R. Peaiiel, F. Monserrat,
F. Solano y J. A. Lozano
INTRODUCCIN
Durante los ltimos quince aos los autoanalizadores de aminocidos
han jugado un gran papel en el campo de la deteccin de las enfermedades
denominadas errores congnitos del metabolismo de aminocidos, tales
como fenilcetonuria, enfermedad del jarabe de arce, etc. Ello implica la
estimacin rutinaria de los niveles de aminocidos en muestras biolgicas
tales como sangre y orina.
La deteccin de aminocidos, despus del paso de las muestras lquidas por una columna cromatogrfica de intercambio inico (1,2), que se
ha venido realizando hasta hace poco con ninhidrina, ha sido sustituida
en muchos casos por mtodos de deteccin ms sensibles basados en tcnicas de fluorescencia que emplean como reactivo fluorescamina (3) y
o-ftalaldehido (4,5), con lo que se ha conseguido aumentar la sensibilidad
de deteccin al rango de nanomoles.
A pesar de estos avances, la utilizacin de muestras lquidas no siempre es posible en determinadas aplicaciones, tales como el screening de
muestras de recin nacidos para la deteccin precoz de aminoacidopatas,
ya que, por una parte, es frecuentemente difcil obtener sangre suficiente
de los neonatos, y, por otra parte, an ms importante, este screening
precisa un mtodo fcil, seguro y rpido para que las muestras lleguen lo
ms pronto posible al laboratorio, por lo que el mtodo ms efectivo es
sin duda la recogida de las muestras en papel de filtro y el envo, por correo, de dichas muestras al laboratorio una vez impregnadas y secas.
Por tanto, y haciendo uso de la gran sensibilidad de deteccin del mtodo fluorimtrico, que alcanza un rango de deteccin del orden de nanomoles, se ha estudiado la posibilidad de la cuantificacin rpida de los
aminocidos contenidos en una muestra biolgica impregnada en papel de
filtro, tanto para el screening neonatal como para el seguimiento y control
del tratamiento de los desrdenes metablicos relacionados con ciertos
aminocidos.
MATERIALES Y MTODOS
1)
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.
Se utiliz un autoanalizador Chromaspek Rank Hilger con un programa optimizado para la separacin de aminocidos de muestras biolgicas. La duracin del programa fue de 4 horas, emplendose un gradiente
de pH obtenido por la combinacin programada de un tampn cido de
ctrico^citrato de litio 0,1 M pH = 1,9 y otro bsico de borato 0,1 M pH =
11,9. En determinados perodos a lo largo del programa se incluy la adicin de un tampn con metanol para la mejor separacin de aminocidos
hidroxilados no aromticos, y la variacin de temperatura de la columna
de 40 C a 60 C para una mejor resolucin de los aminocidos ramificados y aromticos. La deteccin de los aminocidos eluidos de la columna
de intercambio inico (resina MK2, Rank Hilger) se llev a cabo por reaccin del aminocido con o-ftalaldehido (0,8 g/1) en presencia de 2-mercaptoetanol (2 g/1) y en un tampn borato 0,1 M pH = 9, y ilectura en el FIuormetro Chromaspek.
El programa incluye la adicin a tiempos preestablecidos de una disolucin al 0,008 % de hipoclorito sdico, con el fin de aumentar la sensibilidad de deteccin de los aminocidos cistina, prolina e hidroxiprolina,
que dan una baja respuesta con el o-ftalaldehido.
El registro de la seal fluorimtrica e integracin de dicha seal se
llev a cabo mediante un integrador Hewlett-Packard, modelo 3390 A.
Como patrn de concentracin se emple una mezcla de los siguientes
aminocidos, a concentracin 1,6 mg/1, obtenidos de Sigma Chemical Co.
Londres: taurina, asprtico, hidroxiprolina, treonina, serina, glutmico.
prolina, glicina, alanina, valina, cistina, metionina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, homocistina, P-aminorsobutrico, histidina, ornitina. Usina y arginina. Nor-Leucina se us como patrn interno. El o-ftalaldehido
fue obtenido de Aldrich y otros reactivos fueron de grado analtico y
suministrados por diferentes firmas.
2)
REACCIN DE DETECCIN.
S-CH2-CH2OH
^V\
(I)
El producto fluorescente (I), l-alquil-2-tioalquil-isoindol, sufre en medio acuoso un reajuste azufre-oxgeno dando un producto no fluorescente (II), 2,3-dihidro-l-ona isoindol.
CU)
Esta ltima reaccin depende del radical R, es decir, del aminocido.
Glicina e histidina forman los complejos fluorescentes ms inestables (6),
siendo la descomposicin del 40 % y 10 % respectivamente en la primera
media hora despus de la formacin del complejo. Los restantes aminocidos producen isoindoles de mayor estabilidad, siendo el decaimiento
10
R. Peafiel,
F. Monserrat,
F. Solano
y J. A.
Lozano
PREPARACIN DE MUESTRAS.
a) Patrn lquido.
Para la determinacin de aminocidos en muestras lquidas, se prepar una disolucin mezcla de todos los aminocidos a una concentracin
de 1,6 mg/1 incluido la Nor-leucina, que se usa como patrn interno,
en CIH 0,025 M. Una muestra de 160 al se inyecta al autoanalizador, y se
somete al programa de 4 horas.
Un cromatograma tpico de esta disolucin patrn se muestra en la
figura 1. Cada aminocido es identificado por un tiempo de elucin, representado en minutos en cada uno de los picos en la figura. El orden de
elucin es aproximadamente desde los aminocidos ms cidos, es decir,
de pl ms bajo, los ms bsicos, aunque existen ciertas modificaciones
como el cas de la Treonina y Serina por la aplicacin al principio del
gradiente de pH de un tampn con metanol al 10 % para la separacin
de stos.
Por integracin de los picos, el factor de respuesta (f) de cada aminocido respecto a Nor-leucina, se puede calcular por medio de la expresin:
f =
Anlisis
de aminocidos
b) Patrn en papel
en muestras
biolgicas
11
impregnado.
lquidas.
12
Se corta un disco de 6,4 mm de dimetro (1/4 de pulgada) y se adicionan 200 |jil de tricloroactico al 5 % y 200 [xl de Nor-leucina de 3,2 mg/1
y se procede como en 1 apartado b. Por ltimo, se aplican al autoanalizador 160 [ de muestra.
La determinacin de cada aminocido se realiza por comparacin con
el patrn disco, mediante la frmula:
f
(aa) = - X 80 mg/1
Siendo f y f los factores de respuesta de cada aminocido respecto a Norleucina en el disco problema y en el disco patrn, respectivamente.
RESULTADOS Y DISCUSIN
El tanto por ciento de extraccin de los aminocidos del papel de filtro
fue establecido por comparacin entre los factores de respuesta de patrones lquidos y de patrones impregnados en papel SS-903, considerando
una impregnacin media de 4,7 Jil por disco (7). Se aplicaron al autoanalizador muestras patrones lquidas y muestras patrones en papel SS-903.
Aunque los factores de respuesta pueden variar apreciablemente y dependen de una gran diversidad de factores, la tabla 1 muestra el valor de estos factores para cada aminocido (primera columna) en el patrn lquido. No obstante, y para controlar esta variabilidad, dichos patrones han
de ser introducidos peridicamente en el autoanalizador durante el anlisis rutinario cada 20 muestras aproximadamente y aplicar correcciones
cuando sea necesario o realizar la determinacin de aminocidos en las
muestras problemas referencindolas al patrn ms cercano en tiempo
que se haya aplicado a la columna del autoanalizador.
El tanto por ciento de extraccin para cada aminocido a partir del
papel SS-903 viene representado en la segunda columna. Puede observarse
una extraccin total en los primeros aminocidos que eluyen de la columna e incluso en algunos casos apreciablemente mayores del 100 %. La
razn de este aumento es desconocida, aunque puede observarse, por un
Anlisis
de aminocidos
en muestras
biolgicas
13
14
'
Anlisis
de aminocidos
en muestras
biolgicas
15
16
Anlisis
de aminocidos
en muestras
17
biolgicas
TABLA
Aminocidos
Tau
Asp
HO-Pro
Tre
Ser
Glu
Pro
Gli
Ala
Val
Cis
Met
He
Leu
Tir
Fen
Homocis
Baba
His
Orn
Lis
Arg
0,905
0,512
0,123
0,660
0,980
0,516
0,293
1,160
1,130
0,890
0,165
0,550
1,074
1,062
0,830
0,890
0,045
0,760
1,013
0,600
0,686
0,688
0,192
0,096
0,015
0,060
0,143
0,061
0,037
0,124
0,108
0,072
0,012
0,120
0,062
0,052
0,040
0,036
0,003
0,052
0,108
0,072
0,064
0,089
78,9
116,6
124,4
104,3
104,0
107,9
67,4
60,0
57,0
81,2
77,3
66,5
77,1
78,3
83,8
79,3
81,2
76,1
75,7
75,1
72,5
76,4
15,1
23,4
16,8
12,3
16,4
9,6
5,3
10,5
6,6
13,6
5,4
8,2
4,3
3,9
5,7
5,2
3,1
6,0
9,8
10,2
6,4
6,7
82,6
121,6
114,0
96,6
88,5
94,8
64,5
63,0
57,9
91,7
82,4
?1,9
84,2
83,8
92,2
88,8
80,8
83,9
82,5
85,0
81,3
88,0
16,3
22,5
15,6
9,9
12,4
10,7
5,2
9,6
5,8
12,6
7,2
7,8
5,4
4,5
6,1
4,8
3,8
7,6
7,9
10,9
8,2
8,4
18
R. Peafiel,
F. Monserrat,
F. Solano y J. A.
Lozano
TABLA 2
B
28,3 4,2
39,1 5,3
39,0 2,9
12,1 1,1
24,5 2,9
61,2 7,5
24,6 10,3
79,710,3
28,3 4,5
3,7 1,3
8,3 2,0
9,6 1,8
4,5 0,9
33,3 5,9
30,6 3,2
35,9 2,5
7,5 1,1
30,3 6,5
31,5 6,4
37,4 3,6
14,9 1,4
29,2 3,2
71,7 6,6
22,8+ 2,9
98,7 12,0
29,5 3,2
5,6 0,6
10,5 1,3
11,6 2,2
6,0 1,4
27,3 4,6
25,8 3,9
29,4 3,6
6,7 0,6
38,7
32,2
32,61
13,5
34,8i
65,1
23,6
98,2
33,0
5,9i
13,6'
10,6
6,71+
27,0'
30,4!+
32,8
7,6
5,7
4,6
7,5
1,9
4,2
8,0
3,2
11,2
4,1
0,9
1,6
1,5
1,2
5,3
4,2
4,1
0,9
TABLA 3
Asp
Tre
Ser
Glu
Pro
Gli
Ala
Val
He
Leu
Tir
Fen
His
Orn
Lis
Arg
i?
Plasma
Sangre
16,3 2,1
10,7 1,4
15,5 2,1
29,9 2,8
14,1 1,6
28,4 3,2
21,9 2,6
8,2 1 , 1
12,6 1,2
11,8 0,9
7,9 0,8
20,6 3,4
12,3 1,8
30,1 2,8
14,3 1,9
13,4 2,2
13,2 1,6
10,2 1,2
16,7 2,1
18,6 2,3
12,7 1,8
20,2 1,4
21,1 2,6
6,5 0,8
13,4 1 , 2
10,0 1,3
6,8 1,2
16,1 4,5
14,4 2,2
25,4 3,1
11,0 2 , 3
Plasma
26,4 +
21,8
17,6
17,3
26,7
15,7
22,5
16,3
7,1
10,1
9,8
6,2
23,5
19,6
27,0
10,7
5,4
2,8
3,2
1,8
3,5
1,3
2,9
4,8
0,9
1,1
1,9
0,7
4,6
1,7
3,2
2,1
Sangre
26,4 4,6
14,2 4,5
19,0 3,6
22,5 2,4
19,3 5,1
15,0 1,2
24,81 3,5
26,9 7,2
9,7 1,2
16,5 2,4
14,4' 3,1
8,9 + 1,1
12,6 ! 5,2
15,9 3,6
34,6' 2,9
7,6 1,9
l-t
a
o H W
>
ai
s:
m 3 j
fH )
v< c
1 -H a
>- J z - (^
FIGURA 1.Cromatograma obtenido a partir de una disolucin patrn de aminocidos a concentracin de 1,6 mg/1. (Los tiempos de retencin se expresan
en minutos.
o J S5 <
U T-i r-t
U <<
CH
33
01
S
i-l 01 I -H 0)
H f4 Z H b
t M i -
U -H X
O tA g.
M
U
<
FIGURA
VLy^^-V
FiGURA 3B.Cromatograma obtenido con un disco impregnado de sangre
en un caso de tirosinemia.
tu
f-i
t-'
FIGURA
3 01
a) ,-5
J
I
Anlisis
de aminocidos
en muestras
biolgicas
25
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of 2nd. Chromaspek
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meeting,