Serrano Aguilar Ilian Haide

Bioqumica General

Semestre 2016-2

PURIFICACIN Y SECUENCIACIN DE PROTENAS

La protemica es una tecnologa que se desarrolla en la actualidad para investigar el proteoma, la produccin
funcional del genoma. El genoma nos da una lista de los productos genticos que podran estar presentes, pero
solamente una parte de estos productos genticos se expresar realmente en un contexto biolgico
determinado. El proteoma nos dice lo que est presente funcionalmente, por ejemplo, qu protenas
interaccionan para formar una va transductora de seal o un canal inico en una membrana. El proteoma es
mucho mayor que el genoma debido a que casi todos los productos genticos son protenas que se pueden
modificar de mltiples formas. Adems, estas protenas no existen aisladas: a menudo, interaccionan entre ella
para formar complejos con propiedades funcionales especficos. A parte de proporcionar oportunidades para
resolver problemas biolgicos bsicos (p. ej., determinar los mecanismos precisos por medio de los cuales se
producen procesos celulares como el transporte neuronal o el corte y empalme del mRNA), la protemica tiene
aplicaciones evidentes en la investigacin biomdica. Entre las ltimas investigaciones se encuentran las causas
y el diagnstico de enfermedades genticas e infecciosas y las que se enfocan en el descubrimiento de
frmacos. A diferencia del genoma, el proteoma no es esttico. El conocimiento del proteoma se obtiene
investigando, caracterizando y catalogando las protenas. En algunos, pero no en todos los casos, el proceso
comienza separando una protena determinada del resto de las biomolculas de la clula.
Una finalidad primordial de la bioqumica es el determinar cmo las secuencias de aminocidos especifican la
conformacin y, por tanto, la funcin de las protenas. Otras metas son el saber cmo las protenas individuales
se unen a sustratos especficos y a otras molculas, cmo median en la catlisis y transducen energa e
informacin. Habitualmente, el primer paso en estos estudios es la purificacin de la protena que nos interesa.
Las protenas se pueden separar en base a su solubilidad, tamao, carga y capacidad de unin. Una vez que
se ha purificado la protena, se puede determinar su secuencia de aminocidos.

La cromatografa que se dise originalmente para separar sustancias de peso molecular bajo, como los
azcares y los aminocidos, se ha convertido en una herramienta inestimable en la purificacin de protenas.
Existe una extensa variedad de tcnicas cromatogrficas, que pueden utilizarse para separar mezclas de
protenas segn propiedades moleculares como el tamao, la forma y el peso, o determinadas afinidades de
unin. Con frecuencia para obtener, de manera indiscutible, una protena pura deben emplearse varias
tcnicas de forma secuencial. En todos los mtodos cromatogrficos, la mezcla protenica se disuelve en un
lquido conocido como fase mvil. Al pasar las protenas a travs de la fase estacionaria (una matriz slida), se
separan unas de otras debido a su distribucin diferente entre las dos fases. El movimiento relativo de cada
molcula es consecuencia de su capacidad para permanecer asociada con la fase estacionaria mientras
contina fluyendo la fase mvil. Los tres mtodos cromatogrficos que se emplean de forma habitual en la
purificacin de protenas son:
Cromatografa por filtracin en gel Es una forma de cromatografa por exclusin de tamaos en la cual una
columna empaquetada con un polmero gelatinoso separa a las molculas segn su tamao y su forma. Las
molculas que son ms pequeas que los poros del gel difunden dentro y fuera de los poros, de forma que se
retrasa su movimiento por la columna. Las molculas que son mayores que los poros del gel quedan excluidas
y por lo tanto eluyen primero cuando la solucin amortiguadora fluye por la columna.

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Cromatografa de intercambio inico Separa la protenas segn su carga. Las resinas de intercambio aninico
que estn formadas por materiales con carga positiva, se unen forma reversible con los grupos con carga
negativa de una protena. De igual forma, las resinas de intercambio catinico se unen a los grupos con carga
positiva. Tras eliminar las protenas que no se han unido a la resina, se recupera la protena de inters por medio
de un cambio adecuado del pH del solvente y/o de la concentracin salina.
Cromatografa de afinidad Utiliza las singulares propiedades biolgicas de cada protena; es decir, utiliza la
afinidad de unin no covalente especial entre la protena y un ligando. ste est unido de forma covalente a
una matriz insoluble, que se coloca en una columna. Tras pasar a travs de la columna las molculas de protena
que no se unen, la protena de inters se separa alterando las condiciones que afectan a la unin.
La tcnica conocida como cromatografa lquida de alta eficiencia (HPLC, de high performance liquid
chromatography), es una versin mejorada de las tcnicas de columna. Los materiales propios de las columnas
estn mucho ms finamente divididos y, como consecuencia, hay ms centros de interaccin y, por lo tan,
mayor poder de resolucin. Dado que la columna se construye de material ms fino, se debe aplicar presin
para obtener las velocidades de flujo adecuadas.
Por electroforesis entendemos el recorrido de partculas cargadas en un campo elctrico. Las protenas se
mueven proporcionalmente a su cociente carga/masa y mediante una friccin, que depende de su tamao y
forma, se frenan en una matriz de gel. En la electroforesis nativa en gel, las disoluciones proteicas deben
aplicarse, por tanto, en el centro del lecho del gel, pues las protenas cidas corrern hacia el nodo, mientras
que las protenas bsicas se movern hacia el ctodo. El logro en la separacin de la electroforesis nativa en
gel no es muy alto y funciona slo con protenas solubles en agua. Se obtiene una separacin mucho mejor
usando dodecilsulfato de sodio (SDS, de sodium dodecyl sulfate), en la SDS-PAGE desnaturalizante (de
polyacrylamide gel electrophoresis). El SDS es un detergente aninico que se une con gran afinidad a las
protenas. A l hacerlo, se destruye el plegamiento proteico y las protenas se desnaturalizan. Las numerosas
cargas negativas que se introducen con el gran nmero de molculas de SDS unidas cubren la carga
relativamente baja propia de las protenas. Esto hace acelerar tanto las protenas grandes como las pequeas,
que se mueven con igual fuerza en el campo elctrico en direccin al nodo. Es entonces cuando la matriz del
gel que frena con ms fuerza a las protenas grandes que a las pequeas, permite separar a las protenas en
funcin de su masa. Un proceso de separacin de alto rendimiento es la electroforesis bidimensonal. En una
primera direccin, las protenas se separan por isoelectroenfoque (separacin de protenas sometidas a un
campo elctrico en un gel que contiene un gradiente de pH). A continuacin, stas se resuelven en una
segunda direccin, perpendicular a la primera, sobre la base de su masa molecular. Este procedimiento
bidimensional permite separar en un nico gel miles de protenas, que pueden ser detectadas con reactivos de
coloracin, por fluorescencia o radiomarcaje y, posteriormente, cuantificadas.

La espectrometra de masas (MS, mass spectroscopy) es una tcnica que determina la masa de una molcula.
El tipo ms sencillo de espectrofotmetro de masas mide el tiempo que tarda una molcula cargada, en fase
gaseosa, para trasladarse desde su punto de inyeccin hasta un detector sensible. Ese tiempo depende de la
carga de una molcula y de su masa, y el resultado se maneja como relacin de masa/carga. Se ha usado la
tcnica en qumica, durante casi cien aos, pero su aplicacin a las protenas era limitada porque slo en fecha
reciente fue posible dispersar molculas cargadas de protena en una corriente de partculas gaseosas.

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El problema fue resuelto a finales de la dcada de 1980, con el desarrollo de dos tipos de espectrmetros de
masas. En la espectrometra de masas por electropresin, lo solucin de protena se bombea a travs de una
aguja metlica, a alto voltaje, para crear diminutas gotitas. El lquido se evapora con rapidez a vaco y las
protenas cargadas se enfocan hacia un detector mediante un campo magntico. La segunda de las nuevas
tcnicas se llama ionizacin por desorcin asistida por matriz (MALDI, matriz assisted desorption ionization). En
este mtodo la protena se mezcla con una matriz qumica y la mezcla se precipita en un sustrato metlico. La
matriz es una molcula orgnica pequea que absorbe luz a determinada longitud de onda. Un impulso de
lser con la longitud de onda de absorcin imparte energa a las molculas de protena, a travs de la matriz.
En un instante las protenas se liberan del sustrato y se dirigen hacia el detector. Cuando se mide el tiempo de
vuelo (TOF, time of flight), la tcnica se llama MALDI-TOF.
Pehr Edman desarroll, en 1950, una tcnica que permite extraer e identificar uno por uno los residuos del Nterminal de una protena. El procedimiento de degradacin de Edman consiste en tratar una protena a pH 9.0
con fenilisotiocianato (reactivo de Edman). El PITC (phenyl isothiocyanate) reacciona con el N-terminal libre de
la cadena para formar un derivado de feniltiocarbamolo, o PTC-pptido. Cuando este derivado se trata con
un cido anhidro, como cido trifluoroactico, el enlace peptdico del residuo N-terminal se rompe en forma
selectiva y libera un derivado de anilinotiazolinona de residuo. Este derivado se puede extraer con un solvente
orgnico como el cloruro de butilo y deja el pptido remanente en la fase acuosa. El derivado inestable de
anilinotiazolinona se trata entonces con cido acuoso que lo convierte en un derivado estable de
feniltiohidantona del aminocido que constitua el residuo N-terminal (PTH-aminocido). La cadena peptdica
en fase acuosa, ahora un residuo ms corto, se puede ajustar regresando a pH 9.0 y tratndolo de nuevo con
PITC. Todo el procedimiento se puede repetir en serie, usando un instrumento automtico llamado
secuenciador. Cada ciclo produce un PTH-aminocido que se puede identificar cromatogrficamente, por lo
general mediante HPLC. Cuando una protena contiene uno o ms residuos de cistina se deben romper los
puentes disulfuro para permitir la liberacin de los residuos de cistena como PTH-aminocidos, durante los ciclos
adecuados de la degradacin de Edman. El rendimiento de este procedimiento bajo condiciones
cuidadosamente controladas se acerca al 100%, y unos pocos picomoles de la protena pueden producir
secuencias de 30 residuos o ms antes de que la concentracin creciente de muestra no recuperada en los
ciclos anteriores del procedimiento haga confusa la medicin.

Bibliografa
[1] McKee, Trudy; McKee, James R. Bioqumica: Las Bases Moleculares de la Vida. 5 edicin. McGraw Hill. China. pp. 158
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[3] Peret, Juli. Fundamentos de Bioqumica. Universitat de Valncia. Espaa. 2007. pp. 92 95.
[4] Mller-Esterl, Werner. Bioqumica: Fundamentos para Medicina y Ciencias de la Vida. Revert. Espaa. 2008. pp. 108 y 111.
[5] Berg, Jeremy M.; Tymoczko, John L.; Stryer, Lubert. Bioqumica. 6 edicin. Revert. Espaa. 2008. p. 65 y 66.