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ISSN 0568-3076

agron. 18 (2): 7 - 16, 2010

MS ALL DE LOS HALOS DE INHIBICIN: CUANTIFICACIN


DE VARIACIONES MORFOLGICAS POR ANLISIS DE
IMGENES EN PRUEBAS DE ANTIBIOSIS*
Juliana Soler Arango**, Laura Mara Muoz*** y Juan Carlos Prez****
Joven Investigador de COLCIENCIAS, estudiante de Maestra en Biotecnologa, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln.
julianasolerarango@gmail.com.
***
Ingeniera Biolgica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln. lmmunoze@unal.edu.co.
****
Profesor Asociado, Coordinador Laboratorio de Microbiologa de Suelos, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln. jcperez@unal.edu.co.
**

Recibido: 15 de junio; aprobado: 30 de junio de 2010.

RESUMEN
El antagonismo entre microorganismos mediado por
antibiosis, es un fenmeno ampliamente registrado en la
literatura cientfica. En los organismos sensibles sus efectos
generalmente se estudian a nivel celular, y resultan en la
formacin de halos de inhibicin de crecimiento, pero, rara
vez, se estudian cambios generales en las colonias. Este
estudio utiliz anlisis de imgenes para detectar variaciones
morfolgicas en las colonias de la bacteria Bacillus mycoides,
enfrentadas a otros aislamientos productores de antibiosis.
Los resultados indicaron diferencias significativas en
patrones de crecimiento de colonias de B. mycoides,
cuando se enfrent a diferentes aislamientos bacterianos
productores de antibiosis. Esos cambios no siempre
fueron paralelos a los observados en las reas de la zona
de inhibicin. Estos resultados sugieren que la medicin
tradicional de halos de inhibicin pueden subestimar las
diferencias entre aislamientos bacterianos para generar
antibiosis. As, como los mecanismos de respuesta en
los microorganismos antagonizados. Igualmente, el
anlisis de imgenes ofrece una herramienta sensible para
estudiar la naturaleza de relaciones antagnicas entre
microorganismos y, como apoyo a programas de bsqueda
de microorganismos cultivables eficientes.

Palabras clave: antagonismo, control biolgico,


densidad, dimensin fractal, patrn de crecimiento.

ABSTRACT
BEYOND THE INHIBITION ZONE:
MORPHOLOGICAL VARIATIONS
QUANTIFICATION FOR IMAGE ANALYSES
IN ANTIBIOSES TESTS
The antagonism between microorganisms mediated by
antibioses is a widely reported phenomenon in scientific
literature. In sensitive organisms, its effects are generally
studied at a cellular level and result in the formation of
growth inhibition zones. However, the general changes
in the colonies are rarely studied. This study used image
analyses to detect morphological variations in the
Bacillus mycoides, bacteria colonies facing other isolations
producing antibioses. The results indicated significant
differences in growth patterns of B. mycoides, confronted
with other bacterial isolates producing antibioses. These
changes not always were parallel to those observed in the
inhibition zone. These results suggest that the traditional
measurement of inhibition zones might overlook the
differences between bacterial isolates to generate antibioses
as well as the response of mechanisms in antagonized
microorganisms. Similarly, image analysis offers a sensitive
tool for the study of the nature of antagonic relations
between microorganisms and serves as a support for
programs searching efficient cultivable microorganisms.

Key words: antagonism, biological control, density,


fractal dimensions, growth patterns.

Est investigacin se benefici con la participacin de Elizabeth Meneses, Marcela Ramrez y Vernica Ypez, quienes prestaron ayuda durante
el desarrollo de esta investigacin y la correccin de este manuscrito.

Juliana Soler Arango, Laura Mara Muoz y Juan Carlos Prez

INTRODUCCIN
La competencia entre microorganismos del
suelo, mediada por antibiosis es un fenmeno
bien establecido. La presencia de antibiosis entre
microorganismos tradicionalmente se evala en
pruebas in vitro, que han sido clave para el desarrollo
de bioproductos que controlan patgenos de plantas
y animales (Cook & Baker, 1983). Un criterio comn
para la seleccin de microorganismos cultivables
productores de antibiticos se basa en la deteccin
de zonas de inhibicin de crecimiento de otros
microorganismos, pero se presta menos atencin
a las variaciones morfolgicas de las colonias de
los microorganismos sensibles en la prueba. Este
aspecto es importante, debido a que, las variaciones
morfolgicas de las colonias en varios tipos de
bacterias representan las estrategias de respuesta
global frente a la presencia de antibiosis (Ben-Jacob
& Cohen, 2000).
El suelo alberga mltiples especies de bacterias
y hongos productores de antibiticos (Dennis &
Webster 1971; Gottlieb 1976; Beer et al., 1990;
Haas & Keel 2003; McSpadden, 2004; Tsviya et al.,
2010). En las pruebas in vitro para detectar halos de
inhibicin entre dos microorganismos enfrentados,
los efectos sobre el microorganismo antagonizado se
han concentrado en el estudio de clulas expuestas
al antimicrobiano en la zona de inhibicin, y se han
identificado cambios en viabilidad, morfologa y
fisiologa de las clulas (Pastor & Cantn, 1999).
Sin embargo, una colonia puede responder en
forma concertada a la presencia de antibiticos y su
sensibilidad es diferente a la de clulas individuales
(Ben-Jacob & Cohen, 2000).
Este fenmeno se ha estudiando en varios tipos de
bacterias del gnero Bacillus que forman colonias
complejas. En esas colonias las clulas bacterianas
presentan mecanismos de comunicacin clula a
clula que, alteran la arquitectura general de la colonia
(Ibdem). Esa forma de la colonia representa una
respuesta concertada a cambios ambientales, y es

una estrategia competitiva y adaptativa, en ambientes


adversos, como aquellos con baja disponibilidad de
nutrientes o en presencia de antibiosis (Ibdem) (Beer
et al., 2009).
Bacillus mycoides, es una especie bacteriana que posee
un crecimiento micelial o filamentoso caracterstico
(Di Franco et al., 2002), y las variaciones en su forma
de crecimiento podran usarse como indicadores de la
actividad antibitica de otras bacterias. Sin embargo,
es difcil cuantificar ese tipo de crecimiento mediante
elementos de geometra clsica, aunque esos patrnes
de crecimiento complejo pueden describirse usando
dimensiones fractales (Boddy et al., 1999), y anlisis
de caractersticas espaciales en imgenes digitales
(Thomas & Paul, 1996). La cuantificacin de estos
cambios en patrones de crecimiento es importante,
debido a que, esas variaciones indican respuestas
diferenciales de los microorganismos a cambios
biticos o abiticos en el ambiente (Boddy et al.,
1999; Golinski et al., 2008; Barry et al., 2009; Beer et
al., 2009; Sirota-Madi et al., 2010).
Los antecedentes sugieren, que el estudio de
variaciones morfolgicas en colonias de bacterias
con crecimiento filamentoso, permitira detectar
preliminarmente las diferencias en tipos de antibiosis
generada por diferentes aislamientos bacterianos, as
como, los mecanismos de respuesta en la bacteria
antagonizada. El objetivo general de esta investigacin
fue determinar cambios en patrones de crecimiento
de una bacteria con crecimiento filamentoso como
respuesta al enfrentamiento a diferentes bacterias del
suelo productoras de antibiosis.

MATERIALES Y MTODOS
Aislamientos bacterianos
Se seleccionaron cuatro asilamientos de bacterias
productoras de antibiosis denominadas: T1, T2, T3 y
T4, y un aislamiento de Bacillus mycoides, de colecciones
de microorganismos obtenidas previamente de

Ms all de los halos de inhibicin

varios suelos del departamento de Antioquia


(Muoz, 2010; Castrilln, 2011), o mantenidas en
el laboratorio. Esos aislamientos se conservan en el
laboratorio de microbiologa de suelos de la Escuela
de GEOCIENCIAS (Facultad de Ciencias de la
Universidad Nacional de Colombia. Sede Medelln).

Cultivos puros, preparacin de inculos


y pruebas de antibiosis
Los inculos de los aislamientos productores de
antibiosis T1, T2 y T4, se prepararon mediante la
dilucin de las colonias individuales con 24 h de
crecimiento en tubos con 0.3mL de agua estril. Del
aislamiento T3 se usaron como inoculo colonias
individuales con 72 h de crecimiento. Finalmente el
inculo de Bacillus mycoides, se prepar diluyendo en
0.6mL de agua estril un fragmento de agar nutritivo
de aproximadamente 2 x 2 mm colonizado por la
bacteria.
La prueba se realiz en cajas Petri con medio agar
nutritivo (Merck), preparado segn las instrucciones
del fabricante. Con ayuda de una plantilla se marcaron
en el exterior de cada caja de Petri dos puntos
separados 2cm uno del otro. En uno de los puntos
de cada caja se sembraron 0.06mL de las diluciones
de cada bacteria o colonias completas del aislamiento
T3. Las cajas se incubaron a 28C. Dos das despus
de sembradas las bacterias se sembraron en el otro
punto marcado en la caja 0.04mL del inculo de B.
mycoides. Las cajas se incubaron en oscuridad a 28C.
Para cada prueba de antibiosis se incluyeron cuatro
repeticiones.

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Captura, procesamiento y anlisis de


imgenes
Doce horas despus del inicio de la prueba se
tomaron fotografas de las colonias de B. mycoides,
sobre un fondo negro en un estereomicroscopio
Nikon equipado con una cmara Nikon DSFI-1
con magnificacin 0.8x. Las cajas se fotografiaron
nuevamente nueve das despus de iniciada la prueba

utilizando una cmara digital Olympus FE140 con


funcin de enfoque automtico y a una altura fija.
Las imgenes se procesaron y analizaron en el
software libre IMAGEJ (Abrmoff et al., 2004). Los
anlisis se concentraron en la morfologa de partes
o colonias completas de B. mycoides. En fotografas
tomadas a las 12 h de inicio la prueba se extrajo de
cada foto una seccin rectangular del mismo tamao
(aprox. 10 x 5mm) junto a la colonia de B. mycoides, y
opuesto al lado en el que se ubic la colonia bacteriana
productora de antibiosis. Para el procesamiento
cada seccin fotogrfica se convirti en escala
de grises de 8 bits o se ajustaron directamente el
contraste y el brillo utilizando del men image los
comandos adjust/balance (auto) y Brightness/
contrast (auto), respectivamente. Partculas no
deseadas (interferencias del medio de cultivo o de
la caja de Petri) se eliminaron de la imagen usando
filtros disponibles en el men process/filters/unsharp
mask (radius=7 y mask=0.90). En imgenes en
escala de grises se estimaron los parmetros de
textura (contraste y correlacin), que indican un
patrn de crecimiento concentrado o disperso, o bien
orientado espacialmente y en sentido perpendicular a
la orientacin de la imagen (Haralick et al., 1973). Se
ajusto el brillo y el contraste a las imgenes binarias
y se estim la densidad de crecimiento utilizando el
programa accesorio FracLac_2,5, luego las imgenes
fueron esqueletonizadas con la opcin disponible
en men process/binary/skeletonize y se estim
la dimensin fractal (D) utilizando el programa
accesorio FracLac_2,5 (Karperien, 1999-2007).
Los valores se compararon con los de una caja que
contena slo B. mycoides.
Las imgenes tomadas nueve das despus, se
convirtieron en imgenes de 8 bits en escala de grises.
En estas imgenes se midi en cada caja el rea de la
zona de inhibicin. Luego se seleccion un polgono
de la misma forma y tamao conteniendo una franja
de 13 x 3 mm de B. mycoides, en la interfase entre la
zona de inhibicin y la colonia, en la que se midieron
los parmetros de textura ya mencionados. El rea de

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la zona de inhibicin y las caractersticas texturales


(contraste y correlacin) se midieron usando el
software IMAGEJ (Abrmoff et al., 2004).

Anlisis estadstico
Los valores de dimensin fractal, densidad de
crecimiento, rea de la zona de inhibicin y parmetros
de textura, se sometieron a pruebas de distribucin y
homogeneidad de varianzas para probar los supuestos
del anlisis de varianza. Debido al no cumplimiento
de supuestos, los datos se sometieron a una prueba
no paramtrica de Kruskall-Wallis. Adicionalmente
se estimaron valores de error estandar para los
promedios de cada tratamiento como medida de

Figura 1.

dispersin. Todos los anlisis se realizaron en el


software Systat 12.

RESULTADOS Y DISCUSIN
Las reas de las zonas de inhibicin y los patrones de
crecimiento de B. mycoides, a los nueve das y a las 12
h (Figura 1), respectivamente, variaron dependiendo
del aislamiento bacteriano productor de antibiosis.
La mayor inhibicin del crecimiento de B. mycoides,
se present con el aislamiento T4 y la menor con el
aislamiento T3. Los aislamientos T1 y T2, presentaron
zonas de inhibicin similares entre ellos, e intermedias
a las de T3 y T4 (Figura 2).

Secciones de la imagen de la colonia de B. mycoides que se tomaron para anlisis a las 12 h (izquierda) y
10 das (derecha) de crecimiento.

Los patrones de crecimiento de B. mycoides, variaron


dependiendo de la posicin en la colonia y el momento
en el que se analizaron. Micelios de B. mycoides, con
12 h de crecimiento y en el lado no expuesto a cada
antagonista productor de antibiosis no presentaron

diferencias en los valores de dimensin fractal o


densidad de crecimiento. Sin embargo, nueve das
ms tarde los patrones de crecimiento de B. mycoides,
en la interfase entre la colonia y la zona de inhibicin,
variaron dependiendo del aislamiento bacteriano

Ms all de los halos de inhibicin

al que se enfrentaron. El contraste y la correlacin


espacial (parmetros de la textura de la imagen) en las
imgenes tomadas a los nueve das, se diferenciaron

Figura 2.

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mejor en esta zona de avance de las colonias que, al


inicio de la prueba y en el lado opuesto al antagonista
bacteriano (Figuras 3, 4).

Efecto de varios aislamientos bacterianos en el desarrollo de zonas de inhibicin y patrones de crecimiento


de B. mycoides.

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Las zonas de inhibicin se midieron nueve das despus del inicio de la prueba. Los patrones de crecimiento se estimaron
en fotografas digitales 12 h despus de iniciada la prueba. En los anlisis de dimensin fractal y densidad para el
aislamiento T4 solo se incluyeron dos repeticiones ya que el crecimiento de B. mycoides fue completamente inhibido en
las otra dos repeticiones. Los valores no se incluyeron en el anlisis estadstico.

Estos resultados sugieren, que diferentes mecanismos


de antibiosis en esas bacterias T1 a T4, as como
las estrategias adaptativas de B. mycoides, a ese
antagonismo, pueden ser detectados mediante
el anlisis de imgenes. Esta estrategia unida a la
deteccin de zonas de inhibicin podra contribuir
significativamente al conocimiento de los mecanismos
de inhibicin y adaptacin en los microorganismos
enfrentados en las pruebas, lo que a su vez acelerara
la bsqueda y deteccin de microorganismos para
introduccin al suelo.

Muchos microorganismos con potencial agrcola o


ambiental, que se introducen al suelo, usualmente se
seleccionan de colecciones extensas mediante pruebas
de antibiosis. Sin embargo, es difcil pronosticar
el desempeo de esos microorganismos una vez
introducidos al suelo. Esta perspectiva de seleccin,
sera ms efectiva si se conocen los mecanismos de
accin y reaccin de los microorganismos frente a
sus competidores o biocontroladores.

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Figura 3.

Efecto de varios aislamientos bacterianos en patrones de crecimiento de B. mycoides en la interface


entre su colonia y la zona de inhibicin de cada bacteria.

Para el aislamiento T4 solo se incluyeron dos repeticiones ya que el crecimiento de B. mycoides fue
completamente inhibido. Los valores no se incluyeron en el anlisis estadstico.

En esta investigacin el aislamiento T4, gener a los


nueve das los mayores halos de inhibicin, y menores
valores de contraste y correlacin, caractersticos de
un crecimiento muy denso y localizado en B. mycoides.
Esa mayor zona de inhibicin generada por T4,
unida a un crecimiento denso de B. mycoides, podran
reflejar alta produccin de compuestos txicos por

T4, y mayor actividad de B. mycoides para degradarlos


o limitar el paso hacia el centro de la colonia. Esto
tambin explicara, la poca diferenciacin de patrones
de crecimiento de B. mycoides al lado opuesto de las
colonias de los aislamientos T1 a T4 a las 12 h de
crecimiento (Figura 2).

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Figura 4.

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Aspecto general del crecimiento de B. mycoides, hacia la zona de inhibicin segn el aislamiento bacteriano
enfrentado (de izquierda a derecha aislamientos T1 a T4).

Anteriormente se ha sugerido que transformaciones


ultra estructurales en bacterias del Gnero Proteus
pueden evitar el ataque de agentes antimicrobianos o
efectos antagonistas por otras bacterias (Hernndez
& Rodrguez, 1993). Por otro lado, el crecimiento de
B. mycoides, frente a T1 y T2, no es diferente en las
zonas de inhibicin (Figura 2), pero si es diferente en
los bordes de las colonias (Figura 3), lo que reflejara
diferentes estrategias de generacin de antibiosis por
T1 y T2, y diferentes mecanismos de respuesta por
B. mycoides. No se conoce el mecanismo de antibiosis
generado por los aislamientos bacterianos incluidos
aqu, pero algunos de esos mecanismos podran
explorarse fcilmente usando por ejemplo fuentes
especificas de carbono en estas pruebas de antibiosis.
Anteriormente, se sugiri, que la generacin de
patrones variables de micelios y tasas de crecimiento

son estrategias ecolgicas para buscar y capturar


nutrientes y fuentes de carbono (Boddy et al., 1999).
En hongos, el cambio en dimensiones fractales se
presumi como un mecanismo para optimizar la
utilizacin de espacio y nutrientes (Bolton & Boddy,
1993), o como consecuencia de la infeccin con un
virus que posiblemente result en virulencia reducida
hacia su hospedero y un uso ineficiente de nutrientes
(Golinski et al., 2008).
En conclusin, el anlisis de imgenes permiti,
detectar diferencias en la respuesta de B. mycoides a
la generacin de antibiosis por varios aislamientos
bacterianos. Esos cambios en patrones de crecimiento
de B. mycoides, posiblemente reflejan diferencias en
los mecanismos de antibiosis por cada aislamiento

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bacteriano, que pasaran desapercibidas al medir


solamente las zonas de inhibicin de crecimiento.
La estrategia combinada del uso de esta bacteria de
crecimiento filamentososo unida a las mediciones
tradicionales de halos de inhibicin, provee una
herramienta sensible que favorecer la bsqueda
de microorganismos eficientes para uso agrcola o
ambiental.

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