Groeikinetiek en stoichimetrie van Pichia

Jadinii CBS 621 tijdens een batchfermentatie

Datum: 12 maart 2015
Naam: Axel Blom

Studienummer: 4399307
Koppel: 33

E-mailadres: A.D.Blom@student.tudelft.nl

Naam koppelgenoot: Andrea Snoek

Samenvatting
Het doel in dit experiment was om te onderzoeken of biotechnologische processen, specifiek de groei
van Pichia Jadinii op glucose, te verklaren en te berekenen zijn met macroscopische stromen. Om dit te
doen zijn de groeiparameters glucose consumptie, ammonium consumptie, zuurstof consumptie,
loogconsumptie, koolstofdioxide productie en biomassa productie gemeten. Op basis hiervan zijn met
behoudsrelaties balansen opgesteld en is de groeicurve van de groei bepaald. Ook is de kLa van de
fermentor tijdens de groei bepaald in het geval zuurstof een beperkend nutrint was.
Alle behoudsrelaties zijn kloppend bepaald met de gemeten waarden op twee meetpunten na. Verder is
een exponentiele groeicurve bepaald die stationair werd op het moment dat het substraat op raakte. De
bepaalde kLa was 40,4 mol/(L*uur).
De conclusie is dat biotechnologische processen redelijk accuraat beschouwd kunnen worden met
macroscopische stromen, aangezien praktisch alle balansen kloppen waren binnen een gesteld
criterium. Ondanks de lage kLa was glucose het beperkend nutrint. De kLa verschilde 13% van een
eerder gemeten referentie kLa in ongeveer dezelfde omstandigheden.

Inhoud
Samenvatting ................................................................................................................................................ 2
Inleiding......................................................................................................................................................... 4
Materiaal en Methode .................................................................................................................................. 5
Resultaten ..................................................................................................................................................... 6
Cumulatieve gegevens .............................................................................................................................. 6
Behoudsrelaties ........................................................................................................................................ 7
Groeigegevens ........................................................................................................................................ 10
De kLa gedurende de fermentatie........................................................................................................... 12
Discussie ...................................................................................................................................................... 13
Conclusie ..................................................................................................................................................... 14
Referenties .................................................................................................................................................. 15
Bijlage .......................................................................................................................................................... 16

Inleiding
De biotechnologie staat bekend om het gebruik van micro-organismen voor productie van materialen.
Het grote verschil tussen biotechologische en chemische productie is dat de micro-organismen in de
biotechnologie zich voortplanten, dus de katalysator van het proces is zelfreplicerend. In een aantal
processen wordt het product gemaakt gedurende de groeiperiode, maar soms wordt het product pas
gemaakt na de groei. In elk geval is de groeisnelheid van belang in de biotechnologie. Hetzelfde geldt
voor de hoeveelheid micro-organismen: meer micro-organismen betekent een snellere omzet van
substraat. In dit experiment wordt gekeken naar de groeikinetiek en stoichiometrie van de gist Pichia
Jadinii in een batch-cultuur.
Het doel in dit experiment is om te laten zien dat processen met micro-organismen te beschouwen en
dus te berekenen zijn met macroscopische stromen. Op deze manier is een bioreactor net als een
gewone reactor, een black box waar stoffen ingaan en andere stoffen uitgaan. Vanwege de wet van
behoud van massa en de wet van behoud van energie kunnen balansen opgesteld worden over de in- en
uitgaande stofstromen. Op basis van die balansen kan geconcludeerd of de metingen die je hebt verricht
nauwkeurig genoeg en voldoende zijn om verdere voorspellingen of berekeningen te maken. Op die
manier kunnen ook zaken die misgaan in een productieproces opgespoord worden of processen kunnen
geoptimaliseerd worden.
Om de balansen op te stellen worden een aantal groeiparameters bepaald. Om de koolstofbalans op te
stellen wordt de substraatconcentratie, in dit geval glucose, de biomassa concentratie en de gas (CO2)
in- en uitstroom gemeten. Voor de stikstofbalans wordt additioneel de NH4+ concentratie gemeten. Voor
een ladingsbalans is verder nog nodig de loogconsumptie te weten. Op basis van deze gegevens kan ook
de yield bepaald worden.
De groei van micro-organisme in een batch-cultuur bestaat normaal gesproken uit vier fases: de lag-fase,
waarin het organisme zich aanpast aan de nieuwe omgeving, de exponentiele fase, wanneer de
groeisnelheid maximaal is, de stationaire fase, wanneer groei stagneert, en de afstervingsfase. Er zijn
een aantal redenen voor de stop van de exponentiele fase, zoals uitputting van het medium, ophoping
van toxische stoffen of zuurstofgebrek. Om te onderzoeken welk van deze factoren de oorzaak is, wordt
gekeken naar de massabalans, maar hiertoe wordt ook de kLa bepaald. De kLa is de zuurstof
overdrachtscofficint, waaruit de hoeveelheid zuurstof die reactor kan opnemen weergeeft. Om te
onderzoeken of de kLa bepaald tijdens de fermentatie enigszins klopt worden ook referentiemetingen
uitgevoerd onder verschillende condities.

Materiaal en Methode
Alle experimentele details staan vermeld in de practicumhandleiding Practicum Biotechnologische
Basistechnieken LST deel A: Microbiologie en Fermentatie (Dr. Robertson, Dr. Van Gulik, Dr. Ir. Van Der
Lans, & Zomerdijk, 2015).
Als verduidelijking van de practicumhandleiding moet vermeld worden dat gedurende het experiment
een roersnelheid van 600 rpm gehanteerd is.

Resultaten
De resultaten van dit experiment zijn de te verdelen in een aantal verschillende onderdelen. In het
eerste deel worden de cumulatieve consumptie en productie behandeld. In het tweede deel worden de
behoudsrelaties van koolstof, stikstof, reductiegraad en lading behandeld. In het derde deel wordt de
groeicurve behandeld. In het laatste deel wordt de kLa bepaald.

Cumulatieve gegevens
In Tabel 1 staan de cumulatieve vergaarde gegevens tegen de tijd. De eerste meting werd genomen vlak
na de ent. De tweede meting werd een uur na beenting verricht en vervolgens werd ieder kwartier een
sample genomen. De glucose verschillen zijn gemeten door middel van een absorbantie meting op 505
nm na behandeling met een reagens (zie Bijlage).
Op eenzelfde manier zijn de ammoniumverschillen gemeten, maar daarbij werd absorbantie op 550 nm
gemeten (zie Bijlage)

Tabel 1. Cumulatieve productie en consumptie gegevens van de groei van P. Jadinii op glucose
Biomassa
(mCmol)

Tijd (h)

NH4 (mmol)

Base (mmol)

O2 (mmol)

Glucose
(mmol)

CO2 (mmol)

9,4

-1,23

-1,425

-0,41

0,64

-1,86

1,25
1,5

13,0
14,9

-1,89
-2,41

-1,89
-2,48

-0,99
-1,62

1,60
2,65

-2,25
-3,13

1,75

17,6

-2,92

-3,1

-2,26

3,72

-3,54

20,4

-3,42

-3,875

-2,99

4,84

-4,24

2,25

22,8

-4,27

-4,715

-3,90

6,08

-5,27

2,5
2,75

26,7
31,3

-4,51
-6,10

-6,32
-6,87

-5,10
-6,68

7,56
9,39

-6,12
-7,37

38,9

-7,89

-8,065

-8,68

11,6

-9,00

3,25

44,5

-9,05

-9,3

-11,1

14,3

-10,8

3,5

51,0

-10,4

-9,49

-13,9

17,4

-11,3

3,75

54,3

-9,37

-9,505

-17,0

20,8

-11,3

54,3

-10,9

-9,505

-20,3

24,3

-11,3

De Base is berekend doordat van een bekende oplossing het aantal verbruikte milliliters is
bijgehouden. Als voorbeeld:
= = 1 0,5 = 0,5
De Biomassa is bepaald door de optische dichtheid van een monster te meten bij 660 nm en dit te
vergelijken met een ijklijn gemaakt van een sample waar ook het drooggewicht van is bepaald (zie
6

Bijlage). De s van de gassen zijn berekend door de invoer en uitvoer van de gassen van elkaar af te
trekken op ieder meetpunt en door de ontstane grafiek een polynomial fit te maken in Excel (zie Bijlage).
Met de integraal van polynoom worden de cumulatieve gas consumptie en productie termen berekend.

Behoudsrelaties
Om te controleren of de conversietermen enigszins vrij zijn van al te grote meetfouten, is gebruik
gemaakt van behoudsrelaties. In een behoudsrelatie zouden alle positieve termen bij elkaar opgeteld
gelijk moeten zijn aan alle negatieve termen. Voor dit experiment zijn vier verschillende behoudsrelaties
gebruikt: de koolstofbalans, de stikstofbalans, de reductiegraadbalans en de ladingsbalans. Om deze
balansen op te stellen wordt eerst gekeken naar de algemene groeivergelijking:
Glucose + Ammonium + Loog + Zuurstof Biomassa + Koolstofdioxide + Water
Door alle termen met waar koolstof in zit uit te drukken in molaire eenheden koolstof, kan een
koolstofbalans opgesteld worden omdat net zoveel koolstof in als uit moet.
6 + 1 + 1 = 0
Met de cumulatieve gegevens kan berekend worden of dit klopt. Op t=1 volgt dan:
6 1,8578 + 1 9,37638 + 1 0,636142 = 1,13
Deze balans komt dus niet helemaal uit. Als maatstaf van onnauwkeurigheid kan |

Productie
|
Consumptie

berekend

worden. Op die manier wordt de het relatieve verschil duidelijk. In dit experiment wordt gehanteerd dat
de waarde acceptabel is wanneer deze tussen de 0,8 en de 1,25 ligt. In het voorbeeld geldt dan:
|

1 9,37638 + 1 0,636142
| = 0,898
6 1,8578

Volgens de criteriumwaarde is deze waarde dus acceptabel. In Tabel 2 is de koolstofbalans naar

aanleiding van de cumulatieve gegevens weergegeven. Alle criteriumwaarden vallen binnen het
gestelde bereik, dus deze balans is kloppend.
Zoals de koolstofbalans is opgesteld kunnen ook de stikstof-, reductiegraad- en ladingsbalansen
opgesteld worden. Omdat alleen in ammonium en biomassa stikstof zit, geldt voor stikstof de
vergelijking:
1 + 0,18 = 0
De reductiegraadbalans bevat vervolgens alleen de termen met een reductiegraad die niet 0 is:
24 + 4,17 4 = 0
De ladingsbalans bevat alleen de stoffen met een lading:

 =0
Deze zijn te zien in respectievelijk Tabel 3, Tabel 4 en Tabel 5. Alle dikgedrukte criteriumwaarden liggen
buiten het gestelde bereik.
Tabel 2. Koolstofbalans van de groei van P. Jadinii op glucose
Tijd
(h)

Biomassa
(mCmol)

Restterm
CO2 (mmol)

Criterium

Glucose (mCmol)

9,4

0,64

-11,1

-1,13

0,90

1,25
1,5

13,0
14,9

1,60
2,65

-13,5
-18,8

1,07
-1,20

1,08
0,93

1,75

17,6

3,72

-21,2

0,03

1,00

20,4

4,84

-25,4

-0,17

0,99

2,25

22,8

6,08

-31,6

-2,68

0,92

2,5
2,75

26,7
31,3

7,56
9,39

-36,7
-44,2

-2,47
-3,55

0,93
0,92

38,9

11,62

-54,0

-3,46

0,94

3,25

44,5

14,29

-64,5

-5,75

0,91

3,5

51,0

17,37

-67,8

0,54

1,01

3,75

54,3

20,76

-67,9

7,17

1,11

54,3

24,32

-67,8

10,8

1,1

.
Tabel 3. Stikstofbalans van de groei van P. Jadinii op glucose
Tijd (h)

0,18 * Biomassa (mCmol)

Restterm

NH4 (mmol)

Criterium

1,6877484

-1,22805

0,4597

1,374328578

1,25
1,5

2,3368824
2,6830872

-1,88955
-2,40808

0,447332
0,275012

1,236739715
1,114204017

1,75

3,1591188

-2,91711

0,242006

1,08296095

3,678426

-3,41666

0,261764

1,076613995

2,25

4,111182

-4,26804

-0,15686

0,963247317

2,5
2,75

4,8035916
5,625828

-4,50596
-6,10495

0,297632
-0,47913

1,066053022
0,921518559

7,0106472

-7,89034

-0,87969

0,888510031

3,25

8,005986

-9,04744

-1,04145

0,8848899

3,5

9,1744272

-10,3737

-1,1993

0,884390319

3,75
8

9,7802856

-9,32337

0,456916

1,0490076

9,7802856

-10,947

-1,16672

0,893420806

Tabel 4. Reductiegraadbalans van de groei van P. Jadinii op glucose

Tijd
(h)

4,17*Biomassa
(mCmol)

-4*O2 (mmol)

Restterm

Criterium

24*Glucose (mmol)
0

39,0995

1,63103671

-44,58726

-3,85671869

0,913501779

1,25
1,5

54,13778
62,15819

3,966599584
6,460715228

-54,029268
-75,011508

4,075107184
-6,392605972

1,075424068
0,91477833

1,75

73,18625

9,047112593

-84,978072

-2,744707207

0,967700995

85,21687

11,96473313

-101,763864

-4,582261872

0,954971621

2,25

95,24238

15,60806125

-126,417996

-15,56755175

0,876856522

2,5
2,75

111,2832
130,3317

20,40227513
26,70321778

-146,87568
-176,775372

-15,19019947
-19,74047222

0,896577844
0,88833019

162,4133

34,72218846

-216,117072

-18,98155674

0,912170026

3,25

185,472

44,4755544

-258,081552

-28,1339886

0,89098799

3,5

212,5409

55,75918284

-271,195452

-2,895372365

0,989323669

3,75

226,5766

68,14769334

-271,720008

23,00430174

1,084661788

226,5766

81,01853048

-271,195452

36,39969488

1,134219415

Tabel 5. Ladingsbalans van de groei van P. Jadinii op glucose

Tijd (h)

Restterm

NH4 (mmol)

- Base (mmol)

Criterium

1,425

-1,22805

0,196946951

0,861791613

1,25
1,5

1,89
2,48

-1,88955
-2,40808

0,000449295
0,071924675

0,999762278
0,970998115

1,75

3,1

-2,91711

0,182887615

0,941003995

3,875

-3,41666

0,458338115

0,881719196

2,25

4,715

-4,26804

0,446955931

0,905205529

2,5
2,75

6,32
6,87

-4,50596
-6,10495

1,814040631
0,765046451

0,712968255
0,888639527

8,065

-7,89034

0,174658915

0,978343594

3,25

9,3

-9,04744

0,252562575

0,972842734

3,5

9,49

-10,3737

-0,883730919

1,093122331

3,75

9,505

-9,32337

0,181630371

0,980891071

9,505

-10,947

-1,442009

1,151710573

Groeigegevens
Met alle verzamelde gegevens kan nu de groeicurve van P. Jadinii in dit experiment opgesteld worden.
In Afbeelding 1 is deze groeicurve te zien.

Hoeveelheid Biomassa (mCmol)

80
70
60
50
40
mCmol Biomassa

30
20
10
0
0

Tijd (uren)
Afbeelding 1. Groeicurve van P. Jadinii op glucose

ln(hoeveelheid biomassa) (ln(mCmol))

Deze zelfde grafiek kan ook weergegeven worden op een logaritmisch as, zoals te zien in Afbeelding 2.

4,5
4
Lineair deel ln
Biomassa

3,5

ln Biomassa

Lineair (Lineair deel ln

Biomassa )

2,5
2
0

y = 0,4024x + 2,7288
R = 0,9921

Tijd (uren)
Afbeelding 2. Groeicurve van P. Jadinii op glucose op een logaritmische as.

10

Het lineaire deel van de logaritmische grafiek komt overeen met de exponentiele groeifase van de gist.
Het eerste meetpunt is hier niet bijgevoegd, maar aan de grafiek te zien zal de lagfase niet heel lang
geduurd hebben. Door te kijken naar de helling van het lineaire deel van de grafiek kan de specifieke
maximale groeisnelheid van P. Jadinii bepaald worden. In dit geval geldt dus = 0,4024 1 .
Door de groei van P. Jadinii ook uit te zetten tegenover glucose en zuurstof concentratie, kan bepaald
worden wat de limiterende nutrinten in de fermentor werden die ervoor hebben gezorgd dat de groei
stopte. Deze grafiek is te zien in Afbeelding 3.

Hoeveelheid stof/Concentratie

100
90
80
70
Hoeveelheid biomassa
(mCmol)

60
50

Opgeloste O2
concentratie (%)

40
30

Hoeveelheid Glucose
(mCmol)

20
10
0
0

Tijd (uren)
Afbeelding 3. Groeicurve van P. Jadinii op glucose tegenover O2 concentratie en hoeveelheid
substraat.

In deze grafiek is duidelijk te zien dat het opraken van het substraat uiteindelijk heeft gezorgd voor de
stop van de groei. De zuurstofconcentratie is nooit onder 10% geweest, waaruit blijkt dat er altijd
genoeg zuurstof is geweest om te blijven groeien. De zuurstof concentratie schoot omhoog rond de tijd
dat de suiker opraakte, waarschijnlijk omdat de gisten geen oxidatieve dissimilatie van glucose meer als
energiebron konden gebruiken.
Met deze data van substraat en biomassa kan ook de yield bepaald worden. In Afbeelding 4 is de yield
per tijdseenheid weergegeven. Dit is berekend volgens

/ = =

Als voorbeeld:
Y/ =

11

54,3
0,8 mCmol/mCmol
6 11,3

1,2
Yield Biomassa op Glucose
(mCmol/mCmol)

1
0,8
Biomassa Yield
op Glucose

0,6
0,4
0,2
0
0

Tijd (uren)
Afbeelding 4. Biomassa yield van P. Jadinii op glucose per tijdseenheid

Alhoewel uit de afbeelding blijkt dat de yield niet constant is, schommelen de waarden allemaal rond de
0,8 mCmol/mCmol.

De kLa gedurende de fermentatie

= (

, waarin r0 de

300
250
kLa (1/uur)

De kLa tijdens deze batch

fermentatie is berekend
volgens de statische methode.
Dat houdt in dat gebruikt is
gemaakt van de zuurstofbalans
en een pseudo steady state
verondersteld is, waardoor de
volgende gesimplificeerde
vergelijk verkregen wordt

200
150
100

kLa gedurende
fermentatie

50

0
omzettingssnelheid van
*
0
2
4
6
zuurstof is, CL de
Tijd (uren)
verzadigingsconcentratie van
de oplossing en CL de
Afbeelding 5. kLa gedurende de fermentatie van P. Jadinii op glucose per tijdseenheid
concentratie van de oplossing.
Op deze manier kan de kLa voor elk meetpunt bepaald worden (zie Bijlage). De resulterende grafiek is
weergegeven in Afbeelding 5. In de grafiek is te zien dat de eerste en laatste paar waarden niet geheel
overeenkomen met de andere waarde. Wanneer het gemiddelde van het lineaire deel genomen wordt,
komt daar een kLa van 40,4 h-1.

12

Discussie
Vanuit de cumulatieve gegevens blijkt dat er een groeiproces heeft plaatsgevonden in de fermentor. Er
is substraat verbruikt en er is biomassa geproduceerd, zoals verwacht bij een inoculum in een rijk
medium. Het is nuttig om te weten dat er inderdaad een proces is geweest, want wanneer dit niet zo
was geweest zouden alle andere berekeningen die erop volgde zinloos zijn geweest.
De balansen die zijn opgesteld naar aanleiding van de cumulatieve gegevens geven bijna allemaal geen
grote restwaardes. Van twee metingen zijn de criteriumwaarden buiten het gestelde bereik, maar
verder zijn alle balansen kloppend. Dat wil zeggen dat de nauwkeurigheid van de metingen goed genoeg
is om mee door te rekenen en conclusies uit te trekken. Vooral in een van de ammoniumbepalingen is
duidelijk een meetfout, aangezien de cumulatieve afname ineens dichter naar 0 gaat, maar de fout is
schijnbaar klein genoeg om betrouwbaar te zijn. Wanneer de balansen in het proces niet zouden
kloppen, zou er een verklaring voor gezocht moeten worden en in een industrieel proces kunnen
problemen in de productie op die manier opgelost worden. Uit de balansen blijkt dat in dit experiment
geen onvoorziene omstandigheden opgetreden zijn. Op basis van de balansen kan ook gesteld worden
dat in dit hele proces het micro-organisme bijna gezien kan worden als chemische katalysator: alle
ingaande stofstromen komen er ook uit en er ontstaat product. Dit verstevigd het black box denken
over een bioreactor: kennis van metabole routes en biologie is niet benodigd om aan het proces te
rekenen en eventueel procescondities te verbeteren.
Vanuit alle data is de groei van biomassa geplot. In de grafiek (Afbeelding 1) is duidelijk een sterke groei
te zien, maar de kromming van de grafiek is net niet groot genoeg om exponentieel genoemd te
worden. Dit is ook terug te zien in de logaritmische plot (Afbeelding 2) in de vorm van een knik naar
beneden tijden het lineaire deel. Het verwachte resultaat was een volledig exponentiele groei na een
lag-fase, zoals normaal na benting van een batch. De lineaire fit in deze grafiek heeft maar een kleine
afwijking, een R2 waarde van boven de 0,99, wat betekent dat de afwijking van het verwachte resultaat
een onnauwkeurigheid kan zijn in de meting. Deze meetfout zou uitgesloten kunnen worden door de
OD600 meting in duplo of zelfs triplo te meten. Verder is te zien dat de lag-fase niet lang heeft geduurd,
omdat de eerste meting bijna lineair is door te trekken naar het lineaire stuk. Dit heeft te maken met het
grote inoculum wat is gebruikt om de fermentor de enten.
Uit Afbeelding 3, waarin substraat, zuurstof en biomassa tegen elkaar zijn uitgezet, kan worden
geconcludeerd dat glucose het limiterend nutrint is geweest wat de groei deed stoppen. Wanneer er
ongeveer geen glucose meer was, schoot de zuurstofconcentratie omhoog omdat de groei die er nog
was niet meer voortkwam uit oxidatieve dissimilatie van glucose, maar vanuit een andere bron.
Wanneer het substraat, glucose, niet meer aanwezig is, is het verwachte resultaat dat de groei stopt.
Dat is hier niet direct gebeurt, dus de gist moet een andere koolstofbron gevonden hebben om op te
groeien. Waarschijnlijk is de gist uit noodzaak andere stoffen aanwezig in het medium gaan omzetten
om nog door te kunnen groeien. Vrij snel daarna is de groei gestagneerd.

13

Gedurende de hel e exponentiele groei werd een constante yield verwacht. De berekende yields
gedurende deze periode fluctueerden tussen de 0,69 en 0,96 met een gemiddelde van ongeveer 0,8
Cmol/Cmol. Verreweg het grootste deel van het substraat is dus gebruikt om biomassa te produceren,
en vanuit de koolstofbalans is bekend dat de rest van het substraat verbrand is en in de vorm van CO2 de
reactor heef verlaten.
De berekende kLa waarden zijn ook niet geheel constant. Specifiek de eerste en laatste waarden wijken
af van het gemiddelde. Dit ligt waarschijnlijk aan een onnauwkeurige bepaling van r0, de volumieke
omzettingssnelheid. Alhoewel de gemeten waarden net zo nauwkeurig zijn als de anderen, zijn de
omstandigheden waarin de micro-organismen zich bevinden wel verschillend. Zij verbruiken of meer of
minder zuurstof in de lag en stationaire fase waardoor die waarden een andere afwijking zullen hebben
dan in de exponentiele fase. De gemiddelde kLa waarde van de exponentiele fase is ongeveer 40 h-1. De
eerder bepaalde kLa waarde onder dezelfde omstandigheden zonder micro-organisme gaf een waarde
van ongeveer 46 h-1. Deze waarden komen redelijk overeen en verschillen ongeveer 13%, een afwijking
die makkelijk verklaart kan worden als meetfout gezien er zoveel afzonderlijk waarden gemeten moeten
worden om de kLa te bepalen.

Conclusie
Het doel in dit experiment was om te onderzoeken of een biotechnologisch proces, de groei van de gist
Pichia Jadinii, op eenzelfde manier te behandelen is in berekeningen als een chemisch proces door de
bepaling van macroscopische stromen. Met andere woorden, het gebruik van de black box
behandeling van een bioreactor. Uit de zes groeiparameters die bepaald zijn blijkt dat dit inderdaad zo
is. Vanuit de macroscopische stromen konden alle andere parameters en groeifactoren bepaald worden.
Verder is bepaald dat de groeicurve van P. Jadinii inderdaad exponentieel is. De beperkende factor in dit
experiment was de substraatconcentratie, want de exponentiele groeifase stopte op het moment dat
het substraat op was. Dat betekent dat er genoeg zuurstof was gedurende het proces ondanks de lage
roersnelheid en dus lage kLa.

14

Referenties

Robertson, L, Van Gulik, W.M., Van Der Lans, R.G.J.M, & Zomerdijk. M (2015), Practicum

Biotechnologische Basistechnieken LST deel A: Microbiologie en Fermentatie. Delft: TU Delft

15

Bijlage

kLa bepalingen onder verschillende condities

Inleiding
De kLa, of volumieke zuurstofoverdrachtscofficient, is een maat voor de hoeveelheid zuurstof
die vanuit de lucht overgedragen wordt naar een medium per tijdseenheid. Deze waarde is
afhankelijk van een heleboel parameters, waaronder rotatie snelheid van de roerder, manier
van beluchting en het luchtdebiet. In dit experiment wordt van deze parameters gemeten wat
het effect is op de kLa.
Het doel van dit experiment is achterhalen wat het effect is van de rotatiefrequentie van de
roerder, de manier van beluchting, het luchtdebiet en de toevoeging van antischuim op de kLa.
Om dit te doen wordt een fermentorvat met demiwater eerst ontlucht met stikstofgas en
vervolgens op verscheidene manieren belucht. De tijd die elk van de methoden gebruikt om de
vloeistof volledig te beluchten wordt gemeten en op basis daarvan kan de kLa berekend
worden.

Materiaal en Methode
Alle experimentele details staan vermeld in de practicumhandleiding Practicum
Biotechnologische Basistechnieken LST deel A: Microbiologie en Fermentatie (Dr. Robertson, Dr.
Van Gulik, Dr. Ir. Van Der Lans, & Zomerdijk, 2015).

Resultaten
Vanuit de gemeten dat kan direct de grafiek worden verkregen die staat in Afbeelding B-1.
Hierin zijn alle metingen aan een stuk door te zien als functie van de tijd. Om iets uit deze dat te
halen moeten de metingen verdeeld worden en moeten alleen de stijgingen van de DOT in de
grafieken te zien zijn. Door voor elk van deze stukken de ln

()
1

(0) tegen de tijd te plotten krijg

1

je een grafiek waarvan de helling de kLa is. CL* is de maximale DOT (100%), CL(t) is de meting en CL(0) is
de laagste DOT waarde (0%). Een voorbeeld is te zien in Afbeelding B-2.

16

120
100

DOT (%)

80
60
kLa metingen

40
20
0
0

0,5

1,5

-20

2,5

3,5

4,5

Tijd (h)

Afbeelding B-1. DOT tegenover de tijd voor kla bepalingen onder verschillende condities

ln((1-(CL(t)/CL*))/(1-(CL(0)/CL*))

0,5
0
1,8

1,9

2,1

2,2

2,3

2,4

2,5

Vortexbeluchting,
0,7 L/min, 600 rpm

-0,5
-1

Lineair
(Vortexbeluchting,
0,7 L/min, 600
rpm)

-1,5
-2

y = -5,0849x + 10,172
R = 0,9968

-2,5

Afbeelding B-2. ln

Tijd (h)
()

()

tegenover de tijd voor bepaling van de kLa gedurende vortexbeluchting met een debiet van 0,7

L/min en een roersnelheid van 600 rpm.

Een rekenvoorbeeld voor een punt in deze grafiek is als volgt:

()
88,8
1 100

ln
= ln
= 2,189
0
(0)
1 100
1

17

Alle data op deze manier uitgewerkt geven de resultaten in Afbeelding B-3 en B-4.
160

kLa (mol/(L*uur))

140
120
100

0,7 L/min

80
60

0,7 L/min
vortexbeluchting

40

0,7 L/min antischuim

20
0
0

500

1000

1500

Roersnelheid (rpm)
Afbeelding B-3. Stijging van de kLa bij hogere roersnelheden
80

KLa (mol/(L*uur))

70
60
50
40
600 rpm

30
20
10
0
0

0,5

1,5

2,5

Gasdebiet (L/min)
Afbeelding B-4. Stijging van de kLa bij hogere luchtdebieten

18

Discussie en Conclusie
Het doel van dit experiment was om het effect van de parameters luchtdebiet, manier van beluchting,
roersnelheid en toevoeging van antischuim op de volumieke zuurstofoverdrachtscofficient kLa. Het
eerste wat opvalt is dat de laagste kLas behaald worden met vortexbeluchting. Dit is te verwachten,
omdat het oppervlak om zuurstof uit te wissel kleiner is aan alleen het oppervlak van het water dan
wanneer er constant luchtbellen door het water geblazen worden. Een volgende conclusie is dat
antischuim een positief effect heeft op de kLas bij hoge roersnelheden. Dit is omdat antischuim
voorkomt dat er grote luchtbellen vormen. Grote luchtbellen hebben naar verhouding een kleiner
oppervlak dan kleine luchtbellen, dus omdat er nu makkelijker kleine dan grote luchtbellen ontstaan is
er een groter grensvlak aan lucht in de fermentor, dus en hogere kLa. Om deze zelfde reden stijgt ook de
kLa bij een hogere roersnelheid: meer roeren betekent een meer kleine bellen maken en dus een groter
oppervlak creren. Een laatste conclusie die getrokken kan worden is dat een hoger luchtdebiet zorgt
voor een hogere kLa. Ook dit is logisch aangezien meer lucht ook direct meer zuurstof betekent.

19

Bepaling van glucose

De glucose concentratie in de fermentor is bepaald door verdunningen van monsters te behandelen met
een reagens en de absorptie bij 505 nm te vergelijken met een van tevoren gemaakte ijklijn. De ijklijn is
gemaakt met en bekende oplossing en een reeks verdunningen. De ijkgrafiek is te zien in Afbeelding B-5.
0,45
0,4

Absorptie (AU)

0,35
0,3
0,25
Glucose IJklijn

0,2
0,15

Lineair (Glucose IJklijn)

0,1

y = 0,0686x + 0,0009
R = 0,9997

0,05
0
0

Concentratie (mM)
Afbeelding B-5. IJklijn voor de bepaling van glucose in een oplossing

Alle metingen voor de ijklijn zijn in triplo gedaan. Met de lineaire regressielijn kan bepaald worden wat
de concentratie is naar aanleiding van de absorptie. In de lijn is y absorptie en x concentratie.
Omgeschreven wordt dat:
= 14,571 505 () 0,0122
De samples van de fermentor zijn eerst 2 keer verdund voordat de meting werd verricht, dus de
concentratie moet nog verdubbeld worden voor de juiste waarde. Als voorbeeld:
= (14,571 0,2615 0,0122) 2 = 7,596 /
De totale hoeveelheid glucose in de fermentor kan dan bepaald worden door het fermentorvolume te
vermenigvuldigen met de concentratie
= ( ) = 7,596 1,5 = 11,39
Alle glucosebepalingen zijn in duplo gedaan. De metingen staan in Tabel B-1.

20

Met deze berekende waarde kan zowel een grafiek van de daling van de glucose hoeveelheid worden
gemaakt (Afbeelding B-6) als een tabel met de cumulatieve daling van glucose (Tabel B-2).
Tabel B-1. Metingen en berekende glucosewaarden
Tijd
(h)

A505 (AU)

Cgluc (mmol/L)

Mgluc (mmol)

0,2615

7,60

11,39

0,219

6,36

9,54

1,25
1,5

0,21
0,19

6,10
5,51

9,14
8,27

1,75

0,1805

5,24

7,85

0,1645

4,77

7,15

2,25

0,141

4,08

6,13

2,5
2,75

0,1215
0,093

3,52
2,69

5,27
4,03

0,0555

1,59

2,39

3,25

0,0155

0,43

0,64

3,5

0,003

0,06

0,09

3,75

0,0025

0,05

0,07

0,003

0,06

0,09

Tabel B-2. Cumulatieve

glucose consumptie
12,00

Tijd
(h)

Mgluc (mmol)

10,00

Glucose
(mmol)

8,00

-1,86

6,00

1,25
1,5

-2,25
-3,13

1,75

-3,54

Glucose afname

4,00
2,00
0,00
0

3
Tijd (h)

Afbeelding B-6. Glucose daling over de tijd

21

-4,24

2,25

-5,27

2,5
2,75

-6,12
-7,37

-9,00

3,25

-10,8

3,5

-11,3

3,75

-11,3

-11,3

Bepaling van ammonium

De ammonium concentratie in de fermentor is bepaald door monsters te behandelen met een reagens
en de absorptie bij 550 nm te vergelijken met een van tevoren gemaakte ijklijn. De ijklijn is gemaakt met
en bekende oplossing en een reeks verdunningen. De ijkgrafiek is te zien in Afbeelding B-7.
IJkconcentratie was gegeven in mg [N]/L. Dit is makkelijk om te rekenen naar mmol/L door te delen me
de molmassa van N:
4 =

200
= 14,28
14,01

16

Concentratie (mM)

14
12
10
8

NH4 ijklijn

Poly. (NH4 ijklijn)

4
2
0
0

0,05

0,1

y = 790,63x2 + 47,922x + 0,1689

R = 0,9965
0,15

A505 (AU)
Afbeelding B-7. IJklijn voor de bepaling van ammonium in een oplossing

De lijn is duidelijk niet lineair, dus er is een polynoom gebruikt als trendlijn. Alhoewel het onorthodox is
om de gemeten waarde op de y-as te zetten, maakt het in dit geval het rekenwerk een stuk makkelijker.
Alle metingen voor de ijklijn zijn in triplo gedaan. Met de regressielijn kan bepaald worden wat de
concentratie is naar aanleiding van de absorptie. De ammoniumconcentratie kan dus geschreven
worden als:
4 = 790,63 550 2 47,922 550 + 0,1689
4 = 790,63 0,0872 47,922 0,087 + 0,1689 = 10,322
De totale hoeveelheid ammonium in de fermentor kan dan bepaald worden door het fermentorvolume
te vermenigvuldigen met de concentratie
4 = (4 ) = 10,322 1,5 = 15,48

22

Alle ammoniumbepalingen zijn in duplo gedaan. De metingen staan in Tabel B-3.

Met deze berekende waarde kan zowel een grafiek van de daling van de ammonium hoeveelheid
worden gemaakt (Afbeelding B-8) als een tabel met de cumulatieve daling van glucose (Tabel B-4).
Tabel B-3. Metingen en berekende ammoniumwaarden
Tijd
(h)

A550 (AU)

CNH4 (mmol/L)

MNH4(mmol)

0,087

10,32

15,48

0,0825

9,50

14,26

1,25
1,5

0,08
0,078

9,06
8,72

13,59
13,08

1,75

0,076

8,38

12,57

0,074

8,04

12,07

2,25

0,0705

7,48

11,22

2,5
2,75

0,0695
0,0625

7,32
6,25

10,98
9,38

0,054

5,06

7,59

3,25

0,048

4,29

6,44

3,5

0,0405

3,41

5,11

3,75

0,0465

4,11

6,16

0,037

3,02

4,54

Tabel B-4. Cumulatieve

ammonium consumptie

18,00
Hoeveelheid NH4 (mmol)

16,00
14,00

Tijd
(h)

12,00

10,00

-1,23

1,25
1,5

-1,89
-2,41

8,00

Hoeveelheid NH4

6,00

NH4 (mmol)

1,75

-2,92

4,00

-3,42

2,00

2,25

-4,27

0,00

2,5
2,75

-4,51
-6,10

-7,89

3,25

-9,05

3,5

-10,4

3,75

-9,37

-10,9

3
Tijd (h)

Afbeelding B-8. Ammonium daling over de tijd

23

Bepaling biomassa concentratie

Voor de bepaling van de hoeveelheid biomassa in de fermentor is de optische dichtheid bij 660 nm
gemeten van elk monster. Van een van de monsters is ook het drooggewicht bepaald. Zo is er een direct
verband te trekken tussen drooggewicht en OD660. Het gemeten drooggewicht in 10 ml was 9,8 mg. De
berekening die naar concentratie leidt is als volgt:
=

9,8

=
= 38,628
0,01 25,37

De optische dichtheid die hierbij hoorde was 0,241. De ijklijn die als volgt gemaak werd staat in
Afbeelding B-9.

0,3
0,25

OD660

0,2
Biomassa Concentratie

0,15
0,1

Lineair (Biomassa
Concentratie)

0,05
0
0

10

20

30

40

50

y = 0,0062x
R = 1

Concentratie (mM)
Afbeelding B-9. IJklijn voor de bepaling van de biomassa van Pichia Jadinii in een oplossing

De berekening voor de hoeveelheid biomassa in de fermentor verloopt dan als volgt (met voorbeeld):
= 160,28 660 () = 160,28 0,056 = 8,976
= = 8,976 1,5 = 13,464
Alle gemeten OD660 waarden en de berekende biomassa concentraties en hoeveelheden staan
weergegeven in Tabel B-5. Met deze waarden kan ook een grafiek getekend worden met de toename
van de biomassa over de tijd (Tabel B-6).

24

Tabel B-5. Metingen en berekende biomassa waarden

Tijd
(h)

A550 (AU)

CNH4 (mmol/L)

Tabel B-6. Cumulatieve

biomassa productie

MNH4(mmol)

0,056

8,98

13,46

Tijd
(h)

0,095

15,23

22,84

1,25
1,5

0,11
0,118

17,63
18,91

26,45
28,37

9,4

1,75

0,129

20,68

31,01

1,25
1,5

13,0
14,9

0,141

22,60

33,90

1,75

17,6

2,25

0,151

24,20

36,30

20,4

2,5
2,75

0,167
0,186

26,77
29,81

40,15
44,72

2,25

22,8

0,218

34,94

52,41

2,5
2,75

26,7
31,3

3,25

0,241

38,63

57,94

38,9

3,5

0,268

42,96

64,43

3,25

44,5

3,75

0,282

45,20

67,80

3,5

51,0

0,282

45,20

67,80

3,75

54,3

54,3

25

Biomassa
(mCmol)

Bepaling van CO2 productie en O2 consumptie

De gasconsumptie en productie is bepaald door naar aanleiding van de gemeten zuurstoffractie en
koolstofdioxidefractie in de in- en uitgaande gasstroom. Deze is gedurende het experiment bijhouden.
Vervolgens kan met een polynomial fit in Excel een functie worden opgesteld. De oppervlakte onder
deze functie is cumulatieve productie of consumptie van het gas. Nu volgen een koolstofdioxide en een
zuurstof rekenvoorbeeld.
Als we beginnen met een laagste molfractie in de uitgaande stroom kan de hoeveelheid mol CO2 per uur
berekend worden met de gasinstroom als we die gelijk stellen aan de uitstroom, en de gasconstante bij
35 C:
2 =

0,079 0,7

(min) 1000 =

60 1000 = 1,481 /
100
100 22,4

Wanneer dit met alle meetpunten gedaan wordt volgt de grafiek in Afbeelding B-10.

CO2 productie (mmol/uur)

18
16
14
12
10
8

CO2

Poly. (CO2)

4
2
0
0

2
Tijd (uur)

4
5
6
7
y = 0,2349x5 - 3,681x4 + 20,513x3 - 49,957x2 + 55,301x - 18,658
R = 0,943

Afbeelding B-10. CO2 productie over de tijd

Via het integreren van dit polynoom kunnen de cumulatieve waarden uitgerekend worden. Als
voorbeeld wordt het twee meetpunt berekend:
0,917

0,2349 5 3,681 4 + 20,513 3 49,957 2 + 55,301 18,658

0,667

= (0,03915 0,9176 0,7362 0,9175 + 5,12825 0,9174 16,6523 0,9173

+ 27,6505 0,9172 18,658 0,917)
(0,03915 0,6676 0,7362 0,6675 + 5,12825 0,6674 16,6523 0,6673
+ 27,6505 0,6672 18,658 0,667) = 0,636

26

Door dit voor alle meetpunten te doen wordt Tabel B-6 verkregen met de cumulatieve CO2 productie
gegevens. Ditzelfde proces is gedaan met O2. De berekening voor de consumptie is als volgt (met het
tweede meetpunt als voorbeeld:
2,

2, ()

2 = (

(min) 1000) (

(min) 1000)
100
100

20,74 0,7
20,63 0,7
=

60 1000

60 1000 = 2,063 /
100 22,4
100 22,4
De grafiek voor alle meetpunten behandeld met deze berekening staat in Afbeelding B-11
18

O2 Consumptie (mmol/uur)

16
14
12
10
8

O2

Poly. (O2)

4
2
0
-2 0
-4

2
Tijd (uur)

y = 0,2118x5 - 3,2291x4 + 17,259x3 - 39,474x2 + 40,656x - 13,126

R = 0,9336

Afbeelding B-11. O2 consumptie over de tijd

De berekening voor de cumulatieve

zuurstproductie wordt weer berekend met de
integraal van de polynomial fit. Deze waarden
staan in Tabel B-7.

27

Tabel B-7. Cumulatieve O2

productie

Tabel B-6. Cumulatieve CO2

productie

Tijd
(h)

Tijd
(h)

O2 (mmol)

CO2 (mmol)

-0,41

0,64

1,25
1,5

-0,99
-1,62

1,25
1,5

1,60
2,65

1,75

-2,26

1,75

3,72

-2,99

4,84

2,25

-3,90

2,25

6,08

2,5
2,75

-5,10
-6,68

2,5
2,75

7,56
9,39

-8,68

11,6

3,25

-11,1

3,25

14,3

3,5

-13,9

3,5

17,4

3,75

-17,0

3,75

20,8

-20,3

24,3