UNIVERSIDAD NACIONAL

AUTNOMA DE CHOTA

INGENIERA
AGROINDUSTRIAL

TEMA: ESPECTROFOTOMETRIA
PRESENTADO POR:

TERRONES MIRANDA LIZBETH

BAUTISTA VAZQUES NANCY

Para:
Ing. Qumico: CARLOS RAMOS, Jos Alberto

DEDICATORIA

Con mucho amor y cario agradezco a mis

padres que siempre nos dieron todo su apoyo
tanto en lo moral y econmico para ser una
futuro profesional.

A mis amigos y compaeros de clase que de

una u otra manera nos incentivaron y
estuvieron presente en las en las buenas y
malas con sus sabios consejos que nos
llevaron a progresar par no desmayar y seguir
adelante

AGRADECIMIENTO

Al personal acadmico y a nuestros

profesores,
tambin
al
personal
administrativo de la universidad nacional
autnoma de chota, quienes nos imparten
sus enseanzas durante mi formacin
profesional.
A mis familiares y amigos que de una u otra
contribuyeron a la realizacin de este
informe.

3
NDICE

1.
2.

3.
4.

5.

6.

Dedicatoria
Agradecimiento
Introduccin
ESPECTROFOTOMETRA
1.1. Espectro
1.2. Fotometra
EL ESPECTRO ELECTROMAGNTICO
2.1. Los rayos csmicos
2.2. Rayos y (gamma)
2.3. Rayos x
2.4. La luz Ultravioleta
2.5. La luz visible
2.6. La radiacin infrarroja
2.7. Las microondas
2.8. Las ondas de radio
LAS MOLECULAS ABSORVEN RADIACIN ELECTROMAGNTICA
CUANTIFICACIN
4.1. Ley de beer
4.2. Medidas de desviacin de la Ley de beer
4.3. Calibracin
4.4. Parmetros de calidad
EL ESPECTROFOTMETRO
5.1. Fuente
5.2. Visible
5.3. Ultravioleta
5.4. Infrarrojos
5.5. Monocromador
5.6. Tipos de espectrofotometras
5.7. Espectrofotometra de absorcin molecular VIS-UV
5.8. Espectrofotometra de absorcin molecular IR
OTROS MTODOS
6.1. Resonancia magntica nuclear
6.2. Espectroscopia de masas (MS)
6.3. Espectrofotometra de rayos x
6.4. Espectrometra de emisin por rayos x
6.5. Instrumentos
6.5.1. Espectrmetros de rejilla
6.5.2. Monturas de rejilla esfrica
6.5.3. Interfermetros
6.6. Espectroscopia de RMN con Ondas Continua (CW: Continuos Wave)

i
II
iv
06
06
06
07
07
07
07
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07
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11
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30
31
31
31
32
32

INTRODUCCIN:
Desde hace muchos aos se ha usado el color como ayuda para reconocer las sustancias
qumicas; al reemplazar el ojo humano por otros detectores de radiacin se puede estudiar

4
la absorcin de sustancias, no solamente en la zona del espectro visible, sino tambin en
ultravioleta e infrarrojo mediante la interaccin de la luz espectrofotomtrica.
Esta propiedad de interaccin de la Luz con una gran cantidad de especies qumicas nos
permitir

identificar

cuantificar

analitos,

dando

lugar

una

rama

de

la

Qumica
Espectrofotometra significa "medida del espectro de la luz" y se refiere a la medida
del tipo y cantidad de luz que se obtiene de una disolucin. A continuacin explicamos que
es el espectro de la luz y como se produce la interaccin con la materia.
Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que parece ser
completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro visible;
el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo. La absorcin de las radiaciones
ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es
caracterstica para cada sustancia qumica.

La Espectrofotometra es una de las tcnicas experimentales ms utilizadas para la

deteccin especfica de molculas. Se caracteriza por su precisin, sensibilidad y
su aplicabilidad

a molculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomolculas,

etc.) Y estado d e agregacin (slido, lquido, gas)

OBJETIVOS
-

Conocer

los

fundamentos de

la

espectrofotometra

determinacinde concentraciones en soluciones.

Estudiarlo y analizarlo la espectrofotometra y las variables involucradas en la

ley de Lambert-Beer-Bourger.
Profundizar en el principio fsico en el cual se basa la espectrofotometra y sus leyes,
as como su utilizacin en diversos campos de la ciencia y la tcnica.

para

la

1. ESPECTROFOTOMETRA
1.1. Espectro: se refiere a radiaciones electromagnticas, o sea, luz Monocromtica,
caracterizada por una frecuencia o un nmero de onda o una longitud de onda.
1.2. Fotometra: es la medicin de luz o de energa radiante en cuanto a su intensidad.
La espectrofotometra es
las investigaciones

el

qumicas y

mtodo

de anlisis

bioqumicas.

ptico ms

usado

El espectrofotmetro

es

en
un

instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una

solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene
una cantidad conocida de la misma sustancia.
En la espectrofotometra se aprovecha la absorcin de radiacin electromagntica
en la zona del ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la
radiacin incidente en este espectro y promueve la transicin del analito hacia un
estado excitado, transmitiendo un haz de menor energa radiante. En esta tcnica
se mide la cantidad de luz absorbida como funcin de la longitud de onda
utilizada. La absorcin de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas
depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica de cada sustancia
qumica.
La espectrofotometra ultravioleta-visible utiliza haces de radiacin del espectro
electromagntico, en el rango UV de 180 a 380 nm, y en el de la luz visible de 380
a 780 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la
regin ultravioleta del espectro.
2. EL ESPECTRO ELECTROMAGNTICO
Consiste en un amplio intervalo de longitudes de onda y frecuencias, que van
desde las ondas de radio en el extremo de las bajas frecuencias hasta los rayos
gamma en el da las altas.
La energa electromagntica que viaja a travs del vaco se compara de cierta
forma como las olas del mar, que se mueven a travs del agua .igual que estas, la
energa electromagntica se caracteriza por su frecuencia longitud de onda y

amplitud. El espectro electromagntico est integrado por los siguientes

componentes:
2.1. Los rayos csmicos: que consiste de radiacin descargada por el sol tienen la
energa ms alta.
2.2. Rayos y (gamma). Se emiten desde los ncleos de ciertos elementos radioactivos,
dada su alta energa, puedan daar severamente los organismos biolgicos.
2.3. Rayos x. un poco ms bajos en energa que los rayos y, son menos dainos excepto
en grandes dosis. Los rayos x de dosis baja se usan para examinar la estructura
interna de los organismos. Mientras ms denso es el tejido ms bloquea los rayos
x.
2.4. La luz ultravioleta (uv). Es el responsable de las quemaduras solares y la
exposicin frecuente puede causar cncer a la piel al daar las molculas de ADN
al daar la piel.
2.5. La luz visible. Es la radiacin electromagntica se ve.
2.6. La radiacin infrarroja. se siente como calor.
2.7. Las microondas. Se usan para cocinar y en los radares.
2.8. Las ondas de radio. Tienen la energa ms baja. Se usan para comunicacin de
radio y televisin, visualizacin digital, controles remotos.
Aquellas detectables por nuestro ojo corresponden a la luz visible, pero la mayora
son invisibles para nosotros. La luz se puede explicar como un conjunto de
radiaciones que se mueven por todo el Estas radiaciones se pueden describir
como partculas y como ondas. La descripcin como ondas se basa en que la luz
so campos elctricos y magnticos que oscilan perpendicularmente a la direccin
de traslacin por el espacio daado lugar a ondas transversales.
Una

radiacin

electromagntica

se

define

generalmente mediante

dos

parmetros:
a. Longitud de onda (). Distancia recorrida por un ciclo completo. Es la distancia
Entre dos picos o crestas sucesivos de la onda.

b. Frecuencia (V): Se define como el nmero de cresta de una onda que pasan por
un punto dado en un segundo. En

el

vaco, el

producto

de

estos dos

parmetros es constante e igual a la velocidad de traslacin de la luz.

Donde c es la velocidad de la luz en el vaco (3.108 m/s)
La longitud de onda se expresa en unidades de longitud y vara entre dcimas
de nanmetro a varios metros.

La frecuencia se expresa en ciclos por

segundo (s-1) o Hertzios (Hz) Un Hz es igual a 1 ciclo/s.

Mediante la frmula anterior podemos calcular a partir de

o viceversa

Ejem. 1. Cul es la frecuencia de una radiacin electromagntica

de

650 nm que corresponde al color rojo?

Por otro lado, la luz se puede describir como una partcula.

En

Este

caso se dice que es una partcula de energa llamada fotn. Tambin se puede
describir como un paquete de energa.

La energa que tiene un fotn es

proporcional a la frecuencia de la radiacin que forma mediante la ecuacin.

Donde h es la constante de Planck (J.s) y tambin se puede relacionar con la
longitud de onda.
Ejem. 2. Cul ser la energa del fotn correspondiente a la radiacin
roja de 650 nm? y la de un fotn de una radiacin ultravioleta de 50 nm?

El

conjunto

de

radiaciones

electromagnticas

se

llama

espectro

electromagntico y es conveniente agruparlas en regiones para poder conocer

sus propiedades. En la fig. Siguiente se muestran
segn la clasificacin

las zonas del espectro

ms aceptada. Como se puede observar la zona del

visible (radiaciones percibidas por nuestro ojo) es muy pequea en comparacin

con la gran amplitud del espectro.
Teniendo en cuenta, tambin, que aunque hablamos de una radiacin
determinada, fsicamente es imposible aislar dicha radiacin. Siempre podremos
obtener un rango de radiaciones pequeo segn la exactitud del dispositivo de
seleccin (difractores

de radiacin

y filtros), pero nunca una sola.

misma manera que no podemos obtener o aislar un punto de

Las radiaciones ms importantes con aplicacin al anlisis qumico son:

De la

10

Rayos X

0,1-10 nm

Ultravioleta
Visible (VIS)
(UV)
Infrarrojo (IR)
Microondas
Radio

Fluorescencia

10-380 nm
380-780
780 nm- 300
300m
m 0,01m- 10 m
0,01

absorcin/emisin
absorcin/emisin/colorimetr
Infrarrojos
as
resonancia

electrnica

/nuclear
Cuando una molcula absorbe un fotn su energa interna aumenta y
pasa a un estado inestable,

por lo que rpidamente

vuelve a liberar esa

energa "sobrante" y vuelve al estado inicial que es ms estable.

El estado inicial se denomina estado

fundamental y

el

estado

ms

energtico se llama estado e x c i t a d o .

La absorcin de radiacin produce un paso del estado fundamental al excitado

(excitacin) y en el proceso contrario (llamado relajacin) hay una liberacin
de energa.
forma

de

Este

Esta energa liberada

calor

ltimo

en

forma

proceso

de

de

en

la

relajacin

puede

ser

radiacin electromagntica o t r a

desprendimiento

de

en
vez.

radiacin se llama

emisin.
Estos procesos se pueden representar

como una reaccin qumica y en

un diagrama de energa

3.

LAS MOLECULAS ABSORBEN RADIACIN ELECTROMAGNETICA

11

Todas las sustancias qumicas interactan con la radiacin electromagntica de

alguna manera. La medicin de esta interaccin puede proporcionar informacin
valiosa acerca de la sustancia. Cuando una molcula absorbe energa, ocurre una
transformacin o perturbacin que puede ser temporal o permanente. La radiacin
de baja energa puede causar simplemente una rotacin molecular o la vibracin
de un enlace. La radiacin de mayor energa pude afectar la promocin de
electrones a niveles de ms alta energa; y la radiacin de energa todava mayor
puede dar por resultado la ruptura de enlaces y la desorganizacin de la
molcula.
Cuando una molcula absorbe un fotn su energa interna aumenta y pasa a un
estado inestable, por lo que rpidamente vuelve a liberar esa energa sobrante y
vuelve al estado inicial que es ms estable. El estado inicial se denomina estado
fundamental y el estado energtico se llama estado excitado. La absorcin de
radiacin se produce un paso del estado fundamental al estado excitado y en el
proceso contrario (llamado relajacin) y ay una liberacin de energa. Esta
energa liberada en la relajacin puede ser en forma de calor o en forma de
radiacin electromagntica otra vez. Este ltimo proceso de desprendimiento de
radiacin se llama emisin.
4. CUANTIFICACIN
La cuantificacin de un compuesto consiste en medir la absorbancia de la
solucin a esa longitud de onda y compara este valor con la absorbancia de
soluciones de concentracin conocida de la sustancia o llevarlo a tablas o
grficos.
4.1. Ley de beer
La ley de beer afirma que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende
de la concentracin en la solucin, la cantidad de radiacin electromagntica
absorbida por un analito e puede relacionar cuantitativamente con la
concentracin de dicha sustancia en disolucin.
a. transmitancia (t). como la fraccin de radiacin incidente transmitida por la
disolucin. si la potencia radiante que incide sobre la disolucin. Tambin son
magnitudes que se obtienen en el espectrofotmetro.

12

b. absorbancia. Es ms til en la espectrofotometra que la transmitancia, debido a

que la representacin grfica de la concentracin versus la absorbancia produce
una lnea recta.

Po P

Adems
b

transmitida disminuye

concentracin

se

observa que

la

potencia de

la

geomtricamente (exponencialmente)

energa
con

la

c y con la distancia b recorrida a travs de la disolucin.

Donde k y k

son c o n s t a n t e s d e p r o p o r c i o n a l i d a d , combinando

ambas y a p l i c a n d o logaritmos.

Qu es la expresin matemtica de la Ley de Beer y que indica la relacin

directa entre la absorbancia de un analito y su concentracin en disolucin.

13

Absorbancia(A) Es la medida de la energa radiante que es absorbida por un

material o una superficie como funcin de la longitud de onda de dicha energa
En espectrofotometra, la absorbancia (A ) est definida por la forma:

, donde:
I Es la intensidad de la luz con una longitud de onda especfica

y que es

pasada por una muestra (intensidad de la luz transmitida)

I0 Es la intensidad de la luz antes de que entre a la muestra llamada tambin
intensidad de la luz incidente.
Los tomos y molculas, slo absorben y emiten radiacin de determinadas
frecuencias, lo que implica la cuantizacin de sus niveles de energa. La
separacin entre los niveles electrnicos de una molcula se encuentran entre el
IR cercano el VisibleUltravioleta.
Concentracin y unidad de distancia recorrida por el haz.

Cuando se usan

unidades molares se llama absortividad molar ( ) y se expresa en L/mol.cm

Ejemplo:
Cul ser la transmitancia y la absorbancia de una disolucin de 1,00 mg de Fe
en 100 mL en una celda espectrofotomtrica d e 1 cm. Absortividad del Fe es
15,5 L/g.cm

En la prctica esta ley no se cumple exactamente y para determinar

la concentracin de un analito a partir de las medidas de absorbancia, es
preciso realizar un proceso de calibracin.
4.2. Medida de desviaciones de la ley de beer.
a. Errores instrumentales.
Hay dos errores de lectura inherentes al detector espectro mtrico. El primero
se produce cuando hay una gran cantidad de analito y, por lo tanto, una gran

14

absorbancia de radiacin. Al detector llega muy poca potencia radiante y se

encuentra en la zona lmite de detencin con lo que no responde bien a
pequesimas variaciones de absorbancia.
b. Errores qumicos.
Hay analitos que tienen una ionizacin parcial y la especie ionizada pude
tener diferente absorbancia al desplazamiento del equilibrio.
4.3. Calibracin.
Dado que hay una serie de fenmenos que no permiten la aplicacin de la ley de
beer en la prctica se realiza siempre una calibracin de la tcnica de medida
con la cual obtenemos una relacin matemtica entre la concentracin y la
absorbancia. El procedimiento de la calibracin se basa en medir la absorbancia
de varia disoluciones patrn (de concentracin conocida), en las mismas
condiciones que se mide la absorbancia de la disolucin problema y se hace una
interpolacin.
4.4. Parmetros de calidad.
La calidad de una tcnica espectrofotomtrica expresada 4en trminos de
incertidumbre, se basa esencialmente en tres parmetros: sensibilidad, lmites
de deteccin y rango de linealidad.

a. Sensibilidad. Es la concentracin requerida para dar 1% dfe4 absorbancia

(99% de transmitancia o lo que es un mismo 0,0044 unidades de absorbancia).
A medida que esta concentracin es menor la sensibilidad de la tcnica es
mayor porque es necesaria menos concentracin para producir una seal en el
detector.
b. Lmite de deteccin. Es la mnima concentracin que se pude medir con la
tcnica y con un elevado nivel de certidumbre. Est relacionado con el ruido de
fondo del aparato, es decir la seal que mide el aparato cuando se introduce un
blanco. Una manera de calcularlo es multiplicar por tres la seal
correspondiente al ruido de fondo.
c. Rango de linealidad. Es el intervalo de concentraciones del cual podemos
medir una muestra problema con un elevado nivel de certidumbre.
Generalmente a partir del nivel mximo de absorbancia, la seal (absorbancia)
deja de tener una relacin lineal con la concentracin y la curva se hace
horizontal, teniendo un valor mximo de absorbancia. Las muestras o patrones

15

que estn fuera de este rango no se pueden medir con la seguridad con la
tcnica empleada.
5.

EL ESPECTROFOTMETRO.
El espectrofotmetro es
un

instrumento

que

permite

comparar

la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad
desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma
sustancia.
El espectrofotmetro es

un

instrumento

que

permite

comparar

la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad
desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma
sustancia.
El diseo de un espectrofotmetro incluye una fuente de luz, un prisma, un
porta celdas y una fotocelda. Conectado a cada equipo se tienen apropiados
sistemas elctricos o mecnicos para controlar la intensidad luminosa, la
longitud de onda, y para la conversin de energa recibida por la fotocelda en
un cambio de voltaje. La fluctuacin de voltaje es mostrada en una escala
mtrica, es presentada digitalmente, o es almacenada en una computadora
para su posterior anlisis.
Los espectrofotmetros son muy tiles por la relacin de la intensidad de color
en una muestra y su relacin con la cantidad de soluto dentro de la muestra.
Por ejemplo, si usted usa una solucin de una sustancia roja en agua, y mide la
cantidad de luz azul absorbida cuando atraviesa la solucin, una fluctuacin
medible de voltaje puede ser inducida en una fotocelda. Si una solucin roja es
diluida a la mitad por la adicin de agua, entonces el color ser
aproximadamente 1/2 de Los intenso y el voltaje generado en la fotocelda ser
aproximadamente la mitad. Es decir, hay una relacin entre el voltaje y la
cantidad de colorante en la muestra

16

5.1.

Fuente: e s

el

dispositivo e m i s o r

Generalmente emite u n a banda

de

radiacin

muy

electromagntica.

amplia

de

radiaciones

continuas alrededor de la l deseada. Segn la zona del espectro que

emite hay tres tipos:
5.2.

Visible: Lmparas de filamento de Tungsteno incandescente

o de

Wolframio (halgeno). Son similares a las bombillas comunes.

5.3.

Ultravioleta: Tubo de hidrgeno o de descarga de de uteri o .

veces estn refrigerados con agua para disipar el elevado calor que
producen.
5.4.

Infrarrojos:

Fuentes

especiales

de

xidos

de

(disprosio, holmio, erbio) o carburos (de silicio).

tierras

Estos

raras
e mi te n

radiacin en IR ( 1,5 a 2,0 mm) a elevadas temperaturas (1000-2000C).

5.5.

Monocromador

selector

de:

tiene

como

objetivo

controlar

la

pureza de la radiacin emitida consiguiendo el menor ancho de banda

de longitud de onda posible. Consta de un conjunto de lentes, espejos
y rendijas para dispersar y separar, enfocar y restringir la radiacin no
deseada. Los componentes de los monocroma dores son:
a. PRISMAS: producen la refraccin de la luz, siendo el

ngulo

de refraccin mayor cuanto menor es la de la radiacin. Despus del

prisma hay una rendija por donde se hace pasar la radiacin deseada.
Segn el tipo de radiaciones se usan prismas de vidrio (VIS),
cuarzo o slice (UV) y cristales de NaCl para IR.

b. Redes de difraccin: es una lmina metlica (Al) altamente pulida la

que se han hecho una gran cantidad de estras (lneas paralelas) estas

17

estras actan como centros de dispersin de todas las radiaciones

incidentes; por lo tanto se puede usar en todas las regiones del espectro.
c. Celdas para muestra: recipientes donde se coloca la muestra a
analizar. .

Varan mucho segn l a t c n i c a

como caracterstica

comn

a utilizar,

pero

deben s e r transparentes en la

regin del que se va a medir. VIS y UV cubetas cuadradas de vidrio,

cuarzo de 1 cm de lado. IR cubetas de NaCl, AgCl.
d. Detector ( transductor):

Produce u n a s e a l e l c t r i c a c u a n d o

r e c i b e u n f o t n . Esta s e a l elctrica luego es convertida en

unidades de potencia radiante transmitida o absorbida. Los detectores
tambin dependen de la regin de
en la que se trabaja.
e. Fototubo. Para la zona de VIS y UV con el mismo principio de
funcionamiento que la clula fotoelctrica. Al golpear un fotn en el
clculo, este emite un electrn hacia el nodo, por lo cual provoca un
flujo de corriente elctrica que es medida por un voltmetro. Cuando se
utilizan radiaciones de baja intensidad la seal elctrica es muy dbil y
sujeta a un gran error. En este caso se utiliza el tubo fotomultiplicador;
que se incluye varios fototubos en serie. En este caso, el choque de un
fotn forma una cascada de electrones que dan una seal ms
intensa. Fotodiodo array Sobre un semiconductor se fabrican diodos
en serie paralela de manera que al incidir sobre l una radiacin
difractada, se puede tener una seal instantnea para un amplio rango
de Infrarrojos. Los
propiedad

detectores

trmica

de

de

infrarrojos

se

basan

en

la

estas radiaciones y traducen el calor

asociado a la radiacin transmitida en una seal elctrica. Los

ms

utilizados

son

los

formados por metales

temperatura.
f. Registrador:

BOLOMETROS,

En los instrumentos ms antiguos la seal se

aguja que

de t r a n s m i t a n c i a

instrumentos ms
que

cuya resistencia elctrica cambia con la

mostraba en un medidor de
unidades

TERMOPARES

aparece

concentracin

modernos
el

tienen

pu ede

una

escala

y de a b s o r b a n c i a .

valor numrico

cuando

tena

un

display

digital,

en
Los

en

el

de absorbancia o el valor de

re al i za r

automticamente

los

18

clculos de calibracin.
absorcin

En el caso de obtener el espectro de

(en un intervalo de ) de una sustancia, el registrador

nos muestra un grfico con el valor de abscisas y la absorbancia en

ordenadas.

5.6.

Tipos de espectrofotometras.
En la tabla siguiente se muestra una clasificacin de los principales tipos
de espectrofotometras

agrupados

segn

el t i p o

de

interaccin

luz-molcula (absorcin o emisin) y segn la zona del espectro en la que

se trabaja. Y a continuacin se describen las caractersticas principales
de cada tipo, los instrumentos utilizados y las aplicaciones analticas ms
importantes. Clasificacin

19

5.7.

Espectrofotometra de absorcin molecular VIS-UV.

Hay un proceso de absorcin de radiacin por parte de las molculas
pasando a un estado excitado.
Absorcin: en un tiempo muy breve se produce la relacin con emisin
de energa El

aumento

de

energa

interna

conlleva

transiciones

electrnicas. Estas transiciones son de electrones compartidos que

forman enlaces o de electrones de orbitales atmicos externos (no
compartidos).
Los principales tipos de molculas que experimentan este fenmeno son:
compuestos orgnicos

con

grupos

no

saturados

(dobles

triples enlaces), donde hay electrones de enlace que pueden saltar

a otros orbitales de enlace. Estos grupos funcionales que absorben
en VIS o UV se llaman cromfobos. Compuestosde

coordinacin

(complejos) de metales de transicin.

Ej. Fe (SCN)2- rojo intenso.- iones de metales de transicin, de lantnidos
y de actnidos. Ej. Color azul de la disolucin de Cu2+ Generalmente la
absorcin de estos compuestos se produce en varias
bandas de

absorcin,

definidos.

Sobre

por
todo

lo

que

no

hay

cuando hay interacciones

amplias

picos
con

bien
el

disolvente.
Esto

confiere

poca

selectividad

la

tcnica para identificacin

de especies, siendo ms til en anlisis cuantitativo.

20

Instrumento u t i l i z a d o e n l a t c n i c a e s e l e s p e c t r o f o t m e t r o
v i s i b l e -ultravioleta.
de

Que permiten trabajar con una gran cantidad

, incluso hay algunos que hacen un barrido en una regin del

espectro

dando

un

grfico

del

espectro

de

absorcin de

una

sustancia. Estos aparatos constan de un selector de , , y una cubeta

transparente de 1 cm de lado y 3 cm de alto donde se coloca la disolucin
a

medir.

Normalmente hay dos huecos para dos cubetas, uno para la

muestra y otra para una disolucin de referencia o blanco, frente a la cual se

hacen todas las medidas.
La especie qumica a medir absorbe en el visible (y la disolucin tiene
color) la t c n i c a se llama vulgarmente colorimetra. Y
utilizados

se

los

aparatos

llaman colormetros. Tambin se comercializan kits de

anlisis rpidos que tienen unas tablas de comparacin de colores (o

disoluciones preparadas y de color estable) en lugar de un aparato
como el descrito.

La disolucin problema se mezcla con los reactivos

adecuados en un pequeo tubo de ensayo y se compara con la

tabla de colores. En esta tabla est asignada la concentracin de analito
que corresponde a cada color, con lo cual se puede determinar la
concentracin

en

el

problema.

Este mtodo

no

tiene

una

gran

exactitud pero en muchas aplicaciones es suficiente (cloro en piscinas,

nitratos en aguas de embalses, NaCl en aguas para riego, etc.).

21

Muchos

casos

la

especie

estudiada

no

absorbe

pero s un complejo formado con otro compuesto.

no absorbe en el VIS, pero

en

el

VIS-UV,

Por ej. el ion fosfato

forma un complejo con el ion molibdato

y el vanadato (fosfomolibdovanadato) que tiene una gran intensidad de

absorcin a 430 nm (azul), y se emplea para anlisis de fsforo en
aguas, suelos, etc.

En

estos

casos

la

determinacin espectro

mtrica no es directa, sino que previamente se hace reaccionar la muestra

con unos reactivos adecuados (reaccin colorimtrica se mide la absorbancia
de la mezcla.

A. Ventajas y aplicaciones.
gran

aplicabilidad,

posibilidades

ya

que

hay

muchas

especies

absorbentes

de formar complejos con las que no lo son elevada

sensibilidad, se pueden determinar concentraciones hasta 10-5 M.

selectividad media, interacciones cuando hay grupos que absorben a la
misma.
permite automatizacin del proceso, se usa en sistemas de anlisis en
continuo.
sistema no destructivo en medidas directas como principal desventaja de
la tcnica las interacciones por partculas que interfieran el paso de
luz.
5.8.

Las disoluciones han de ser exentas de slidos en suspensin.

Espectrofotometra de absorcin molecular IR

22

La

absorcin molecular

espectro

de radiaciones

produce transiciones vibraciones

de

esta zona

del

y r o t a c i o n a l e s . Por l o

t a n t o , t o d a s l a s m o l c u l a s absorben en IR, e x c e p t o algunas

diatnicas (O2, N2, Cl2) de elevada simetra.
Las bandas de absorcin son muy estrechas y corresponden a
enlaces

muy especficos, y a menudo dependen de los tomos ms

prximos. Un espectro de IR es como una huella dactilar de la molcula

y esto implica que es una tcnica idnea para identificar compuestos
orgnicos o inorgnicos puros, pero no es tan adecuada para cuantificar.
Los instrumentos ms utilizados son:

a. Espectrofotmetros IR.
Similares al VIS-UV pero con componentes diferentes hacen un barrido y
recogen el espectro. Los ms utilizados son los llamados NIR que
trabajan con zonas del espectro en el infrarrojo cercano.
b. Espectrmetros de transformada de Fourier.
Recoge datos de una zona del espectro simultneamente y en
varias

pasadas,

complejo

se

posteriormente por

resuelven

los

picos

un

proceso matemtico

muy

del

espectro

gran

con

una

sensibilidad. Son los ms usados actualmente.

c. fotmetros

de filtro. Con un filtro adecuado se selecciona una

deseada. Sirven para monitorizar la concentracin de una especie

qumica en un punto fijo.

Se usan mucho para contaminantes

atmosfricos: CO, nitrobenceno, cloruro de vinilo, HCN, piridina, etc. En

algunos instrumentos se usan para determinar CO2, SO2, etc.
d. Aplicaciones.
Se usa en la identificacin de compuestos en investigacin de
medicamentos, bioqumica, biologa, fisiologa.
En la industria farmacutica, pesticidas, alimentacin, contaminantes,
etc.

23

5.8.1. Espectrofotometra de absorcin y de emisin atmica. Permite la

determinacin (cuantificacin) de unos

70 elementos

concentraciones que oscilan entre ppb a ppm.

qumicos

en

La medida de los elementos

qumicos se hace en estado atmico mediante una atomizacin de la muestra

en

estado gaseoso. Estos tomos experimentan absorcin, emisin o

fluorescencia de radiaciones VIS, UV rayos x debido a transiciones electrnicas

entre orbitales atmicos. Esta tcnica
moleculares

en absoluto

no

da informacin

sobre enlaces

y nos da informacin especfica sobre un elemento

qumico.
La principal diferencia con las otras espectrometras es la atomizacin,
proceso por el cual la muestra se introduce en un mechero, junto con el
combustible, y se quema a elevada temperatura. Las molculas del analito
se

rompen

totalmente liberando

los

elementos qumicos

en

estado

atmico, y estos pueden experimentar fenmenos de absorcin, emisin o

fluorescencia. En

la

figura siguiente se muestra un esquema de estas

posibilidades.
Segn el sistema de atomizacin, y la temperatura a la que se produce, se
tienen los siguientes mtodos de espectrofotometra atmica:

llama,

electro

trmico, plasma, arco voltaico y chispa elctrica.

5.8.2. Espectrofotometra de absorcin atmica con llama.
Es el mtodo ms utilizado de la espectrofotometra atmica.

Muy adecuado

para la determinacin de ppm de Fe, Cd, Au, Pb, Zn, Cu, Mn en disoluciones
acuosas de aguas, fertilizantes, suelos, extractos vegetales, etc.
Los tomos en la llama absorben radiacin de determinadas (VIS y UV) segn
su naturaleza, por lo que es una tcnica muy especfica para cada elemento.
La absorcin en la llama sigue la ley de Beer, pero en la prctica es necesario
hacer un calibrado con disoluciones patrn de las que se obtienen valores de
absorbancia y que permiten calcular la recta de calibrado.

24

Como fuente de radiacin se usa una lmpara que contiene el mismo metal que
se va analizar y que emite una radiacin con una banda de entorno a la que se va
a absorber la l l a m a c o n l a q u e s e a t o m i z a l a m u e s t r a .
Esta llama suele ser

de propano, acetileno o

hidrgeno y oxgeno o xido

nitroso (N2O). Las temperaturas que alcanza varan entre 1500 y 3000C.
5.8.3. de emisin atmica con llama.
Es una tcnica muy utilizada
alcalinos

para

la

determinacin

de

metales

alcalino- trreos: Na, K, Li, Ca, etc., en concentraciones del orden

de ppm. Se utiliza con los mismos materiales ya comentados:

fertilizantes, suelos, material vegetal, alimentos, contaminantes, etc.

aguas,

25

Se basa en el mismo principio que la absorcin, pero en este caso la

temperatura de la llama es suficiente para que haya una excitacin atmica y una
emisin posterior.

Los

instrumentos

Espectrofotmetros

utilizados

en

esta

tcnica

se

denominan

de Emisin Atmica (EEA) y en ingles con las siglas

AES. A diferencia de los anteriores (absorcin) no tienen fuente de radiacin. El

resto de componentes es igual, as como el procedimiento de calibracin y
clculo de resultados.
5.8.4. Espectrofotometra con atomizadores electro trmicos.
Se utiliza para determinar concentraciones muy pequeas (ppb) de metales
contaminantes: Pb, Cd, Cr, Zn, Cu, Co, Mn, Pt, Hg, etc. En

las

tcnicas

anteriores el rendimiento de la atomizacin (molculas atomizadas con

respecto al total) es muy bajo: aproximadamente del 0,1%. Esto hace que la
sensibilidad de la tcnica sea baja. El atomizador electro trmico consta de
un pequeo mini horno,

que

es

un cilindro de grafito de 50mm10mm,

que se calienta con una resistencia elctrica hasta 3000C.

Con una

pequea cantidad de muestra (varios mL) se obtiene una gran cantidad de

partculas atomizadas (eficiencia del 100%) y una gran seal que da
una gran sensibilidad a la tcnica.

Por el contrario la precisin no es

tan buena y hay un gran nmero de interferencias. El proceso

calibrado

es

muy

delicado

solo

es

til

de

en determinaciones de

concentraciones muy bajas de algunos metales.

El instrumento utilizado se llama, Espectrometra con Horno de Grafito o
GFS (Graphit Furnace Spectrometry).
5.8.5. Espectrofotometra de emisin con plasma

26

Se consigue una llama de altsima temperatura que transforma la mezcla de

combustible y muestra al estado de plasma: una mezcla gaseosa con
una concentracin muy alta de cationes y electrones. Esto

permite

una

elevada eficiencia en la atomizacin, una intensa emisin de los tomos y

la determinacin de una gran cantidad de elementos qumicos metlicos (y
algunos no metales) con algo menos de sensibilidad que el Horno de
Grafito, pero

con

ms

precisin.

Adems

la

combinacin

de

esta

tcnica con un sistema informtico potente, permite la determinacin de la

concentracin

de

varias

decenas

de elementos en unos segundos. Los

diferentes aparatos se basan en la fuente de energa para obtener el plasma

el mechero. Los ms comunes son:
DCP: plasma generado por una corriente continua.
ICP: (induced coupled plasm) plasma acoplado por induccin de un generador de
radiofrecuencias. generado por frecuencias de microondas.
Entre los no metales que pueden ser determinados por esta tcnica se
encuentra el P y el B.

Se obtienen lmites de deteccin entre 0,1 y 100

ppm, y el acoplamiento de esta tcnica con otras muy sensibles permite

llegar hasta 1 ppb. Ej. ICP-EM o ICP espectrmetro de masas.

5.8.6. Espectrofotometra de fluorescencia molecular.

Se basa en el fenmeno que experimentan
liberar

calor (radiacin trmica) y otra parte

como

radiacin

la

energa como

electromagntica

de una

proceso

longitud

de

de

de

de

el

molculas

absorber una radiacin determinada

parte

en

algunas

relajacin,

onda mayor a la

incidente.
Este fenmeno se produce en un intervalo de tiempo muy pequeo despus
de la absorcin (10-5 s) a diferencia de la fosforescencia que puede durar
minutos y horas. Este fenmeno permite una tcnica muy sensible ya que
no todas las molculas fluorescen y las l pueden cambiar segn las
condiciones.
VIS-UV.

Los lmites de deteccin son inferiores a la absorcin molecular

27

El instrumento ms usado es el espectrofluormetro,

y la tcnica ms

comn se denomina Fluorescencia de Rayos X, ya que son estos los utilizados

como fuente de energa. Tiene una gran aplicabilidad en cuantificacin de
molculas

orgnicas

en productos alimenticios, farmacuticos, clnicos y

naturales.

6. OTROS MTODOS.
6.1. Resonancia Magntica Nuclear (RMN).
Se produce una absorcin de radiacin electromagntica por los ncleos
atmicos. Estos tienen un movimiento de giro, que es cambiado en el proceso
de absorcin. El tipo de radiaciones que se utilizan son de gran l (microondas de
baja energa), y la
que

rodea

al

absorcin

ncleo

depende
de

de

la

configuracin

electrnica

las interacciones intramoleculares.

Por lo

tanto da informacin sobre los enlaces que tiene un tomo, y el tipo de

molcula que se estudia. Las radiaciones involucradas en esta tcnica no
alteran los materiales estudiados (dada su baja energa), por lo que
tiene una gran aplicacin en seres vivos, productos fcilmente alterables, etc.
Los elementos qumicos que se detectan
P,

B,

Cl,

N.

por

esta

tcnica

son

H,

F,

Mientras que el C y el O no tienen un momento cintico de

giro nuclear. Esto hace que la tcnica sea muy interesante para identificar
molculas orgnicas, Obteniendo espectros de los tomos de H, de los que
se deduce todos los enlaces del H en la molcula Esta tcnica tiene una
gran aplicacin en medicina (estudios no destructivos de tejidos de rganos
del cuerpo humano), determinacin de humedad, estudios de aceites y
grasas, estudios de F en plsticos, etc.
6.2. Espectroscopia de masas (MS).
No es una tcnica espectrofotomtrica propiamente dicha, pero se utiliza
mucho en conjunto con algunos de los instrumentos citados.
Se basa en obtener una nube de molculas gaseosas ionizadas, de
manera que quedan los elementos qumicos en forma inica (cationes)
en estado gaseoso. Esta nube se acelera mediante un campo elctrico y
pasa por un potente imn que separa los iones segn su masa, y finalmente
choca sobre un detector sensible a todos los iones. El

detector

es

como

una pantalla alargada y los tomos de un mismo elemento chocan en

28

una

misma

zona, distinguindose varias regiones o rayas en el detector

relacionadas con la masa de los tomos presentes en la muestra. Al final se

obtiene una grfica llamada espectrograma o espectro de masas,

con los

pesos atmicos en abscisas y la frecuencia o cantidad en ordenadas.

En este aparecen rayas

indicando

los

elementos

qumicos

presentes

y son ms o menos largas segn la cantidad de tomos que hay.

La instrumentacin de esta tcnica es muy sofisticada y solo disponible
en muy buenos Laboratorios.
siendo

la

qumicos.

tcnica

Da un grado de exactitud muy bueno,

ms sensible

para determinar

algunos

elementos

Permite determinar ppb de algunos metales en combinacin

con la tcnica ICP

6.3. Espectrometra de rayos X
La espectrometra de rayos X es un conjunto de tcnicas espectroscpicas
para la determinacin de la estructura electrnica de materiales mediante el uso
de excitacin por rayos X.
6.4. Espectrometra de emisin por rayos x
Karl Manne Georg Siegbahn de Uppsala, Suecia (Premio Nobel 1924), fue uno
de los pioneros en el desarrollo de rayos X espectrometra de emisin (tambin
llamado X-espectroscopa de fluorescencia de rayos). Midi las longitudes de
onda de los rayos X en muchos elementos de alta precisin, utilizando
electrones de alta energa como fuente de excitacin.
Los rayos X intensos y de longitud de onda sintonizable son tpicamente
generados con sincrotrones. En un material, los rayos X pueden sufrir una
prdida de energa en comparacin con el haz de luz que entra. Esta prdida de
energa del haz re-emergente refleja una excitacin interna del sistema atmico,
de forma anloga a la conocida espectrofotometra raman que se utiliza
ampliamente

en

la

regin

ptica.

En la regin de los rayos X hay suficiente energa para producir cambios en el

estado electrnico (transiciones entre orbitales, lo que contrasta con la regin
ptica, donde la prdida de energa es a menudo debida a los cambios en el
estado de rotacin o los grados de libertad vibracionales). Por ejemplo, en la

29

regin ultraligera de los rayos X (por debajo de aproximadamente 1 k eV), las

excitaciones de los campos cristalinos dan lugar a la prdida de energa.
Podemos pensar en el proceso fotn-dentro-fotn-fuera como un evento de
dispersin. Cuando la energa del rayo X corresponde a la energa de enlace de
un nivel electrnico bsico, este proceso de dispersin potencia su resonancia
en muchos rdenes de magnitud. Este tipo de espectrometra de emisin de
rayos X se conoce a menudo como dispersin inelstica resonante de rayos X
(RIXS).
Debido a la amplia separacin de energas orbitales de los niveles bsicos, es
posible seleccionar un determinado tomo de inters. As, se puede obtener
informacin valiosa sobre la estructura electrnica local de sistemas complejos,
y los clculos tericos son relativamente sencillos de realizar.
6.5. Instrumentos
Existen varios diseos eficientes para analizar un espectro de emisin de rayos
X en la regin de los rayos X ultra ligeros. La cifra de valor para estos
instrumentos es el rendimiento espectral, es decir, el producto de la intensidad
detectada y el poder de resolucin espectral. Por lo general, es posible cambiar
los parmetros dentro de un cierto rango, mientras se mantiene su producto
constante.
6.5.1. Espectrmetros de rejilla
Normalmente, los rayos X que emergen de una muestra deben pasar una
hendidura que define la fuente, y luego los elementos pticos (espejos y/o
rejillas) los dispersan por difraccin segn su longitud de onda y, por ltimo, se
coloca un detector en sus puntos focales.
6.5.2. Monturas de rejilla esfrica
Henry Augustus Rowland (1848-1901) desarroll un instrumento que permita el
uso de un solo elemento ptico que combina la difraccin y la concentracin:
una rejilla esfrica. La reflectividad de los rayos X es baja, independientemente
del material utilizado y, por tanto, la incidencia sobre la rejilla es necesaria.

30

Imaginemos un crculo con la mitad del radio R tangente al centro de la

superficie de la rejilla. Este pequeo crculo se llama crculo de Rowland. Si la
hendidura de entrada estn en cualquier parte de este crculo, un haz de luz que
pase por la hendidura y golpee la rejilla se dividir en un haz reflejado
especularmente, y en haces de todos los rdenes de difraccin, que van a
concentrarse en determinados puntos en el mismo crculo.
Los espectrmetros de hendidura plana son similares a los espectrmetros
pticos. En primer lugar necesita una ptica que convierta los rayos divergentes
emitidos por la fuente de rayos X en un haz paralelo. Esto puede lograrse
mediante la utilizacin de un espejo parablico. Los rayos paralelos que salen de
este espejo golpean una rejilla plana (con una distancia de ranura constante) en
el mismo ngulo, y son difractados en funcin de su longitud de onda. Un
segundo espejo parablico, a continuacin, recoge los rayos difractados en un
cierto ngulo y crea una imagen en un detector. Un espectro dentro de un
determinado rango de longitud de onda puede ser registrado simultneamente
usando un detector sensible de posicin bidimensional tal como una placa
fotomultiplicadora de microcanal o un chip CCD sensible a los rayos X (tambin
se pueden utilizar placas de pelcula fotogrfica).
6.5.3. Interfermetros.
En lugar de utilizar el concepto de interferencia de haz mltiple que producen las
rejillas, se puede dejar simplemente que dos rayos interfieran. Registrando la
intensidad de dos de esos rayos colineales en algn punto fijo y cambiando su
fase relativa, se obtiene una intensidad del en funcin de la diferencia de
longitud de ruta. Se puede demostrar que esto es equivalente a una
transformada de Fourier del espectro en funcin de la frecuencia. La mayor
frecuencia registrable de dicho espectro depende del tamao mnimo de paso
elegido en la exploracin y de la resolucin de frecuencia (es decir, cmo de
bien una cierta onda puede definirse en trminos de su frecuencia). Esta ltima
caracterstica permite un diseo mucho ms compacto para lograr alta
resolucin que para un espectrmetro de rejilla, porque las longitudes de onda
de los rayos X son pequeas en comparacin con las diferencias de longitud de
ruta

alcanzables.

31

6.6. Espectroscopia de RMN con Onda Continua (CW: Continuos Wave)

Desde sus comienzos hasta finales de los 60, la de RMN utiliz una tcnica
conocida como espectroscopia de onda continua (CW). La manera de registrar
un espectro de RMN en el modo de CW era, bien mantener constante el campo
magntico e ir haciendo un barrido de frecuencias con un campo oscilante, o
bien, lo que era usado ms a menudo, se mantena constante la frecuencia del
campo oscilante, y se iba variando la intensidad del campo magntico para
encontrar las transiciones (picos del espectro). En la RMN de CW las seales del
espectro se registran como seales en resonancia.
La espectroscopia CW est limitada por su baja sensibilidad, ya que cada seal
se registra una sola vez por cada barrido y la tcnica de resonancia magntica
nuclear ya es de por s no demasiado sensible; esto quiere decir que la tcnica
sufre de una. Afortunadamente, en RMN es posible mejorar la relacin sealruido mediante el promediado de seal. El promediado de seal consiste en
repetir la adquisicin del experimento e ir sumando los espectros que se
obtienen. De esta manera, las zonas del espectro en que existen seales se
suman de manera constructiva, mientras que, por su parte, las zonas en que hay
ruido, por su carcter aleatorio, se acumula ms lentamente que la seal.
Mediante el promediado de seal se incrementa la relacin seal-ruido en un
valor que es la raz cuadrada del nmero de espectros que se han acumulado.
Esta relacin se cumple con espectros de RMN en los que intervienen un slo
tipo de ncleos, por ejemplo, slo 1H, 13C, etc., tambin llamados espectros
mononucleares.
La FT-NMR permite disminuir drsticamente el tiempo que requiere adquirir una
acumulacin del espectro completo de RMN. En vez de realizar un barrido lento
de la frecuencia, una en cada instante, esta tcnica explora simultnea e
instantneamente todo un rango de frecuencias. Dos desarrollos tcnicos fueron
fundamentales para poder hacer realidad la tcnica FT-NMR: ordenadores
capaces de llevar a cabo las operaciones matemticas necesarias para pasar
desde el dominio de tiempo al de la frecuencia, es decir, para obtener el
espectro; y el conocimiento sobre cmo poder excitar simultneamente todo un
rango de frecuencias.

32

La FT-NMR funciona con la muestra (espines nucleares) sometida a un campo

magntico

externo

constante.

Se

irradia

la

muestra

con

un

pulso

electromagntico de muy corta duracin en la regin de las radiofrecuencias. La

forma que suele usarse para este pulso es rectangular, es decir, la intensidad de
la radiofrecuencia oscila entre un mximo y un mnimo que es constante
mientras dura el pulso. Un pulso de corta duracin tiene una cierta incertidumbre
en la frecuencia). La descomposicin de Fourier de una contiene contribuciones
de una de todas las frecuencias. El pulso que se genera es por tanto poli
cromtico y cuanto ms corto sea, es capaz de excitar un mayor rango de
frecuencias.
La aplicacin de un pulso poli cromtico en una regin estrecha de la banda de
radiofrecuencias (MHz) afecta a aquellos espines nucleares que resuenen en
esa regin. Un pulso poli cromtico con una anchura en frecuencia de unos
pocos kHz puede llegar a excitar simultneamente slo a los espines nucleares
de un mismo tipo de ncleo atmico dentro de una molcula, por ejemplo, todos
los ncleos de hidrgeno (1H). Antes del pulso el vector de la direccin del
campo magntico. Durante el tiempo que se aplica el pulso, el pulso introduce
un segundo campo magntico en una direccin perpendicular al campo principal
del imn y el vector polarizacin realiza un determinado movimiento de Tras
cesar el pulso, el vector polarizacin de todos los espines afectados puede
formar un cierto ngulo con el eje del campo magntico principal. En este
momento, los espines, comportndose como pequeos imanes polarizados,
comienzan a presionar con su frecuencia caracterstica en torno al campo
magntico externo, induciendo una pequea corriente oscilante de RF en una
bobina receptora situada en las inmediaciones de la muestra. A medida que los
ncleos van regresando poco a poco a la situacin inicial de equilibrio alineados
con en el campo magntico principal, la seal detectada va disminuyendo de
intensidad hasta hacerse cero. Esta cada de la seal se conoce como cada
libre de la induccin y da lugar al espectro de RMN.
La FID es una onda que contiene todas las seales del espectro en una forma
que es dependiente del tiempo. Esta onda puede convertirse en un espectro de
seales en funcin de su frecuencia. Para ello se utiliza una funcin matemtica
conocida como.

33

La posibilidad de excitar la muestra con uno o ms pulsos de radiofrecuencia

(RF), cada uno de ellos aplicado con una potencia, duracin, frecuencia, forma y
fase particulares, e introducirlos en momentos especficos de tiempo durante el
experimento de RMN, generalmente antes de que el sistema haya regresado al
equilibrio por relajacin, permite disear toda una gama de secuencias de
pulsos de las que se puede extraer informacin molecular muy variada.
Una secuencia de pulsos es una distribucin en el tiempo de alguno o varios de
los siguientes elementos: i) un cierto nmero de pulsos de RF que afecten a uno
o ms tipos de ncleos, ii) tiempos de espera en los que no se hace nada sino
esperar a que el sistema evolucione de una determinada forma. Estos tiempos
de espera pueden ser fijos o bien incrementables si su duracin se va
aumentando a medida que se repite el experimento. iii) gradientes de campo
magntico y iv) una etapa final en la que se adquiere la FID.
En un experimento de RMN multidimensional la secuencia de pulsos debe
constar de al menos dos pulsos y stos deben separados por un periodo de
espera incrementable. La secuencia de pulsos se repite un nmero de veces
adquirindose una FID en cada ocasin. La fase de alguno de los pulsos puede
alterarse en cada repeticin as como incrementarse la duracin de uno o ms
tiempos de espera variables. Si la secuencia de pulsos tiene un tiempo de
espera incrementable el experimento tendr dos dimensiones, si tiene dos ser
de tres dimensiones, si tiene tres el experimento ser de cuatro dimensiones.
Aunque en teora no existe lmite en el nmero de dimensiones de un
experimento, experimentalmente hay limitaciones impuestas por la consiguiente
prdida de seal por relajacin que conlleva la deteccin de las distintas
dimensiones. Los tiempos de registro de los experimentos de RMN
multidimensional se pueden acortar drsticamente con las Los experimentos
multidimensionales se pueden clasificar en dos tipos principales:
Grosso modo, las interacciones que pueden detectarse por RMN se pueden
clasificar en dos tipos:
Las interacciones a travs de enlaces se basan en el acoplamiento escalar

34

Las interacciones a travs del espacio se basan en el acoplamiento dipolar. En

el caso de muestras en disolucin.
La RMN puede utilizarse tambin para el estudio de muestras en estado slido.
Si bien en su estado actual queda lejos de poder proporcionar con buen detalle
la estructura tridimensional de una biomolcula.
En el estado slido las molculas estn estticas y no existe, como ocurre con
las molculas en disolucin, un promediado de la seal de RMN por el efecto de
la rotacin trmica de la molcula respecto a la direccin del campo magntico.
Las molculas de un slido estn prcticamente inmviles, y cada una de ellas
experimenta un entorno electrnico ligeramente diferente, dando lugar a una
seal diferente. Esta variacin del entorno electrnico disminuye la resolucin de
las seales y dificulta su interpretacin. Fue uno de los pioneros en el desarrollo
de mtodos de alta resolucin para l fue quien introdujo la tcnica de la
rotacin en el ngulo mgico

que permiti incrementar la resolucin de los

espectros de slidos varios rdenes de magnitud. En ms, las interacciones se

promedian

rotando

la

muestra

una

velocidad

de

varios

kilohertzios. Revolucionaron tambin la RMN de slidos introduciendo la tcnica

de la polarizacin cruzada (CP) que consigue incrementar la sensibilidad de
ncleos poco abundantes gracias a la transferencia de polarizacin de los
protones a los ncleos ms insensibles cercanos, generalmente 13C, 15N o 29Si.
A caballo entre la RMN en disolucin y en fase slida, se encuentra la tcnica
de (High Resolution with Magic Angle Sinning), cuya aplicacin fundamental es
el anlisis de geles y materiales semislidos. El fundamento del HR-MAS es
hacer girar la muestra, al ngulo mgico, a una velocidad muy superior que en
slidos habituales. El efecto conseguido son espectros mono y bidimensionales
de gran calidad, prxima a la RMN en disolucin. En la actualidad los imanes
comerciales ms potentes estn en torno a los 22.31 T, o 950 MHz frecuencia de
resonancia de 1H. Los avances en la tecnologa audio-visual e informtica
tambin han mejorado los aspectos de generacin de pulsos y la recepcin de
seal y el procesado de la informacin.
La sensibilidad de las seales tambin depende de la presencia de ncleos
magnticamente-susceptibles a la RMN y, por tanto, de la abundancia natural de
tales ncleos. Para el caso de biomolculas los ncleos ms abundantes y

35

magnticamente susceptibles son los istopos de hidrgeno 1H y fsforo 31P. Por

el contrario, ncleos como carbono y nitrgeno tienen istopos tiles a la
RMN, 13C y 15N, respectivamente, pero se presentan en baja abundancia natural.
Para hacer frente a esta dificultad existe la posibilidad de enriquecer las
molculas de la muestra con estos istopos (ej. sustitucin de 12C por 13C y/o
de 14N por 15N) para poder estudiarlos por RMN con la suficiente sensibilidad. Se
trata de istopos perfectamente estables que no producen ms que una
pequea variacin en la masa molecular de la molcula, sin afectar para nada a
otras propiedades estructurales o qumica.
Un imn que genere un estable, el cual puede ser de una intensidad variable,
definiendo la frecuencia de resonancia de cada ncleo. Generalmente se
identifica cada espectrmetro por la frecuencia de resonancia del protn, as en
un imn de 7.046 Tesla, los ncleos de 1H resuenan a 300 MHz, y por tanto sera
un espectrmetro de 300 MHz. Por el momento el imn de mayor campo
magntico del mundo lo ha instalado Bruker en la Universidad de ciencia y
tecnologa. Una sonda, que se sita dentro del imn, en la que se introduce la
muestra y que consta de las bobinas responsables de emitir y recibir los pulsos de
RF y se controla el resto de la parte electrnica del espectrmetro.
Un ordenador que sirve de interfaz con el espectrmetro y con el que se analiza
toda la informacin obtenida. La aplicacin fundamental de la espectroscopia de
RMN es la determinacin estructural, ya sea de molculas orgnicas,
organometlicas o biolgicas. Para ello es necesaria la realizacin de diferentes
tipos de experimentos de los cuales se obtiene una determinada informacin.
Para la elucidacin estructural de molculas orgnicas y organometlicas los
experimentos ms utilizados son los siguientes: Espectro mono dimensional
de 1H: Da informacin del nmero y tipo de hidrgenos diferentes que hay en la
molcula. La posicin en el espectro (desplazamiento qumico) determina el
entorno qumico del ncleo, y por tanto da informacin de grupos funcionales a
los que pertenecen o que estn cerca. La forma de la seal da informacin de
los protones cercanos acoplados escalarmente.
Espectro mono dimensional de 13C: Al igual que en 1H el desplazamiento
qumico da informacin de los grupos funcionales. Dependiendo del tipo de

36

experimento realizado se puede obtener informacin del nmero de hidrgenos

unidos a cada carbono. Espectros bidimensionales: Los experimentos COSY y
TOCSY dan informacin de las relaciones entre los protones de la molcula, por
acoplamiento escalar o dipolar (NOESY).
Espectros bidimensionales heteronucleares: Los experimentos HMQC y HSQC
indican qu hidrgenos estn unidos a qu carbonos. El experimento HMBC
permite determinar relaciones entre protones y carbonos a mayor distancia (2 o
3 enlaces), Experimentos con otros ncleos: Si la molcula posee otros ncleos
activos en RMN es posible su medida a travs de experimentos mono
dimensionales o bidimensionales (por deteccin indirecta), La luz se puede
explicar como un conjunto de radiaciones que se mueven por todo el espacio.
Aquellas detectables por nuestro ojo corresponden a la luz visible, pero la
mayora son invisibles para nosotros. Estas radiaciones se pueden describir
como partculas y como ondas. La descripcin como onda se basa en que la luz
son campos elctricos y magnticos que oscilan perpendicularmente a la
direccin de traslacin por el espacio dando lugar a ondas transversales. Una
radiacin

electromagntica

(cualquier

fenmeno

ondulatorio)

se

define

generalmente mediante dos parmetros:

Longitud de onda (l): distancia recorrida por un ciclo completo. De cresta a
cresta de la onda.
Frecuencia(n): nmero de oscilaciones completas que realiza la onda per
segundo.
RADIACION ELECTROMAGNETICA

37

a. SOLIDOS
Los slidos en disolucin es complementaria de la cristalografa de rayos x ya
que

la

primera

permite

estudiar

la

estructura

tridimensional

de

las molculas en fase lquida o disuelta en un cristal lquido, mientras que la

cristalografa de rayos-X, como su nombre indica, estudia las molculas en
fase slida.
La RMN puede utilizarse tambin para el estudio de muestras en estado
slido. Si bien en su estado actual queda lejos de poder proporcionar con
buen detalle la estructura tridimensional de una biomolcula.
En el estado slido las molculas estn estticas y no existe, como ocurre con
las molculas en disolucin, un promediado de la seal de RMN por el efecto
de la rotacin trmica de la molcula respecto a la direccin del campo
magntico. Las molculas de un slido estn prcticamente inmviles, y cada
una de ellas experimenta un entorno electrnico ligeramente diferente, dando
lugar a una seal diferente. Esta variacin del entorno electrnico disminuye
la resolucin de las seales y dificulta su interpretacin. (MAS) que permiti
incrementar la resolucin de los espectros de slidos varios rdenes de
magnitud. En MAS, las interacciones se promedian rotando la muestra a una
velocidad de varios kilohertzios.
Alex Pines en colaboracin con John Waugh revolucionaron tambin la RMN
de slidos introduciendo la tcnica de la polarizacin cruzada (CP) que
consigue incrementar la sensibilidad de ncleos poco abundantes gracias a la
transferencia de polarizacin de los protones a los ncleos ms insensibles
cercanos, generalmente 13C, 15N o 29Si.
A una velocidad muy superior que en slidos habituales. El efecto conseguido
son espectros mono y bidimensionales de gran calidad, prxima a la RMN en
disolucin. La principal aplicacin de esta tcnica es el anlisis de matrices
biolgicas y polimricas.
La seal de RMN, y por tanto, tambin la sensibilidad de la tcnica depende
de la fortaleza del campo magntico, desde los inicios de la RMN ha existido

38

gran inters por el desarrollo de imanes ms potentes. En la actualidad los

imanes comerciales ms potentes estn en torno a los 22.31 T, o 950 MHz
frecuencia de resonancia de 1H. Los avances en la tecnologa audio-visual e
informtica tambin han mejorado los aspectos de generacin de pulsos y la
recepcin de seal y el procesado de la informacin.
La sensibilidad de las seales tambin depende de la presencia de ncleos
magnticamente-susceptibles a la RMN y, por tanto, de la abundancia natural
de tales ncleos. Para el caso de fsforo 31P. Por el contrario, ncleos como
carbono

nitrgeno

tienen

istopos

tiles

la

RMN, 13C

y 15N,

respectivamente, pero se presentan en baja abundancia natural. Para hacer

frente a esta dificultad existe la posibilidad de enriquecer las molculas de la
muestra con estos istopos (ej. sustitucin de 12C por 13C y/o de 14N por 15N)
para poder estudiarlos por RMN con la suficiente sensibilidad. Se trata de
istopos perfectamente estables que no producen ms que una pequea
variacin en la masa molecular de la molcula, sin afectar para nada a otras
propiedades estructurales o qumicas de la muestra.
Campo magntico estable, el cual puede ser de una intensidad variable,
definiendo la frecuencia de resonancia de cada ncleo. Generalmente se
identifica cada espectrmetro por la frecuencia de resonancia del protn, as
en un imn de 7.046 Tesla, los ncleos de 1H resuenan a 300 MHz, y por tanto
sera un espectrmetro de 300 MHz. Por el momento el imn de mayor campo
magntico del mundo lo ha instalado Bruker Una sonda, que se sita dentro
del imn, en la que se introduce la muestra y que consta de las bobinas
responsables de emitir y recibir las radiofrecuencias (RF). El nmero de
bobinas y su disposicin determinan el tipo y las aplicaciones de cada sonda.
Una consola en la que se generan los pulsos de RF y se controla el resto de
la

parte

electrnica

del

espectrmetro.

Un

ordenador

que

sirve

de interfaz con el espectrmetro y con el que se analiza toda la informacin

obtenida.
Fundamental de la espectroscopia de RMN es la determinacin estructural, ya
sea de molculas orgnicas, organometlicas o biolgicas. Para ello es
necesario la realizacin de diferentes tipos de experimentos de los cuales se
obtiene una determinada informacin. Para la elucidacin estructural de

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molculas orgnicas y organometlicas los experimentos mas utilizados son

los siguientes:

Ejemplo de un espectro 1H de RMN.

Espectro mono dimensional de 1H: Da informacin del nmero y tipo de
hidrgenos diferentes que hay en la molcula. La posicin en el espectro
(desplazamiento qumico) determina el entorno qumico del ncleo, y por tanto
da informacin de grupos funcionales a los que pertenecen o que estn cerca.
La forma de la seal da informacin de los protones cercanos acoplados
escalarme

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Ejemplo de un espectro APT, un tipo de experimento de 13C.

Espectro monodimensional de 13C: Al igual que en 1H el desplazamiento
qumico da informacin de los grupos funcionales. Dependiendo del tipo de
experimento realizado se puede obtener informacin del nmero de
hidrgenos unidos a cada carbono.

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Ejemplo de un espectro COSY.

Espectros bidimensionales homonucleares: Los experimentos COSY y
TOCSY dan informacin de las relaciones entre los protones de la molcula,
por acoplamiento escalar o dipolar (NOESY). Espectros bidimensionales
heteronucleares: Los experimentos HMQC y HSQC indican qu hidrgenos
estn unidos a qu carbonos. El experimento HMBC permite determinar
relaciones entre protones y carbonos a mayor distancia (2 o 3 enlaces).
Experimentos con otros ncleos: Si la molcula posee otros ncleos activos
en RMN es posible su medida a travs de experimentos mono dimensionales
o bidimensionales (por deteccin indirecta)

EJERCICIOS:
Una solucin de KMO4 tiene absorbancia de 0.539 cuando se mide a 540 nm
en una celda de 1.o cm cul es la concentracin de KMO4 antes de
determinar la absorbancia de la solucin desconocida, se obtuvieron los
siguientes datos de calibracin para el espectrofotmetro?
Concentracin del
KMNO4.
0.0300
0.0600
0.09OO
0.120
0.150

ABSORVANCI
A
0.162
0.33
0.499
0.670
0.840

42

BIBLIOGRAFIA

http:\espectofometria f\espectrofotometra\ESPECTROFOTOMETRIA y
LABORATORIOS.mht
http://www.frlp.utn.edu.ar/grupos/aepeq/lab.html
http:\espectofometria f\espectrofotometra\Ley de Lambert-Beer

(Espectrofotometra).mht
brainybetty.com 2
Analysis Instrumental, Douglas R. Skoog and Donald M. West.
Espectrofotometra. Fonaments Qumics. Univ. Girona
http://perso.wanadoo.es/sergioram1/espectrofotometria.htm
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-

mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf
http://materias.fi.uba.ar/6305/download/Espectrofotometria.pdf
http://www.bmglabtech.com/es/tecnologico/modos-dedeteccion/absorbancia/
http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/transmitancia-yabsorbancia
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf

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ANEXOS
f.1: Distribucin de luz en el espectro fotmetro.

F.2: El espectro de la absorcin de la clorofila.

44

F.3: Absorciones mximas de algunos compuestos que absorben

en la regin ultravioleta.

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F.4: Grupos funcionales cuyos picos se localizan en la regin del

infrarrojo.

F.5: Absorcin de luz.

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