Diversidad metablica del mundo

microbiano

Metabolismo microbiano
vas metablicas
genes

procesos moleculares

reciclado de elementos

Desarrollo de la diversidad de
metabolismos microbianos
Metabolismo, replicacin y herencia son inseparables del contexto ambiental
interaccin de
presiones selectivas

habitat

Microorganismos

presin selectiva
recursos

evolucin

tiempo
3.8109
aos

Bacterias

Arqueas

Diversida
d
fisiolgica

Eucariote
s

Clasificacin metablica segn

requerimientos de C y E
Fuente de E
qumica

luz

Quimiotrofos

Fototrofos

Fuente de C
Comp. orgnicos

CO2

Quimioheterotrofos

Quimiolitotrofos

Aceptor final de electrones

O2
oxidativo

No O2
Comp.
orgnicos
Fermentativo

Comp.
inorgnicos
NO3-,

SO42-,

Fe(III), Mn(VI)

Bacterias
oxidantes de
S, Fe y CO

Fuente de C
Comp. orgnicos
Fotoheterotrofos

CO2

Fotoautotrofos

GNB, PNB
Usa H2O para reducir CO2?
Si

No

Fotosntesis
oxignica

Fotosntesis
anoxignica

Metabolismo:
Anabolismo y catabolismo
Material celular,
macromolculas,

biomasa

Biosntesis
Creacin de uniones C-C
Reduccin asimilatoria
de CO2, NO3-, SO42-

ATP

Recursos

Oxidacin de sustratos
reducidos
Uso de fosforilacin y
transporte de electrones
Reduccin disimilatoria
de O2, NO3-, Fe(OH)3,
Mn(OH)4, SO42-, CO2

Intercambio de
energa bioqumica

ATP

La termodinmica predice que reacciones

son energticamente favorables
Tipos de reaccin
Cambio de estado
Disolucin/precipitacin
Formacin de complejos

Reactivos

Reaccin cido/base
Adsorcin/desorcin
Oxidacin/reduccin
Productos

Reacciones redox, equilibrio qumico

y energa libre
Reduccin

B
Oxidacin

A oxidado

B reducido

Reacciones redox, equilibrio qumico

y energa libre
Reduccin

H+

H+

molcula
orgnica
con 2H

NAD+ (carrier
de electrones)
Oxidacin

molcula
orgnica
oxidada

NADH + H+
(carrier de ereducido)

Las coenzimas aumentan la diversidad de

reacciones redox posibles en una clula

Potencial de reduccin: medida de la tendencia

a donar electrones en sistemas biolgicos
estado
oxidado

estado
reducido

La cantidad de energa que puede ser

liberada de 2 hemi-reacciones se puede
calcular a partir de la diferencia en los
potenciales de reduccin de las 2
reacciones y el nmero de electrones
transferidos:

Zehnder, A.J.B. and W. Stumm. 1988. Geochemistry and biogeochemistry of anaerobic habitats.
A.J.B. Zehnder (ed.) Biology of Anaerobic Microorganisms, pp. 138

1. Termodinmica de la hemireaccin
Proceso

G0 (kJ/ec)

Respiracin aerbica

-125

Desnitrificacin

-119

Reduccin de manganeso -98

Reduccin de hierro

-42

Fermentacin

-27

Reduccin de sulfato

-25

Metanognesis

-23

Acetognesis

-22

2. Presencia de constituyente
geoqumico en el ambiente
Proceso

G0 (kJ/ec)

Respiracin aerbica

-125

Desnitrificacin

-119

Reduccin de manganeso -98

Reduccin de hierro

-42

Fermentacin

-27

Reduccin de sulfato

-25

Metanognesis

-23

Acetognesis

-22

3. Fisiologa de los microorganismos

Aceptor terminal
de electrones
Aerbico
Anaerbico

Producto

Microorganismo

Impacto geoqumico de la respuesta a

una perturbacin ambiental
H2

Equivalente
s

Especies qumicas
SO4O2
O2

pE

+10

Fe (II)

orgnicas

H2S

NO3-

NO3-

CH4

Aceptores de electrones
gas oil

Fe (III)

SO4-

CO2

-10

Proceso dominante de aceptor terminal de electrones

Respiracin
aerbica

Desnitrificacin

Reduccin
de Fe (III)

Reduccin
de sulfato

Distancia

Metanogenesis

Reacciones redox, equilibrio qumico

y energa libre
oxidacin
reduccin

27.87
Energa libre de formacin
(de tablas)

744.6

39.83

Transduccin de energa biolgica

Los denominadores comunes en el metabolismo de
energa son ATP y los potentiales transmembrana

Fosforilacin a nivel de sustrato

Mecanismos para la
generacin de ATP

Respiracin
Fotofosforilacion

La conservacin de energa est ligada a

un estado energizado de la membrana
Los transportadores de electrones estn
orientados en la membrana de modo que a
medida que los electrones son
transportados, los protones son separados
de los electrones

Potencial de reduccin

Fuerza motora de protones (pmf)

++
+

Diversidad catablica:
quimio-organotrofos
Fermentacin
Flujo de carbono
en respiracin

Aceptores de
electrones

Comp orgnicos

Flujo de carbono

Transporte de eGeneracin de pmf

aceptores
orgnicos
Respiracin anaerbica

Biosntesis
Respiracin aerbica

Diversidad catablica:
quimio-litotrofos

Transporte de eGeneracin de pmf

Aceptores de
electrones

Biosntesis

Respiracin aerbica
Respiracin anaerbica

Diversidad catablica:
Fottrofos
luz
Fotohetertrofos
Compuestos
orgnicos

Fotoauttrofos
Dador
de eTransporte
de electrones

generacin de pmf
y poder reductor

Biosntesis

Biosntesis

Diversidad metablica y
economa del crecimiento

Economa del crecimiento

Los precursores, que son la fuente de
monmeros para todos los componentes
celulares, se originan en los pathways
centrales: guclisis y ciclo del cido
tricarboxlico (TCA)

gluclisis

bacteria

ciclo
del
TCA

Todos los sustratos ingresan en los pathways

centrales luego de un nmero limitado de
reacciones, para proveer al organismo con los
metabolitos precursores

Glucosa 6-P

piruvato

Fosfoenolpiruvato

Fructosa 6-P

Gliceraldehido 3-P

3-P glicerato

Metabolismo oxidativo
consumo de O2
Contaminantes
orgnicos y
nutrientes
(C,P,N,O,Fe,S)

Crecimiento divisin
celular

CO2

Qu pasa con la energa?

Qu pasa con la biomasa

Respiracin aerbica
38 ATP

ca

lo

CO2

CH2O
O2
luz

CH2O
O2

clula microbiana
fsforo

Catabolismo de hidratos de carbono

4.75g/mol ATP

Cintica de crecimiento
Concentracin de
biomasa activa

Tasa de crecimiento
especfica

tasa de utilizacin de
sustrato

Mximo coeficiente de
crecimiento microbiano

Efecto de la concentracin
de sustrato
Crecimiento de
biomasa activa

Mxima tasa de
crecimiento especfica

Constante de
saturacin

Mxima tasa especfica de

utilizacin de sustrato

Crecimiento neto
Coeficiente de
decaimiento
Crecimiento en 3-Cl benzoato

Bodegom, Microb Ecol 2007, Vol. 53

Significado del coeficiente

de decaimiento b
Por definicin:
cuando

Smin es un parmetro cintico independiente de la configuracin del reactor

Que pasa cuando b = 0?
La existencia de un Smin es consecuencia de decaimiento y mantenimiento microbiano
La mnima concentracin de sustrato que se puede lograr en un sistema aumenta con b

Representacin genmica: qu son,

que hacen, de donde vienen?

Nelson, K.E., et al., 2002. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida
KT2440. Environ. Microbiol. 4:799808.

Conclusiones extradas de los

genomas bacterianos
1. Correspondencia entre el tamao del genoma y nmero de
ORF
2. Cepas de la misma especie pueden tener variado genotipos
y fenotipos

3. Diversidad en el tamao

Nelson, K.E., et al., 2002. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida
KT2440. Environ. Microbiol. 4:799808.

Cuanto conocemos de la
biologa de procariotas?

Almacenamiento Procesos Metabolismo Funciones no

y procesamiento celulares
caracterizadas
de informacin

Es importante el cultivo?

Importancia en biotecnologa

Optimizacin de compuestos bioactivos

a lo largo de la evolucin
interaccin de
presiones selectivas

habitat

Microorganismos

evolucin

tiempo
3.8109
aos

Bacterias

Arqueas

Diversida
d
fisiolgica

Eucariote
s

Importancia del cultivo en laboratorio

Bioprospeccin
Metagenmica

Pre-genmica

Secuencia
del genoma

Fisiologa
en cultivo

Post-genmica

Elementos mayoritarios en
clulas microbianas
Elemento

Funcin

Constituyentes principales de las

clulas en las macromolculas y

otras molculas orgnicas

N
S

Protenas, coenzimas

Acidos nucleicos, fosfolpidos, cido tecoico, coenzimas

Principal catin inorgnico, cofactor enzimtico

Mg

Cofactor enzimtico, unido a pared celular, membrana y

steres de fosfato, includo cidos nucleicos y ATP

Ca

Cofactor enzimtico, unido a pared celular

Fe

Citocromos, ferredoxina, protena Fe-S, cofactor enzimtico

Na

Transporte y transduccin de energa

Cl

Principal anin inorgnico

Elementos minoritarios:
cofactores
Elemento

Funcin

Mn2+

Superxido dismutasa, fotosistema II

Co2+

Coenzima B12

Ni2+

Hidrogenasa, ureasa

Cu2-

Citocromo oxidasa, oxigenasa

Zn2+

Alcohol deshidrogensa, aldolasa, fosfatasa alcalina,

RNA y DNA polimerasa, arsenato reductasa

SeO32-

Formato deshidrogenasa, glicina reductasa

MoO42-

Nitrogenasa, nitrato reductasa, formato

deshidrogenasa, arsenato reductasa

WO42-

Formato deshidrogenasa, aldehdo oxidoreductasa

Factores de crecimiento

aminocidos

vitaminas
purinas y pirimidinas

Temperatura

Temperatura
Ecuacin de Arrhenius

Coeficiente de temperatura Q10

Relacin de las velocidades de reaccin a 2 temperaturas
T2 y T1, con T2 =T1 +10

Oxgeno
Aerobios

Facultativos

Catalasa
Superoxido dismutasa

Anaerobios

Anaerobios
aerotolerantes

SOD

Microaerfilos

Una clasificacin ecolgica de

bacterias
oligotrofos

Acidobacteria

Betaproteobacteria
copiotrofos
Bacteroidetes

El concepto de estrategas r y K

Tamao de poblaciones (N)

Estrategias de vida: 2 extremos de un

continuo
Crecimiento
exponencial

Crecimiento
logstico

K
Nmero de generaciones

Triada de supervivencia

Panikov, N.S. Microbial Ecology en Environmental Biotechnology (2010) Wang, L.K., Ivanov, V., Tay, J.H. Hung,Y.T. eds. Humana Press

Respuesta a condiciones ambientales

Enriquecimiento selectivo como mecanismo

de adaptacin en biotecnologa ambiental

Alta afinidad por sustrato limitante

Alta tasa de crecimiento

Los microorganismos no cultivables

The great plate count anomaly

Staley, J. T., and A. Konopka. 1985. Measurements of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and
terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39:321-346.

Los microorganismos no cultivables

The great plate count anomaly

Achtman M, Wagner M (2008) Microbial diversity and the genetic nature of microbial species. Nat Rev Microbiol 6:31440

Por qu los microorganismos se

resisten a crecer en cultivo?
(i) El cultivo en el laboratorio destruye interacciones presentes
en ambientes naturales
(ii) Incapacidad de crecer sobre sustratos del medio de cultivo
(iii) Infecciones por fagos
(iv) La alta concentracin de sustrato necesaria para obtener
crecimiento detectable en el laboratorio puede ser txica
(v) Las prcticas de laboratorio suelen ignorar los primeros
ciclos de crecimiento en medio lquido que aparentemente no
muestran crecimiento, debido a la falta de buenos mtodos
de deteccin de densidad celular y falta de paciencia

El crecimiento microbiano puede determinarse

sin el uso de tcnicas moleculares

Zengler, K. Central Role of the Cell in Microbial Ecology (2009) Microbiol Mol Biol Rev, 73: 826-834

Efecto del medio de cultivo y del

tiempo de incubacin
Gellan como agente solidificante:

Davis et al., Effects of Growth Medium, Inoculum Size, and Incubation Time on Culturability and Isolation of Soil Bacteria (2005)
Appl Environ Microbiol, 71, 826834

Uso de aceptor de electrones

alternativos

Costa del Mar de Norte

Alta eficiencia de cultivo: 23% del nmero total de clulas
en los 2 m superficiales
Kopke et al., Microbial Diversity in Coastal Subsurface Sediments: a Cultivation Approach Using Various Electron Acceptors and
Substrate Gradients (2005) Appl Environ Microbiol, 71, 7819-7830

Uso de aceptor de electrones

alternativos: reductores de sulfato

Widdel et al., Anaerobic degradation of hydrocarbons with sulphate as electron acceptor (2007) en Sulphate Reducing Bacteria,
Barton & Hamilton, eds. Cambridge

Uso de aceptor de electrones

alternativos: sedimentos anxicos

Zengler et al., Methane formation from long-chain alkanes by anaerobic microorganisms (1999) Nature, 401, 266

Uso de compuestos que median

comunicacin entre bacterias
OHHL: N-(oxohexanoyl)-dlhomoserine lactone

Monmero/xico

Polmero/xico

BHL: N-(butyryl)-dl-homoserine
lactone
cAMP: AMP cclico

Monmero/anxico

Polmero/anxico

Bruns et al., 2002

Ver tambin Bruns et al., Effect of Signal Compounds and Incubation Conditions on the Culturability of Freshwater Bacterioplankton
(2003) Appl Environ Microbiol, 69, 19801989

Cultivo y deteccin de
microorganismos
Mnima cantidad de nutrientes
Incubaciones largas (30d)
Proteccin de perxidos
cidos hmicos
QS (AHL)
aerbico
1-2% O2
anxico
5% CO2

Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70,
4748-4755

Cultivo y deteccin de
microorganismos

Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70,
4748-4755

Cultivo y deteccin de
microorganismos

Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70,
4748-4755

Cultivo de microorganismos en
microgotas encapsuladas en gel
+
Dilucin de clulas

agarosa (40C).

2,200
rpm

suspensin aceite-bacteria en hielo con a 1,100 rpm

107 microgotas de gel (GMDs)

10% ocupadas por una nica clula encapsulada
Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686

Cultivo de microorganismos en
microgotas encapsuladas en gel

Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686

Separacin celular por citometra

de flujo

Cultivo de microorganismos en
microgotas encapsuladas en gel

Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686

Cultivo de microorganismos GMDs

problemas y soluciones

Alain, K., Querellou, J. (2009) Cultivating the uncultured: limits, advances and future challenges. Extremophiles, 13, 583594

Cultivo de microorganismos marinos

en cmaras de difusin
membrana

sedimento

aga
r
La mayora es invisible a simple vista
La mayora no crece luego de 2-3 pasajes
Kaeberlein et al., Isolating Uncultivable Microorganisms in Pure Culture in a Simulated Natural Environment (2002) Science, 70,
1127-1129

Cultivo de microorganismos marinos

en cmaras de difusin

Los mtiples pasajes en cmaras de difusin permiten la adaptacin al cultivo in vitro

Bollmann et al. Incubation of Environmental Samples in a Diffusion Chamber Increases the Diversity of Recovered Isolates (2007)
Appl Environ Microbiol, 73, 63866390

Cmaras de difusin en formato

masivo: Ichip

Nichols et al. Use of Ichip for High-Throughput In Situ Cultivation of Uncultivable Microbial Species (2010) Appl Environ Microbiol,
76, 24452450

Otros mtodos
con membranas

Ferrari et al Cultivating previously uncultured soil bacteria using a soil substrate membrane system (2008) Nature Protocols 3,
1261-1264

Microplaca de Petri: un milln de

cmaras de cultivo

xido de
aluminio poroso
7 x 7m

Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of
microorganisms. PNAS 104, 1821718222

Microplaca de Petri: un milln de

cmaras de cultivo

chip de 8x36 mm
recubierto en Pt
180.000 cmaras
20m x 20m

Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of
microorganisms. PNAS 104, 1821718222

Los chips pueden ser utilizados para

recuento de UFC
Imagen de microscopio invertido mostrando el
crecimiento de L plantarum (crculos claros) en
cmaras de 20 x 20 m

Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of
microorganisms. PNAS 104, 1821718222

Screening de 200.000 aislamientos

basados en el metabolismo de un
organofosforado
1. Incubacin 6 das
2. Recuento: 200.000 c
3. Screening

fluorescein 3,6-diphosphate

fluoresceina

4. Identificacin
Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of
microorganisms. PNAS 104, 1821718222

Ley de Moore de duplicacin del nmero

de transistores en un circuito integrado

Duplica cada 18 meses

Ley de Moore

Procesador Intel

Ley de Moore para la miniaturizacin de

cultivos microbianos
Se aplica al volumen de cultivo pero no
al nmero de aislamientos obtenidos!

Gefen & Balaban (2010) The Moores Law of microbiology towards bacterial culture miniaturization with the micro-Petri chip.
Trends in Biotechnology 26 , 345-347

Cultivo de no cultivables: resumen

de estrategias

Alain, Querellou (2009) Cultivating the uncultured: limits, advances and future challenges. Extremophiles 13:583

Cultivo de no cultivables:
estrategias futuras
Descubrimiento de autoinductores en anlisis metagenmicos
LuxR: activador de transcripin

METREX: metabolite-regulated expression

Williamson et al. (2005) Intracellular Screen to Identify Metagenomic Clones that Induce or Inhibit a Quorum-Sensing Biosensor Appl
Environ Microbiol 71: 6335-6344

Bibliografa adicional
McMahon, K.D., Garcia Martin, K.D., Hugenholtz, P. (2007) Integrating
ecology into biotechnology. Current Opinion in Biotechnology, 18: 287292
Rittmann, B.E. et al. (2006) A Vista for Microbial Ecology and Environmental
Biotechnology. Environmental Science and Technology, 40, 10961103