FACULTAD DE INGENIERA

ESCUELA DE INGENIERA DE ALIMENTOS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
C= 4,2
CARACTERIZACIN BIOQUIMICA DE ENTEROBACTERIAS Y BACILOS
Balanta, Lina Marcela; lina.balanta@correounivalle.edu.co
Char Sotelo, Deisy Johana; deisychara121@hotmail.com
Mosquera, Mayra Alejandra; mayra.mosquera@correounivalle.edu.co

RESUMEN
Para establecer la identidad de un microorganismo, se requiere conocer de forma detallada su
actividad bioqumica, pues otras caractersticas no seran suficientemente diferenciales
En la prctica se llevaron a cabo diversas pruebas para la identificacin, basadas en las
caractersticas
bioqumicas
presentadas
por
Escherichiacoli
y
Bacillus
cereus. Para la identificacin del primer microorganismo se realizaron pruebas tales como: TSI,
realizada con asa recta en profundidad y por estras; prueba de Lisina descarboxilasa, la que se
realiz igual que la anterior; Prueba de Citrato de Simmons, para la cual se tom muestra de la
bacteria con asa esterilizada y se sembr realizando estras sobre la superficie del agar; Urea de
Christensen, sembrando sobre la superficie en forma de estra con el asa; prueba de movilidad
realizada con asa recta introducida hasta el fondo del agar; prueba de indol, en la cual se sembr la
muestra por puncin. Todas las pruebas se realizaron sembrando la bacteria en agar inclinado,
contenido en tubos de ensayo y se llevaron a estufa para incubacin a 37C por 48 horas. Se realiz
igualmente la reaccin del rojo de etilo y la reaccin de Vogues Proscaver, para las cuales, se
sembr con asa esterilizada, una muestra del microorganismo sobre caldo MRVP y pasadas 48 horas
de incubacin se agreg a la primera reaccin, 5 gotas de solucin de rojo de Metilo y a la segunda,
5 gotas de Sulfato de Cobre.
Para la identificacin de Bacillus cereus se realiz siembra en agar leche, agar almidn y agar
gelatina, sobre los cuales se inocul el microorganismo con asa esterilizada, realizando lnea recta
sobre la superficie de cada uno. Se llev a incubacin por 48 horas a 37C. De igual manera se
sembr muestra de este microorganismo en caldo de Nitrato, caldo de Glucosa, Caldo Arabinosa y
caldo Xilosa con ayuda de asa esterilizada y se llevaron a incubacin por 48 horas a 37C.
Pasadas las 48 horas se observ que la Escherichia coli dio resultado negativo para las pruebas
lisina descarboxilasa, citrato de Simmons, ureas de christensen, vogues proscaver
y positivo
para la prueba de movilidad, rojo de metilo y prueba de Indol. El Bacillus cereus dio positivo para
el caldo de glucosa y para arabinosa, xilosa y nitrgeno el resultado fue negativo, para las siembras
en agar almidn, leche y gelatina no logrndose observar en los dos ltimos respectivamente debido
a la degradacin total por el tiempo de incubacin.

INTRODUCCIN

Las pruebas bioqumicas son un conjunto de

test qumicos que se realizan a medios
1

biolgicos para su identificacin, basados en

las actividades metablicas y enzimticas de
los microorganismos.

contaminan el agua, alimentos y crecen en

medios de cultivo mu simples. Su
diferenciacin bioqumica se hace por las
caractersticas antes mencionadas.

Para realizar las pruebas bioqumicas se

dispone de mltiples medios, los cuales se
deben aplicar de acuerdo a la exigencia del
microorganismo objeto de estudio. Las
pruebas son simples y se usan para demostrar
en forma clara la presencia o no de algn
microorganismo especfico de acuerdo a su
desarrollo o no en presencia de inhibidores,
presencia o no de cierta actividad enzimtica,
grupo de enzimas, crecimiento a determinada
temperatura, etc.

Las
pruebas
permiten
tambin
la
identificacin de Bacilluscereus. Es un bacilo
formador de esporas, gram positivo, aerobio
facultativo y mvil, responsable de
intoxicaciones alimentarias; se encuentra
comnmente en el suelo, contamina con
frecuencia
cereales,
leche,
cremas
pasteurizadas y especias, entre otros
alimentos

Mediante estas pruebas bioqumicas es

posible establecer la presencia de bacterias
pertenecientes al tipo Escherichiacoli; stas
bacterias
pertenecen
a
la
familia
Enterobacteriaceae;
son
bacilos
gramnegativos, anaerobios facultativos y
estn presentes como comensales en los
intestinos de animales y del organismo
humano (son necesarias para el buen
funcionamiento del proceso digestivo); son
de vida libre pero tambin pueden ser
patgenas, causantes de enfermedad. Todas
las bacterias son oxidasa negativos, reducen
nitratos a nitritos y fermentan la glucosa. Son
poco exigentes, se encuentran en el ambiente,

OBJETIVOS

Aplicar pruebas bioqumicas a

enterobacterias (Escherichiacoli) y
bacilos (Bacillus cereus) para su
diferenciacin.
Reconocer la presencia o ausencia de
E. coli en un medio, de acuerdo a las
caractersticas que esta ocasiona en
un cultivo.
Reconocer la presencia de Bacillus
cereus en un medio de acuerdo a la
modificacin que causa en donde est
contenido.

MATERIALES Y MTODOS
Pruebas bioqumicas
ESCHERICHIA COLI
1. TSI
En tubo que contena agar inclinado concomponentes de TSI (Agar Triple Azcar), se sembr sobre
la superficie, con asa esterilizada, muestra de E. coli, en forma de estra y por puncin. Dicho tubo
fue llevado a incubacin por 48 horas a 37C, para luego observar los resultados.

2. Lisina descarboxilasa
Se realiz el mismo procedimiento que en la siembra en medio TSI, se llev a estufa para
incubacin durante 48 horas, a 37C. Posteriormente se observ el resultado.

3. Citrato de Simmons
Se sembr la bacteria con el asa de inoculacin sobre la superficie del agar inclinado, en forma de
estra y se llev a incubacin. Pasado el tiempo requerido, se observ el resultado.

4. Urea de Christensen
Se sembr muestra de E. coli, en forma de estra, sobre la superficie del agar con el asa de
inoculacin; se llev el sembrado a la estufa para su incubacin y se observ los resultados.
5. Movilidad
Se realiz siembra en profundidad con asa recta, en un tubo con medio SIM. Se llev a incubacin
por 48 horas a 37C. Se observ el resultado.
6. Prueba de Indol
Se sembr por puncin sobre tubo de ensayo con medio SIM (Silfuro Indol Movilidad), una
muestra de Escherichia coli, tomada con asa recta. Se llev a incubacin a 37C durante 48 horas.
Pasado el tiempo de incubacin, al tubo se le adicion 0,1 mL del reactivo de Kovacs, se esper la
reaccin y se observ el resultado.
7. Reaccin del rojo de Metilo
Se tom muestra de la bacteria con el asa de inoculacin y se diluy en un tubo de ensayo con caldo
MRVP, se llev a incubacin y pasadas las 48 horas, se le adicion 5 gotas de la solucin rojo
metilo para observar la reaccin.
8. Reaccin de VoguesProskaver

Para la siembra se emple el mismo procedimiento que en la reaccin del rojo de Metilo y pasado
el tiempo de incubacin, se adicion 5 mL de solucin de sulfato de cobre dentro del tubo con
cultivo y se observaron los resultados.

Bacilluscereus
1. Caldo glucosa, arabinosa y xilosa
Se tom muestra de la bacteria con el asa de inoculacin y sta fue vertida en los tubos con los
caldos, previa esterilizacin del asa. Se llevaron los tubos a la estufa para su incubacin y se
observaron los resultados.

2. Agar almidn
Con asa de inoculacin se tom muestra de Bacillus cereus y se realiz una lnea recta sobre el agar
y se llev a incubacin; pasadas las 48 horas, se cubri la superficie del agar con lugol y se observ
la reaccin producida.
3. Agar gelatina
Se sembr de la misma manera que en agar almidn. Una terminado el proceso de incubacin, se
aadieron 5 gotas de
Cloruro de mercurio al 15%; se elimin luego de 5 minutos, con agua y se observ.
4. Agar leche
Se sembr la bacteria (igual que en agar almidn y agar gelatina), se llev a estufa para incubacin
y posteriormente se observ el resultado.

RESULTADOS Y DISCUSIN
Caracterizacin Bioqumica
Escherichia coli
La Tabla 1 muestra los resultados tericos que deberan ser obtenidos durante las pruebas
bioqumicas realizadas a muestras de Echerichia coli.

GNERO Y ESPECIE
Escherichia coli
PRUEBA
RESULTADO

TSI
A/A
LISINA
DESCARBOXILASA
CITRATO DE
SIMMONS
UREA DE
CHRISTENSEN
Escherichia coli
MOVILIDAD
+
INDOL
+ +
INDOL
ROJO DE METILO
+
PROSCAVER
-

ROJO DE METILO

VOGUES PROSKAUER

Tabla 1. Identificacin bioqumica de

E. coli
CITRATO

TSI

UREASA

LISINA

MOVILIDAD

En la Tabla 2 se muestran los resultados

de las pruebas bioqumicas aplicadas a
la bacteria Escherichiacoli en diferentes
medios de cultivo, antes y despus de la
incubacin y de la adicin de reactivos.

Tabla 2. Pruebas bioqumicas para Escherichia coli

1. TSI
La Figura 1 muestra la imagen durante la siembra (izquierda) y luego de la incubacin
(derecha) de E. coli en medio TSI.

Figura 1. Prueba TSI

Tambin conocido como agar citrato de hierro tres azcares, es un medio de cultivo utilizado para la
identificacin de entero-bacterias basados en la fermentacin o no de azcares contenidos en el
medio (glucosa, lactosa y sacarosa). Al final de la prctica se observ que el medio TSI se torn de
coloracin amarilla, lo que evidencia fermentacin de los antes mencionados azcares. La
Escherichia coli, es una bacteria que pertenece a la familia de las Enterobacteriaceae; las bacterias
entricas fermentan los azcares mediante la reaccin de Embden-Meyerhof. Estas fermentaciones
presentan una caracterstica bioqumica particular, que no se da en otras fermentaciones bacterianas.
Se trata de una forma especial de escisin del cido pirvico que da lugar a cido frmico. Por
consiguiente el cido frmico es con frecuencia producto final mayoritario. Sin embargo no siempre
se acumula, ya que algunas de estas bacterias poseen el enzima hidrogenoliasa frmica que lo
escinde en CO2. (Stainer, et. al 1996).
La fermentacin de los azcares produce cambios en el pH (acidificacin) del medio, lo que causa
el cambio en la coloracin. La acumulacin de gas en el tubo de ensayo, est representado como un
espacio vaco en la parte central del medio de cultivo (Figura 2). El resultado concuerda con lo
estipulado en la Tabla 1.

2. Lisina descarboxilasa
La Figura 2 muestra la imagen durante la siembra (izquierda) y luego de la incubacin (derecha) de
E. colipara la prueba de Lisina Descarboxilasa.

Figura 2. Prueba Lisina Descarboxilasa

Muchas especies de bacterias tienen enzimas capaces de descarboxilar aminocidos especficos en

el medio de prueba. Las enzimas descarboxilasas eliminan una molcula de CO 2 de un aminocido

para formar aminas de reaccin alcalina. En el medio slido de agar hierro-lisina, la prueba tiene un
90% de positividad en Escherichia coli, liberando aminas de reaccin alcalina y CO 2.La bacteria
posee la enzima descarboxilasa, por tanto, la descarboxilacin de la lisina produce una amina, que
neutraliza el cido producido por la fermentacin de la glucosa y retorna el medio a su color
original violeta. (Koneman, et. al).El resultado concuerda con lo estipulado en la Tabla 1.

3. Citrato de Simmons
La Figura 3 muestra la imagen durante la siembra (izquierda) y luego de la incubacin y adicin de
reactivo (derecha) a la cepa de E. coli para la prueba de Citrato de Simmons.

Figura 3. Citrato de Simmons

El principio de la prueba de utilizacin de citrato es determinar la capacidad de un microorganismo

para utilizar citrato de sodio como nica fuente de carbono para su metabolismo y crecimiento.
Simmons mejor el mtodo de citrato de Koser agregando agar y azul de bromotimol a la frmula
de Koser, lo que proporcion un parmetro de color ms sensible (Konemanet al., 2008). El
metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs
del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y
piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser
utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio
entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa.
La bacteria Escherichia coli present un cambio de color en esta prueba bioqumica y de acuerdo a
la teora, no debera presentar dicho cambio; esto pudo ser producido por el tamao del inculo, ya
que cuando el inculo es demasiado grande, los compuestos orgnicos preformados dentro de las
paredes celulares de las bacterias moribundas pueden liberar suficiente carbono y nitrgeno como
para producir un resultado falso positivo en la prueba. El resultado no concuerda con lo estipulado
en la Tabla 1.

4. Urea de Christensen
La Figura 4 muestra la imagen del resultado obtenido durante la prueba de Urea de Christensen.

Figura 4. Urea de Christensen

El agar de Christensen tiene menos buffers de sales de fosfato a pH de 6,8 que el caldo urea de
Stuart y contiene peptonas y glucosa. Los microorganismos que tienen la enzima ureasa hidrolizan
la urea, liberan amonaco y producen un cambio de color rojo-rosado en el medio (Koneman et al.,
2008). En los resultados se puede observar la tonalidad final de la urea, la cual es de un rosa claro
indicando que la bacteria Echerichiacoli tiene presente a la enzima ureasa. (Konemanet al.,
2008).El resultado concuerda con lo estipulado en la Tabla 1.

5. Movilidad
La Figura 5 muestra la imagen del resultado obtenido para la prueba de movilidad.

Figura 5. Prueba de moviIidad

La prueba de movilidad permite determinar si un microorganismo es mvil o inmvil. Las bacterias

tienen movilidad por medio de sus flagelos.Las bacterias mviles pueden contener un nico flagelo
o muchos flagelos y su ubicacin vara segn las especies bacterianas y las condiciones del cultivo.
En ocasiones las bacterias mviles producen bacterias inmviles que parecen estables y en raras
oportunidades revierten a las formas mviles (Rondinoneet al., 2000). La prueba de movilidad
realizada a la bacteria Escherichia coli da positiva pues esta posee cierta movilidad gracias a una
serie de flagelos que rodean su estructura; esta caracterstica se evidenci pues al terminar el
periodo de incubacin, se observ crecimiento a lo ancho de la lnea de inoculacin. El resultado
concuerda con lo estipulado en la Tabla 1.

6. Indol
La Figura 6 muestra la imagen del resultado obtenido luego de la adicin del reactivo a la muestra,
durante la prueba de Indol.

Figura 6. Prueba de Indol

El Indol es uno de los productos de degradacin del metabolismo del aminocido triptfano. Las
bacterias que tienen la enzima triptofanasa pueden escindir el triptfano y producir as indol, cido
pirvico y amonaco. La presencia del indol se detecta por una coloracin roja al adicionar el
reactivo de Kovac, compuesto por p-dimetilaminobenzaldehdo (Konemanet al., 2008). El tubo
analizado con la bacteria Escherichia colipresent la coloracin antes mencionada, lo que indica
que el resultado para esta prueba es positivo y consecuentemente indica que la bacteria posee la
enzima triptofanasa.El resultado concuerda con lo estipulado en la Tabla 1.

7. Reaccin del rojo de Metilo

La Figura 7 muestra la imagen durante la siembra (izquierda) y al final de la reaccin ocurrida
durante la prueba del rojo de Metilo.

Figura 7. Reaccin del rojo de Metilo

La prueba del rojo metilo proporciona una caracterstica til para identificar especies bacterianas
que producen cidos fuertes a partir de la glucosa. El metabolismo del piruvato formado a partir de
la fermentacin de la glucosa se puede hacer por dos vas alternativas (cido mixto y butilenglicol).
Las bacterias que siguen la va de fermentacin cida mixta producen el cido suficiente para
mantener el pH por debajo de 4,4 (Konemanet al., 2008). El rojo de metilo presenta un color

amarillo cuando el pH es superior a 5,1 y un color rojo cuando el pH desciende a 4,4 (Forbes,
2009). Al realizar esta prueba a la bacteria Escherichia coli se obtuvo una coloracin roja despus
de la incubacin, lo que indica que sta bacteria degrada la glucosa por fermentacin cida mixta,
manteniendo el medio de cultivo cido. El resultado concuerda con lo estipulado en la Tabla 1.

8. Reaccin de VoguesProskauer
La Figura 8 muestra la imagen durante la siembra (izquierda) y luego de la incubacin (derecha) de
E. coli para la prueba de Vogues Proscauer.

Figura 8. Reaccin de VoguesProscauer

La prueba de Vogues-Proskauer se basa en la deteccin de acetona, un producto final neutro

derivado del metabolismo de la glucosa. La glucosa es metabolizada a cido pirvico, el principal
intermediario en la gluclisis. A partir del cido pirvico, las bacterias pueden seguir muchos
caminos metablicos para la degradacin de la glucosa; la produccin de acetona es una de estas
vas (MacFaddin, 2003). El desarrollo del color rojo 15 minutos o ms despus del agregado de los
reactivos, indica la presencia del diacetilo, el producto de oxidacin de la acetona lo cual indica
una prueba positiva. La prueba VoguesProskauer no debe leerse ms all de una hora despus de
dejar los tubos en reposo ya que los cultivos negativos pueden producir un color cobrizo, que se
puede interpretar como un positivo falso (Konemanet al., 2008). En la prctica no se obtuvo un
cambio de color para esta prueba en la bacteria Escherichia coli, segn la Tabla 1 no debe haber un
cambio de color ya que esta bacteria produce cidos en la fermentacin de la glucosa y lactosa y no
acetona.

Bacillus cereus
Reactivos

Resultados

CIDO Y
GAS A
PARTIR DE
GLUCOSA

XILOSA

ARABINOSA

Nitrato

AGAR
LECHE,
GELATINA
YALMIDN

Bacillus cereus

Antes

Despues

se observ
1. Caldo
burbujas
glucosa,
en el arabinosa,
medio lasxilosa,
cualesnitrato
corresponden a nitrgeno gaseoso ya que el nitrito
intermediario inhibe las descarboxilaciones( MacFaddin, 2000.)

2. Agar almidn
Todos los grupos de Bacilluscereus hidrolizan el almidn. La hidrolisis de almidn se da por la
accin de exoenzimas amilasas, que lo degradan a maltosa y glucosa (Alarcn et al., 2004). Para
observar la hidrolisis se agrega lugol en el agar, el cual hace que las zonas hidrolizadas tomen un
color claro y los alrededores de las zonas hidrolizadas se tornen de un color azul. El Bacillus cereus
hidroliz completamente el agar almidn debido al tiempo de incubacin, por lo tanto al agregar el
lugol la mayor parte del agar se torn de color claro.

3. Agar gelatina
En el agar gelatina el Bacillus cereus hidroliza la gelatina, la cual es una protena fibrosa. La
reaccin se da por la accin de la exoenzima gelatinasa y la gelatina hidrolizada se vuelve lquida
(Alarcn et al., 2004). Luego de retirar el mercurio al 15% se deben observar zonas claras rodeando
las estras de incubacin. Debido a que se hidroliz por completo el agar no se observan las zonas
claras despus del lavado.
4. Agar leche
La bacteria Bacillus cereus hidroliza la casena, la cual es una protena que se encuentra en la leche.
Cuando la leche se mezcla con un medio de cultivo, el medio pierde su transparencia y se vuelve
turbio dado que la casena reacciona con los iones calcio y forma complejos coloidales insolubles
de caseinato de calcio. Los aminocidos resultantes se disuelven en el medio acuoso y el medio se
torna de nuevo transparente alrededor de la colonia de microorganismos, esto permite detectar la
degradacin de la protena (Alarcn et al., 2004). En el agar leche utilizado en la identificacin del
Bacillus cereus, no se observan las zonas claras debido a la ausencia de aminocidos libres, y esto
es producto de una hidrolisis completa del medio por el tiempo de incubacin.
CONCLUSIONES

Las caractersticas del bacillus cereus estn presentes tambin en otras bacterias, por ello la
diferenciacin depende en gran manera de la determinacin de su movilidad (la mayora de
B. cereus son mviles).
- La prueba rojo de metilo indic que la bacteria Escherichia coli degrada la glucosa por
fermentacin cida mixta, manteniendo el medio de cultivo cido.
-Un prolongado tiempo de incubacin produce una hidrlisis completa del agar almidn,
gelatina y leche impidiendo la identificacin de la bacteria Bacillus cereus.

Solo esto de concluye???

REFERENCIAS
Alarcn, L., Olivas, E. 2004. Manual de prcticas de microbiologa bsica y microbiologa de
alimentos. Ciudad de Jurez. 107 paginas.
Forbes, B. 2009. Diagnostico microbiolgico. 12 edicin. Buenos Aires: Mdica Panamericana.
1160 pginas.
Koneman, E. Allen, S. 2008. Diagnostico microbiolgico: texto y atlas en color. Sexta edicin.
Buenos Aires: Mdica Panamericana. 1696 pginas.
MacFaddin, J. 2003. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica.
Tercera edicin. Madrid: Mdica Panamericana. 850 pginas.
MacFaddin. 2000. Biochemical tests for identification of medical bacteria, 3rd ed., Lippincott
Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
Rondinone, S., Octavio, G. 2000. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de
importancia clnica. Tercera edicin. Uruguay:Mdica Panamericana. 839 pginas.
Sainer, R., Ingraham, J. 1996. Microbiologa. Segunda edicin. Editorial Revert. 768 pginas.