, Histologa e Histopatologa (estudio
microscpico de las lesiones), se trata de obtener, a travs del microscopio (Figura 1), datos
microscpicos (imgenes microscpicas) de organismos o partes de los mismos (objetos
microscpicos) normales (msculo, cerebro, rin, ...) o alterados (lesiones: tumores,
inflamaciones, necrosis, ...) para analizarlos y reconstruir modelos conceptuales
microscpicos que nos permitan explicar como estn hechos los organismos y as poder
responder a las diferentes preguntas que sobre ellos se hace cualquier observador.

Figura 1: Principales pasos en la obtencin de datos utilizando el microscopio. En


ocasiones con el ojo desnudo o con lupas (microscopio simple) es posible observar
pequeos detalles situados en la frontera entre lo macroscpico y lo microscpico u
observacin macro-microscpica. (De Juan, 1999).

Cuando el objeto de nuestro estudio son las asociaciones celulares de los organismos
clasificados como metafitas y metazoos, las imgenes observadas con el microscopio
(Figuras 2 y 3) las denominamos imgenes histolgicas, dndole el nombre de objetos
histolgicos a los componentes microscpicos de donde las imgenes proceden (rganos,
tejidos y clulas). Para obtener imgenes histolgicas, a partir de objetos histolgicos, es
preciso someter a estos ltimos a un conjunto de procedimientos de laboratorio que
denominaremos tcnica histolgica.

Figura 2: Principales pasos en la obtencin de datos o imgenes histolgicas. Cualquier


observador, con un microscopio puede observar imgenes histolgicas a partir de un
determinado objeto histolgico, convenientemente procesado con la tcnica histolgica.
Con sus observaciones puede reconstruir un modelo del objeto histolgico estudiado. (De
Juan (1999).

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Figura 3: Principales pasos en la obtencin de datos utilizando el microscopio. A partir de


un cerebro y tras procesar con la tcnica histolgica un pequeo fragmento de la corteza
(objeto histolgico) se obtienen imgenes histolgicas que el observador interpreta,
generando en su cerebro un modelo de la realidad (modelo histolgico). (Modificado de
De Juan, 1980)

A modo de introduccin, podemos definir la tcnica histolgica como;


El conjunto de actividades y procedimientos de laboratorio, que nos
permiten observar y obtener, a travs del microscopio, imgenes
histolgicas a partir de objetos histolgicos.

Figura 4: Los elementos bsicos de la tcnica histolgica. (De Juan , 1999).

De forma esquemtica podemos reducir a tres, los elementos bsicos a considerar en


el anlisis de la tcnica histolgica (Figura 4):
A) El objeto a estudiar (objeto histolgico real) con el microscopio, debe ser
adecuadamente preparado para su perfecta observacin. Es precisamente esta manipulacin y
preparacin del material de estudio, una parte muy importante de la tcnica histolgica.
B) El observador, que extrae la informacin de los objetos histolgicos reales
procesados con la tcnica histolgica, analizando las imgenes histolgicas obtenidas de
las preparaciones histolgicas. Estas imgenes pueden ser observadas directamente, a

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travs del microscopio, o almacenadas en diferentes soportes (papel o digital). A partir de


ellas el observador puede reconstruir un modelo histolgico conceptual del objeto
histolgico real. De los aspectos que el observador selecciona para su estudio, surgen
nuevos problemas que generan nuevas tcnicas de estudio.
C) El microscopio, condicin sine qua non para la existencia de la Histologa. Con
l observamos y capturamos las imgenes histolgicas (fotografas, diapositivas,
documentos digitales, etc.).
Aunque la histologa y la histopatologa, estn cada vez ms prximas a la
Biologa Molecular, la utilizacin del microscopio sigue siendo la
caracterstica tcnica ms importante de estas disciplinas.

2. OBTENCIN Y PROCESAMIENTO DEL MATERIAL:


2.1. Diferentes formas de estudiar los organismos:
La Biologa es la ciencia que estudia los organismos.
Dicho estudio se puede realizar considerando a los organismos (Cuadro 1 y Figura 5)
como comunidades o como individuos independientes con sus distintos niveles de
complejidad (sistemas, rganos, tejidos, clulas, etc.). La Ecologa y la Epidemiologa son
ejemplos de disciplinas que utilizan las tcnicas de campo para estudiar a los organismos
como comunidades. La Histologa, la Anatoma, la Fisiologa, la Bioqumica, etc. Tienen al
individuo como objeto de estudio.
Cuadro 1: Mtodos y tcnicas generales para el estudio de los
organismos (De Juan, 1999)
__________________________________________________________
1) Los organismos como partes de una comunidad:
Tcnicas de campo:
Etologa
Ecologa
Sociobiologa
Biogeografa
.......................
Estudios epidemiolgicos
2) Los organismos como individuos (ver cuadro 2).
3) Estudio mixto de los organismos como comunidades y como
individuos:
Zoologa
Botanica
......................
__________________________________________________________

Entre los mtodos que se ocupan de estudiar a los organismos como individuos, se
distinguen dos formas diferentes (Cuadro 2 y Figura 5), segn recaigan sobre el individuo
ntegro y vivo (Mtodos holsticos o estudios "in vivo") o sobre partes aisladas del
individuo (Mtodos reduccionistas).

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Figura 5: La Biologa estudia los organismos como individuos (A) o como comunidades (B). El
estudio de los individuos puede ser holstico (A) o reduccionista (C). Disciplinas como la ecologa,
la epidemiologa o la biogeografa, estudian comunidades mientras que la anatoma, bioqumica,
fisiologa, histologa, etc. estudian individuos tanto desde el punto de vista holista (A) como
reduccionista (C).
Cuadro 2: Mtodos y tcnicas generales para el estudio de
los organismos (De Juan, 1999)
_______________________________________________
Mtodos holsticos o estudios in vivo
1) Gota pendiente
2) Transiluminacin
3) Cmaras transparentes
4) Injertos blefoblsticos
5) PET (Tomografa por Emisin de Positrones)

Mtodos reduccionistas (sobre partes de un individuo)


Atendiendo a la parte del organismo:
A) Preparaciones enteras (Wholemount)
B) Tejidos
C) Clulas aisladas
D) Orgnulos celulares aislados
E) Macromolculas
Atendiendo al modo de obtener la parte:
A) Diseccin, microdiseccin, micromanipulacin, etc.
B) Maceracin
C) Digestin enzimtica
D) Frotis e impronta
E) Squasch
F) Cortes
Atendiendo al estado vital de las clulas:
A) Estudios en fresco:
a) Material supravital y estudios in vivo
b) Material postvital
B) Estudios en material fijado
_______________________________________________

A) Estudios holsticos o "in vivo":


Son aquellos en los que se analizan los rganos y los tejidos vivos, "in situ", en su
estado natural. Son muchos los procederes empleados para este tipo de estudios, entre ellos
destacaremos los siguientes:

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a) Mtodo de la gota pendiente: se utiliza para el estudio de clulas y


microorganismos (bacterias, protozoos, etc.) inmersos en una gota, suspendida de un
cubreobjetos (Lamina 1, Figura 6).
b) Transiluminacin de rganos exteriorizados: consiste en observar "in situ", por
transparencia, los rganos o finas membranas como el mesenterio de pequeos animales
vivos, a travs un microscopio. Se trata de un mtodo especialmente til en el estudio de la
circulacin.
c) Mtodo de la cmara transparente (Lamina 1, Figura 7): es uno de los mtodos
ms tiles para estudiar material "in vivo". Son cmaras metlicas y de cristal o plstico que
instaladas en las orejas de conejo (cmara de CLARK y CLARK) o en la piel del ratn
(ALGIRE y LEGALLAIS) permiten observar, a pocos aumentos, la circulacin en pequeos
vasos. Con ellas se han realizado estudios "in vivo" sobre el crecimiento de vasos snguineos
y nervios, migracin de leucocitos desde los vasos, desarrollo de clulas adiposas, etc.
d) Injertos blefoblsticos (Lamina 1, Figura 8): la cmara anterior del ojo es una
cmara transparente y natural, en la que pequeos fragmentos de tejidos, procedentes del
mismo animal, pueden ser transplantados y adquirir vascularizacin desde el ngulo
corneoiridial. De esta manera, las clulas y tejidos as transplantados, sumergidos en un liquido
fisiolgico (el humor acuoso), pueden ser observados con un microscopio a travs de la
cornea.
e) Otras tcnicas: la tcnica empleada por el grupo de Purves para estudiar, en el
animal vivo, los cambios en las dendritas de clulas de los ganglios simpticos. Dentro de este
grupo estaran tcnicas como la Tomografa por Emisin de Positrones (PET) y la Resonancia
Nuclear (MR) de importante aplicacin en Medicina.
B) Estudios reduccionistas:
A diferencia de los holistas, en los mtodos reduccionistas el organismo es estudiado
en sus diferentes partes, separadas del mismo. Entre los mtodos reduccionistas podemos
distinguir diferentes tipos atendiendo a la parte del organismo estudiada, al modo de obtener
esas partes y al estado vital de sus clulas.
a) Atendiendo a la parte del organismo: se estudian desde rganos enteros
(preparaciones enteras o "wholemounts") hasta sus ms pequeas molculas, pasando por
sus tejidos, clulas y organoides. En las preparaciones enteras (Lamina 1, Figura 9), la pieza
es estudiada en su totalidad, sin separar sus componentes y sin realizar cortes en ella.
b) Atendiendo al modo de obtener la parte a estudiar:
Tcnicas de separacin o de disociacin: consiste en aislar los diferentes elementos
constitutivos de un rgano o tejido. Entre las diferentes tcnicas de separacin podemos
sealar las siguientes:
- Separacin por centrifugacin (Lamina 1, Figura 10): en general se aplican al
estudio de lquidos como, por ejemplo, la sangre en la que mediante centrifugacin podemos
separar los leucocitos del resto de los componentes.
- Separacin por homogeneizacin y ultracentrifugacin diferencial (Lamina1, Figura
10): tras homogeneizar los rganos, tejidos o clulas, sus componentes subcelulares (ncleos,
mitocondrias, ribosomas, etc.) son separados al ser sometido, el homogeneizado, a diferentes
aceleraciones de una ultracentrifuga.
- Separacin por micromanipulacin (Lamina 1, Figura 11): se trata de un conjunto de
tcnicas caracterizadas por el uso de varios artilugios de precisin (microagujas,
microbisturies, micropipetas, micropinzas, etc.), adosados a una lupa o microscopio, para
manipular clulas y tejidos a nivel microscpico. Con estas tcnicas es posible realizar
microdisecciones, separar fibras nerviosas (tcnica del "teasing"), transplantar ncleos

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celulares, etc.
- Separacin por maceracin: separacin de componentes tisulares por la accin de
determinados lquidos como el alcohol, el hidrxido de potasio, la solucin de Mller, etc. agua,
micromanipuladores, etc.). Con esta tcnica se pueden aislar estructuras microscpicas
complejas como las nefronas del rin.
- Disociacin o digestin enzimtica: en otras ocasiones la separacin de los
componentes de un tejido u rgano puede ser realizada mediante la utilizacin de enzimas
como la pepsina, la tripsina, la papaina, etc.
Tcnica del frotis ("smear") y de la impronta (Lamina 1, Figuras 12 y 13) la
extensin o frotis, frottis en frances) consiste en extender, sobre un portaobjetos, una gota de
una solucin en la que se encuentran suspendidos elementos celulares (sangre, bacterias,
espermatozoides, etc.), para su observacin con el microscopio. La impronta consiste en poner
en contacto la superficie de corte de un rgano (por ejemplo un ganglio linftico) con la
superficie del portaobjetos, de esta forma una fina capa de clulas queda adherida a la
superficie de este para su observacin al microscopio. Una vez realizadas la extensin o la
impronta, las clulas pueden ser teidas con diferentes tcnicas segn convenga.
Tcnica del aplastamiento ("squash"): consiste en aplastar el objeto de estudio entre
el portaobjetos y el cubreobjetos. De esta forma se realiza a la vez una disociacin y una
extensin. Es una tcnica rudimentaria, pero rpida y til en algunos casos.
Tcnica de los cortes:
Consiste en obtener secciones muy finas del material objeto de estudio, para su
mejor observacin con los microscopios de transmisin, al pasar la luz o los electrones a travs
de ellos. Tambin son importantes el estudio de cortes de rganos ("slices") para analizar su
metabolismo, su composicin o para registrar, electrofisiolgicamente, las caractersticas de
sus clulas.
c) Atendiendo al estado vital de las clulas:

Figura 13: Atendiendo al estado vital de las clulas y tejidos extrados de un organismo tenemos diferentes formas de
estudiar el materia. El material extrado de un organismo vivo, es un material fresco que tiene un periodo de vida
denominado periodo supravital. Este periodo se puede prolongar colocando las muestras en soluciones fisiolgicas
(estudios in vitro) o mediante criopreservacin, congelando adecuadamente el material. Si el tejido ha superado el
periodo supravital, los estudios se denominan postvitales. Otra alternativa es fijar el material.

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Estudio en fresco: estudio del material biolgico, tal y como se obtiene del
organismo (fresco), sin fijar. Podemos distinguir diversas modalidades:
- Estudio supravital: realizado en material fresco, obtenido en el periodo supravital o
perodo de tiempo que media entre el momento que de un tejido deja de recibir aporte
sanguneo hasta su necrosis (Figura 13). Esto ocurre al morir un organismo o en la
separacin, accidental o quirrgica, de alguna de sus partes (extraccin de rganos,
amputaciones, etc.). En el periodo supravital, todava existe actividad metablica que puede
ser prolongada colocando la muestra en soluciones fisiolgicas (Ringer, Tyrode, Krebs, etc.).
Los estudios, en los que el material se mantiene "vivo" de ese modo, reciben el nombre de
estudios "in vitro" (cultivo de tejidos, cortes de rganos vivos, cortes de Warburg, etc.).
- Estudio postvital: Cuando los estudios se realizan sobre muestras en las que se ha
superado el periodo supravital, hablamos de estudios postvitales. Esto ocurre en piezas
anatmicas, separadas del organismo sin fijacin ni conservacin. Tambin en muestras de
organismos muertos recientemente (necropsias) o tras mucho tiempo despus del fallecimiento
(restos de carcter forense, arqueolgico, paleopatolgico o paleontolgico). En todos estos
casos, el material pude ser tratado de diferentes formas segn la informacin que deseemos
obtener de l (Figura 13).
Estudios en material fijado:
En este tipo de tcnicas, que por otra parte son las ms habituales en Histologa, el
material a estudiar es sometido a una serie de agentes qumicos y ocasionalmente fsicos para
detener los procesos de autolisis y putrefaccin, as como permitir la conservacin, lo ms
fidedigna posible, de la estructura real del objeto a estudiar con el microscopio.
2.2. Introduccin a la tcnica histolgica:
En la figura 14, se recogen muchos de los procedimientos o tareas que se pueden
llevar a cabo en la tcnica histolgica. De todos ellos los remarcados en rojos son los ms
habituales en los laboratorios de histologa y de anatoma patolgica y cuyas caractersticas
sern objeto de sta y de las siguientes prcticas.

Figura 14: Principales procedimientos de la tcnica histolgica. A partir de muestras de organismos


frescas (1), fijadas (2) o procedentes de cultivos celulares, la tcnica histolgica puede seguir diferentes
caminos, dependiendo de los objetivos que nos propongamos. En esta prctica nos centraremos en la
obtencin del material y su fijacin.

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El primero de los procedimientos de la figura 14 (1) es la obtencin del material


cuya procedencia puede ser de organismos vivos o muertos, o de material procedente de
estudios in vitro, como los cultivos celulares. Una vez obtenidas las muestras, pueden ser
utilizadas directamente (material fresco), fijadas (punto 2 de la figura 14) o congeladas (punto 3
de la figura 14). En el siguiente apartado de esta prctica abordaremos el estudio de la fijacin.
3. LA FIJACIN DE CLULAS Y TEJIDOS
3.1. Concepto y tipos de fijacin:
Una vez obtenido el material de estudio (nmero 1 de la figura 14), la fijacin
(nmero 2 de la figura 14), es el primer paso en la inmensa mayora de los casos en los que se
utiliza la tcnica histolgica. Se trata de un procedimiento histolgico que presenta las
siguientes caractersticas fundamentales:
a) Permite paralizar la dinmica funcional del organismo o de una muestra del
mismo, al tiempo que conserva su estructura y detiene los procesos enzimticos de los
tejidos, evitando su autolisis y putrefaccin.
b) La conservacin de la estructura del organismo o de los especmenes
procedentes de l, se debe al establecimiento de enlaces cruzados entre las protenas y entre
estas y los grupos reactivos de las molculas de los tejidos.
c) Preserva, sin coagulacin de las protenas, los componentes de los tejidos y los
protege de los posibles efectos "traumticos" debidos a las manipulaciones ulteriores
(diseccin, deshidratacin, inclusin, etc.) evitando adems la retraccin de los tejidos.
d) Modifica la reactividad de los tejidos frente a diferentes agentes, de forma que
determinados grupos reactivos de los tejidos pueden quedar enmascarados o activos, segn
interese.
e) Facilita o evita, segn el caso, la difusin de substratos a travs de las membranas
celulares.
La fijacin puede ser llevada a cabo por diferentes agentes que se pueden dividir en
dos grandes grupos: fijacin de naturaleza qumica y fijacin de naturaleza fsica.
3.2. Fijacin de naturaleza qumica:
A) Tipos de fijadores qumicos
Se trata de diferentes sustancias, generalmente en forma lquida, que fijan las
estructuras de cuatro formas diferentes, a saber:
a) Por deshidratacin: Es llevada a cabo por sustancias como el alcohol etlico y
la acetona;
b) Mediante la formacin de sales: puede ser realizada por mltiples sustancias
tales como el cloruro de mercurio y el bicromato potsico, por poner un par de ejemplos.
c) Modificando el estado coloidal: as funcionan el cidos actico y el
tricloroactico, mximos representantes de la fijacin por este medio.
d) Por reticularizacin de las protenas: el cido smico y algunos aldehdos
como la formalina, el paraformaldehdo y el glutaraldehdo, entre otras sustancias, son
fijadores que actan preferentemente desnaturalizando y reticularizando las protenas. En
general los fijadores de tipo aldehdo previenen de la perdida de protenas y de los artefactos
que producen las soluciones crioprotectoras, pero no protegen de la perdida de iones y de sus

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consecuencias.
e) Mezclas fijadoras: se da ese nombre a la combinacin de varios fijadores. Las
mezclas de aldehdos dan mejores resultados que los utilizados solos, sobre todo cuando se
selecciona con cuidado las proporciones adecuadas. Una mezcla tpica es la formada por
glutaraldehdo y paraformaldehdo. El ltimo penetra rpidamente y reacciona pronto,
mientras que el primero establece reacciones ms estables y eficientes. Son especialmente
tiles en microscopa electrnica e incluso en inmunocitoqumica electrnica.
Existen mezclas de aldehdos como glutaraldehdo y acroleina y otras no
aldehdicas como imidoesteres, lisina y carbodiimide.
B) Formas de realizar la fijacin qumica
La fijacin puede llevarse a cabo de dos maneras, bien introduciendo las piezas en el
fijador (fijacin por inmersin) o bien introduciendo el fijador dentro del sistema vascular del
animal en cuyo caso hablamos de fijacin por perfusin (Figura 15).
La perfusin vascular del fijador es el mtodo ideal para minimizar el dao fsico de
las piezas y obtener una fijacin uniforme en superficie y en profundidad. En la fijacin por
inmersin esta no es uniforme ya que se fijan primero las estructuras superficiales y luego las
profundas.

Figura 15: Fijacin por perfusin. Consiste en introducir el fijador en el rbol circulatorio del animal vivo y anestesiado.
De esta forma alcanza muy rpidamente hasta el ltimo rincn de sus clulas. Es la mejor tcnica para obtener buenas
imgenes en microscopa electrnica de transmisin.

3.3. Fijadores de naturaleza fsica:


La temperatura y las microondas son agentes fsicos utilizados en algunos
procedimientos de fijacin de los tejidos.
El calor se utiliza tradicionalmente para fijar las extensiones celulares o frotis (Figura
12), pasando el porta con la extensin de clulas, de forma suave, rpida y controlada, sobre la
llama de un mechero. De esta forma el calor coagula las protenas y produce una fijacin casi
instantnea. Clsicamente, para lograr fijaciones rpidas (en biopsias peroperatorias), se
calentaba el fijador para su ms rpida penetracin en la pieza. Actualmente el efecto calrico
en la fijacin se consigue utilizando hornos microondas comercializados ad hoc. Estos
instrumentos han alcanzando una amplia difusin y tienen como ventaja su rapidez de accin
cuando se aplican sobre piezas sumergidas en fijadores qumicos.
El fro, mediante la congelacin (nmero 3 en la Figura 14) de las muestras

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biolgicas, se utiliza como un medio para su conservacin durante largos periodos de tiempo
(criopreservacin). En este sentido, la congelacin se comporta como una forma de fijacin
alternativa y como veremos en otra prctica , como un modo de obtener cortes histolgicos.
La aplicacin de bajas temperaturas en el procesamiento de muestras biolgicas para
microscopa, se han desarrollado ampliamente (criometodos) en las ltimas dcadas, con la
finalidad de preservar lo mejor posible la estructura real o nativa del material y para
identificacin de molculas in situ.
Los mtodos histolgicos convencionales empleados para preparar muestras
biolgicas suponen un tratamiento agresivo de clulas y tejidos, en cuanto que son sometidos
a poderosos agentes fijadores qumicos, a deshidratacin con disolventes orgnicos a
temperatura ambiente, a inclusiones en resinas a altas temperaturas, etc. Todos estos
procedimiento, alteran profundamente la estructura de clulas y tejidos y modifican la
reactividad frente a marcadores de molculas.
En contraposicin, los criomtodos actuales conservan la reactividad qumica y
antignica de la muestra, mantiene la ultraestructura y los componentes celulares y tisulares
ms prximos a su estado nativo, lo que facilita el acceso de sondas y anticuerpos a sus
correspondientes substratos.
3.4. Caractersticas de una buena fijacin:
La fijacin debe realizarse siguiendo las siguientes reglas: Rapidez, volumen de
fijador adecuado, tiempo adecuado de fijacin, presin osmtica adecuada, manipulacin
delicada del material y tamao de la pieza:
a) Rapidez:
Consiste en no dejar pasar mucho tiempo desde la obtencin de la muestra o muerte
del organismo y la fijacin, para evitar cambios en la estructura debidos a la autolisis. La
fijacin por perfusin es ideal en este sentido.
b) Volumen de fijador adecuado:
Debe utilizarse una cantidad adecuada de fijador. La proporcin entre el volumen de
la pieza y del fijador debe ser de 1/12 a 1/20. El fijador debe baar toda la superficie de la
pieza y debe usarse tan solo una vez.
c) Tiempo adecuado de fijacin:
Deben evitarse largos tiempos de fijacin sobre todo en microscopa electrnica.
d) Presin osmtica adecuada:
El liquido fijador debe tener una presin osmtica adecuada que se puede calcular
con un osmmetro, mediante ensayo error o bien usando tablas al respecto.
e) Manipulacin delicada del material:
Las piezas deben tallarse y disecarse con finas tijeras o cuchillas de bistur o de
afeitar nuevas y con suaves y firmes movimientos para evitar producir grandes modificaciones
de la estructura microscpica.
f) Tamao de la pieza:
El tamao de la pieza debe ser lo ms pequeo posible sobre todo para microscopa
3
electrnica (de 0.5 - 1mm ).

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4. PRECAUCIONES A TENER EN CUENTA EN LA FIJACIN:


A) Usar campana extractora de gases (100 lpm) o mascarillas, guantes
desechables impermeables y gafas protectoras.
B) En relacin con los tampones debe tenerse en cuenta que el cacodilato de sodio
tiene arsnico y puede producir, en contacto con cidos, gases arsenicales que al inhalarse o
absorberse por la piel, pueden producir afectacin (inflamacin) heptica, renal y dermatitis. El
veronal ingerido es venenoso. La s-collidina es mal oliente y toxica
B) En relacin con los fijadores debe tenerse en cuenta que: El tetroxido de smio
(OsO4) se volatiliza a la temperatura ambiente, siendo sus vapores nocivos para las mucosas
bucal, ocular, laringo-faringea, etc. Por ello cuando se trabaja con l hay que proteger la piel y
las mucosas.
C) Los aldehdos son todos peligrosos, tanto inhalados como por contacto con la piel
y mucosas. En este sentido la mezcla de los vapores de formaldehdo con ClH forman un
producto carcingeno. La acroleina, por su parte, es peligrosa al ser muy inflamable y muy
txicos sus vapores, especialmente al ser inhalados.

5. ACTIVIDADES A REALIZAR EN EL LABORATORIO


5.1. Visionado de un video sobre obtencin del material y fijacin de las
muestras.
5.2. Diseccin de una pieza anatmica fresca:
El alumno, siguiendo las instrucciones del profesor, disecara y preparar para su
fijacin por inmersin una pieza anatmica fresca que el responsable de la prctica pondr a
su disposicin. De ella deber obtener (tallar la pieza) entre 2 y 4 fragmentos de 10X10X2
mm, cada uno.
El alumno tomar nota de los procedimientos realizados y dibujar aquellos aspectos
de la pieza que sean de inters para su posterior observacin a travs del microscopio.
5.3. Realizar la fijacin por inmersin:
Utilizando el pequeo recipiente que el responsable de la prctica pondr a su
disposicin, el alumno introducir en l los fragmentos tallados, junto con una pequea
etiqueta de papel (5X10 mm) donde previamente habr escrito, con lpiz, las iniciales de su
nombre y apellidos, seguidas del nmero de la plaza que ocupa en el laboratorio.
Seguidamente sumergir los fragmentos en el fijador correspondiente que se le
proporcionar.
5.3. Trabajo independiente del alumno :
Una vez terminada la prctica, con ayuda bibliogrfica, el alumno realizar en su
portafolios, una breve descripcin de los siguientes aspectos de la pieza anatmica: a) su
anatoma, su histologa y , c) su funcin.

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LAMINA 1
Figura 6

Figura 7

Figura 8

Figura 9

Figura 10

Figura 11

Figura 12

Figura 13

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LEYENDAS DE LAS FIGURAS DE LA LAMINA 1


Figura 6: El mtodo de la gota pendiente permite observar, a travs del microscopio, clulas y
microorganismos vivos suspendidos en un medio acuoso.
Figura 7: Mtodos holsticos (in vivo) que utilizan cmaras transparentes para estudiar
diferentes fenmenos biolgicos y patolgicos, como la circulacin de la sangre, el crecimiento
vascular tumoral. etc. En la parte alta (A) se representa un conejo con una cmara
transparente de CLARK y CLARK, implantada en la oreja. En la parte baja de la figura,
tenemos una rata con otro tipo de cmara, la de ALGIRE y LEGALLAIS.
Figura 8: A) Fotografa de una rata en cuya cmara anterior de su ojo derecho se ha
implantado un embrin, en el estadio de ocho clulas, para observar su desarrollo. B) Ojo de
otra rata en la que se ha transplantado un ovario en la cmara anterior del ojo, con el fin de
observar el desarrollo de sus folculos ovricos.
Figura 9: Ejemplo de preparacin entera (Wholemount). A) Retina visual, en forma de
casquete de esfera, recin extrada del globo ocular. Con un bistur se proceder a cortar,
radialmente sus bordes para poder aplanarla sobre un soporte (un porta, por ejemplo). B.
Retina aplanada sobre la superficie de un portaobjetos.
Figura 10: La figura de la izquierda es el esquema de una ultracentrfuga. Las muestras se
colocan en tubos y estos en el rotor, que tras girar a altas velocidades provoca grandes fuerzas
de centrifugacin sobre las partculas de la muestra. Como resultado unas partculas se
sedimentan y otras quedan en suspensin. El vaco reduce el rozamiento y evita el
calentamiento del rotor. El sistema de refrigeracin mantiene la muestra a 4 grados
centgrados (Copiado de ALBERTS et al. 1994).
La homogeneizacin (A) consiste en triturar tejidos y/o clulas hasta conseguir pequeas
partculas aisladas de sus componentes (fragmentos celulares, de membrana, mitocondrias,
ribosomas, etc.). Para ello se utiliza un artilugio denominado homogeneizador (a) que mediante
acciones mecnicas (b) nos permiten obtener triturados y suspensiones (c) para su ulterior
ultracentrifugacin (1-5). La ultracentrifugacin diferencial (B), nos permite separar diferentes
componentes celulares empleando distintas velocidades de centrifugacin, sobre el
sobrenadante obtenido en cada paso. De esta manera podemos separar: clulas enteras,
ncleos y citoesqueleto a bajas velocidades (2), mitocondrias, lisosomas y peroxisomas a
velocidades medias (3), microsomas y pequeas vesculas a altas velocidades (4) y ribosomas,
virus y grandes molculas a muy altas velocidades de centrifugacin (5).
Figura 11: Micromanipulacin de un ovocito (centro) inmovilizado con una micropipeta
(izquierda) y atravesado por otra que inyectar un espermatozoide. Todas las operaciones son
realizadas con un microscopio dotado de micromanipuladores que transforman finos
movimientos de nuestros dedos en movimientos micromtricos a nivel de las micropipetas.
Figura 12: Para realizar un frotis, por ejemplo la extensin de una gota de sangre, se coloca un
portaobjetos haciendo un ngulo de 45 grados sobre otro horizontal. En el ngulo entre ambos
portaobjetos, se coloca la gota a extender. De forma firme se desplaza el primer porta, sobre el
colocado horizontalmente, para de esta forma extender la muestra entre los dos extremos del
portaobjetos.
Figura 13: Para hacer la impronta (huella) de un rgano (por ejemplo, un ganglio linftico), se
coloca este, sobre una superficie limpia (una placa de Petri, por ejemplo) y se corta con el
bistur en dos mitades. Con unas pinzas se coge uno de los fragmentos y se procede a
estampar, la superficie de corte, sobre la superficie del portaobjetos. De esta forma, obtenemos
una huella de dicha superficie de corte, huella que esta formada por lquidos tisulares mas
clulas sueltas. Esta tcnica nos permite obtener informacin rpida sobre la tipologa celular
del rgano estudiado. Esto es especialmente importante en Patologa si andamos tras la
bsqueda de clulas neoplsicas. La impronta, como las huellas dactilares, tambin nos puede
informar acerca del patrn estructural del rgano en cuestin.

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