Los daos causados por micro-organismos e insectos son extremadamente costosos para
la
humanidad. En Estados Unidos se ha estimado prdidas causadas por enfermedades
microbiales por un valor de US$ 9.1 billones por cada ao, mientras que US$ 7.7
billones
de prdida es causada por insectos. Por otro lado en muchos cultivos de pases
desarrollados, las prdidas por enfermedades y plagas representan aproximadamente el
20% en pre-cosecha. Estas prdidas en pases en desarrollo son frecuentemente cercanas
a
30-45 %. Las prdidas por sanidad pueden ser ms que la capacidad financiera; en
ciertas
ocasiones y lugares, ellas llevan la amenaza de hambre crnico y hambruna. Frente a
estos
desafios, la gente por muchos siglos practic mejoramiento gentico de plantas y
mejoramiento agronmico con la finalidad de reducir prdidas por enfermedades y
plagas.
La biologia molecular es una herramienta poderosa, que puede acelerar la obtencin de
nuevos genotipos ms resistentes, con mayor calidad alimenticia y con altos
rendimientos.
Consecuentemente, ayudar en la reduccin de plagas y enfermedades de cultivos,
convirtiendo a la agricultura ms productiva y eficiente.
4.1. Fitomejoramiento y marcadores
El fitomejoramiento tradicional involucra el cruzamiento repetido de grandes nmeros
de plantas con caractersticas deseables (rendimiento, resistencia a enfermedades y
plagas, tolerancia a sequa, etc.), confiando que tales caractersticas puedan ser
combinadas de manera estable en un solo germoplasma. Emplea rasgos o marcadores
fenotpicos, morfolgicos o fenolgicos para efectuar la seleccin de individuos, lneas
o cultivares. Sin embargo, no existe con frecuencia una relacin clara entre el genotipo
y el fenotipo. Tal desventaja puede eludirse mediante el uso de marcadores bioqumicos
y moleculares; puesto que poseen un control gentico mendeliano, permiten evaluar la
variacin gentica (en funcin de la mutacin, la seleccin o la deriva gentica), y
representan una muestra de la variacin a nivel del DNA, con lo que se obvia el efecto
ambiental.
4.2. Clases de marcadores existentes
Un marcador es considerado como un carcter cuyo patrn de herencia puede definirse
en un nivel morfolgico o fenotpico, bioqumico o molecular. Se le utiliza para
obtener, aunque de manera indirecta, informacin con respecto de las bases genticas
de los caracteres o rasgos de inters en el organismo sujeto a estudio. Strictu sensu, se
asocian marcadores con caracteres.
Las investigaciones iniciales de la herencia de caracteres se condujeron en funcin de
caracteres morfolgicos, los cuales son profundamente afectados por fluctuaciones
ambientales y por las etapas de desarrollo de la planta. En general existe variacin en
los caracteres morfolgicos lo que obliga a analizar un vasto nmero de individuos.
As, surgi la idea de utilizar marcadores genticos para esclarecer la relacin entre un
locus gentico y un carcter determinado.
Los primeros sistemas de marcadores (no fenotpicos) disponibles en plantas fueron
aquellos desarrollados a partir de la electroforesis de polipptidos: isoenzimas o
aloenzimas, y protenas de reserva de semilla.
Marcadores morfolgicos y cariolgicos
Fundamento terico
La reaccin en cadena de la polimerasa es una reaccin cclica dirigida
enzimticamente que permite la amplificacin in vitro de una regin del cido
desoxirribonuclico (DNA), localizada entre dos regiones de secuencia conocida.
Utiliza dos oligonucletidos que funcionan como "iniciadores", que se hibridan a las
cadenas opuestas de DNA de secuencia complementaria, flanqueando a la secuencia de
inters. Los iniciadores, toman diferentes denominaciones, tales como
oligonucletidos,
cebadores, primadores, amplmeros, detonadores o primers. Los iniciadores son
molculas de DNA de cadena individual y longitud corta (10-30 nucletidos), se
hibridan complementariamente a las partes terminales o flancos de una secuencia
especfica de la cadena sencilla del DNA patrn, se efecta la amplificacin (extensin)
por la DNA polimerasa, la enzima que cataliza la sntesis de cadenas largas de
polinucletidos. La sntesis se dirige incorporando monmeros de trifosfato de
desoxinuclesido al grupo libre 3'-hidroxilo del iniciador en direccin 5'>3', la
polimerizacin se efecta siempre del -fosfato 5' del trifosfato de desoxinuclesido
al grupo hidroxilo terminal 3' de la cadena creciente de DNA. Esto resulta en la
sntesis de nuevas cadenas de DNA complementarias a las cadenas patrn iniciales
(Figura 4.5).
En cada ciclo de amplificacin, las cadenas de DNA sintetizadas se convierten en un
patrn (o substrato) para cualquier nuevo ciclo; idealmente, la secuencia de DNA
"objetivo" o DNA blanco se amplificar de manera selectiva ciclo tras ciclo.
Tericamente, los productos de amplificacin (amplicones) del primer ciclo seran
el resultado de la sntesis de DNA del patrn original, de longitud indefinida. La
polimerasa del DNA sintetizara nuevas molculas (a partir de tales moldes o
patrones) hasta que fuese interrumpida por el inicio del siguiente ciclo. A partir del
tercer ciclo, los productos de amplificacin poseeran una longitud definida, pues
nicamente se sintetizan los fragmentos de la secuencia "objetivo", cuya longitud
correspondiera a las posiciones de alineamiento (anillamiento, ensamblaje) de los
iniciadores con el patrn original. En lo consecutivo, la secuencia "objetivo" se
amplificar exponencialmente. Concretamente la amplificacin entendida como el
nmero final de copias de la secuencia "objetivo", se expresa por la frmula:
(2n -2n) x x (2n)
Donde:
n = nmero de ciclos
2n = primer producto obtenido despus del ciclo 1, y productos
obtenidos despus del ciclo 2
2n = productos amplificados que contienen la secuencia objetivo y
salientes en los extremos (no corresponden exactamente a la region
objetivo)
x = nmero de copias del patrn original.
Parmetros de la PCR
La PCR es un evento bioqumico relativamente complicado, donde las cambiantes
interacciones cinticas entre los componentes determina la calidad de los productos a
obtener.17 A pesar de ser extremadamente eficaz, la amplificacin exponencial de los
amplicones no es un proceso infinito. Un gran nmero de factores actan en contra del
proceso, siendo pronunciado su efecto en ciclos posteriores de la PCR.
Ciclos trmicos
Los parmetros de los ciclos de temperatura son considerablemente importantes para
una PCR ptima. Los pasos ms importantes en los perfiles del tiempo y temperatura a
considerar, son:
Etapas del ciclo de amplificacin
Un proceso tpico de PCR, requiere de un nmero de ciclos para amplificar una
secuencia
AT12
AT9
DNA individuo 1
DNA individuo 2
Regin
Conservada
Iniciador 2
Regin
conservada
Iniciador 1
PCR
Electroforesis
Alelo a1
Alelo a2
268
Marcadores SCAR (Sequence Characterized Amplified Region- Caracterizacin de
producto de amplificacin)
Fragmento de DNA genmica amplificada por PCR con los iniciadores especficos (1420
bases). Estos iniciadores son definidos gracias al conocimiento de la secuencia de un
fragmento RFLP, RAPD, AFLP de inters particular, el que es aislado de un gel,
clonado y
secuenciado. Luego por un PCR simple, usando dos iniciadores elaborados segn la
secuenciacion para ambos extremos, se genera banda simple, de fcil lectura y
especfico.
Estos marcadores especficos son cada vez ms utilizados, entre otros, en los programas
de
mejoramiento gentico de plantas e identificacin de sexo en las plantas, ya que
permiten
discriminar fcilmente, especialmente si estn muy ligado al gen o son parte del gen
(Figura 4.13).
Figura 4.13. Generacin de marcadores tipo SCAR. P1 es el iniciador usado para la
tcnica RAPD, P2 y P3 son iniciadores diseados luego del
secuenciamiento del fragmento para la tcnica SCAR.
PCR
Clonar la banda
polimrfica en un
vector
Secuenciar el fragmento y
disear nuevos cebadores
para amplificar nicamente
la banda de inters.
Despus de la PCR con los nuevos
iniciadores, el resultado es un patrn
de bandas ms fcil de interpretar.
123
Banda Polimrfica
Gel de
RAPD
Bandas
Polimrficas
123
SCAR
RAPD p1 p1
P2 P3
PCR
PCR
269
Marcadores CAPS (Cleaved Amplified Polimorphic Squense - Digestin de
producto
de amplificacin)
Un fragmento de DNA genmico amplificado (STS o SCAR) es digerido por las
enzimas
de restriccin, luego el polimorfismo del tamao de los fragmentos generados es
revelado
12341234
Perfil luego de la digestin (polimrfico)
270
El desarrollo de los marcadores de tipo SNP se basa en la secuenciacin extensiva del
genoma, por lo que su utilizacin a gran escala est por ahora restringida a iniciativas de
la
envargadura del proyecto de genomas. Adems de la secuenciacin, otros mtodos de
deteccin de SNPs incluyen otras tcnicas, como la PCR alelo-especfica y los SSCP
(Single strand Conformation profile) entre otras. Cabe destacar que muchos de los
polimorfismos detectados por otros tipos de marcadores, tienen su orgen en SNPs. En
271
Anlisis de la arquitectura de caractersticas cuantitativas (nmero, posicin, accin
gentica, magnitud de efecto e interacciones de QTLs).
Deteccin de loci homlogos en otras especies o generos a travs de mapas
comparativos (Comparative o Synteny mapping).
Introgresin de caractersticas por retrocuzamiento asistido por marcadores.
seleccin y recombinacin dirigida de genotipos superiores.
seleccin durante el desarrollo de lineas endgamas.
Prediccin de fenotipos esperados.
evaluacin. Por eso, hacer seleccin asistida con marcadores moleculares para
fragmentos
relacionados con QTL, tiene un gran impacto. Adems de eso, tambin se puede hacer
el
mapeo de caractersticas heredadas que sean cualitativas. En esos casos, la tcnica de
SCAR es muy til para hacer seleccin asistida. La seleccin asistida fue sealada como
una tcnica que disminuye el costo de un programa de mejoramiento. La seleccin
asistida
puede tambin ser utilizada para reconocimiento de individuos en una progenie que
contiene un gen introducido por transformacin gentica de plantas.
Los marcadores moleculares ya permitieron el clonaje de un gran nmero de genes
(Mapbased
cloning). As, la tcnica de los marcadores moleculares puede tambin relacionarse
con las del DNA recombinante y transformacin gentica de plantas.
Es conveniente indicar que el estudio utilizando marcadores moleculares en programas
de
mejoramiento con objetivo de anlisis de diversidad gentica, mapeo de caractersticas
cualitativas o cuantitativas o an mapeo gentico, necesita no slo conocimiento tcnico
de
esas metodologas, sino tambin conocimientos para anlisis estadsticos en las
progenies
utilizando mtodos biomtricos de evaluacin.
Actualmente, en el rea de la genmica, los estudios de secuenciacin conducen al
conocimiento de diversas secuencias gnicas nuevas. La caracterizacin de nuevos
genes,
asociados a alguna caracterstica de inters, puede ser una herramienta muy poderosa
para
dar soporte a los programas de mejoramiento y estn asociadas al anlisis con
marcadores
moleculares. Por medio del conocimiento de sus secuencias, se pueden hacer diseos
con
iniciadores especficos y as hacer amplificacin especfica de los genes ms
importantes
que se quieren fijar en una poblacin y analizar su segregacin en sta. An ms. Se
puede
estudiar su presencia gentica (homocigosis o heterocigosis). El mapeo gentico de
organismos utilizando los marcadores moleculares tambin da soporte a los trabajos de
secuenciacin completa de genomas.
Seleccin asistida por marcadores moleculares (MAS)
Los trabajos de ligamiento se realizan con la finalidad de encontrar marcadores
asociados a
ciertos genes de inters, como resistencia a una enfermedad, rendimiento, entre otros.
Para ello se identifican padres muy diferentes para ese gen, por ejemplo uno debe ser
susceptible y el otro resistente. Estos se hibridan y se genera la F1. Luego se hace
generalmente la F2 (por autofecundacin) para observar la segregacin. Este material
(poblacin segregante y junto con los padres) debe ser evaluado con cualquiera de las
tcnicas moleculares, como por ejemplo AFLP, y a la vez se debe evaluar este material
para su respuesta genotpica. Esta comparacin nos lleva a la asociacin de ciertos
fragmentos de DNA (conocidos como marcadores), ya que solo estarn en un parental,
por