ENCAPSULACIN DE EXTRACTOS POLIFENLICOS EN MICROESFERAS DE

ALGINATO PARA ALIMENTOS FUNCIONALES

Lupo B. *, Maestro A., Prras M., Gutirrez J.M y Gonzlez C.
Departament dEnginyeria Qumica. Facultat de Qumica. Universitat de Barcelona. C/Mart i
Franqus 1-11 08028, Barcelona.
bryshilalupo@ucla.edu.ve
Palabras clave:
Cocoa, emulsin, gelificacin interna, diseo experimental.

RESUMEN
Polvo de cocoa liofilizado es encapsulado en microesferas de alginato a travs de la tcnica
de emulsificacin por gelificacin interna con objeto de preservar el contenido de polifenoles
para ser incorporadas en alimentos. Se realiza un diseo experimental para evaluar la
influencia de las variables de composicin y preparacin sobre el tamao de las microesferas
y el porcentaje de retencin de los componentes luego de ser separadas de la emulsin. Las
variables de composicin estudiadas fueron la concentracin de tensioactivo, cantidad de
fase dispersa y concentracin de CaCl2. Mientras en las variables de preparacin, la velocidad
de agitacin y de centrifugacin para la separacin de las microesferas. El diseo factorial
compuesto mostro microesferas con dimetros medios entre 59 y 827 m, as como
porcentajes retenidos de cocoa entre 0,64 y 83%. El anlisis estadstico no seal influencia
significativa de la concentracin de tensioactivo ni del CaCl2 sobre el dimetro pero s para la
cantidad de fase dispersa. Al ajustar el pH en la fase dispersa, se evidencia por estudios de
la viscosidad a 10 y 25C una influencia significativa del tiempo y la temperatura. Al realizar
un diseo experimental fraccionado se observaron cambios importantes en los resultados.
INTRODUCCIN
Las nuevas tendencias tecnolgicas se han enfocado en la produccin de alimentos
funcionales al incorporar aminocidos, minerales e incluso de pequeas molculas como
clulas, enzimas y microorganismos probiticos beneficiosos para la salud, y por tanto, de su
conservacin en los alimentos durante el procesamiento y almacenaje (Parra-Huertas, 2010).
Los antioxidantes son sustancias que retardan o inhiben el proceso de oxidacin de los
lpidos y otras molculas impidiendo reacciones de oxidacin causantes de los procesos de
envejecimiento y de algunas otras enfermedades (Young y Woodside, 2001; Silva et al.,
2007), tales como el cncer, enfermedades neurodegenerativas, inflamatorias y
cardiovasculares (Prior y Gu, 2005). Dentro del grupo de compuestos antioxidantes podemos
encontrar los fenoles y flavonoides. Los flavonoides son compuestos polifenlicos
ampliamente distribuidos entre los vegetales mayoritariamente en las semillas, frutas y en
bebidas como el t, el vino y la cerveza. A su vez, los fenoles se encuentran en la mayora de
las plantas azulgrana o violeta, tales como la berenjena, las bayas, los arndanos, la uva,
entre otros. La actividad antioxidante de los compuestos fenlicos se debe principalmente a
sus propiedades de oxidoreduccin, ya que juegan un papel importante oxidando y
neutralizando radicales libres (Goh et al., 2003). Considerando los beneficios mencionados y
las nuevas ideas de disminuir el uso de antioxidantes sintticos comerciales, se plantea
emplear extractos naturales con alto contenido de polifenoles como principio activo que
puedan ser incorporados en alimentos con la finalidad de hacerlos funcionales. Debido a que
la adicin de antioxidantes naturales puede alterar la coloracin, y sabor de los alimentos,
recientes estudios proponen la aplicacin de la tcnica de microencapsulacin con alginato
para enmascarar dichos efectos, protegerlos del medio que los rodea o para su liberacin
controlada (Deladino et al., 2008).
El alginato ha sido usado debido a sus mltiples ventajas tanto para el consumo humano
como versatilidad en aplicaciones industriales. Tales aspectos han sido compilados en la
literatura por Imeson (2010) resaltando el efecto prebitico de los alginatos de bajo peso
molecular, los beneficios de su ingesta como fibra diaria para la reduccin de los niveles de
azcar y colesterol en sangre, as como, la capacidad para prolongar la vida til en
productos. El alginato ha sido uno de los polmeros ms empleado en la microencapsulacin,

este forma una matriz altamente verstil, biocompatible y no txica para la proteccin de
componentes activos de factores como el calor y la humedad, mejorando as su estabilidad y
biodisponibilidad.
La tcnica de microencapsulacin ha sido descrita como un proceso en donde pequeas
partculas o gotas son rodeadas por un recubrimiento homogneo o heterogneo integrado a
las cpsulas con variadas aplicaciones (Borgogna et al., 2010). Una definicin general de
encapsulacin dada por Desai y Park (2005) se refiri al empaquetado de materiales slidos,
lquidos o gaseosos mediante cpsulas que liberan su contenido de forma controlada bajo
condiciones determinadas. El proceso de microencapsulacin puede ocurrir por gelificacin
inica de forma externa o interna, dependiendo si el calcio se difunde desde una fuente
externa que rodea al hidrocoloide hacia la solucin de alginato a pH neutro. Mientras que, la
gelificacin interna consiste en la liberacin controlada del ion calcio desde una fuente
interna de sal de calcio insoluble o parcialmente soluble dispersa en la solucin de alginato
de sodio que permite su liberacin con la acidificacin del medio (Funami et al., 2009). La
tcnica ms empleada ha sido la microencapsulacin por extrusin que consiste en la
formacin de gotas de alginato con el componente a encapsular mediante un dispositivo
extrusor sobre un bao de calcio que induce la gelificacin de forma externa, dependiendo su
tamao del dimetro de boquilla (Chan et al., 2009). Mientras que, la tcnica de
encapsulacin en emulsin se ha definido como el proceso de dispersin de un lquido en otro
lquido inmiscible donde la fase dispersa consta de la matriz que incluye el componente a
encapsular. La adicin de un tensioactivo mejora la formacin y estabilidad de la emulsin,
as como la distribucin de tamao de las gotas (Poncelet, 2001; de Vos et al., 2010). En
este sentido, la preparacin de microcpsulas en emulsin puede llevarse a cabo empleando
el mecanismo de gelificacin externa o interna. Para el primer caso, la gelificacin externa en
emulsin consta en la dispersin de una mezcla solucin de alginato-componente en una fase
continua no acuosa, seguido de la adicin de una fuente de calcio que al difundirse a la fase
dispersa inicie la gelificacin permitiendo la encapsulacin, y a su vez, la desestabilizacin de
la emulsin para la separacin de las cpsulas formadas. Mientras que, la tcnica en
emulsin por gelificacin interna se fundamenta en la liberacin del in calcio desde un
complejo insoluble o parcialmente soluble en cuyo caso se adiciona un agente secuestrante,
contenido en una solucin de alginato-componente el cual es dispersado en una fase
continua no acuosa generando una emulsin agua en aceite (W/O) (Gouin, 2004; Chan et
al., 2006). Trabajos previos en gelificacin interna mencionan la dificultad de controlar la
polidispersidad de las esferas, con dimetros medios entre 50-1000 m (Poncelet, 2001). Sin
embargo, no presentan conclusiones respecto a la influencia de la composicin y de las
variables de preparacin en el tamao y polidispersidad de las microesferas formadas.
Investigaciones posteriores muestran, la influencia de estas variables en el proceso de
preparacin de las microesferas de alginato para la encapsulacin de insulina en emulsin
por gelificacin interna y de extractos naturales de plantas en una matriz de alginato con
recubrimiento de quitosano al emplear el mecanismo de gelificacin externa con la tcnica
por extrusin (Silva et al, 2006; Deladino et al, 2008). Puesto que en muchos de
experimentos interviene el estudio de los efectos de dos o ms factores. En general, los
diseos factoriales son los ms eficientes para este tipo de experimentos. Entendindose por
diseo factorial que en cada ensayo o rplica completa del experimento se investigan todas
las combinaciones posibles de los niveles con los factores y por tanto, su efecto sobre una
respuesta (Montgomery, 2002).
En este trabajo, se establecen como factores las variables de composicin referidas a la
concentracin de tensioactivo, cantidad de fase dispersa empleados en la emulsin y
concentracin de cloruro de calcio (CaCl2) en la solucin de separacin de las microesferas
de alginato, as como variables de preparacin tal como la velocidad de agitacin y
centrifugacin para la separacin de las microesferas. Y el efecto de dichas variables sobre la
distribucin de tamao de las microesferas, el porcentaje de retencin del polvo de cocoa y
la polidispersidad de las microcpsulas como respuesta al diseo factorial establecido.

MATERIALES Y MTODOS
Materiales
Alginato de sodio fue suministrado por Panreac. La solucin de alginato al 2% p/p se disolvi
utilizando un Ultra-trrax modelo T25 Basic de IKA-WERKE a temperatura ambiente. Las

sales de cloruro y citrato de calcio tetrahidratado al 96%, 99% respectivamente, la sal de

carbonato de sodio al 99%, el monolaureato de sorbitn polioxietilenado (Tween20), el
Folin-Ciocalteau y cido glico fueron proporcionados por Aldrich. El cido actico glacial y el
hidrxido de sodio 6 M fueron suministrados por Panreac. El Polirricinoleato de Poliglicerol
(PGPR) empleado como tensioactivo de alta calidad fue proporcionado Lansenor Emul, S.L.
Para la preparacin de la emulsin se utiliz aceite refinado de Girasol, suministrado por
Aceites del Sur-Coosur, S.A. El polvo de cocoa con alto contenido de polifenoles fue
suministrado por la Facultat de Farmacia de la Universitat de Barcelona. Se emple a partir
de una solucin madre de cocoa al 1% p/p disuelta por sonicacin utlizando el Ultrasonic
homogenize HD2070 (Sonoplus Bendelin) equipado con sonda de titanio, frecuencia 20 KHz y
una potencia de 21W durante 20 min, el pH se ajust entre 6,5-6,8 con NaOH 6M empleando
un pH/ISE measuring instrument (ProLab 3000) y finalmente se adicion 2% p/p de alginato
de sodio con agitacin vigorosa con posterior desaireacin y completa hidratacin durante 24
horas bajo refrigeracin. Para la separacin de las microesferas se emple una Centrfuga de
control electrnico digital Mixtasel-BL marca Selecta con velocidad regulable hasta 4200 rpm.
La caracterizacin de tamao de las microesferas se realiz por difraccin de rayos lser con
el Mastersizer 2000 para anlisis de tamao de partculas entre 0,02 y 2000 m. La
dispersin de la muestra se realiz va hmeda en una unidad de dispersin con agua
denominada Hydro 2000S de capacidad 800 ml. El equipo cuenta con un Software (SOP) que
permite crear un entorno de trabajo personalizado donde se definen las variables de control.
Se tom como ndice de refraccin (IR) para el medio de dispersin el IR del agua (1,333) y
para la muestra el IR del alginato de calcio (1,336) determinado por refractometra
empleando un Refractmetro ABBE a 25C. Para el estudio de viscosidad se utiliz un
Remetro Modular MARS III dotado de un bao termosttico (modelo F6) y recipiente HAAKE
(modelo C25) empleando un sensor placa-placa rugoso, para evitar deslizamientos, de
dimetro 35 mm y un espaciado para la muestra de 1 mm. El anlisis de viscosidad en
funcin del gradiente se realiz a frecuencias entre 0,01 y 100 Hz. El contenido de fenoles
totales se determin por espectrofotometra mediante el mtodo de Folin-Ciocalteau
empleando un Perkin Elmer UV/VIS Spectrometer Lambda 20 a una longitud de onda de 760
nm.
Mtodos
Preparacin de Microesferas
Se emple el protocolo de preparacin de las microesferas de alginato en emulsin por
gelificacin interna propuesto por (Poncelet, 2001). El procedimiento estndar para todas las
variables de formulacin se estableci a 25 C, velocidad de agitacin de 250 rpm y
centrifugacin 4000 rpm durante 10 min para la separacin de las microesferas. Mientras
que, para las variables de preparacin se consideraron las condiciones de composicin dadas
para el punto central. La emulsin se prepar en un reactor encamisado de 100 ml de
capacidad y especificaciones variables de velocidad de agitacin entre 100 y 700 rpm.
Previamente, se adicion 1 ml de suspensin de citrato de calcio a 0,05 M a la fase acuosa
constituida por alginato al 2% p/p y cocoa al 1% p/p bajo agitacin constante durante 5 min.
La mezcla acuosa es dispersada (27,5%) en 40 ml de aceite vegetal con 9,5% de PGPR. La
emulsin W/O es preparada bajo agitacin constante durante 15 min. La gelificacin de las
gotas se inicia al agregar los 10 ml restantes de aceite vegetal junto con 80 l de actico
glacial disueltos en el mismo por 15 min ms. Las microesferas pregelificadas son separadas
de la fase oleosa adicionando 100 ml de solucin de CaCl2 con 10% p/p de Tween20 con
agitacin vigorosa durante 15 min con la finalidad de continuar el proceso de gelificacin,
mejorar la retencin de cocoa y favorecer la separacin de las fases, finalmente las
microesferas son separadas por centrifugacin donde la fase oleosa es descarta y las
microesferas de alginato con cocoa redispersas en agua para su anlisis de distribucin de
tamao.
Determinacin del contenido de polifenoles totales
El contenido total de fenoles fue analizado por el mtodo espectrofotomtrico de FolinCiocalteau siguiendo el procedimiento propuesto por Erkan et al., (2008) usando cido glico
como material de referencia. Para determinar la cantidad de fenoles totales en la fase
dispersa se tom 1 ml (diluido 1:1000), enseguida se adicionaron 6,25 ml de carbonato de

sodio al 20%, 1,25 ml de Folin 1N y resto de agua miliQ hasta completar 10 ml, se agit
vigorosamente y dej en reposo durante 2 horas a temperatura ambiente. Pasado este
tiempo se midi la absorbancia a 765 nm. Procedimiento que se realiz para cada uno de los
ensayos sealados por el diseo experimental tanto para las variables de formulacin como
preparacin, con el objetivo de determinar el porcentaje de fenoles totales retenidos por
diferencia de concentracin entre la cantidad presente en la fase dispersa y el sobrenadante
acuoso producto de la separacin de las microesferas. En este sentido, se aplic el mismo
procedimiento de anlisis al sobrenadante. La preparacin de los blancos fueron
considerados para cada caso con la finalidad de eliminar cualquier interferencia. La cantidad
de fenoles totales se expresaron como mg equivalentes de cido glico (mg cido glico/g
polvo de cocoa seco).
Distribucin de Tamao de las Microeesferas
Las microesferas de alginato con cocoa fueron caracterizadas por la tcnica de difraccin
lser dispersando las mismas en agua bajo continua agitacin, el software del equipo genera
el dimetro medio del volumen equivalente referido como D(4,3) en micras, as como una
representacin de la distribucin de porcentajes volumen frente a los dimetros de las
microesferas. Asimismo, el software reporta otra variable respuesta denominada SPAN o
factor de polidispersidad referido a la variabilidad del tamao de las partculas presentes en
la muestra.
Anlisis de viscosidad de la fase dispersa
La fase dispersa formada por 2% p/p de alginato de sodio, 1% p/p de cocoa y 1 ml de
suspensin de citrato de calcio fue estudiada aplicando un anlisis de viscosidad en funcin
del gradiente a temperatura controla y en funcin del tiempo. Primeramente, se observ el
comportamiento de la fase dispersa empleada para el diseo experimental propuesto. Los
resultados mostraron una influencia importante del tiempo en el aumento de la viscosidad.
Asimismo, se realiz el estudio para la fase dispersa neutralizada a pH entre 6,5 y 6,8 con
unas gotas de NaOH 6M bajo continua agitacin y control del pH. Las viscosidades obtenidas
reflejan una disminucin de casi un 95% en el valor de la viscosidad estacionaria para el
tiempo inicial de 6 min respecto a la fase dispersa neutralizada a 10 C. Por otra parte, el
comportamiento de la viscosidad frente al gradiente a 25 C muestra valores de viscosidad
con menores variaciones en el tiempo, as como la influencia de la temperatura sobre el
sistema. Tal como se aprecia en la Figura 1.

t1 = 6 ; t2 = 32 ; t3 = 58 ; t4 = 84 (min). *Fase dispersa sin neutralizar

Figura1. Viscosidad Fase dispersa

Anlisis Estadstico
Tanto la construccin del diseo experimental como el anlisis de los resultados se
procesaron usando el software STATGRAPHICS PLUS (Versin 5.1, Statistical Graphics
Corporation, Rockville, USA, 2000). Todos los datos se analizaron mediante ANOVA, donde
se consideraron significativos las respuestas con valores de p < 0,05. Los valores fueron
expresados como mediaD.S.

RESULTADOS Y DISCUCIN
Diseo Experimental
Se estableci para la construccin del modelo un diseo experimental de tipo factorial 2k,
compuesto y rotable con tres rplicas en el punto central. Para las variables de composicin
se plantearon tres factores: concentracin de tensioactivo, concentracin de CaCl2, y
cantidad de fase dispersa donde los niveles inferiores y superiores fueron 4-15%, 0,03-0,1 M
y 15-40% respectivamente. El diseo obtenido se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Diseo Experimental 23 factorial.

9,5*

Fase
Dispersa
%
27,5

0,065

273,959,36

5,590,92

28,449,16

9,5

6,48

0,065

448,8767,57

7,861,08

0,640,32

0,25

27,5

0,065

486,8616,28

1,890,04

63,020,88

9,5

48,52

0,065

101,9385,17

3,355,42

64,400,33

Tensioactivo
%

CaCl2
(M)

m D(4,3)

SPAN

%Ret

9,5

27,5

0,124

827,11152,65

1,690,18

47,460,07

9,5*

27,5

0,065

157,0630,84

2,420,74

42,644,24

15

40

0,03

59,213,62

6,297,52

82,811,16

15

0,1

301,7156,56

3,550,49

1,962,91

15

15

0,1

241,13108,15

4,210,94

30,154,71

9,5

27,5

0,006

171,8713,76

1,420,16

44,322,67

40

0,1

152,6232,76

2,510,47

62,770,02

15

0,03

332,3843,71

3,761,02

1,930,66

9,5*

27,5

0,065

236,8131,78

2,260,64

57,910,87

18,7

27,5

0,065

113,2344,89

3,332,75

76,412,80

15

15

0,03

187,9462,36

4,071,06

40,561,04

40

0,03

171,7425,73

4,81,02

80,650,23

15

40

0,1

101,7267,47

5,025,77

76,384,21

*Rplica: Puntos centrales. Ret.: retencin cocoa en microesferas

El anlisis estadstico mediante ANOVA muestra que las variables de composicin no tienen
influencia significativa sobre el dimetro medio de las microesferas ni el factor de
polidispersidad de la muestra. Sin embargo, se observa un valor de p < 0,05 como efecto de
la cantidad de la fase dispersa sobre el porcentaje de retencin de la cocoa en las
microesferas de alginato. Lo que indica que mencionado factor tiene un efecto significativo
sobre esta variable respuesta. Cabe resaltar, que los valores dados por los puntos centrales
muestran diferencias entre ellos, lo cual indica la existencia de variables no controladas en el
sistema. Para las variables de preparacin se plantearon dos factores definidos como
velocidad de agitacin y centrifugacin con mximos y mnimos de 250-600 rpm y 20003800 rpm respectivamente. El diseo obtenido se muestra en la tabla 2.

Tabla 2. Diseo Experimental 22 factorial.

Cent.
(rpm)

D (4,3)
m

425*

2900

600

3800

675

V.A
(rpm)

SPAN

%Ret

90,0217,63

1,810,098

70,680,14

73,020,96

1,590,007

21,660,16

2900

59,669,24

1,650,059

73,370,10

425*

2900

75,274,74

1,630,031

75,040,02

250

2000

157,2311,67 2,050,113

74,610,07

425*

2900

80,9820,51

1,650,106

84,220,03

425

1630

79,168,81

1,630,067

54,680,05

250

3800

127,137,23

1,890,04

75,970,07

175

2900

148,065,89

2,280,038

77,280,01

600

2000

84,0112,26

1,530,074

26,730,19

425

4170

61,30,23

1,750,009

52,923,05

*Rplica: Puntos centrales. Ret.: retencin cocoa en microesferas

Cent.: centrifugacin. V.A.: velocidad de agitacin

Con valores de p < 0,05 se establecen diferencias significativas de la variable agitacin sobre
el dimetro medio y el SPAN. Mientras que el factor de centrifugacin no afecta a ninguna de
las variables respuestas. Debido a la variabilidad de los puntos centrales y evidencia del
efecto del cambio de viscosidad en funcin del tiempo y pH de la fase dispersa, se consider
estudiar por medio de un diseo factorial fraccionado la influencia de este aspecto sobre las
variables de composicin establecidas. Los resultados se muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Diseo Experimental Fraccionado 23 factorial.

Tensioactivo
%

Fase
dispersa %

CaCl2
(M)

D (4,3)
m

9,5*

27,5

0,065

9,5*

27,5

0,065

40

0,03

15

40

0,1

15

15

0,03

143,939,19

2,370,1

47,760,02

15

0,1

321,1423,42

3,90,19

53,610,03

Span

%Ret

85,480,41

1,810,01

58,970,05

87,351,86

1,860,03 59,930,07

136,3410,02 1,770,04 78,450,01

39,62,43

1,880,02

80,920,3

*Rplica: Puntos centrales. Ret.: retencin de cocoa en microesferas

Puede observarse, que una vez controlado el pH de la fase dispersa se facilita el control de la
viscosidad de la mezcla en emulsin, al apreciarse que la influencia de las variables de
composicin sobre el dimetro medio muestra resultados con una menor variabilidad en
contraste con los obtenidos previamente (tabla 1). Por otro lado, las rplicas del punto
central sealan reproducibilidad en los resultados.

CONCLUSIONES
El estudio muestra la posibilidad de encapsular compuestos naturales con alto contenido de
fenoles en microesferas de alginato empleando la tcnica en emulsin por gelificacin interna
ya que se observan valores de retencin de la cocoa por encima del 50% a mayor cantidad
de fase dispersa. El estudio reolgico de la fase dispersa con cocoa manifiesta la importancia

de controlar el pH, la temperatura y los tiempos de preparacin de las microesferas.

Asimismo, la importancia de plantear un diseo experimental fraccionado preliminar con la
finalidad de establecer si las variables propuestas ejercen una influencia significativa sobre el
sistema en estudio.

AGRADECIMIENTOS
Se agradece al Programa de Becas para intercambio acadmico nimo-Chvere! dentro del
Proyecto Erasmus Mundus. A la Asesora CYCYTCTQ2011-29336-C03-02 por el financiamiento
del proyecto. Y a la Universidad Centrooccidental Lisandro Alvarado, Venezuela como
Institucin Socia del Proyecto nimo-Chvere!.

REFERENCIAS
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