GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

PROFESORES :
Dr. Jos Mar a Guevara Duncan
Dr. Nicanor Dom nguez Navarrete
Dra. Sara Palomino Berrios

AO 2005 - II

Alumno : .........................................................

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INSTRUCCIONES GENERALES
1.- Recomendaciones
Las personas que tienen que desarrollar alguna actividad dentro de un laboratorio
manipulando materiales biolgicos , tejidos o microorganismos , deben observar un
comportamiento denominado Normas de Bioseguridad , que son un conjunto de
disposiciones orientadas a evitar la contaminacin de las personas , siendo las
principales :
a.- Usar mandil, que cubra la ropa de vestir
b.- No comer, beber, fumar ni aplicarse cosmticos .
c.- Desarrollar el hbito de mantener las manos lejos de la boca, nariz, ojos y cara. para
evitar la autoinoculacin.
d.- Utilizar guantes cuando se manipulan l quidos orgnicos.
e.- Sobre la mesa de trabajo slo se podr ubicar el cuaderno de notas.
f.- Disponer siempre de un bocal con desinfectante (Ejm. Fenol al 5 %)
g.- Al finalizar los trabajos prcticos, lavarse las manos con jabn.

2.- Manejo del microscopio

En microbiolog a el manejo del microscopio es de gran ayuda para el reconocimiento
de los microorganismos. Se utiliza en preparaciones en fresco los objetivos secos de
10X 40X y en preparaciones coloreadas el objetivo de inmersin, 100X , el cual
necesita de aceite de cedro en la interfase objetivo portaobjeto.
Antes y despus de usar el microscopio debe hacerse una limpieza con alcohol al 50%
3.- Manipulacin de cultivos
Los cultivos bacterianos deben ser tratados con el mayor cuidado, para evitar tanto la
contaminacin del operador como la de los cultivos mismos, por lo cual se
recomienda:
a.- Trabajar siempre frente a la llama de un mechero
b.- Mantener los tubos en posicin vertical y tapados
c.- Colocar las placas petri en posicin invertida, para evitar que el agua de
condensacin contamine la superficie y mantenerlas cerradas.
d.- Eliminar los portaobjetos y laminillas en soluciones desinfectantes.
e.- El asa de siembra debe ser esterilizada antes y despus de su uso
f.- Todos los cultivos deben tener las anotaciones siguientes: nombre del germen,
nombre del alumno, nmero de mesa y fecha.
g.- En caso de accidente durante el trabajo, avisar al profesor.

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GUIA DE PRACTICAS
SEMANA
SEMANA

TEMARIO

Primera

01 02 03 04 05

Segunda

06 07

Tercera

08 09 10

Cuarta

11 12 13 - 14

Quinta

Seminario I

Sexta

15 16 17 18 19

Stima

20

Octava

21 - 22

Novena

Seminario II

Dcima

23 24 25 26

Onceava

27 28

Doceava

Seminario III

Treceava

29 30 - 31

Catorceava

32 33

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TEMA 01 : EXAMEN EN FRESCO
Introduccin:
El examen en fresco tiene por finalidad apreciar el tamao de las bacterias , que es del
orden de la micras ( milsima de mil metro) , su relacin con las clulas humanas y
algunas caracter sticas de inters para su identificacin , como la movilidad , la
presencia de cpsula , etc.
Este estudio se realiza con muestras recin emitidas o cultivos jvenes, mientras las
bacterias se encuentran viables.
Materiales:
Suspensin de mezcla de bacterias, levaduras y hemat es
Lminas portaobjetos y laminillas cubreobjetos
Suero fisiolgico ( ClNa 8.5 %) en goteros
Asa de siembra o microgotero
Procedimiento:
Tomar dos a tres asadas o una microgota de la mezcla bacteriana y depositarla en un
portaobjetos . Cubrir la preparacin con un cubreobjetos.
Observar al microscopio , utilizando objetivo de 40 X
Resultados:
Anotar la proporcin del tamao de las clulas humanas y las bacterias.
Apreciar la movilidad de las bacterias.

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TEMA 02 : OBSERVACIN DE CAPSULA

Introduccin :
Algunos microorganismos tienen la capacidad de producir una estructura que rodea a la
bacteria, denominada cpsula , que le otorga un factor de virulencia al germen, ya
que impide la fagocitosis.
Esta estructura se puede observar con facilidad en forma indirecta utilizando tinta china
, que no penetra en las bacterias capsuladas , dejando un halo transparente alrededor del
microorganismo.
Materiales :
Suspensin de cultivo de Criptococcus neoformans.
Solucin de tinta china
Lminas portaobjetos y laminillas cubreobjetos
Procedimiento :
Depositar una microgota o asada de tinta china sobre un portaobjetos.
Depositar muy junto a la anterior una microgota o asada de la suspensin del cultivo de
Criptococcus .
Seguidamente colocar una laminilla cubreobjetos sobre ambas muestras, de tal manera
que se junten y obtener una gradiente de la mezcla.
Observar al microscopio con objetivo de 40 X
Resultados
Registrar la forma ovalada de los Criptococcus , su forma gemada y el halo transparente
que los rodea en un campo oscuro.

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TEMA 03 : COLORACIN DE AZUL DE METILENO

Introduccin :
La coloracin de las bacterias permite el estudio morfolgico y apreciar la agrupacin
de ellas, caracter sticas tiles para su identificacin.
Los colorantes con radical cido coloreado (eosina, fucsina cida, azul de anilina y
fluoresce na ) colorean el protoplasma de las clulas . En cambio los colorantes con
radical bsico coloreado (azul de metileno, violeta de genciana, fucsina bsica,
safranina ) tien el ncleo de las clulas.
La clula bacteriana es rica en cido nucleico, el que se combina con colorantes bsicos
. Los colorantes cidos no tien a las clulas bacterianas, son usados como contraste.
Para proceder a colorear a las bacterias es necesario hacer un frotis, que es el
resultado de depositar la preparacin sobre un portaobjetos y fijar con calor suave.
Cuando el material es l quido se deposita una microgota o asada y cuando es slido
(agar) se debe realizar una suspensin ligera de la colonia en solucin salina y luego
fijarla.
Se denomina coloracin simple cuando se emplea un slo colorante y compuesta
cuando se emplean varios colorantes.
Materiales :
1. Suspensin de mezcla bacteriana
2. Lminas portaobjetos
3. Asa de siembra
4. Solucin de colorante Azul de metileno
5. Microscopio con objetivo de inmersin
6. Aceite para inmersin
Procedimiento :
1. Preparar un frotis a partir de la mezcla bacteriana . Fijarlo con calor suave.
2. Cubrir la preparacin con el colorante y dejarlo actuar durante 5 minutos.
3. Lavar la preparacin con agua corriente . Secar la lmina con calor suave.
4. Observar al microscopio con objetivo de inmersin, previa gota de aceite de
inmersin.
Resultados :
Hacer esquema de las diversas formas bacterianas y agrupaciones observadas.

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TEMA 04 : COLORACIN DE VAGO

Introduccin :
Las espiroquetas no toman con facilidad los colorantes , para colorearlas se emplean las
tcnicas de Giemsa o impregnacin argntica . Una tcnica sencilla, es la de Vago, que
se describe .
Materiales :
1. Mondadientes
2. Solucin de Mertiolate coloreado.
3. Solucin de Violeta de Genciana al 1 %
4. Lminas portaobjetos.
Procedimiento :
1. Con la ayuda de un mondadientes obtener una muestra de sarro dental y hacer un
frotis.
2. Dejar secar al ambiente . Cubrir con Mertiolate coloreado y dejar actuar durante 3
minutos
3. Lavar con agua corriente . Cubrir con Violeta de Genciana y dejar actuar durante 3
minutos.
4. Lavar con agua corriente y secar.
5. Observar al microcopio con objetivo de inmersin, previa gota de aceite.
Resultados :
Hacer esquema de las diversas morfolog as bacterianas , buscar en especial las
espirilares.

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TEMA 05 : COLORACIN DE GRAM
Introduccin :
Es la coloracin mas empleada en bacteriolog a, puesto que permite agrupar a las
bacterias en dos categor as, las Gram Positivas que son las que retienen el colorante
violeta de genciana y las Gram Negativas que pierden el colorante primario por accin
del decolorante, para luego teirse con un colorante bsico de contraste (rojo ).
Esta coloracin tiene relacin con la composicin qu mica de la pared y se describen
varias modificaciones .
Materiales :
1. Suspensin de mezcla bacteriana
2. Juego de colorantes para Gram :
a. Violeta de Genciana al 1 %
b. Solucin de Yodo
c. Decolorante : alcohol-acetona al 50%
d. Fucsina bsica al 0.1 %
3. Lminas portaobjetos
Procedimiento :
1. Hacer un frotis a partir de la mezcla bacteriana. Fijarla con calor suave.
2. Cubrir la lmina con violeta de genciana. Dejar actuar por 30 segundos
3. Lavar con agua. Cubrir con solucin de Yodo. Dejar actuar por 30 segundos
4. Decolorar con Alcohol-Acetona haciendo movimientos de vaiven durante diez
segundos
5. Lavar con agua. Cubrir con solucin de Fucsina. Dejar actuar durante 30 segundos
6. Lavar la lmina con agua y Secar.
7. Observar al microscopio con objetivo de inmersin y aceite.
Resultados :
Hacer esquema de la morfolog a y coloracin de las bacterias. Las Gram positivas se
tien de color azul violeta y las Gram negativas de color rojo.

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TEMA 06 : COLORACIN DE ZIEHL-NEELSEN
Introduccin:
Algunos grupos bacterianos poseen un elevado contenido de l pidos en su estructura,
que impide tomar los colorantes simples. Las Mycobacterias y las Nocardias tienen
sta propiedad.
La coloracin de Ziehl-Neelsen utiliza fucsina con fenol y la ayuda del calor para que
el colorante penetre en la pared celular. Como decolorante emplea una mezcla de
alcohol con cido clorh drico. Luego las bacterias que retienen el colorante se les
denomina cido alcohol resistentes.
Esta coloracin se emplea para el diagnstico de enfermedades como la tuberculosis y
la lepra.
Materiales :
1. Lminas portaobjetos con frotices de esputo de paciente con tuberculosis
2. Juego de colorantes para Ziehl-Neelsen
a. Solucin de Fucsina fenicada
b. Solucin de alcohol-cido al 3 %
c. Solucin de Azul de metileno
d. Mechero de alcohol
Procedimiento :
1. Colocar el portaobjetos con frotis sobre un soporte en el lavatorio
2. Cubrir la lmina con colorante Fucsina fenicada
3. Con la ayuda del mechero de alcohol, calentar suavemente la preparacin hasta que
se desprendan vapores , retirar la llama y repetir por tres veces ste procedimiento.
El colorante NO debe hervir ni secarse.
4. Eliminar el colorante y lavar la lmina con agua.
5. Decolorar con alcohol-cido , cubriendo la preparacin y hacer movimientos de
vaiven durante 15 a 30 segundos, hasta que no se desprenda colorante.
6. Lavar con agua y cubrir la lmina con solucin Azul de metileno . Dejar actuar
durante 5 minutos.
7. Lavar con agua .Secar.
8. Observar al microscopio con objetivo de inmersin
Resultados :
Hacer esquema de las estructuras celulares observadas de color azul y resaltar los
bacilos cido alcohol resistentes de color rojo de morfolog a caracter stica.

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TEMA 07 : METODOS DE ESTUDIO DE LAS BACTERIAS
Introduccin :
Las bacterias son capaces de desarrollar en medios inertes provistos de sustancias
nutritivas como compuestos nitrogenados, inorgnicos, energticos, concentracin
apropiada de hidrogeniones, humedad y condiciones ambientales de temperatura ,
ox geno, anh drido carbnico, etc.
De acuerdo a la consistencia los medios de cultivo se agrupan en l quidos, slidos y
semislidos. El grado de solidez se obtiene aadiendo el compuesto agar. Los medios
l quidos se emplean como enriquecimiento para incrementar la poblacin bacteriana,
en cambio los slidos distribuidos en placas de petri , se emplean para separar las
bacterias y obtener colonias puras.
Segn la necesidad de ox geno las bacterias pueden ser Aerobias estrictas, que
desarrollan slo en presencia de ox geno, Anaerobias facultativas que crecen en
presencia o ausencia de ox geno, Anaerobias estrictas que crecen slo en ausencia de
ox geno y las Microaerfilas que desarrollan en tensiones bajas de ox geno.
Tcnica de siembra: es el procedimiento por el cual se pone en contacto el
microorganismo con el medio de cultivo, para que en condiciones ptimas de nutricin,
temperatura y tiempo pueda desarrollarse la bacteria in vitro. El dispositivo empleado
se denomina asa de siembra, asa de platino o asa de Kolle y se usan diversos
mtodos: Inoculacin, puntura, estr a, dispersin-agotamiento.
Materiales :
1. Cultivo de Bacillus subtilis, Escherichia coli y Staphylococcus en medio slido
2. Cultivo de Staphylococcus sp en medio l quido ( caldo )
3. Medios sin sembrar : Caldo, placa con Agar nutritivo, Thioglicolato, Agar
movilidad
4. Lminas portaobjetos
5. Juego de colorantes para Gram
6. Cultivo de Escherichia coli en Caldo thioglicolato
7. Cultivo de Enterobacter en agar movilidad
8. Cultivo de Klebsiella en agar movilidad
Procedimiento :
1. Observar la caracter stica del desarrollo bacteriano en los medios slidos :
formacin de colonias.
2. Observar las caracter sticas del desarrollo en el medio l quido ( turbidez, sedimento
, etc ).
3. Observar y registrar las caracter sticas de las colonias desarrolladas en Agar
nutritivo: Tamao, Forma (circular, el ptica, puntiforme, filamentosa ), Superficie
(lisa,rugosa,granular), Elevacin (plana, convexa, umbilicada), Borde (entero
,ondulado, dentado, filamentoso ), Consistencia (cremoso, membranoso, mucoso),
Cromognesis (amarillo, rojo, verde )
4. Seleccionar dos o tres colonias diferentes , preparar un frotis de ellas y colorearlas
con Gram . Observar al microscopio con objetivo de inmersin.
5. Observar la turbidez uniforme en el medio de movilidad ( cepa mvil) y el
desarrollo slo en el trazo de siembra en la cepa inmvil.
Resultados :

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Hacer esquema de lo observado

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TEMA 08 : ACCION DE AGENTES FISICOS .- CALOR HUMEDO
Introduccin :
El comportamiento de los microorganismos frente a diversos agentes f sicos es variable,
en algunas condiciones puede estimular la multiplicacin bacteriana, en otros inactiva
su metabolismo e incluso logra destruirlos. Este ltimo efecto es utilizado para obtener
la esterilizacin de instrumentos mdicos y material biolgico.
El calor seco (horno) necesita temperaturas de 180 oC durante 60 minutos para obtener
esterilidad .
El calor hmedo ( bao maria hirviendo ) necesita periodos superiores a 20 minutos
para destruir a las bacterias.
El calor hmedo a presin (autoclave) es el procedimiento de esterilizacin mas
confiable . A una presin de 15 libras por pulgada cuadrada se obtiene 121 oC de
temperatura , que por un periodo de 15 minutos se consigue la esterilizacin total.
Materiales :
1. Suspensin de un cultivo de Staphylococcus sp
2. Suspensin de un cultivo de Bacillus subtilis
3. Suspensin de un cultivo de Escherichia coli
4. Placas petri con Agar nutritivo , con cuatro divisiones
5. Dispositivo para calentar agua hasta hervir
6. Asas de siembra
Procedimiento :
1. Calentar agua hasta hervir
2. Dividir la placa petri con agar nutritivo en cuatro partes y rotular con : 0 , 2, 5, y 10.
que son los tiempos de exposicin a la temperatura de 100 oC
3. Cada mesa trabajar con una bacteria. Sembrar una asada de la suspensin
bacteriana en el area marcada con 0, que ser el control de viabilidad de la
bacteria y de referencia.
4. Colocar la suspensin bacteriana en el bao mar a hirviendo durante 2 minutos ,
seguidamente sembrar una asada en la zona rotulada con 2
5. Volver a colocar la suspensin bacteriana en el bao mar a hirviendo y completar el
tiempo de exposicin de 5 minutos. Luego sembrar una asada en la zona rotulada
con 5
6. Volver a colocar la suspensin bacteriana en el bao maria hirviendo hasta
completar el tiempo de 10 minutos. Luego sembrar una asada en la zona de la placa
rotulada con 10
7. Incubar la placa petri a 37 C durante 24 horas, previa rotulacin de: nmero de
mesa, d a de la prctica, hora y bacteria utilizada.

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Resultados :
Luego de 24 horas de incubacin, leer el cultivo por la presencia de colonias que indica
desarrollo bacteriano (viabilidad). En cambio la ausencia de colonias es expresin de
muerte bacteriana.
Las zonas marcadas con 0, son los controles de viabilidad de la cepa en estudio,
donde siempre debe haber desarrollo bacteriano.

Tiempo de Exposicin a 100 oC

Staphylococcus

Bacillus subtilis

Escherichia coli

Cero

2 minutos

5 minutos

10 minutos

Anotar el nmero de colonias presentes en cada rea

EFECTO DE LA LUZ ULTRAVIOLETA

La luz ultravioleta tiene accin bactericida en la zona que cae directamente y es
emitida por una lmpara de mercurio.
Materiales:
1. Suspensin de un cultivo de Staphylococcus sp.
2. Suspensin de un cultivo de Pseudomonas.
3. Suspensin de un cultivo de Escherichia coli.
4. Placas petri con agar nutritivo, con 2 divisiones
5. Asas de siembra
6. Lmpara de luz ultravioleta.
Procedimiento:
1. Cada mesa trabajar con una bacteria.
2. Sembrar toda la placa con una asada de la suspensin bacteriana.
3. Llevar la placa sembrada al cub culo que tiene la luz ultravioleta.
4. Exponer la placa destapada a la luz ultravioleta tapando inmediatamente la
mitad de la placa con un papel.
5. Dejar actuar 10 minutos

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6. Tapar la placa ya rotulada y llevarla a la estufa a 37 C por 24 horas.
Resultados:
Observar el desarrollo bacteriano en la zona cubierta y no cubierta de la placa.

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TEMA 09 : ACCION DE AGENTES QU MICOS
Introduccin :
Numerosos compuestos qu micos inorgnicos como orgnicos son txicos para los
microorganismos. Los agentes qu micos que destruyen grmenes patgenos suelen
denominarse desinfectantes y a los que se aplican tpicamente se les denomina
antispticos .
El efecto biolgico de stos agentes puede ser bactericida o bacteriosttico .
En la prctica se demostrar comparativamente la actividad de los compuestos qu micos
mas frecuentemente empleados en medicina.
Materiales :
1. Suspensin bacteriana de Staphylococcus sp , Pseudomonas a. y Escherichia coli
2. Solucin de antispticos: Mertiolate , Aseptil rojo y Alcohol a 70 o, :2 ml
3. Placas petri con Agar nutritivo, divididas en cuatro areas. Una para cada antisptico
y para el control.
4. Pipetas Pasteur o goteros estriles.

Procedimiento :
1. Dividir la placa petri con Agar en cuatro areas : Control, Mertiolate , Aseptil Rojo
y Alcohol
2. Cada mesa trabajar con un microorganismo
3. Depositar una asada de la suspensin bacteriana en la zona marcada con C
control de viabilidad
4. A cada solucin de desinfectante , aadirle 5 gotas de la suspensin bacteriana.
Dejar actuar durante 10 minutos.
5. Seguidamente tomar una asada de cada mezcla y depositarla en la superficie del
agar rotuladas con M , ARy A, respectivamente.
6. Esperar unos minutos hasta que el inculo se seque e incubar la placa a 37 oC
durante 24 horas.
Resultados :
Registrar el desarrollo bacteriano por la formacin de colonias.
Comparar el desarrollo y nmero de colonias de la zona de control con los de la mezcla
con antispticos.
Microorganismo : Staphylococcus sp
CONTROL

ASEPTIL ROJO

MERTIOLATE

ALCOHOL

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Microorganismo : Pseudomonas aeruginosa.

CONTROL ASEPTIL ROJO

MERTIOLATE

ALCOHOL

Microorganismo : Escherichia coli

CONTROL

ASEPTIL ROJO

MERTIOLATE

ALCOHOL

Comentario

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TEMA 10 : ACCION DE AGENTES ANTIMICROBIANOS

ANTIBIOGRAMA
Introduccin :
La actividad de los antibiticos y quimioterpicos debe ser evaluada in vitro para
obtener la informacin que permita decir si un microorganismo es susceptible o
resistente a determinado producto .
La determinacin de la m nima concentracin inhibitoria (MIC) nos proporciona la
dosis m nima necesaria del quimioterpico para impedir el desarrollo bacteriano, lo que
permite hacer estudios de uso cl nico y detectar mutantes resistentes.
Dos son los procedimientos empleados para conocer sta informacin , el mtodo del
tubo dilucin y el del disco difusin en agar , a ste ltimo se le denomina
antibiograma.
Mtodo del Tubo dilucin :
Materiales:
1. Se presenta una gradilla con diez tubos en los que se han realizado diluciones
sucesivas al medio, a partir de una solucin de antibitico con 200 microgramos ,
obteniendo concentraciones decrecientes de:
100 50 25 12,5 6,25 3.12 1.56 0.78 y 0.39 mcg/ml .
El ltimo tubo no contiene antibitico, es control de viabilidad de la bacteria en
estudio.
A cada tubo se ha aadido 0.5 ml de un cultivo de 18 horas de la bacteria en
estudio. Toda la gradilla de tubos ha sido incubada a 37 oC durante 24 horas.
Lectura :
1. Leer el desarrollo bacteriano como turbidez, por lo tanto resistencia bacteriana al
quimioterpico.
2. Los tubos que permanecen transparentes indican ausencia de desarrollo, luego
susceptibilidad bacteriana al quimioterpico.
3. Iniciar la lectura por el tubo que contiene mayor concentracin de quimioterpico
4. El ltimo tubo transparente ( ausencia de desarrollo ) representa la dilucin de
quimioterpico denominada MIC
5. El timo tubo , que no contiene quimioterpico, debe estar siempre turbio, control
de viabilidad bacteriana.
Resultados : Hacer esquema de lo observado

Tubo
Concentracin
de antibitico

100

50

25

12.5 6.25 3.1

1.56

0.78

10

0.39

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MIC

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Mtodo de Disco difusin en agar :

Materiales :
1. Se presenta una placa de Agar Mueller Hinton sembrada con una suspensin
bacteriana. En la superficie se han depositado discos de papel de filtro embebidos
en antibiticos: Penicilina (P), Ampiclina (AM), Cefalotina (CF), Ceftriaxona
(CTX), Sulfatrimetoprim (SXT), Kanamicina (K), Amikacina (AK), Nitrofuranos
(FD), Acido nalid xico (AN), etc.
La placa ha sido incubada a 37 oC durante 24 horas.
Lectura :
1. El desarrollo bacteriano se lee por la presencia de colonias .
2. Observar alrededor de los discos la formacin de halos transparentes sin desarrollo
bacteriano, indica que la bacteria debe ser sensible a dicho antibitico.
3. El dimetro de los halos de ausencia de desarrollo deben ser medidos y llevados a
la tabla de Bauer y Kirby para catalogar los resultados.
Resultados :
Hacer esquema de lo observado

Tabla de Bauer y Kirby :

Quimioterpico
Ampicilina
AM
Amikacina
AK
Ac. nalid xico AN
Cefalotina
CF
Cefoxitina
CTX
Ceftriaxona CRO
Cloranfenicol C
Kanamicina
K
Nitrofuranos FD
SulfatrimetoprimSXT
Ciprofloxacina CIP

Concentracin
del disco mcg
10 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
300 ug
231.2 ug
5 ug

Halo de inhibicin de desarrollo

Sensible
Intermedio Resistente
+17
14-16
- 13
+17
- 15
+19
14-18
- 13
+18
15-17
- 14
+21
16-20
- 15
+21
14-20
- 13
+18
15-18
- 14
+18
14-17
- 13
+17
15-16
- 14
+16
11-15
- 10
+21
16-20
-15

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TEMA 11 : STAPHYLOCOCCUS
Introduccin :
Este microorganismo se encuentra muy distribuido en la naturaleza y forma parte de la
flora normal del hombre.
La especie Staphylococcus. aureus es causante de diversos procesos infecciosos como
la forunculosis, imptigo, abscesos, intoxicaciones alimentarias, etc.
Las caracter sticas que permiten identificar al Gnero, son la morfolog a de cocos
agrupados en racimos, que se tien como Gram positivos. En los cultivos desarrollan
en medios hipertnicos y producen una potente enzima catalasa.
Estudiaremos las especies de inters mdico: aureus, saprophyticus y epidermidis
Materales :
1. Cultivo de Staphylococcus en caldo nutritivo
2. Cultivo de Stph.. aureus en medio hipertnico con manitol (MH) y Agar
nutritivo con disco de Novobiocina.
3. Cultivo de Stph. epidermidis en medio hipertnico con manitol (MH) y Agar
nutritivo con disco de Novobiocina
4. Cultivo de Stph. saprophyticus en medio hipertnico con manitol (MH) y Agar
nutritivo con disco de Novobiocina.
5 Plasma humano diluido al 50
7. Agua oxigenada 30 vol.
8. Juego de colorantes para Gram.
Procedimiento :
1. Observar el desarrollo del Staphylococcus en caldo con turbidez uniforme. Hacer
un frotis y colorearlo con Gram.
2. Observar las caracter sticas de las colonias de las tres especies de Staphylococcus
desarrolladas en medio hipertnico y apreciar el metabolismo del manitol.
3. Observar el comportamiento de las tres especies frente a la Novobiocina.
4. Depositar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos. Con el asa de
siembra tomar una pequea colonia de Staphylococcus y ponerla en contacto con el
agua oxigenada , apreciar la formacin de burbujas ,por accin de la enzima
catalasa.
5. Depositar 1 ml de plasma en tubo pequeo. Con el asa de siembra tomar una
pequea colonia del cultivo y depositarla en el plasma. Incubar a 37 oC durante 2
horas . Observar la formacin de cogulo por accin de la enzima coagulasa.
Proceder por separado con cada especie bacteriana.

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Resultados :
Registrar las observaciones

Caldo

Gram

Coagulasa

Medio Hipertnico con manitol

Agar nutritivo y Novobiocina

Catalasa

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TEMA 12 : STREPTOCOCCUS
Introduccin :
Este gnero comprende un grupo numeroso de microorganismos , muchos viven como
comensales , algunos son patgenos para el hombre, como el pygenes, agalactiae,
pneumoniae. Producen infecciones focales como faringitis , imptigo, endocarditis,
escarlatina, neumon a, meningitis, otitis y s ndromes posinfecciosos como la
cardiopat a reumtica y la glomerulo nefritis aguda.
Estos microorganismos son cocos esfricos o lanceolados que se orientan en cadenas o
pares., Gram positivos.
La clasificacin mas prctica es la basada en el tipo de hemlisis que se produce en la
placa con agar sangre.
El St. pygenes produce hemlisis tipo beta o total y es sensible a la bacitracina
El St viridans produce hemlisis tipo alfa o parcial,
El St pneuminae tambin produce hemlisis tipo alfa , pero es formador de cpsula y
sensible a la etilhidrocupreina (optochin)
El Enterococo tiene la capacidad de desarrollar en medio salino ( 6.5 % de ClNa)
Materiales :
1. Cultivo de Streptococcus sp.en caldo nutritivo
2. Cultivo de Streptococcus pygenes en agar sangre , con disco de bacitracina
3. Cultivo de Streptococcus viridans en agar sangre con disco de optochin
4. Cultivo de Streptococcus pneumonia en agar sangre con disco de optochin
5. Cultivo de Enterococcus en agar sangre y caldo salino
6. Juego de colorantes para Gram
Procedimiento :
1. Observar la caracter stica de desarrollo del Streptococcus en caldo nutritivo , con
formacin de sedimento.
Mezclar el tubo y hacer un frotis , colorearlo con Gram
2. Observar las placas de agar sangre , estudiar las caracter sticas de las colonias y su
comportamiento con la sangre. Tipo de hemlisis alrededor de ellas.
3. Observar el comportamiento de cada especie bacteriana frente a la bacitracina y el
optochin
4. Apreciar el desarrollo uniforme del Enterococcus en el caldo salino.

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Resultados :
Registrar lo observado

Caldo nutritivo
Streptococcus

Gram

St. pyogenes
St beta
(bacitracina)

Caldo salino
Enterococcus

St pneumoniae
(optochin)

St viridans ( optochin)
Agar sangre

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TEMA 13 : CORYNEBACTERIUM
Introduccin :
El Corynebacterium diphtheriae es la nica especie patgena de ste grupo , su rol
patgeno est ntimamente relacionado con la produccin de exotoxina y su transmisin
es inter-humana. Hay varias especies saprofitas.
Son microorganismos de forma bacilar, pleomrfica, algunas en forma de mazo y se
agrupan en letras chinas, Gram positivas. Desarrollan con facilidad en los medios de
cultivo que contengan plasma o sangre.
Materiales :
1. Frotis de exudado faringeo de un paciente con difteria. Colorearlo con Gram
2. Frotis de cultivo de Corynebacterium sp para colorear con Gram
3. Cultivo de Corynebacterium sp. en Agar sangre
4. Juego de colorantes para Gram
Procedimiento :
1. Colorear los frotices presentados con Gram y observar con lente de inmersin.
Apreciar la forma bacilar corta , gruesa y en empalizada
2. Describir las colonias del cultivo en Agar sangre
Resultados :
Hacer esquema de lo observado en el microscopio

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TEMA 14 : LISTERIA
Introduccin :
La Listeria monocitgenes, especie bacteriana saprofita , habita en los vegetales y en el
intestino de los animales . La infeccin humana est relacionada a la ingesta de
alimentos y a la contaminacin de los genitales femeninos , con riesgo en gestante de
producir sepsis neonatal, en adultos inmunocomprometidos puede producir meningitis.
La identificacin se orienta por la morfolog a bacilar corta , Gram positivo, desarrolla
en Agar sangre produciendo una discreta hemlisis . Lo mas caracter stico es la
capacidad de desarrollar a bajas temperaturas y poseer movilidad slo a 22 oC
Materiales :
1. Frotis de cultivo de Listeria m, para colorear con Gram.
2. Cultivo de Listeria m. en Agar angre o Agar nutritivo.
3. Cultivo de Listeria m. en Agar blando movilidad, incubado a 22 oC y 37 oC
4. Cultivo de Listeria en caldo
Procedimiento :
1. Colorear el frotis con Gram y observar con lente de inmersin.
2. Observar las caracter sticas de las colonias del cultivo en Agar sangre
3. Observar el desarollo mvil en agar blando a 22 oC , por la presencia de turbidez
alrededor del trazo de siembra.

Resultados :
Hacer esquema de lo observado

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TEMA 15 : LACTOBACILLUS
Introduccin :
Los Lactobacillus son un grupo de grmenes saprofitos que tienen la capacidad de
producir cido lctico como producto final del metabolismo de los hidratos de carbono.
La especie Lactobacillus acidphilus habita las vias genitales femeninas ( bacilo de
Doderlein ) y metaboliza el glucgeno manteniendo el pH cido de la zona vaginal,
evitando la sobrecontaminacin.
Materiales :
1. Frotis de secrecin vaginal coloreado con Gram
Procedimiento :
1. Observar con objetivo de inmersin el frotis coloreado
Resultados:
Hacer esquema de lo observado en el microscopio

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TEMA 16 : BACILLUS
Introduccin :
Este gnero agrupa a un gran nmero de especies bacterianas que habitan en el medio
ambiente, algunas son utilizadas en el campo de la biotecnolog a como productoras de
antibiticos ( polimixina, bacitracina ), alcoholes, enzimas y vitaminas.
Slo una especie, el Bacillus anthracis, es causante de enfermedad en humanos y
animales, denominado carbunco.
En la prctica estudiaremos la especie Bacillus subtilis, saprofito contaminante
ambiental, para apreciar sus caracter sticas de bacilo grande, Gram positivo, formador
de esporas y que cultiva en condiciones aerbicas.
Materiales :
1. Cultivo de Bacillus subtilis en caldo nutritivo
2. Cultivo de Bacillus subtilis en Agar nutritivo
3. Cultivo de Bacillus subtilis en tubo con Agar blando
4. Juego de colorantes para Gram
Procedimiento :
1. Observar las caracter sticas de desarrollo del B subtilis en los medios l quidos, agar
blando .
2. Estudiar las caracter sticas de las colonias en agar nutritivo
3. Hacer un frotis a partir del caldo nutritivo y colorearlo con Gram
Resultados :
Hacer esquema de lo observado .

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TEMA 17 : CLOSTRIDIUM
Introduccin :
Son microorganismos ampliamente distribuidos en la naturaleza y en el intestino de los
animales herb voros. La infeccin humana es circunstancial a un trauma, a la ingesta
de alimento contaminado y a la presencia de exotoxina espec fica.
Se pueden agrupar en citotxicos, enterotxicos y los productores de intoxicaciones
espec ficas como el ttanos y el botulismo.
Todos los Clostridium son bacilos, Gram positivos, formadores de esporas y que
desarrollan en condiciones de anaerobiosis.
Materiales :
1. Frotis de secrecin de herida gangrenosa coloreada con Gram.
2. Cultivo de Clostridium sp, en medio de thioglicolato y agar semislido
3. Sistemas para obtener anaerobiosis
Procedimiento :
1. Observar con objetivo de inmersin los frotices coloreados, anotar las
caracter sticas de los bacilos.
2. Observar la forma de desarrollo , alejada de la superficie, en el medio de
thioglicolato.
3. Evaluar los sistemas para obtener anaerobiosis.
Resultados :

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TEMA 18 : NEISSERIAS
Introduccin :
El humano es el nico reservorio de gnero Neisseria, habitan, las saprofitas, en el
tracto respiratorio alto y sus mucosas. Dos especies tiene un rol patgeno definido, la
Neisseria gonorrhoeae y la Neisseria meningitidis.
Las neisserias son cocos Gram negativos que se agrupan en pares , son muy sensibles a
las condiciones adversas para su desarrollo en medios de cultivo, requiriendo medios
enriquecidos ( Tayer Mart n) , producen una enzima respiratoria que las identifica , la
citocromo oxidasa.
Materiales :
1. Frotis de secrecin uretral de paciente con Gonorrea, coloreado con Gram y Azul de
metileno.
2. Cultivo de Neisseria sp en Agar Thayer Mart n, incubado a 37 oC en ambiente con
CO2.
3. Reactivo tetrametil para fenil diamino al 1 % para detectar la enzima oxidasa
4. Juego de colorantes para Gram
5. Placas de Agar Muller Hinton sembradas con Neisseria spp
Procedimiento :
1. Observar con objetivo de inmersin los frotices de secrecin uretral. Apreciar la
forma de diplococo y su ubicacin intracelular.
2. Observar las caracter sticas de las colonias del cultivo de Neisseria
3. Realizar la reaccin de oxidasa : tomar una pequea porcin de colonias y ponerla
en contacto con el reactivo. Observar de inmediato el cambio del color por la
oxidacin del reactivo.
Resultados :
Registrar lo observado.

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TEMA 19 : BRUCELLA
Introduccin :
La brucelosis es una zoonosis. En los animales la infeccin es sistmica y de
localizacin en los rganos genitales y glndulas mamarias. Produce aborto en animales
.
Este microorganismo tiene cierta especificidad de especie animal, asi Brucella abortus
es selectiva para ganado vacuno, Brucella mellitensis para ganado caprino y lanar,
Brucella suis para el porcino.
El humano se infecta ingiriendo productos lcteos contaminados, luego hace septicemia
con localizacin en el tejido ret culo endotelial ( h gano, mdula sea y bazo ).
Este microorganismo es muy pequeo, tipo coco-bacilar, Gram negativo, que desarrolla
con lentitud en los medios de cultivo ( 3 a 7 dias ) dando colonias caracter sticas.
Materiales :
1. Frotis de cultivo de Brucella mellitensis, para colorear con Gram
2. Hemocultivo en medio bifsico (Ruiz Castaeda) para aislar Brucella
3. Juego de colorantes para Gram
4. Suero de paciente con brucelosis
5. Ant geno de Brucella para aglutinacin en lmina
Procedimiento :
1. Colorear con Gram el frotis de cultivo. Observarlo al microscopio y apreciar el
diminuto tamao de ste microorganismo.
2. Observar el sistema bifsico para aislar la brucella a partir de l quidos orgnicos .
asi como las caracter sticas de las colonias.
3. Sobre un portaobjetos depositar una microgota (0.04) del suero del paciente y
aadirle una microgota del ant geno.
Mezclar por rotacin durante 3 minutos, apreciar la presencia de aglutinacin
( grumos ), cuando hay anticuerpos.
Resultados :
Registrar lo observado

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TEMA 20 : ENTEROBACTERIAS
Introduccin :
Son un grupo de microorganismos que habitan el suelo, agua, materia en
descomposicin e intestino del hombre y de los animales . La mayor a de las especies
son saprofitas y oportunistas, producen infecciones nosocomiales, pero algunas son
agentes causales de enfermedades gastrointestinales, la disenter a bacilar y diarrea
acuosa.
Estos grmenes son bacilos Gram negativos, no esporulados , que desarrollan
fcilmente en los medios de cultivo. Todos fermentan la glucosa y poseen una
diversidad de enzimas que permite clasificarlos en diferentes gneros de acuerdo al
substrato utilizado y al producto terminal del metabolismo. Carecen de la enzima
citocromo oxidasa.
Para la identificacin se emplean estudios del metabolismo ( biotipo ) e
inmunoserolgicos ( serotipo ).
Materiales :
1. Suspensin de heces en solucin salina
2. Placas petri con medio de Mac Conkey, sembradas con cepas de Escherichia coli,
Klebsiella, Proteus, Salmonella y Shigella.
3. Placas petri con medio de SS agar, sembradas con cepas de Escherichia coli,
Klebsiella, Proteus, Salmonella y Shigella.
4. Tubos con medios diferenciales : TSI (tres azcares y hierro), LIA (lisina hierro y
agar ), Citrato y Urea, todos sembrados con las cepas de Escherichia coli,
Klebsiella, Proteus, Salmonella y Shigella.
5. Juego de colorantes para Gram.
Procedimiento :
1. Hacer un frotis de la suspensin de heces y colorearlo con Gram.
2. Hacer un frotis de cada una de la cepas presentadas y colorearlo con Gram .
3. Estudiar comparativamente las caracter sticas de desarrollo de las diversas especies
bacterianas en los medios de Mac conkey y agar SS.
4. Estudiar las reacciones bioqu micas , producto del metabolismo bacteriano en los
medios diferenciales.
TSI
Lactosa y sacarosa ( pico )
Via oxidativa : acidez amarillo
Produccin de H2S
Color negro (sulfuro de hierro)

FeS

Glucosa ( fondo )
Via fermentativa :acidez amarillo (con gas o sin gas)

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LIA (Lisina Hierro Agar)

V a de utilizacin del aminocido y produccin de H2S

Decarboxilacin de la Lisina, color lila al fondo
alcalinidad de los radicales amina libres

No utilizacin del aminocido: Incoloro o

Amarillento al fondo por ligera acidez el uso de
la glucosa.

Citrato
Agar semislido

Resultados :
Registrar los cambios observados producto de la actividad metablica de la especie
bacteriana.

Escherichia
coli

Klebsiella

Proteus

Salmonella

Shigella

Mac
Conkey
SS agar
Glucosa
Gas
Lactosa
Sacarosa
H2S
Descarboxi
lacin de
Lisina

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Citrato
Urea
Movilidad

TEMA 21 : BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES

Introduccin :
Con ste trmino se agrupa a microorganismos de diferentes familias que habitan en el
medio ambiente o forman parte de la flora normal del cuerpo, patgenos oportunistas,
que tienen en comn la incapacidad de metabolizar los carbohidratos por via
fermentativa.
Incluye a las Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas, etc.
Materiales :
1. Cultivo de Pseudomonas aeruginosa en Caldo nutritivo, Agar Mac conkey, Agar
nutritivo.
2. Cultivo de Pseudomonas aeruginosa sembrado en medio TSI y Agar movilidad
3. Cultivo de Acinetobacter en Caldo nutritivo,Agar Mac conkey y Agar nutritivo
4. Cultivo de Acinetobacter en medio TSI, Agar movilidad y Caldo.
5. Reactivo para reaccin de oxidasa
6. Juego de colorantes para Gram
Procedimiento :
1. Observar el desarrollo en superficie de la Pseudomonas a. en caldo nutritivo.
2. Hacer frotis a partir del caldo con Pseudomonas y colorearlo con Gram
3. Estudiar comparativamente las colonias de Pseudomonas y Acinetobacter en los
medios de Mac Conkey y Agar nutrtivo. Apreciar formacin de pigmento verde que
difunde en el medio de Agar nutrtivo sembrado con Pseudomonas.
4. Observar el comportamiento de ambas cepas en el medio de TSI ( desarrollo slo en
superficie ) y en el medio movilidad
5. Realizar la reaccin para Oxidasa.

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Resultados :
Gram
Caldo
Nutritivo
Agar
M.Conkey
Agar
Nutrititvo
T.S.I.
Movilidad
Oxidasa
Pseudomonas

Acinetobacter

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TEMA 22 : VIBRIOS

Introduccin :
La familia Vibrionaceae comprende tres gneros de importancia mdica: Vibrio,
Aeromonas y Plesiomonas. Todos son de origen acutico, luego la contaminacin
humana es consecuencia de la ingesta de alimentos o agua con grandes cantidades de
microorganismos.
Los agentes patgenos mas importantes son el Vibrio cholerae, el Vibrio
parahaemolyticus y Aeromonas.
Todos ellos son de forma bacilar o curvada , Gram negativos, con movilidad polar.
Desarrollan con facilidad en los medios de cultivo , fermentan glucosa y poseen una
potente enzima citocromo oxidasa .
Materiales :
1. Cultivo de Vibrio cholerae en caldo tripticase y agar TCBS (sacarosa, bilis, citrato
y thisulfato)
2. Cultivo de Vibrio cholerae en medio diferencial de TSI y Agar movilidad
3. Cultivo de Vibrio parahemol ticus en caldo tripticase y agar TCBS
4. Cultivo de Vibrio parahemoliticus en medio diferencial de TSI y Agar movilidad
5. Cultivo de Aeromonas y Plesiomonas en caldo nutritivo y Agar Mac Conkey
6. Cultivo de Aeromonas y Plesiomonas en medio diferencial de TSI y Agar
semislido.
7. Reactivo para detectar oxidasa.
8. Juego de colorantes para Gram.
Procedimiento :
1. Hacer un frotis de los cultivos en medio l quido , de todas las cepas
presentadas, y colorearlos con Gram. Observar con objetivo de inmersin.
2. Observar comparativamente el desarrollo de las cepas presentadas sembradas en
Agar TCBS, apreciar el cambio de color por la utilizacin de la sacarosa.
3. Observar las caracter sticas de las colonias de las cepas sembradas en agar Mac
conkey, apreciar el comportamiento con la lactosa.
4. Observar los cambios en el medio diferencial de TSI, producido por las cepas
presentadas.
5. Observar el desarrollo en el trazo de siembra en el medio movilidad .
6. Realizar la reaccin de oxidasa de las cepas presentadas.

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Resultados :
Vibrio cholerae

Vibrio
parahemolitico

Aeromonas

Plesiomonas

Gram

Agar
TCBS
(sacarosa)

Agar
Mac.
Conkey

Caldo

TSI

Oxidasa

Movilidad

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TEMA 23 : CAMPYLOBACTER - HELICOBACTER

Introduccin:
Estos gneros agrupan a microorganismos con forma helicoidal, coma, en S,
exigentes para desarrollar en medios de cultivo.
El Campylobacter se asocia con infecciones intestinales, para su aislamiento se requiere
de medios de cultivo selectivos, enriquecidos, e incubados en ambiente con 5% de CO2
y a 42 oC . Otra metodolog a es filtrar la muestra por milipore de 0.45 mu.
El Helycobacter pylori se asocia con gastritis y lcera gstrica, para su diagnstico se
debe investigar la produccin de ureasa y la morfolog a t pica en biopsias de la mucosa.
Materiales :
1. Frotices de heces de lactantes, coloreados con Gram
2. Biopsia de mucosa gstrica , coloreada con H E
3. Frotis de Helicobacter pylori de cultivo coloreado con Gram.
4. Cultivo de Campylobacter sp. en Agar sangre.
5. Frotis de Campylobacter para colorear con Gram
Procedimiento:
1. Observar al microscopio con objetivo de inmersin los frotices presentados.

Resultados :

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TEMA 24 : GARDNERELLA - MOBILUNCUS
Introduccin :
Algunos microorganismos se comportan como patgenos oportunistas cuando se crean
las condiciones que permiten su proliferacin. Un ejemplo t pico es el cuadro cl nico de
la vaginosis, que se inicia con la disminucin de la produccin estrognica que
condiciona la elevacin del pH vaginal hacia la neutralidad, permitiendo la
proliferacin de microorganismos como Gardnerella, Mobiluncus,etc.
Gardnerella es un bacilo que colorea variablemente con el Gram, microaerfilo, que
invade las clulas vaginales dando una imagen caracter stica denominada clulas clave
(clu cells).
Mobiluncus es un bacilo curvado, en hoz, Gram variable, anaerobio.
Materiales :
1. Frotis de flujo vaginal con Gardnerella vaginalis coloreado con Gram.
2. Frotis de flujo vaginal con Mobiluncus coloreado con Gram.
Procedimiento :
1. Observar al microscopio con objetivo de inmersin los frotices presentados.

Resultados :

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TEMA 25 : TREPONEMA
Introduccin :
El Treponema pallidum subespecie pallidum es agente causal de la s filis o Lues.
Es una espiroqueta que no cultiva en medios inertes, luego el estudio de ste
microorganismos debe hacerse en base a exmenes microscpicos de la muestra y
demostracin de anticuerpos en sangre.
El examen microscpico con condensador de campo oscuro, se realiza a partir de las
lesiones drmicas, en la zona de inoculacin , denominados chancro duro (en la primera
etapa) y en las formaciones papulosas en toda la piel, denominada roseola (en la
segunda etapa).
Para la demostracin de anticuerpos se dispone de dos categor as de pruebas, las que
usan ant geno no treponmico : VDRL, RPR, de gran sensibilidad pero poca
especificidad y las que utilizan al Treponema pallidum como ant geno : FTA - ABS,
denominada confirmatoria.
Materiales :
1. Suero pacientes con Lues
2. Ant geno no treponmico :VDRL o RPR
3. Lminas portaobjetos.
Procedimiento :
1. Depositar una gota (0.05 ml) de suero problema en una lmina o tarjeta.
2. Aadir una gota de ant geno y mezclar por rotacin durante 3 minutos
3. Observar la formacin de grumos o prdida de la homogeneidad de la suspensin
cuando la reaccin es positiva ( precipitacin)
Resultados :

Negativo

Positivo

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TEMA 26 : BARTONELLA
Introduccin :
Siendo el Per un pais endmico de bartonelosis estamos obligados a pensar en sta
enfermedad cuando un paciente proviene de zonas verrucgenas.
En la fase hemtica el diagnstico se hace mediante la bsqueda de los
microorganismos en los hemat es, por estudios microscpicos de frotices sangu neos
coloreados con Wright o Giemsa , o mediante cultivos incubados a 22 oC.
En la fase histioide el diagnstico es slo por cultivo, asociado a datos epidemiolgicos
y caracter sticas histolgicas de la verruga.
Materiales :
1. Frotices sangu neos de pacientes con bartonelosis , coloreados con wright.
2. Medios de cultivo bifsicos para cultivo de sangre e incubacin a 26 oC
Procedimiento :
1. Observar al microscopio con objetivo de inmersin, apreciar la variacin del
tamao de los glbulos rojos
(anisocitosis), de la intensidad del color
(policromatofilia ) y la presencia de microorganismos coco bacilares dentro de los
glbulos rojos.
Resultados :

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TEMA 27 : MYCOBACTERIUM
Introduccin :
Este gnero incluye dos especies, que producen enfermedades de importancia en Salud
Pblica , son la Tuberculosis y la Lepra.
Estos micoorganismos se tien con una coloracin espec fica, la de Ziehl-Neelsen.
El Mycobacterium tuberculosis ( bacilo de Koch ) desarrolla en medios de cultivo muy
nutritivos como el Lowenstein Jensen, Ogawa, Middlebrook y tarda mas de 15 dias en
formar colonias. Esta caracter stica obliga a realizar un tratamiento a las muestras no
estriles (esputo, contenido gstrico) que van a ser cultivadas, para destruir bacterias
contaminantes de desarrollo rpido. Este proceso se denomina homogenizacin y
descontaminacin, que se consigue aadiendo a la muestra hidrxido de sodio, fosfato
trisdico o N acetil cisteina , seguidamente se neutraliza la muestra con cido hasta
obtener un pH de 7.2 . ( debido a que el M. Tuberculosis es resistente a los lcalis y
cidos fuertes).
Adems del Mycobacterium tuberculosis y bovis , se describen otros Mycobacterium
con diferentes grados de patogenicidad, denominndoseles at picos . Runyon los
clasifica de acuerdo a la velocidad de desarrollo, formacin de pigmento y algunas
reacciones qu micas en : I.- Desarrollo lento foto cromgenas ( Kansasii, simiae) ,
II.- Desarrollo lento escotocromgenas ( Gordonae, Scrofolceaum) , III- Desarrollo
lento no cromgena ( Avium-intracellulare, Terrae) y IV.- Desarrollo rpido , antes de
los 7 d as (Fortuitum, Smegmatis, Phlei).
El diagnstico microscpico de la tuberculosis se realiza mediante la baciloscop a,
procedimiento de bajo costo , de elevada especificidad y de gran utilidad en el
diagnstico y evolucin del tratamiento.
Materiales :
1. Frotices de esputo para colorear con Ziehl-Neelsen
2. Cultivo de Mycobacterium tuberculosis en medio Lowenstein Jensen
3. Cultivo de Mycobacterium at picos en medio Lowenstein Jensen
Procedimiento :
1. Colorear los frotices con el mtodo de Ziehl-Neelsen . Observarlos con objetivo de
inmersin.
2. Contar los bacilos cido resistentes observados en 50 campos microscpicos.
3. Clasificar la lmina de acuerdo a la siguiente tabla :
Negativo : no se observan bacilos
Positivo 1 + : menos de 1 bacilo por campo, en 100 campos observados
Positivo 2 + : de 1 a 10 bacilos por campo, en 50 campos observados
Positivo 3 + : mas de 10 bacilos por campo, en 20 campos observados.
4. Registrar las caracter sticas de las colonias del Mycobacterium tuberculosis
5. Registrar las carcter sticas de las colonias de los Mycobacterium at picos

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Resultados :
BACILOSCOPIA : ...............................................
Observar las caracter sticas de las colonias de las diversas cepas de Mycobacterium
presentadas

La sensibilidad in vitro del Mycobacterium tuberculosis a los antibiticos se realiza por

procedimientos radiomtricos que permiten obtener resultados en 48 horas. Las tcnicas
convencionales demoran 30 a 40 dias y emplea el concepto de las proporciones.

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TEMA 28 : FLORA BACTERIANA NORMAL

Introduccin:
Los microorganismos que habitan el medio ambiente ( suelo, agua, aire ) estn en
relacin constante con los organismos vivientes.
El cuerpo humano est poblado de microorganismos en las zonas expuestas al
ambiente, asi como en la luz intestinal. La flora residente cumple una funcin
determinada para conservar la salud como sintetizar vitamina K, completar el
catabolismo de los alimentos, contribuir a su absorcin y prevenir la colonizacin de
bacterias patgenas, etc.
En determinadas circunstancias como traumatismos, heridas, sistema inmune
deprimido, o sobrepoblacin bacteriana , la flora residente
puede producir
enfermedades .
En la prctica se va a demostrar la presencia de microorganismos en la zona nasal y
faringea de los alumnos.
Materiales :
1. Hisopo de algodn estril
2. Baja lengua
3. Placas petri con agar sangre
4. Tubos con medio hipertnico y manitol
5. Lminas portaobjetos
6. Juego de colorantes para Gram
Procedimiento :
1. Con ayuda del hisopo y baja lengua tomar una muestra de exudado faringeo.
2. Sembrar el hisopo en agar sangre, por agotamiento. Incubar a 37oC /24 horas
3. Con otro hisopo hacer un frotis y colorearlo con Gram
4. Con ayuda de un hisopo tomar una muestra de secrecin nasal
5. Sembrar el hisopo en medio hipertnico. Incubar a 37 oC /24 horas.
Resultados :
Exudado far ngeo

Agar sangre

Secrecin nasal

Medio
hipertnico

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TEMA 29 : HONGOS AMBIENTALES

Introduccin :
Los hongos ambientales son los que viven a expensas de la materia inerte. La mayor a
son saprofitos, algunos pueden actuar como alergenos y ocasionar sensibilizacin.
Estos hongos pueden producir infecciones secundarias
en pacientes con
inmunodeficiencias , infecciones crnicas o diabetes. Desarrollan con gran facilidad en
los medios de cultivo.
Materiales :
1. Cultivo de Penicillium, Aspergillus, Fusarium y Rhyzopus en medio de Sabouraud
2. Microcultivos en lmina de cada una de los hongos en estudio.
3. Cultivo de Rhodotrula en medio Sabouraud .
Procedimiento :
1, Estudiar las caracter sticas macroscpicas de las colonias (aspecto, color,
consistencia, pigmento difundido etc ).
2. Con objetivo de menor aumento ( 10 X ) observar los microcultivos y describir la
caracter stica de los micelios, conidias y conidiforos.
Resultados :

: colonias pulverulentas
de color azul verdoso.
Hifas tabicadas con conidiforos ramificados
en su extremo distal con la apariencia de pincel
y conidias dispuestas en cadena .

: colonias filamentosas
de color blanco, amarillo, verde,
marrn o negro.
Hifas tabicadas con ensanchamiento
en su extremo distal que da origen a
esterigmas de donde nacen las conidias
en cadena.

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: colonias algodonosas
de color rosado .
Hifas tabicadas que dan origen a
conidiforos y macroconidias
multiseptadas fusiformes , curvadas.

: colonias algodonosas
blanco grisaceas con puntos negros
(esporangios).
Hifas no septadas agrupadas como
raices, a partir de las cuales se proyectan
filamentos largos (esporangiforo)
formando en su extremo una estructura
redonda oscura que contiene gran cantidad
de esporas.

: colonias cremosas
De color anaranjado.
Al microscopio se observan clulas ovoides
o redondas.

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TEMA 30 : HONGOS DERMATOFITOS Y MALSSEZIA FURFUR

Introduccin :
Son hongos filamentosos que tienen predileccin por la queratina, por lo que afectan
piel, pelo y ua. Por su habitat pueden clasificarse en Geof licos, Zoof licos y
Antropof licos , puediendo infectar al hombre y a los animales.
Tres gneros patgenos son de inters : Trichophyton,
Microsporum y
Epidermophyton.
Materiales :
1. Muestras patolgicas de piel, pelo y ua en preparaciones en fresco con KOH
2. Cultivo de T. rubrum, T mentagrophytes, T tonsurans, M canis, M gypseum y E
floccosum en agar sabouraud glucosado
3. Microcultivos de los mismos hongos con azul de lactofenol
Procedimiento :
1. Toma de muestra : En lesiones de piel se obtiene por raspado de los bordes de la
lesin . En cuero cabelludo se retiran los pelos de la zona afectada . Las uas son
previamente humedecidas con alcohol y luego recortadas asi como raspado del
lecho ungueal.
2. Examen directo : Se prepara un examen en fresco con hidrxido de potasio al 20%.
Se observa al microscopio con objetivo 40X buscando la presencia de esporas
redondeadas aisaladas o agrupadas en racimos refringentes, hifas cortas o largas
cil ndricas con los extremos redondeados. En los pelos se puede observar esporas
ubicadas en el interior ( endotrix) o alrededor del pelo (ectotrix).
3. Cultivo : El medio de cultivo de eleccin es el Sabouraud que contiene 40 g/L de
dextrosa . La siembra se hace por puntura e incuba a medio ambiente , esperando
desarrollo entre el 5 y l5vo dia .
Resultados :
A) Examen en fresco de
escamas de piel

B) Examen en fresco de
pelo infectado
ECTOTRIX

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:
Colonias algodonosas de color blanco
con pigmento rojo en el reverso del tubo.
Hifas septadas con microconidias
piriformes ssiles.

Colonias pulverulentas granulosas

yesosas, blanquecinas con pigmento
amarillo pardusco en el reverso.
Hifas septadas con abundantes
microconidias esfricas en racimos

Colonias membranosas crateriformes,

acartonadas.
Hifas septadas en raqueta, microconidias
piriformes y clamidosporas.

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Colonia blanquecina con pigmento

amarillo naranja en el reverso.
Hifas septadas con macroconidias
el pticas o fusiformes con tabiques
transversales y excrecencias en la
superficie.

Colonia algodonosa o finamente

pulverulenta de color blanco cremoso.
Hifas septadas con macroconidias de
superficie lisa con tabiques transversales.

Colonias aterciopeladas o finamente

pulverulentas, con pliegues en el centro,
de color amarillo azufre.
Hifas septadas con macroconidias grandes
con el extremo distal romo y ancho,
tabicadas transversalmente.

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TEMA 31 : HONGOS LEVADURIFORMES

Introduccin :
Las levaduras son habitantes del medio ambiente. Situaciones del husped como
terapia
antibitica
prolongada,
corticoterapia,
radiaciones,
diabetes,
inmunodeficiencias, etc pueden permitir la colonizacin de las levaduras oportunistas y
producir infeccin.
Las levaduras mas importantes en patolog a humana son la Cndida albicans , que
produce micosis superficiales y sistmicas y el Criptococcus neoformans (torula), que
produce meningoencefalitis.
Materiales :
Frotis de flujo vaginal coloreado con Gram
Cultivo de Cndida albicans en medio Sabouraud.
Suspensin de Cndida albicans en suero incubado a 37 oC / 2 horas
Cultivo de Critococcus neoformans en medio Sabouraud
Cultivo de Criptococcus neoformans en agar urea.
Preparaciones en fresco con tinta china y l quido cefaloraquideo de paciente con
Criptococosis.
Procedimiento :
Observar con objetivo de inmersin el frotis de flujo vaginal. Apreciar las formaciones
levaduriformes y pseudomicelios de la Cndida.
Describir las caracter sticas del cultivo de Cndida
Hacer una preparacin en fresco a partir de la suspensin de cndida en suero. Observar
con objetivo 40X y apreciar las prolongaciones digitiformes , caracter stico de la
Cndida albicans ( tubo germinativo )
Describir las caracter sticas del cultivo de Criptococcus y apreciar el metabolismo de la
urea.
Observar las preparaciones en fresco con tinta china y l quido cefaloraquideo. Apreciar
la presencia de cpsula del Critococcus neoformans como un halo transparente
alrededor de las esporas.
Resultados :

Frotis vaginal

Cultivo de Cndida

Tubo germinativo

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Criptococcus neoformans :

Cultivo
en Sabouraud

Examen en fresco con tinta china

( cpsula )

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TEMA 32 : MICOSIS SISTEMICAS ( Hongos dimrficos )
MICOSIS SUBCUTANEAS
Introduccin :
Estos hongos se encuentran distribuidos en la naturaleza ( suelo, guano de aves y
murcilagos ). Se les denomina dimrficos por su doble comportamiento a diferente
temperatura de incubacin, asi a 37 oC y en el husped son levaduriformes , en cambio
a temperatura ambiental se comportan como filamentosos .
Las personas y animales se contaminan con los hongos dimrficos por inhalacin
produciendo infecciones sistmicas. Representan a ste grupo el Paracoccidioides
brasiliensis ( blastomyces br) y el Hystoplasma capsulatum.
Las micosis subcutneas son producidas por diversos hongos , siendo el mas frecuente
el Sporothrix schenckii, que se transmite por inoculacin traumtica con espinas o
restos de plantas produciendo infeccin crnica del sistema linftico.
Materiales :
1. Cultivo de Paracoccidiodes br. en Agar Sabouraud incubado a 22 oC
2. Cultivo de Paracoccidioides br. en Agar cerebro corazn (BHI) incubado a 37oC
3. Preparaciones en fresco con azul de lactofenol de Paracoccidioides br en BHI
4. Preparaciones histolgicas de muestras o tejidos infectados con Paracoccidiodes b
5. Cultivo de Histoplasma c. en Agar sabouraud incubado a 22 oC
6. Cultivo de Histoplasma c. en Agar cerebro corazn (BHI) incubado a 37oC
7. Preparaciones en fresco con azul de lactofenol de Histoplasma c. en sabouraud.
8. Preparaciones histolgicas de tejidos infectados con Histoplasma c.
9. Cultivo de Sporotrix sch. en Agar Sabouraud incubado a 22 oC
10. Cultivo de Sporotrix sch. en BHI incubado a 37 oC
11. Preparaciones en fresco con azul de lactofenol de Sporotrix sch. en sabouraud
12. Preparaciones coloreadas con Gram de cultivo de Sporotrix sch. en BHI.
Procedimiento :
1. Observar las caracter sticas de las colonias de cada una de las tres especies de
hongos dimrficos presentados tanto en agar sabouraud como en agar BHI
2. Observar al microscopio, con objetivo de 40X, las preparaciones en fresco
presentadas .
3. Observar con objetivo de inmersin las preparaciones histolgicas presentadas
Resultados:
Registrar las observaciones macroscpicas y microscpicas.

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Paracoccidioides brasiliensis

Corte histolgico o esputo :

Observar las esporas grandes de 10-60 mu
de pared gruesa con varias gemaciones
Cultivo a 37 oC

Cultivo a 22 oC

Examen en fresco

Esporas multigemadas con

doble membrana timn de barco
Histoplasma capsulatum

Corte histolgico (h gado):

Observar levaduras pequeas de 1 a 3 micras
dentro del citoplasma de los histiocitos y
polinucleares.
Cultivo a 37 oC
(agar BHI)

Cultivo a 22 oC
(agar sabouraud)

Examen en fresco
(lactofenol)

Levaduras de 1 a 3 mu
intracelulares.
Sporotrix schenkii

Cultivo a 37 oC

Forma Levaduriforme

Cultivo a 22 oC

Microcultivo: Margarita

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TEMA 33 : ESTUDIO DE LOS VIRUS
Introduccin :
El diagnstico de las enfermedades virales se ha fortalecido con los avances en los
conocimientos y tcnicas en inmunolog a, pero nunca se puede obviar la confeccin de
la historia cl nica del paciente de la que se obtiene informacin muy importante como
tiempo de enfermedad, sintomatolog a, entorno epidemiolgico, etc. , datos que
permiten llegar a un diagnstico presuntivo, necesario para orientar los estudios en el
laboratorio.
Para facilitar la interpretacin de los estudios inmunolgicos muchas veces es
recomendable obtener dos muestras de sangre con intervalo de 2 a 3 semanas, que
permite establecer si la enfermedad est en sus inicios , periodo de estado o
convalecencia.
Examen microscpico :
Si bien los virus tienen un tamao muy pequeo que no pueden ser observados con el
microscopio de luz, algunos virus tienen la capacidad de formar estructuras
intracelulares denominadas cuerpos de inclusin que se pueden reconocer con el
microscopio corriente, estructuras patognomnicas de ciertos virus.
Virus

Nombre

Ubicacin

Caracterstica

Viruela /Vacuna
Rabia
Molusco
contagioso
Tracoma
Linfogranuloma
Conjuntivitis de
inclusin
Fiebre amarilla
Herpes simples

Guarnieri
Negri
Henderson Paterson

citoplasma
citoplasma
citoplasma

Acidfilo
Acidfilo
Basfilo

Halberstaender P.
---

citoplasma
citoplasma
citoplasma

Basfilo
Basfilo
Basfilo

Margarino Torres
Lipschutz

nuclear
nuclear

Acidfilo
Acidfilo

Citomegalovirus

--

nuclear

Acidfilo

Aislamiento :
Para aislar los virus se requiere previamente preparar cultivos de clulas donde se
puedan multiplicar y observar los cambios celulares producto de la infeccin viral,
denominado efecto citoptico, caracterizado por disminucin del tamao celular,
redondeamiento , picnosis y por ltimo lisis celular.
Los cultivos celulares pueden ser primarios, que slo pueden multiplicarse una o dos
veces ( fibroblastos de embrin de pollo, rin de mono, etc ) y los de l nea continua ,
mantenidos en el laboratorio sucesivamente ( Hela, Hep2, etc).
No olvidemos que el primer cultivo celular fu el embrin de pollo (huevo), en la
membrana corio alantoidea y amnitica.

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Identificacin :
Para identificar un virus que ha producido efecto citoptico en un cultivo celular,
debemos disponer de los sueros espec ficos de las diversas especies de la familia viral
que se sospecha, razn por la cual necesitamos tener una diagnstico presuntivo que
oriente el estudio.
Los anticuerpos contenidos en dicho suero inhibirn en forma espec fica el efecto
citoptico u otra propiedad ( hemaglutinante o hemadsorcin ) de dicho virus.
Las tcnicas inmunolgicas permiten reconocer en el paciente la presencia de
anticuerpos, tipo de inmunoglobulina y medir el nivel.
La presencia de anticuerpos no siempre nos indica infeccin viral, en infecciones
crnica o endmicas es muy til investigar la presencia de inmunoglobulinas IgM que
son expresin de infeccin aguda o periodo de estado. (herpes 2, CMV ).
Los procedimientos inmunolgicos ant geno-anticuerpo en sus diversas formas :
Aglutinacin de latex , Inmunofluorescencia, Enzima inmuno ensayo, Radio inmuno
ensayo Electroforesis e Inmunoprecipitacin son empleados en virolog a, usando
cultivos virales patrones.
Con stas tcnicas se puede investigar tanto la presencia de ant geno viral como la de
anticuerpos formados por el husped.
Cuando se investiga la presencia de anticuerpos es necesario obtener dos muestras de
sangre al paciente, con intervalo de 15 a 20 dias, para detectar conversin serolgica .
La titulacin de anticuerpos contra los diversas infecciones virales en la poblacin es el
parmetro que las entidades de Salud Pblica emplean para establecer sus pol ticas de
vacunacin.

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