Anda di halaman 1dari 3

Ketika pengaturan reaksi amplifikasi dilakukan pada suhu kamar, primer dapat

mengikat nonspesifik satu sama lain, membentuk primer-dimer. Selama siklus


amplifikasi, primer-dimer dapat diperpanjang untuk menghasilkan produk spesifik,
yang mengurangi hasil produk tertentu. Untuk aplikasi PCR yang lebih menantang,
penggunaan hot-start PCR sangat penting untuk hasil tertentu sukses. Untuk
menghasilkan panas-start polimerase DNA, aktivitas polimerase Taq DNA dapat
dihambat pada suhu yang lebih rendah dengan antibodi atau, lebih efektif, dengan
pengubah kimia yang membentuk ikatan kovalen dengan asam amino di
polimerase. Modifikasi kimia mengarah untuk menyelesaikan inaktivasi polimerase
sampai ikatan kovalen yang rusak selama awal langkah aktivasi panas. Sebaliknya,
dalam prosedur hot-start antibodi-mediated, antibodi berikatan dengan polymerase
oleh pasukan non-kovalen yang relatif lemah, yang meninggalkan beberapa molekul
polimerase dalam keadaan aktif mereka. Hal ini terkadang menyebabkan produk
ekstensi primer spesifik yang dapat lebih diperkuat selama PCR. Produk ini muncul
sebagai bedak atau salah fragmen berukuran ketika dijalankan pada gel agarosa

When amplification reaction setup is performed at room temperature, primers can


bind nonspecifically to each other, forming primerdimers. During amplification
cycles, primerdimers can be extended to produce nonspecific products, which
reduces specific product yield. For more challenging PCR applications, the use of
hot-start PCR is crucial for successful specific results. To produce hot-start DNA
polymerases, Taq DNA polymerase activity can be inhibited at lower temperatures
with antibodies or, more effectively, with chemical modifiers that form covalent
bonds with amino acids in the polymerase. The chemical modification leads to
complete inactivation of the polymerase until the covalent bonds are broken during
the initial heat activation step. In contrast, in antibody-mediated hot-start
procedures, antibodies bind to the polymerase by relatively weak non-covalent
forces, which leaves some polymerase molecules in their active state. This
sometimes leads to nonspecific primer extension products that can be further
amplified during PCR. These products appear as smearing or incorrectly sized
fragments when run on an agarose gel.
High-fidelity DNA polymerase

Unlike standard DNA polymerases (such as Taq DNA polymerase), high-fidelity PCR
enzymes generally provide a 3' to 5' exonuclease activity for removing incorrectly
incorporated bases. High-fidelity PCR enzymes are ideally suited to applications
requiring a low error rate, such as cloning, sequencing, and site-directed
mutagenesis. However, if the enzyme is not provided in a hot-start version, the 3' to
5' exonuclease activity can degrade primers during PCR setup and the early stages
of PCR. Nonspecific priming caused by shortened primers can result in smearing on

a gel or amplification failure especially when using low amounts of template. It


should be noted that the proofreading function often causes high-fidelity enzymes
to work more slowly than other DNA polymerases. In addition, the A-addition
function required for direct UA- or TA-cloning is strongly reduced, resulting in the
need for blunt-end cloning with lower ligation and transformation efficiency.
PCR cycling
In theory, each PCR cycle doubles the amount of amplicon in the reaction.
Therefore, 10 cycles multiply the amplicon by a factor of ~1000 and so on.

Each PCR cycle consists of template denaturation, primer annealing and primer
extension. If the temperatures for annealing and extension are similar, these two
processes can be combined. Each stage of the cycle must be optimized in terms of
time and temperature for each template and primer pair combination.

Tinggi kesetiaan DNA polymerase

Tidak seperti DNA polimerase standar (seperti Taq DNA polymerase), enzim PCRkesetiaan yang tinggi umumnya memberikan aktivitas 3 'ke 5' exonuclease untuk
menghapus basis tidak benar dimasukkan. enzim PCR tinggi kesetiaan ideal untuk
aplikasi yang memerlukan tingkat kesalahan rendah, seperti kloning, sekuensing,
dan mutagenesis situs-diarahkan. Namun, jika enzim tidak disediakan dalam versi
hot-start, aktivitas 3 'ke 5' exonuclease dapat menurunkan primer selama setup
PCR dan tahap awal PCR. priming nonspesifik yang disebabkan oleh primer
dipersingkat dapat mengakibatkan mengolesi pada kegagalan gel atau amplifikasi terutama ketika menggunakan jumlah rendah template. Perlu dicatat bahwa fungsi
proofreading sering menyebabkan enzim tinggi kesetiaan untuk bekerja lebih
lambat dari DNA polimerase lainnya. Selain itu, fungsi A-Selain diperlukan untuk UAlangsung atau TA-kloning sangat berkurang, sehingga kebutuhan untuk tumpul-end
kloning dengan ligasi lebih rendah dan efisiensi transformasi.
PCR bersepeda
Dalam teori, setiap siklus PCR menggandakan jumlah amplikon dalam reaksi. Oleh
karena itu, 10 siklus kalikan amplikon dengan faktor ~ 1000 dan seterusnya.

Setiap siklus PCR terdiri template denaturasi, annealing primer dan ekstensi primer.
Jika suhu untuk anil dan ekstensi mirip, kedua proses ini dapat dikombinasikan.
Setiap tahap siklus harus dioptimalkan dalam hal waktu dan suhu untuk setiap
template dan kombinasi pasangan primer.