Polmeros bacterianos biodegradables:

Polihidroxialcanoatos (PHAs)
1.

Polmeros biodegradables
Los plsticos son polmeros orgnicos generalmente de origen
petroqumico, cuyo peso molecular vara entre 10 4 a 106 Da y debido a su
estructura pueden ser manipulados y moldeados con facilidad. Presentan
resistencia qumica (cidos, lcalis y disolventes) y mecnica, son
impermeables, tienen una alta relacin resistencia/densidad, excelentes
propiedades para el aislamiento trmico y elctrico y pueden ser transparentes
y coloridos. Estas caractersticas asociadas a su bajo costo de produccin
hacen que el uso de los plsticos est generalizado (Dantas, 2005).
Segn su origen, las molculas de los plsticos pueden ser naturales,
como la celulosa, cera, caucho natural, o sintticas como el polietileno y el
nylon. Los plsticos sintticos se clasifican segn el proceso de polimerizacin
en polmeros de condensacin y de adicin. Las reacciones de condensacin
producen diferentes longitudes de polmeros (nylon, poliuretanos y polisteres)
y pequeas cantidades de subproductos como agua, amoniaco y etilenglicol.
Las reacciones de adicin producen longitudes especficas de polmeros
(polietileno, polipropileno, policloruro de vinilo y poliestireno) y ningn
subproducto. Segn la forma en que son procesados, los plsticos pueden ser
termoplsticos o termoestables. Los termoplsticos formados por polmeros
lineales o ramificados pueden fundirse, se ablandan cuando se calientan y se
endurecen al enfriarse. Por el contrario, la mayora de los plsticos formados
por polmeros entrecruzados son termoestables y ganan dureza cuando se
calientan.
Segn el Consejo Nacional del Ambiente, CONAM, (2006) ms del 80 %
de los plsticos existentes en el mercado, son termoplsticos, entre los que se
incluyen el polietileno tereftalato, PET (envases de gaseosa), polietileno de alta
densidad, PEAD (botellas de detergentes, productos alimenticios, tubos,
juguetes), cloruro de polivinilo, PVC (muebles de jardn, tubos de caos,
zapatillas), polietileno de baja densidad, PEBD (bolsas para basura,
contenedores flexibles), polipropileno, PP (envases de yogurt, margarina y
leche, piezas de automviles). Los termoestables se endurecen mediante un
fraguado, no se pueden volver a fundir ni a moldear y constituyen el 20 % de
los plsticos, como el poliuretano, PU (revestimientos, acabados, colchones,
asientos de vehculos), epoxy (adhesivos, embarcaciones, componentes
elctricos) y fenlicos (hornos, tostadores, placas de circuitos).
El mayor porcentaje de los plsticos se utiliza para embalajes por lo que
tienen una vida til muy corta y despus son descartados en grandes
1

cantidades, acumulndose en los vertederos municipales. Puesto que durante

periodos relativamente largos no se ha producido alguna biodegradacin
significativa de estos materiales, se ha pensado en los polmeros naturales
para sustituirlos. Dado que cualquier sustancia de origen biolgico puede ser
degradada por uno o varios microorganismos, la utilizacin generalizada de
plsticos biolgicos podra resolver el problema ambiental de los petroplsticos
(Madigan et al., 2004).
Los plsticos biodegradables pueden ser divididos en tres categoras: los
sintetizados qumicamente, los que contienen amidas adicionadas a su
estructura y los polihidroxialcanoatos (PHAs). Entre los primeros estn el cido
poligliclico o cido polilctico-alcohol polivinlico o poli (xido de etileno) y la
poli-e-caprolactona que son susceptibles a la degradacin enzimtica
microbiana, pero su aplicacin comercial es reducida porque no presentan
propiedades mecnicas como los plsticos de origen petroqumico. En el
segundo grupo estn los plsticos que tienen un grupo amida como agente de
carga o ligando, ejemplo, el amido-polietileno y los microorganismos degradan
fcilmente la amida quebrando la matriz polimrica; sin embargo, algunos de
los fragmentos de estos polmeros permanecen en al ambiente por largos
perodos. Los polihidroxialcanoatos (PHAs), pertenecen al tercer grupo, son de
origen microbiano, totalmente biodegradables, presentan caractersticas
semejantes a los plsticos derivados del petrleo y pueden ser producidos a
partir de recursos renovables (De Almeida et al., 2004; Dantas, 2005).
2.

Definicin de polihidroxialcanoatos (PHAs)

En la literatura se encuentran muchas definiciones de los PHA, algunas
de las cuales se presentan a continuacin. Los PHAs son molculas que
muestran propiedades similares a las de algunos plsticos comunes como el
polipropileno pero que son reciclables y fciles de degradar por muchos
microorganismos en un tiempo promedio de 6 a 12 meses frente a los plsticos
derivados del petrleo que tardan desde 40 hasta 200 aos en degradarse
(Franco et al., 2009). Tambin son definidos como simples macromolculas
sintetizadas por muchas bacterias Gram positivas y Gram negativas y
acumuladas en grnulos (cuerpos de inclusin) hasta niveles del 80% (Avila,
2007) o ms del 90 % del peso seco (De Almeida et al., 2004), normalmente
bajo condiciones de privacin nutricional de elementos como nitrgeno,
fsforo, azufre, oxgeno, magnesio y en presencia de un exceso de fuente de
carbono.
Los PHAs son una familia de homopolisteres o heteropolisteres
biolgicos pticamente activos, que contienen unidades del monmero cido
(R)-hidroxialcanoico. La acumulacin de PHAs en las clulas microbianas
puede representar entre 30 a 80 % de su masa seca; sin embargo, en
condiciones optimizadas de cultivo o con uso de la ingeniera gentica se
puede alcanzar PHAs en ms del 90 % de la masa bacteriana y pueden ser
2

producidos utilizando como fuente de carbono materias primas como el

acetato, cido 4-hidroxibutirico, celulosa, glicerol, lignina, metano, aceite
mineral y sacarosa entre otros (Dantas, 2005).
Los PHAs son polisteres isotcticos de origen bacteriano obtenidos
mediante fermentacin aerobia en un medio de cultivo rico en hidratos de
carbono bajo condiciones de estrs nutricional. Los carbohidratos provienen de
fuentes naturales renovables como glucosa, sacarosa o bien desechos de la
industria alimentaria como mosto de uva u olivo, melaza de caa de azcar,
etc. Si durante el crecimiento, la bacteria detecta falta o reduccin de algn
nutriente (N, P, S, Mg, K, O 2), entonces genera una reserva de energa
mediante la acumulacin en el citoplasma de PHAs en forma de grnulos
(Hermida y Daz, 2004). Por su origen de fuentes renovables y por el hecho de
ser biodegradables se denominan polmeros doblemente verdes
(Rozsa et
al., 2004).
Los PHAs son una serie de polisteres sintetizados y acumulados por
algunos gneros bacterianos como material de reserva de carbono y energa
cuando el medio de cultivo se encuentra desbalanceado con limitacin de
nutrientes como nitrgeno, fsforo, azufre, magnesio, potasio u oxgeno y con
exceso de fuente de carbono o con limitaciones fsicas como temperatura no
adecuada para el crecimiento. Son considerados como candidatos para el
reemplazo de los polmeros de origen qumico, debido a que son sintetizados
por microorganismos a partir de sustratos agrcolas y tienen la posibilidad de
ser degradados a dixido de carbono y agua en aerobiosis o metano en
anaerobiosis, en hbitats diversos como suelo, mar, agua estancadas y aguas
residuales (Barbosa et al., 2005).
Existen tres clases de polmeros producidos intracelularmente en los
microorganismos, glucgeno, polihidroxialcanoatos (PHAs) y polifosfatos. Slo
el glucgeno y los PHAs son considerados con polmeros de reserva, mientras
que los polifosfatos son disipadores de energa para balancear el contenido
celular (Fadhil et al., 2006). Los PHAs tienen funcin de reserva y asimismo
retardan la degradacin de los componentes celulares como los cidos
nucleicos y protenas en perodos de escasez de la fuente de carbono. La
utilizacin de los PHAs es considerada como una estrategia desarrollada por
las bacterias para incrementar su supervivencia. Son utilizados como fuente de
carbono y energa endgena en condiciones de escasez de nutrientes, como
fuente de carbono y energa para el enquistamiento (Azotobacter sp.) y la
esporulacin (Bacillus sp.), como fuente de poder reductor para la degradacin
de compuestos txicos y como proteccin de la nitrogenasa de las bacterias
fijadoras de nitrgeno, puesto que los PHAs constituyen reductores en
ausencia de sustratos exgenos que puedan ser oxidados. Asimismo, los PHAs
han sido detectados como constituyentes de la membrana citoplasmtica en
complejos con calcio en polifosfatos o asociados a protenas (Avila, 2007).
3

3.

Historia
El primer PHA descubierto fue el poli 3-D-hidroxibutirato, P(3HB), un
homopolmero detectado en Bacillus megaterium, por Maurice Lemoigne en
1923. Desde entonces, una larga variedad de PHAs con diferente longitud de
cadena de carbonos y grupos R se han estudiad, con por lo menos 150
diversos componentes de PHAs y cinco rutas biosintticas diferentes. Esta
variabilidad en la composicin depende de la especificidad del sistema de
polimerizacin, de la naturaleza del sustrato suministrado, as como de las
rutas metablicas que llevan a la formacin de los monmeros.
Los procesos comerciales para la produccin de PHAs fueron desarrollados
inicialmente por W.R.Grace en los aos 60 y desarrollados ms adelante por
Imperial Chemical Industries (ICI), en Inglaterra, entre los aos 70 y 80. Desde
los aos 90, Metabolix Inc. y Monsanto han sido las fuerzas impulsoras para la
explotacin comercial de los polmeros de PHAs en Estados Unidos. Segn
Lemos et al. (2006), existen cuatro marcas: Biopol (copolmero de
hidroxibutirato e hidroxivalerato), Biomer (homopolmero de hidroxibutirato),
Nodax (copolmero de hidroxibutirato e hidroxihexanoato) y Biocyde
(homopolmero de hidroxibutirato, copolmero de hidroxibutirato e
hidroxivalerato).
En los aos 70, la empresa ICI desarroll un proceso para producir a escala
industrial el Biopol. Este polihidroxialcanoato es un copolmero de monmeros
de cuatro y cinco carbonos denominados hidroxibutirato e hidroxivalerato,
(PHBV), respectivamente. Se produca utilizando la bacteria Ralstonia eutropha
(hoy Cupriavidus necator), cultivada en un medio con glucosa y propionato
como fuente de carbono, alcanzando rendimientos superiores al 80 % de peso
seco celular. A pesar de su costo relativamente elevado, el Biopol fue utilizado
en varias aplicaciones en Alemania. A fines del siglo XX el precio del petrleo
disminuy y de la misma manera el inters por los PHAs.
En los ltimos aos la tendencia se ha revertido (Cuadro 1). Adems de
producirse un aumento en el precio del petrleo, se ha tomado mayor
conciencia de que las reservas se estn agotando de manera alarmante. Por
otro lado, los residuos plsticos se acumulan en grandes cantidades y su
reciclado alivia la situacin pero slo en parte. El reemplazo de los plsticos
derivados del petrleo por biopolmeros totalmente degradables sera una
solucin para los diferentes aspectos de este problema; sin embargo, el precio
de los bioplsticos sigue siendo demasiado alto (De Almeida
et al., 2004).
En Latinoamrica polihidroxialcanoatos como el P(3HB), son producidos por la
empresa brasilea PHA Industrial S.A. desde el ao 2000, con capacidad inicial
de 50 t ao-1. Recientemente copolmeros de 3HB y 3-hidroalcanoatos de
cadena media (3 HA mcl) han sido objeto de diferentes patentes. Estos son
polmeros de gran inters puesto que presentan propiedades intermedias entre
4

polmeros de cadena corta (PHA scl) y de cadena media (PHA mcl) como
elongamiento superior al 600 % (Avila, 2007).
Cuadro 1. Principales compaas productoras de polidroxialcanoatos (PHAs)
en el mundo
Compaa

Ubicacin

Producto

Nombre
comercial

Metabolix/USA
(BASF/ADM)

EEUU

P(3HB)(3HO)P(3HB-co3HV)

Mirel

PHB Industrial, S.A

Brasil

P(3HB)P(3HB-co-3HB)

Biocycle

Tianan Biologa
Material Co

China

PHBV

Ecogen

Biotechnology Co.

Alemania

P (3HB)

Biomer

Mitsubishi GAS
Chemical

Japn

P (3HB)

Biogreen

P & G & Kaneca

EEUU/Japn

P(3HB-co-3HHx)

Nodax

Bio-on

Italia

PHA

Minerv- PHA

4.

Estructura qumica

Estructuralmente los PHAs son polmeros lineales de (R) -3-hidroxicidos

en los que el grupo carboxilo de un monmero forma un enlace tipo ster con el
grupo hidroxilo del siguiente monmero (Figuras 1 y 2). El radical R puede ser
un tomo de hidrgeno o una cadena de hasta trece tomos de carbono, que
puede contener insaturaciones, cadenas cclicas, grupos aromticos e inclusive
otros tomos como bromo, flor o cloro. La naturaleza del radical R determina
la identidad de la unidad monomrica y junto con el valor de x (que puede
variar de 600 a 35 000), las propiedades del polmero. Se han identificado ms
de 100 unidades monomricas como constituyentes de estos polisteres
(Dantas, 2005).
Los PHAs son polisteres alifticos constituidos por monmeros con 100
y 3000 unidades. Cuando R= CH 3, se tienen monmeros de hidroxibutirato que
dan como resultado el poli-B-hidroxibutirato P(3HB). Si R= CH 2-CH3, se tienen
monmeros de hidroxivalerato
que en conjunto constituyen el poli-Bhidroxivalerato (PHV). Estos dos compuestos (Figuras 3 y 4) en forma de
homopolmeros o heteropolmeros
(Figura 5) ocupan los lugares
5

predominantes de los polihroxialcanoatos comercialmente disponibles en la

actualidad (Rivera y Nevrez, 2009).
Segn la composicin de los monmeros en la cadena, los PHAs pueden
ser clasificados en homopolmeros (un tipo de monmero) y copolmeros (ms
de un tipo de monmero). Dantas (2005) menciona que dependiendo del
nmero de tomos de carbono presentes en la cadena de un monmero, se
distinguen tres grupos de PHAs, de cadena corta (3 a 5 tomos), cadena
media (6 a 14 tomos) y cadena larga (ms de 14 tomos). Por su parte,
Revelo et al., (2007), consideran dos clases (Figuras 6
y 7): PHAs de
cadena corta (3 a 5 tomos de carbono) o PHAs-scl (short chain length), con
cidos 3-hidroxibutrico (3HB) y 3-hidroxivalrico (3HV) y polmeros de cadena
media (6 a 14 tomos de carbono) o PHAs-mcl (medium chain length), que
contienen
monmeros
de
C6
(3-hidroxihexanoato
a
C14
(3hidroxitetradecanoato). Los PHAs- scl son encontrados en Cupriavidus necator,
Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii, A. chrococcum y Methylobacterium
organophilum entre otras bacterias, mientras que los PHAs-mcl son
encontrados en Pseudomonas oleovorans, P. aeruginosa y otras Pseudomonas
fluorescentes.
La investigacin sobre PHB, demuestra que la naturaleza qumica exacta
y, por tanto, tambin las propiedades qumicas del polmero producido por una
bacteria puede ser controlada variando el sustrato utilizado para su cultivo. Por
ejemplo, en algunas bacterias el acetato y el butirato determinan la produccin
de poli-B-hidroxibutirato, (C4), mientras que el caproato (cido graso de seis
carbonos) lleva a la produccin de un polmero que contiene C6, y el valeriato
(cinco carbonos) a un polmero que contiene C5. Tambin pueden sintetizarse
copolmeros que contienen varias unidades de monmeros que se repiten de
manera alterna (Madigan et al., 2004).

=
O

CH

O
CH2

Figura 1.

Frmula estructural general de los polihidroxialcanoatos (Dantas,

2005).

O CH
R

6 )
(CH
2

100 -

Figura 2. Frmula general de los polihidroxialcanoatos y algunos

miembros representativos (Costa, 2005).
n=1

R=hidrgeno
R= metil
R= etil
R= propil
R=nonil

Poli (3-hidroxipropionato)
Poli (3-hidroxibutirato) P (3HB)
Poli (3 hidroxivalerato) P (3HV)
Poli (3- hidroxihexanoato) P (3H0)
Poli (3-hidroxidodecanoato)

n=2

R=hidrgeno
R=metil

Poli (4-hidroxibutirato) P(4HB)

Poli (4-hidroxivalerato) P(4HV)

N=3

R=hidrgeno
R=metil

Poli (5-hidroxivalerato) P(5HV)

Poli (5-hidroxilhexanoato)

N=4

R=hexil

Poli (6-hidroxihexanoato)

CH3
O

CH

O
CH2

x
Figura 3. P (3HB), polihidroxibutirato: poli (3-hidroxibutirato), OP (3HB).

CH2CH3

CH

CH2

x
7

Figura 4. PHV, polihidroxivalerato: poli (3-hidroxivalerato). OP (3HV).

B4

V4 V5

CH3
O

CH
B3

CH2
B2

CH2CH3

O
O

B1

CH
V3

CH2
V2

C
V1

Figura 5. Estructura qumica de copolmero butirato-valerato PHBV:

P(3HB-co-3HV); b1, carbonilo (C=0); B2, metileno (CH 2); B3,
metino (CH); B4, metilo (CH3) en la unidad P (3HB); V1,
carbonilo (C=0), V2, metileno (CH2); V3, metino (CH); V4,
metileno (CH2);V5, metilo (CH3) en P (3HV) (Trong et al., 2006).

O CH

(CH2)
n

R= H.CH3C2H5,

C
x
n= 1-3

Figura 6. PHA de cadena corta (short side chain), termoplstico.

8

R
O CH

O
(CH2)

R=C3H7 a C13H27, n =1-4

Figura 7. PHA de cadena mediana (medium side chain), elastomrico.

5.

Caractersticas fsicas
La masa molecular de los PHAs vara dependiendo del microorganismo
productor, pero en promedio est en el orden de 5 000 a 1 000 000 Da
(2 x l03 a 3 x 10 6 Da). Las propiedades fsicas y mecnicas como rigidez,
ductibilidad, punto de fusin, temperatura de transicin vtrea y resistencia a los
solventes orgnicos varan considerablemente en funcin de su composicin
monomrica (Dantas, 2005). Los polmeros de cadena corta (scl) son duros y
quebradizos, mientras que los de cadena media (mcl) son flexibles y tienen un
punto ms bajo de cristalinidad por lo que cada polmero tiene diferentes
aplicaciones. Los PHA scl son catalogados como termoplsticos, mientras que
los PHA mcl, por tener cristalinidad y punto de fusin menores son reconocidos
como elastmeros. Los PHA mcl tienen un elongamiento para ruptura mayor
que 100%, mientras que los PHA scl poseen un elongamiento para ruptura
menor que 5 %. La incorporacin de unidades de valerianatos, (steres del
cido pentanoico, 3HV)al P3HV permite aumentar la flexibilidad y resistencia al
impacto, alcanzndose un valor de 50 % en elongamiento para ruptura (Avila,
2009).
Los PHAs son polmeros termoplsticos o elastomricos, con alto grado
de polimerizacin de hasta 30 000 y un grado de cristalinidad que oscila entre
55 a 80 %. Conforme se incrementa la cadena o el nmero de co-monmeros
la estabilidad aumenta. Prcticamente todos son pticamente activos debido a
la presencia de un carbono quiral en la posicin B de la estructura del
monmero. Son estables ante los rayos UV y en contraste con otros
bioplsticos como los cidos polilcticos (PLA) tienen una mnima
permeabilidad al agua.
La temperatura de fusin (Tm) y la temperatura de transicin vtrea (Tg)
de los PHA, estn ntimamente relacionadas con la estructura de los
monmeros y la cantidad de comonmeros en los copolmeros Su temperatura
de fusin parcial es superior a los 180 C y se tornan altamente viscosos y
9

moldeables en temperaturas cercanas o mayores a su punto de fusin. De esta

misma manera, la Tm y la Tg se incrementan conforme aumenta la masa
molecular en el caso de los PHA de bajo peso molecular pero el
comportamiento se invierte en los PHA con elevado peso molecular. Los
homopolmeros como el PHB son materiales muy cristalinos y rgidos pero los
heteropolmeros de hidroxibutirato-hidroxivalerato son ms dctiles y
resistentes. La adicin de monmeros de hidroxivalerato disminuye el punto de
fusin pero aumenta su biodegradabilidad. Los copolmeros PHBV se forman
cuando se utilizan mezclas de sustratos como glucosa y valerato (Hermida y
Daz, 2004; Dantas, 2005).
Las dos clases de PHAs ms comunes son el homopolmero
polihidroxibutirato P(3HB) y el copolmero de polihidroxivalerato conocido como
polihidroxibutirato-valerato (PHBV). El P(3HB) tienen propiedades similares al
polipropileno, puede ser procesado por tcnicas de extrusin e inyeccin, es
altamente cristalino y muy frgil, mientras que el copolmero PHBV es menos
cristalino, ms flexible y fcil de procesar. Un nombre comercial de este
copolmero es Biopol y se obtiene agregando cido propinico. El ms
ampliamente estudiado es el P(3HB), que presenta unidades repetidas de
cido 3-hidroxibutirico, todas en la configuracin D (-), debido a la
estereospecificidad de las enzimas involucradas en la sntesis, lo que lo hace
totalmente cristalino y frgil. La masa molecular del P(3HB) bacteriano vara
entre 103 a 3 x 106 Da, con una polidispersidad en torno a 2. Las densidades
del polmero amorfo y cristalino respectivamente son de 1,18 y 1,26 g /cm 3. Es
soluble en cloroformo y en hidrocarburos halogenados, presenta poca
resistencia frente a los cidos y las bases, pero es muy resistente a la radiacin
ultravioleta.
La temperatura de transicin vtrea del P(3HB) es de 5 y la de fusin es
175 C, cerca del punto de degradacin trmica (200 C), lo cual restringe su
procesamiento. Presenta propiedades mecnicas similares a las del
polipropileno (PP); sin embargo, sus aplicaciones son limitadas. En el mdulo
de Young se encuentra entre 3,5 a 4,0; su resistencia a la traccin es de 40
MPa, la capacidad de elongacin es de 5 % inferior a la del PP, por lo que es
muy frgil, caracterstica que puede ser atribuida a la ruptura y degradacin de
las cadenas polimricas y la formacin de rajaduras en las esferulitas durante
el proceso de extraccin del polmero. Dentro de la clula, existe en estado
lquido y amorfo; sin embargo, despus de la extraccin de la clula por
solventes orgnicos, el P(3HB) se convierte en estado altamente cristalino (5558 %) lo que le da bastante dureza, pero a su vez lo hace un material muy
quebradizo. La incorporacin de monmeros (3HV) en el polmero conduce a
una disminucin en la cristalinidad y punto de fusin, con una disminucin de
la rigidez y un incremento en la dureza, haciendo a poli (hidroxibutirato-co-

10

hidroxivalerato (PHBV)(3HB-co-3HV)y otros copolmeros relacionados ms

adecuados para aplicaciones comerciales (Hermida y Daz, 2004).
Dependiendo de la longitud de la cadena lateral en las unidades
monomricas del polmero PHA (una propiedad que puede ajustarse
modificando la composicin del medio de crecimiento o por modificacin
gentica de la bacteria productora), pueden asegurarse PHAs con diversos
puntos de fusin, cristalinidad, flexibilidad y resistencia a la tensin (Madigan et
al., 2004). En el cuadro 2 se observa una comparacin de algunas
propiedades entre el polipropileno, un homopolmero polihidroxibutirato (PHB) y
un heteropolmero hidroxibutirato-hidroxivalerato (PHBV) en contraste con los
polmeros de cadena corta como el PHB o el PHBV, los PHAs de cadena
mediana son menos cristalinos y ms elsticos.

Cuadro 2. Comparacin de algunas propiedades entre polisteres sintticos

(polipropileno) y polihidroxialcanoatos (Dantas, 2005)
Propiedad
Masa molecular x 103 Da
Densidad (g.cm3)
Temperatura de
fusin (C)
Temperatura de
transicin vtrea (C)
Cristalinidad (%)
Distribucin de masa
molecular
Mdulo de Young (GPa)
(Fuerza de tensin)
Resistencia a traccin
(MPa)

Polipropileno

P(3HB)

2,2-7,0

1,0-8,0

0,90-0,94

1,23-1,25

170-186

171-182

45

4-10

65-70

65-80

5,2-12,0

2,2-3,0

1,7

3,5-4,0

35

40
11

PHBV (20 % HV)

145

56

1,2

Extensin hasta quiebre

(%)
Resistencias a radiacin
ultravioleta
Resistencia a solventes

400

5-8

Baja

Alta

Alta

Baja

Permeabilidad de
oxgeno (cm3 .m2 .atm-1 d- 1700
1
)
Biodegradabilidad
Nula

50

45
Buena

Muy buena

6.

Organismos que sintetizan PHAs

Los PHA son polisteres termoplsticos sintetizados por diversos
organismos, incluyendo procariotas y algunas plantas, bajo determinadas
condiciones de crecimiento. Si bien existen reportes sobre la produccin de
PHAs en plantas, las clulas vegetales obtienen rendimientos menores al 10 %,
mientras que algunas bacterias logran acumular estos biopolmeros de manera
que hasta 80 a 90% del peso seco es atribuible al PHA, convirtindolas en
candidatos idneas para la produccin de PHAs a nivel industrial (Rivera y
Nevrez, 2009).
Los PHAs son producidos por una gran variedad de procariotas (Cuadro
3), siendo acumulados en forma de grnulos en el citoplasma, visibles el
microscopio ptico de contraste de fases debido a su elevada refractividad
(Dantas, 2005). Las bacterias aerobias, anaerobias, hetertrofas y
fotosintticas acumulan PHAs. Las bacterias nitrofijadoras en particular,
acumulan estos polmeros como estrategia de supervivencia y de regulacin
del metabolismo energtico tanto en simbiosis como en vida libre.
Se ha detectado la acumulacin de PHAs en cerca de 300 especies
bacterianas; sin embargo, el porcentaje de acumulacin en muchas de ellas es
muy bajo, por lo cual se rechazan ante la imposibilidad de industrializar el
proceso; no obstante, especies como Cupriavidus necator (Ralstonia eutropha),
Methylobacterium spp. Alcaligenes latus, Pseudomonas oleovorans, P. putida,
P. denitrificans, P.aeruginosa, Bacillus megaterium, Halomonas boliviensis,
Azospirillum brasilense, Escherichia coli recombinante y Azotobacter vinelandii
han sido investigadas ampliamente (Barbosa
et al., 2005). Tambin son
consideradas especies de
los gneros Agrobacterium, Actinobacillus,
Mesorhizobium, Rhodobacter, Methylocistis, Leptothrix, Rhizobium, Halomonas
y Sphaerotilus (Avila, 2007; Guzmn y Guz, 2008).
Existen gneros de bacterias que sintetizan el polmero nicamente en la
fase estacionaria de crecimiento, por limitacin de un nutriente en presencia de
12

una fuente de carbono en exceso, por ejemplo: C. necator, P. oleovorans,

Azotobacter beijerinckii, y Azospirillum brasilense. Otras bacterias acumulan
PHAs durante su crecimiento, sin necesidad que se agote un nutriente
esencial, ejemplo: Mesorhizobium plurifarium, Alcaligenes latus, Pseudomonas
putida, Haloferax mediterranei, Azotobacter chroococcum, los mutantes de
Azotobacter vinelandii y las cepas recombinantes de E. coli (Lasala et al.,
2004, Chen et al., 2006; Choi et al., 1998).
C. necator produce PHAs de cadena corta (unidades C3 a C5). Adems
del homopolmero PHB, puede producir polmeros que contienen varias
porciones de numerosos monmeros C3 a C5 diferentes. La naturaleza y
proporcin de estos monmeros estn influenciados por la fuente de carbono
suministrada en el medio de cultivo (Cuadro 3).Por ejemplo, cuando se
suministra cido propinico o cido pentanoico, se obtiene un copolmero
aleatorio que contiene monmeros tanto de
3-hidroxibutirato (3HB) como
3-hidroxivalerato (3HV).

Cuadro 3. Fuente de carbono, compuesto limitante y tipo de PHA producido

por diferentes bacterias (Dantas 2005; Rivera y Nevrez, 2009)
Bacteria
Alcaligenes latus
Azotobacter vinelandii
Azospirillum
brasiliense
Bacillus cereus
B. megaterium

Fuente de C

Compuesto limitante

Savia de maple

Amonio

P (3HB)

Agua residual

Oxgeno

PHBV

Amonio, carbono,
oxgeno, magnesio
Glucosa

Sulfato de potasio

P (3HB)

Glucosa

Sulfato de potasio

P (3HB-co-3HV)

Sulfato de potasio

P (3HB)

Sulfato de potasio

PHB, PHBV

B. subtilis
B. thuringiensis
Bacillus spp.
Cupriavidus necator
E. coli recombinante
Halomonas boliviensis

Tipo de PHA

Caldo nutritivo

Cado nutritivo,sucrosa,
Sulfato de potasio
alcanoatos
Butrico+valrico
Amonio
Aceite de soya
Glucosa, fructosa,
suero de leche
Almidn hidrolizado
13

PHB, PHBV
P (3HB-co-3HV)
P (3HB-co-3HHx)
P(3HB), P (3HD)
PHB

Hypomicrobium sp.
Methylobacterium sp.

Carbono
Metano

P (3HB)
Amonio,fierro,sulfato,
magnesio,
manganeso.

Pseudomonas sp.
P. aeruginosa
P. oleovorans
P. stutzeri
Rhodopseudomonas
palustris
Rhodosporillum
rubrum
Rhodobacter
sphaeroides

Glucosa

Hierro, magnesio

P (3HB)

Acido octanoico

Amonio, fosfato,
magnesio,
sulfato

P (3HO)

Glucosa

Hierro, magnesio

P (3HB)

C02, acetato

P (3HB)
Amonio, fosfato,
sulfato de potasio
Amonio, fosfato,
sulfato de potasio
Amonio, magnesio,
oxgeno

Acetato

Rhizobium ORS571
S.cerevisiae recomb.

Glucosa

P (3HB)

P (3HB)

P(3HB)= poli (3-hidroxibutirato); P(3HV)= poli (3-hidroxivalerato); P (3HHx) = poli

(3-hidroxilhexanoato); P (3HO)= poli (3-hidroxialcanoato); P(3HD) = poli
(3-hidroxidecanoato).

Los primeros reportes de la formacin de PHA mcl por Pseudomonas

fueron en P. oleovorans, describiendo la produccin del polmero con 3hidroxioctanoato por la asimilacin de cidos grasos de cadena corta y cadena
larga; sin embargo, la sntesis de PHA mcl es ahora considerada pertinente no
slo para P. oleovorans, sino tambin para todas las Pseudomonas
fluorescentes. Muchas especies productoras pueden sintetizar estos polmeros
con varios grupos funcionales como halgenos, alquilos ramificados, fenilos,
fenoxilos, oleofinas y steres, cuando son cultivadas con sustratos que tienen
las estructuras qumicas correspondientes y se ha determinado que estos
grupos funcionales pueden mejorar las propiedades fsicas de los PHA mcl
(Avila, 2007).
Franco et al. (2009), detectaron PHAs en actinomicetos aislados de
suelos rizosfricos y observaron el mayor rendimiento, Y p/x, (27,48 % en peso
seco), en una cepa identificada como Streptomyces subrutilus. Por su parte,
Azotobacter sp. FA8 es una bacteria productora de PHB, aislada de muestras
de suelo y puede utilizar sacarosa o melaza de caa. Adems este
microorganismo no forma cpsula, lo cual significa que no deriva la fuente
carbonada para la sntesis de exopolisacridos.

14

Los productores naturales de PHAs como Azotobacter sp. FA8 se han

adaptado a la acumulacin de este polmero durante su evolucin, pero
normalmente tienen un tiempo de generacin largo y temperaturas de
crecimiento relativamente bajas. Adems son difciles de lisar y poseen
enzimas que degradan el polmero acumulado. E. coli no tiene la capacidad de
sintetizar o degradar PHA, pero crece rpido y es fcil de lisar. Se han
expresado los genes pha de varias especies bacterianas en E. coli,
obtenindose buenos rendimientos del polmero. Asimismo, al no poseer
enzimas que degradan a los PHA, E. coli permite la acumulacin del polmero
de alto peso molecular.
Los genes necesarios para la sntesis de PHB en Azotobacter sp. FA8,
phaA, phaB y phaC han sido clonados y caracterizados en el laboratorio y
transferidos a una cepa de E. coli, para lo cual se construy un plsmido
recombinante introduciendo los genes de Azotobacter sp. FA8 bajo la
regulacin del promotor lactosa en un vector de expresin de alto nmero de
copias. Este plsmido se transfiri a E. coli y permiti la obtencin de PHA en la
cepa recombinante a partir de glucosa. Esta cepa bacteriana tambin degrada
lactosa por lo que se analiz la produccin del polmero utilizando lactosa y
tambin lactosuero en un medio salino, obtenindose PHAs en ambos casos
(De Almeida et al., 2004).

7.

Biosntesis
La biosntesis de P(3HB) o de otros PHAs se inicia con el transporte
facilitado y difusin pasiva de una fuente de carbono hacia el citoplasma, para
ser convertida en un tioster (coenzima A) de un hidroxialcanoico, que puede
ser utilizado como sustrato por la PHA sintetasa y a travs de varios caminos
anablicos o catablicos se forma un polister por accin de la enzima
sintetasa. Independientemente de la fuente de nutriente utilizada, la sntesis de
PHAs depende de la formacin de acetil-CoA, un intermediario en las vas
degradativas de los carbohidratos y del ciclo de Krebs. Durante el crecimiento
vegetativo, el acetil CoA sigue el ciclo del cido tricarboxlico
y es oxidado
hasta dixido de carbono y agua generando energa en forma de ATP y GTP.
En ausencia de restricciones nutricionales, el nivel de CoASH se incrementa y
el acetil-CoA sigue el ciclo de Krebs. Cuando el crecimiento es limitado por los
nutrientes el nivel de CoASH se reduce y se favorece la sntesis de PHAs
(Dantas, 2005).
Existen cuatro rutas metablicas para la sntesis de PHAs, relacionadas
con el tipo de microorganismo productor, el sustrato fuente de carbono y el tipo
de PHA producido. Tres de estas rutas pueden ser utilizadas para la sntesis de
P(3HB). En la primera ruta C. necator utiliza sustratos como carbohidratos,
piruvato o acetato para la sntesis inicial de acetil-CoA. En el mecanismo de
15

sntesis de PHAs de cadena corta (C3 a C5), intervienen bsicamente tres

enzimas -cetoacil-CoA tiolasa, acetoacetil-CoA reductasa y
P (3HB)
polimerasa.
En el primer paso de la biosntesis, las cetotiolasas catalizan la adicin
reversible de un grupo acetil a una molcula de acetil- CoA. Dependiendo de la
especificidad por el sustrato existen dos grupos de -cetoacil-CoA tiolasas. El
primer grupo consiste en tiolasas con una amplia especificidad por el
-cetoacil-CoA en un rango de C4 a C16, son involucradas en la degradacin de
cidos grasos y estn localizadas en el citoplasma de procariotas y en
mitocondrias y peroxisomas de clulas vegetales y de mamferos. El segundo
grupo de tiolasas est considerado como biosinttico, tiene un estrecho rango
de especificidad por el tamao de la cadena de C3 a C5 y presentan dos sitios
activos de cistena. Inicialmente en la reaccin, un sitio activo con cistena
ataca una molcula de acetil-CoA para formar el intermediario acetil-S-enzima.
A continuacin, una segunda cistena deprotona otra molcula de acetil-CoA,
resultando una molcula inactiva de acetil-CoA que es capaz de atacar el
complejo acetil-S-enzima y formar de esta manera acetoacetil-CoA.
En el segundo paso de la biosntesis, una acetoacetil-CoA reductasa que
es una (R)-3 hidroxiacil-CoA deshidrogenasa dependiente de NADPH reduce
(de manera reversible) las molculas de acetoacetil-CoA en D (-) - 3hidroxibutiril-CoA (reaccin estereoselectiva). En C. necator se han encontrado
dos tipos de acetoacetil- CoA reductasas con diferente estereospecificidad a
sustratos y coenzimas. La enzima NADH dependiente es activa con sustratos D
(-) y L (+), en tanto que la NADPH dependiente y estereospecfica solo se
activa con sustratos de cadena C4 a C6 (D (-) 3-hidroxiacil-CoA.
En el tercer paso, la P(3HB) polimerasa o sintetasa cataliza la reaccin
de polimerizacin entre molculas de hidroxibutirato, formndose el PHB
(Figuras 8,9
y 10), como un polmero de l0 5 a l06 unidades de monmeros y
se acumula en los grnulos, conteniendo cada uno aproximadamente 1000
cadenas de polmero. La actividad de polimerizacin de la sintetasa se basa en
la formacin de enlaces ster con un residuo de cistena como sitio activo. Se
presume que el rol de la PHA polimerasa en la transferencia de monmeros en
la cadena, incluye algn control en el peso molecular del polmero producido, lo
cual es una caracterstica tpica de cada microorganismo. El gen phaC es
esencial para la actividad de la sintetasa de la cual se distinguen dos formas:
una activa en las clulas que acumulan PHA y una forma no activa en las
clulas que no estn acumulando y donde el phaC es ms susceptible a la
degradacin. Durante el crecimiento no limitado predomina la forma soluble.
Cuando cambian las condiciones del medio con limitacin de nutriente se
favorece la formacin de PHA y aparece la forma asociada a los grnulos de
PHA, desapareciendo la forma soluble.
16

2 acetil CoA acetoacetil-CoA 3 hidroxibutiril-CoA

CoA SH
CoASH
NADPH NADP+ + H+

P (3HB) +

En la segunda ruta, Rhodopseudomonas rubrum utiliza sustratos como

acetato y anhdrido carbnico. El acetoacetil-CoA formado por la B-cetotiolasa
es reducido por una reductasa NADH dependiente, originando S-3-hidroxibutilCoA, el cual es convertido a R-3-hidroxibutil-CoA por dos enol-CoA hidratasas.
El ltimo paso de la polimerizacin es catalizado por la P (3HB) sintetasa.
La tercera ruta de biosntesis de PHAs es observada en la mayora de
especies de Pseudomonas grupo I (P. olevorans), utilizando sustratos como
cidos grasos (Figura 11) y sustancias que pueden ser convertidas en alcanos
o cidos alcanoicos. Estos cidos son activados por una tioquinasa y son
normalmente degradados va -oxidacin, resultando en la formacin de acetilCoA o propionil-CoA. El P(3HB) puede ser formado a partir de acetil-CoA
como en la primera ruta y los copolmeros pueden ser formados a partir de
acetil-CoA ms propionil-CoA. Los intermediarios de la ruta de -oxidacin
pueden ser direccionados a la sntesis de P(3HB) u otros PHAs de cadena
media. Una coenzima tioster de un cido 3-cetoalcanoico con cuatro o ms
tomos de carbono puede ser reducida a su correspondiente tioester R-3hidroxiacil-CoA por una 3-cetoacil-CoA reductasa. Tambin pueden ser
utilizados otros intermediarios como los tiosteres S-3-hidroxiacil-CoA y enoil
CoA, a travs de la conversin a sus correspondientes tiosteres R-3hidroxiacil-CoA que servir de sustrato para las PHA sintetasas (Figura 11).
Una cuarta ruta, est presente en todas las especies de Pseudomonas
pertenecientes al grupo II (P. aeruginosa), utilizando sustratos como gluconato
o acetato para la sntesis de PHAs de cadena corta.

17

Azucare
s

Acetil CoA

Acetil CoA
B cetoacil CoA
tiolasa

Acetil S - enzima

Acetoacetil - CoA

NADPH +
H+
NADP+

Acetoacetil CoA
reductasa
(R) 3 hidroxibutiril CoA

P (3HB) polimerasa o
sintetasa

CoASH
PHB

18

CoASH

Figura 8. Diagrama de flujo que presenta las etapas de la sntesis de

PHB por Cupriavidus necator a partir de carbohidratos, piruvato
o acetato.

19

Figura 9. Serie de reacciones de la sntesis de PHB en Cupriavidus

necator.

20

Figura 10. Metabolismo de polihidroxibutirato (Cholula,2005).

21

Figura 11. Ruta metablica para la sntesis de polihidroxialcanoatos a

partir de cidos grasos (Dantas, 2005).
Avila (2007), menciona que la biosntesis de PHAscl involucra dos rutas
metablicas diferentes, dependiendo del sustrato empleado, la primera est
mediada por el uso de monmeros generados durante la oxidacin de cidos
grasos como el enoil-CoA, por lo que no implica a las enzimas tiolasa y
reductasa. Se produce PHA principalmente con monmeros de 3hidroxivalerato (3HV), pero tambin se encuentran pequeas cantidades de
3HB. La segunda va envuelve el uso de carbohidratos, por la ruta metilmalonilCoA. Se acumula PHA con monmeros de 3HV, con acetil-CoA y propionil-CoA
como precursores: el succinil-CoA es convertido a metilmalonil-CoA, el cual es
descarboxilado a propionil-CoA. Por su parte, el
acetil-CoA proviene de la
gliclisis. Este tipo de va es caracterstica de los actinomicetos.
Cuando el microorganismo es cultivado con carbohidratos como nica
fuente de carbono, el PHA producido est compuesto principalmente por
monmeros de C10 y C8. Por este motivo se sugiere que estos monmeros
son derivados de intermediarios de la biosntesis de cidos grasos a partir de
glucosa. Se forman molculas de 3-hidroxiacil a partir de la condensacin de
molculas de Acetil-CoA, va malonil-CoA, para formar el hidrxido que ser
incorporado al polmero, que a su vez es transferido de la Acyl Carrier Protein
(ACP) para la coenzima A por la transacilasa para luego realizar la reaccin de
polimerizacin catalizada por la PHA sintasa.

22

Cuando la fuente de carbono est constituida por cidos grasos de C6 a

C12, los monmeros de PHAs tienen la misma longitud que el sustrato
disponible o tienen dos, cuatro o seis tomos menos. Cuando se administran
cidos grasos de C13-C18, la composicin del PHA no est relacionada con la
longitud del sustrato, puesto que el monmero ms largo insertado tiene 11 a
12 carbonos, aunque es dependiente para configuraciones como
insaturaciones. Cuando se utilizan los cidos heptadecanoico u octadecanoico,
no se observa acumulacin de PHAs, puesto que esta fuente de carbono no
permite el crecimiento de los microorganismos. Como los intermediarios de la
oxidacin de los cidos grasos presentan una conformacin (S)-3-hidroxiacilCoA, se necesita un paso adicional para transformarlos a (3)-3-hidroxiacil-CoA,
puesto que la polimerasa para PHAmcl presenta especificidad para este tipo de
monmeros; por lo tanto enzimas como una
(R)-especfica enoil-CoA
hidratasa, una hidroxiacil-CoA epimerasa y una 3-cetoacil reductasa han sido
postuladas para unir la -oxidacin con la biosntesis de PHAs.
En Azotobacter sp. al igual que en C. necator, el polmero PHA se
sintetiza mediante un camino metablico que involucra tres enzimas, una
cetotiolasa que condensa dos molculas de acetil-CoA para formar acetoacetilCoA, una acetoacetil-CoA reductasa que convierte este compuesto en 3hidroxibutiril-Coa y una sintetasa que polimeriza los monmeros (De Almeida et
al., 2004).
En Azospirillum sp. el metabolismo de PHB es un proceso cclico, donde
la proporcin entre reacciones biosintticas y degradativas est determinada
por las condiciones de crecimiento. La va para la produccin de PHB consiste
de tres reacciones bsicas a partir de acetil-CoA. Primero, la condensacin de
dos molculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA por la enzima -cetoacil-CoA
tiolasa (codificada por el gen phhA). La segunda reaccin es la reduccin de
(R)-3 hidroxibutiril-CoA por la deshidrogenasa acetoacetil-CoA dependiente de
NADPH (gen phhB), siendo un proceso reversible y en la tercera reaccin, los
monmeros de (R)-3-hidroxibutiril-CoA son polimerizados para formar poli (3hidroxibutirato) por la polimerasa P(3HB), codificada por el gen phhC. Esta
enzima mayormente conocida como PHB polimerasa determina la composicin
del polmero resultante adems de estar estrechamente relacionada al nivel de
la produccin, largo de la cadena y polidispersidad del PHB generado, as
como en la variacin de la composicin de los copolmeros (Cholula, 2005).
La disponibilidad de acetil-CoA y NADPH son los factores ms
importantes que afectan la biosntesis de PHB tanto en C. necator como en su
recombinante E. coli. La va de las pentosas fosfatadas (PP) tambin genera
NADPH; sin embargo, su poder reductor es dirigido en su mayora a la
formacin de cidos nucleicos y aminocidos. La funcin primaria de la va
Entner-Doudoroff (ED) en E. coli es catabolizar la fuente de carbono y la
expresin del opern de la va es inducida bajo condiciones de fermentacin de
23

gluconato. A travs de esta va una molcula de NADPH, NADH y ATP es

producida por mol de glucosa y dos moles de ATP y dos moles de NADH son
producidos a travs de la va Embden- Meyerhof-Parnas (EMP). Bajo
condiciones de acumulacin de PHB, las clulas prefieren la va ED ya que
permite la formacin de NADPH que es requerido para la formacin del
biopolmero. Variando los flujos metablicos intracelulares en clulas
transformadas de E. coli, que pueden acumular PHB hasta en un 78 %, se
observ que una cantidad significativa fue dirigida a la produccin de PHB, en
comparacin con una cepa silvestre no productora donde la va ED fue muy
activa, con un decremento proporcional del ciclo de Krebs, de la via PP y de la
sntesis celular, cuando se incrementaba el contenido de PHB (Cholula, 2005).
Generalmente, el PHB es sintetizado en una va similar a la de los cidos
grasos excepto que: 1) los intermediarios de PHB son derivados de CoA y no
de protenas acarreadoras, 2) la sntesis de PHB es especfica para el
estereoismero D (-)-3-hidroxibutirato y, en muchos casos, por NADPH, 3) las
enzimas involucradas en la sntesis de PHB no se ensamblan en un complejo,
y 4) la polimerizacin del hidrobutirato produce grnulos de PHB en la interfase
del citoplasma (Trotsenko y Belova, mencionados por Cholula, 2005).
8.

Formacin de grnulos
Los grnulos de PHAs tienen un dimetro tpico entre 0,1 y 0,8 um (Dan
et al.,2008) y poseen una membrana como cobertura de cerca de 2 nm de
grosor, compuesta por lpidos y protenas, representando el 0,5 y 2 %
respectivamente del peso del grnulo. Parece que el nmero de grnulos por
clula es fijado en los estados tempranos de la acumulacin del polmero y
durante la acumulacin, la clula pierde su conformacin tpicamente cilndrica
para acomodar polmero adicional, hasta el punto en que la sntesis de PHAs
disminuye. El cese en la acumulacin de polmero puede deberse a la cantidad
acumulada, puesto que al alcanzar su porcentaje mximo de reserva, la PHA
polimerasa permanece activa, lo que sugiere que una constriccin fsica opera
e impide que la clula acomode ms polmero dentro de ella, a pesar de la
disponibilidad de sustrato y de la polimerasa activa.
Avila (2007), menciona que la formacin de los grnulos puede seguir
cuatro pasos: a) La polimerasa soluble acta con concentraciones cada vez
mayores de 3-hidroxibutiril-CoA en el citoplasma. Durante la fase lag los
oligmeros de hidroxibutiril (HB) son formados y se mantienen unidos con la
enzima. b) Estos oligmeros de HB forman micelas que aumentan en tamao e
hidrofobicidad. Consecuentemente estas pelculas proveen una unin de dos
fases, con la polimerasa en la interfase. c) La enzima entonces procede
rpidamente con la sntesis de P(3HB) dentro del grnulo en crecimiento, lo
cual precisa de una superficie disponible. d) Eventualmente las micelas
coalescen formando grandes grnulos que pueden ser fcilmente visualizados
en el microscopio de contraste de fases (Figura 12).
24

Figura 12. Mecanismo propuesto para la formacin de grnulos de PHAs

(Avila, 2007).

La PhaP es una protena de unin de PHA que determina el tamao de los

grnulos. Esta protena parece que est involucrada en el mantenimiento de las
condiciones ptimas para la sntesis de PHA y la formacin de los grnulos;
acta de manera similar a las oleosinas de las plantas productoras de aceites y
mantiene la integridad de los cuerpos oleosos previniendo su coalescencia. Las
inclusiones de P(3HB) en el citoplasma bacteriano son amorfas, insolubles en
el agua y se observan en forma de esferulitas cuyas superficies son regiones
dinmicas en donde se encuentran las protenas involucradas en la formacin y
estabilizacin de las inclusiones. Adems tambin estn presentes lpidos y
fosfolpidos.
9. Regulacin nutricional de la sntesis de PHAs
Desde el punto de vista nutricional, los PHAs, se acumulan en respuesta a
un factor nutricional limitante, como puede ser falta de nitrgeno, fsforo,
magnesio o del oxgeno y en presencia de un exceso de la fuente de carbono
y energa.
En C. necator que es la bacteria ms estudiada al respecto, el control de
esta ruta se lleva a cabo a nivel de las actividades de las enzimas biosintticas.
El principal blanco de la regulacin es la condensacin de acetil-CoA, mediada
por la -cetotiolasa. Este paso se inhibe por el CoA libre, generado
principalmente en el ciclo de Krebs, eliminndose esta inhibicin cuando se
incrementa la concentracin de acetil-CoA. As la relacin acetil-CoA/CoA
controla la actividad de la primera enzima de esta ruta biosinttica y, como
consecuencia, el destino de acetil-CoA hacia el ciclo de Krebs o hacia la
biosntesis de PHB. Por su parte, la limitacin de oxgeno aumenta la relacin
NADH/NAD por no existir un aceptor final de electrones en la cadena
respiratoria llevando a la formacin de P(3HB). Cuando existe limitacin de
25

nitrgeno, las clulas no producen protenas y se acumula el ATP cuyo exceso

provoca una disminucin de la fosforilacin oxidativa y as mimo acumulacin
de las enzimas reducidas (NADH) que permiten la formacin de P(3HB) cuya
va metablica reoxida estas coenzimas. De esta forma las condiciones
necesarias para la sntesis de PHAs son elevada concentracin de NADPH,
baja concentracin de CoA y elevada concentracin de acetil CoA.
La ruta biosinttica de PHAs en E.coli recombinante tiene varias vas que
compiten por los sustratos e incluyen la formacin de cido ctrico, cido
actico, etanol y sntesis de cidos grasos (Figura 13). Por tanto, la cantidad de
acetil CoA disponible para la sntesis de P(3HB) es dependiente del estatus
metablico celular. En un medio complejo, un mayor nmero de precursores
como aminocidos y vitaminas estn disponibles
para la sntesis de
macromolculas, lo cual genera una disponibilidad de acetil-CoA para la va de
PHAs. Por el contrario, en un medio definido, existe menos disponibilidad de
acetil-CoA, por cuanto este compuesto se debe utilizar para la sntesis de
precursores en otras rutas metablicas. La regeneracin del NADPH tambin
es importante debido a que la segunda enzima en la sntesis de PHAs,
(reductasa) lo requiere como cofactor. La sntesis de aminocidos tambin
requiere NADPH, por ejemplo se necesitan 8 moles de NADPH para la sntesis
de 1 mol de metionina a partir del oxalacetato. Esta puede ser otra razn para
la menor acumulacin de P (3HB) en un medio definido en el cual los
aminocidos deben ser sintetizados. Asimismo, es conocido que la
cetotiolasa es inhibida por las molculas libres de CoA. Las clulas operan el
ciclo de Krebs intensivamente para cubrir los requerimientos biosintticos en un
medio definido lo cual deja libre molculas de CoA por accin de la primera
enzima del ciclo, citrato sintetasa. Todo esto ocasiona una baja acumulacin de
P(3HB) en un medio definido o semidefinido comparado con los medios
complejos.

En Azospirillum brasilense se ha observado que la acumulacin de PHB

aumenta drsticamente al final delGlucosa
crecimiento exponencial, siempre y cuando
la fuente de carbono no sea un factor limitante y se observa que en la fase
estacionaria el contenido de PHB disminuye (Cholula, 2005).

Acetato

Lactato

Piruvato

Acetil P

Acetil CoA

Sntesis de cidos grasos

Acetaldehido

Acetoacetil- CoA

3 hidroxibutiril- CoA

Poli (3 cido hidroxibutrico)

26

Ciclo de
Krebs

Etanol

Figura 13.
Vas metablicas que compiten con la sntesis de PHAs en
Escherichia coli recombinante
10.

Regulacin gentica de la biosntesis de PHAs

En C. necator las enzimas biosintticas de PHAs son sintetizadas
constitutivamente y su regulacin es a nivel enzimtico, con la CoA como
molcula clave reguladora. Las fasinas son protenas estructurales asociadas a
los grnulos de PHAs que impiden que otras protenas puedan asociarse
inespecficamente por lo que se relacionan con su tamao y pureza. Las
fasinas (phaP) se consideran protenas claves en la formacin de grnulos de
PHAs, relacionadas con las protenas represoras de fasinas (phaR), que se
unen a la regin promotora de phaP bloqueando la expresin de phaP en
ausencia de PHA y se desplazan en presencia del mismo, por lo que CoA es
considerado un importante regulador de fasina y biosntesis de PHAs.
En C. necator y A. vinelandii existe una relacin de la acumulacin de
los polisteres intracelulares con el sistema de regulacin metablica conocido
como PTS (sistema fosfotransferasa de azcar), ya que mutaciones en genes
que constituyen este sistema se manifiestan en una menor acumulacin de
PHB en estas bacterias. La sntesis de PHB en A. vinelandii est controlada a
nivel postranscripcional. Cuando el oxgeno es limitado, se incrementa la
actividad de la -cetotiolasa que cataboliza el primer paso de la sntesis del
polmero; sin embargo, tambin existe una regulacin a nivel transcripcional por
la protena activadora phbR.
El opern PHA de Acinetobacter sp. tambin se transcribe
constitutivamente y existe una induccin adicional por medio de un activador
transcripcional llamado phoB que se une a promotores del reguln pho,
inducida por la limitacin de fosfato. En P. aeruginosa, la regulacin del PHA
ocurre a nivel transcripcional por un mecanismo que requiere un factor cuando
crece con glutamato pero no con octanato.
11.

Produccin de polihidroxialcanoatos
Cerca de 300 especies de bacterias pueden sintetizar PHAs (Cuadro 4);
sin embargo, solo algunas han sido utilizadas para la produccin a gran escala
(C.necator, Alcaligenes latus, Azospirillum brasilense, Azotobacter vinelandii,
27

Pseudomonas oleovorans algunos metiltrofos y Escherichia coli

recombinante). Cada bacteria requiere condiciones de crecimiento especficas
para la sntesis de PHA, pero pueden ser divididas en dos grupos: uno que
requiere condiciones limitantes de algn nutriente esencial como carbono o
nitrgeno para poder incrementar la eficiencia de la produccin de PHAs, por
ejemplo C. necator, P. oleovorans y algunos metiltrofos y un segundo grupo
conformado por los que no requieren estas condiciones y acumulan PHAs
durante el crecimiento, por ejemplo A. vinelandii, A. latus y E. coli recombinante
(Franco et al., 2009).
Los procesos para la produccin de PHAs se realizan en su mayora en
fermentacin sumergida, principalmente en cultivos alimentados o fed batch
obteniendo una elevada concentracin de biomasa (necesaria para una
elevada productividad), que conduce a la formacin del polmero. Las
fermentaciones continuas permiten una alta productividad pero slo cuando el
cultivo puede ser mantenido estable sin contaminacin. Los estudios en
fermentadores muestran la influencia del tipo y concentracin de la fuente de
carbono as como de los niveles de aireacin sobre el xito productivo.

28

Cuadro 4. Produccin de polihidroxialcanoatos en diversas bacterias

Bacteria

PHA

Fuente de carbono

Tiempo
(h)

Concentracin
celular (gL-1)

Conc
PHA
(gL-1)

Referencia
Rendimiento
Yp/s
(gg-1)

Contenido
PHA (%)
Yp/x

Rendimiento
Y x/s
(g g-1)

Productividad
(g.L-1.h-1)

Cupriavidus
necator

P(3HB)

Glucosa

50

164

121

76,0

2,42

Cupriavidus
necator

P(3HB)

Glucosa

49

124

92

74,0

1,87

C02 / H2
Etanol
Glucosa
Glucosa

40
50

85,00
63,50
164,0
67,1

61,5
47,0
121,0
47,6

72,80
74,0
76,0
72,1

1,54
0.94
2,42
1,23

59

106,0

61,9

57,5

0,99

36

126,0

94,8

Cupriavidus
necator

Lee et al., 1995

Lee et al., 1995

P(3HB)

Hidrolizado
mandioca
Torta de soya+
melaza

0,00065

32,8

Cupriavidus
necator

P(3HB)

CO2

40

85,0

61,5

72,0

1,54

Cupriavidus
necator

P(3HB)-coP(3HV)

Glucosapropinico

46

158,0

117

74,0

2,55

Cupriavidus
necator

P(3HB)-coP(3HV)

Glucosapropinico

39

113,0

64,0

56,5

1,64

Cupriavidus
necator

P(3HB)

Fructosa
Glucosa

66,2
76,0

0,1245

0,284
0,1 a 0,3

29

Dantas, 2005

Lee et al.,1995
Lee et al., 1995
Lee et al., 1995
Barbosa
et al.,2005

P(3HB)

Almidn de
papa
sacarificado

68

179,0

94,0

Cupriavidus
necator

P(3HB)

Glucosa

68

181,0

99,0

Cupriavidus
necator

P(3HB)

Glucosa

36

13,45

8,11

P(3HB)

Sacarosa

18

145,0

71,4

P(3HB)
P(3HB/3HV)

Sacarosa
Sucrosapropinico

4,65

16,2
2,0

Cupriavidus
necator

Haas et al,, 2008

0,22

53,0

0,46

1,47
Haas et al., 2008

55,0
45,33

60,0

0.42

0,135

Alcaligenes latus

Alcaliges latus

Azospirillum
brasilense
Azospirillum
brasilense

El Sayed et al.,
2009
Finkler, 2006

P(3HB)
P(3HB)

Azospirillum
brasilense

P(3HB)

Azotobacter
vinelandii

P(3HB)

Tomate
Tomate

36
24

50,0

3,9

43,0

2,6
0,3

1,67
1,95

0,16
1,20

9,6

4,0

0,36

17,0

40,1

32,0

79,8

Lee et al., 1995

Martnez
et al.,2004

Lee et al.,1995
Glucosa

47

30

0,68

Azotobacter
vinelandii

P(3HB/3HV)

Beterraga+cido
pentanoico

Chromobacterium
violaceum

P(3HV)

Acido valrico

Haloferax
mediterranei

PHBV

Haloferax
mediterranei

Haloferax
mediterranei

59-71

39,5

24,5

62,0

Almidn
hidrolizado.

39,4

20,0

Glucosa

85,5

23,0

27,0

Paja de arrozalmidn maz

hidrolizadado
Almidn maz
hidrolizado
Glucosa

140,0

77,8

55,6

62,6

24,2

38,7

85,8

23,0

27,0

1-1,7

Lee et al.,1995
Finkler, 2006
Will et al., 2006

50,8

Ting et al., 2006

PHBV

P(3HB)-co3HV)
Haloferax
mediterranei

1922

Suero
hidrolizado

P(3HB)-co3HV)

12,2

31,5

Ting et al., 2006

0,29
72,8

0,09

87,5

0,14

Koller et al.,
2007

0,20

14,7

Suero hidrolizado

Haloferax
mediterranei

P(3HB)-co3HV)

Glucosa

117

85,0

48,6

Halomonas
boliviensis

P(3HB)

Glucosa

27

0,346

48,7

31

Ting et al., 2006

Klebsiella
aerogenes

Lee et al.,1995
P(3HB)

Residuos

32

37,0

24,0

65,0

0,75

Methylobacterium
organophylum

P(3HB)

Metanol

70

250,0

130

52,0

1,36

Rhizobium tropici

P(3HB)

Sacarosa
Sacarosa
sacarosa

36
36
36

4,02
3,58
1,82

18,83
19,84
18,55

Franco et al.,
2009

P(3HB)

48
48
48
48
48
48

0,724
0,716
0,971
0,967
1,152
1,169

0,299
0,279
0,361
0,336
0,146
0,192

41,32
39,07
37,27
34,82
12,68
11,05

Lasala, 2004

Mesorhizobium
plurifarium

Tomate
Lactosa
Sacarosa
Manitol
Melaza
Glucosa

Methylobacterium
extorquens

P(3HB)

Metanol

170

233,0

149

64,0

0,88

Methilobacterium
extorquens

P(3HB)

Metanol

121

223,0

136,0

61,0

1,12

Paracoccus
denitrificans

P(3HB/3HV)

Metanol+alcohol
n- amlico

120

9,0

2,34

26,0

0,02

Melaza

150

3,39

3,34

98,5

11,6

2,9

25,0

Pseudomonas
fluorescens
Pseudomonas
oleovorans

P(3HH-co3HO)

n-octano

32

Lee et al., 1995

Lee et al., 1995
Lee et al., 1995
Ramrez et al,

0,58

Lee et al., 1995

Pseudomonas
oleovorans

P(3HH-co3HO)

n- octano

Pseudomonas
oleovorans

P(3HH/3HO)

n-octano

Pseudomonas
oleovorans

P(3HH/3HO)

n-octano

PHAs-mcl

Escherichia coli
recomb.
Klebsiella
aerogenes recomb.

Pseudomonas
putida

38

37,1

12,1

33,0

0,32

2,25

1,05

46,7

0,09

45

41,8

15,5

37,1

0,34

Acido oleico

69

30,22

13,52

44,9

0,188

P(3HB)

Glucosa

39

101,4

81,2

80,1

2,08

P(3HB)

Melaza

32

37,0

24,0

65,0

0,75

Lee et al., 1995

Lee et al., 1995
Lee et al., 1995
Marsudi et al., 2007

33

0,102

La estrategia actual en la produccin de PHAs es realizar lotes

alimentados o fed batch para alcanzar elevadas densidades celulares en una
primera etapa, evitando adems la posible inhibicin por el sustrato. En una
segunda etapa se reducen los niveles de suministro de oxgeno (o se fuerza
otra condicin de estrs apropiada) para alcanzar la acumulacin del producto.
En esta etapa la concentracin de biomasa permanece constante. Existen dos
maneras para alcanzar la formacin de PHAs en las bacterias. El proceso en
paralelo se ha demostrado en Rhodospirillum rubrum y P. oleovorans; sin
embargo, durante el crecimiento celular parte del polmero formado inicialmente
se pierde debido a que se utiliza como sustrato en el mantenimiento del
metabolismo celular. En el proceso en serie, primero las bacterias se cultivan
con una fuente de carbono para obtener biomasa celular y luego se elimina un
nutriente esencial en el medio, a la vez que se aade un sustrato para la
formacin del polmero. Este es convertido directamente en polmero y el
crecimiento celular es mnimo. Este proceso se usa en la produccin de PHAs
a gran escala con C. necator.
Aunque la fermentacin sumergida es la ms generalizada para la
produccin de PHAs, la fermentacin en estado slido (FES) es una alternativa
viable. Es un proceso caracterizado por la ausencia total de agua libre en el
material slido impregnado con el medio de crecimiento microbiano. En
muchos casos el sustrato sirve tambin de soporte para el crecimiento de los
microorganismos. El desarrollo de stos puede ser tanto en la superficie del
material slido como en el caso de bacterias y levaduras as como en la parte
interna, como los hongos filamentosos que atraviesan el material.
Una de las ventajas de la fermentacin en estado slido es la posibilidad
de la utilizacin de fuentes de nutrientes de bajo costo como los subproductos
o residuos agroindustriales. Asimismo, la purificacin de los productos se
facilita por estar ms concentrados en medios slidos. Los sustratos utilizados
en FES pueden ser divididos en tres grupos, segn el compuesto principal que
constituye la fuente de carbono: los que presentan almidn (arroz, camote,
yuca), los que presentan celulosa o lignocelulosa (maderas) y los que tienen
azcares solubles como fuente de carbono (forrajes, pulpa de frutas). Dantas
(2005) investig la produccin de P(3HB) por fermentacin en estado slido de
C. necator en residuos de extracto de aceite de soya y una solucin de melaza,
a 30 C durante 36 horas de fermentacin, obteniendo 0,65 mg del polmero
por gramo de sustrato.
Lee et al. (1995) realizaron un revisin de la produccin de PHAs en
diversas bacterias como C. necator, A. latus, A. vinelandii, metiltrofos,
Pseudomonas sp.y el recombinante E. coli.
11.1 Cupriavidus necator
34

El copolmero P (3HB-co-3HV) sintetizado por C. necator es producido

industrialmente por Imperial Chemical Industries y comercializado bajo la marca
registrada Biopol . El costo estimado basado en la produccin de 500 000 kg
de polmero al ao es aproximadamente 15 dlares por kg. Los dos
contribuyentes principales al costo de produccin son la fuente de carbono
asociada a la materia prima (sacarosa, glucosa, propionato) y la extraccin del
polmero de las bacterias
C. necator, anteriomente Hydrogenomonas eutropha, Alcaligenes
eutrophus, Ralstonia eutropha y Wautersia eutropha produce PHB y
polihidroxibutirato-valerato. La mayora de trabajos de investigacin utilizan
cepas mutantes, capaces de crecer sobre glucosa; sin embargo, la cepa nativa
crece en fructosa. Industrialmente una mutante de C. necator produce P(3HB)
y P(3HB-co-3HV) a partir de glucosa y una mezcla de glucosa-cido propinico
en cultivo alimentado respectivamente. Las bacterias se cultivan en medio con
glucosa y determinada cantidad de fosfato hasta alcanzar la biomasa requerida
y despus de 60 horas de iniciada la fermentacin se limita el fosfato con
adicin constante de glucosa para mantener una concentracin entre 10 a 20
gL-1. En el cultivo alimentado, despus de 50 horas se alcanzan 121 gL -1 de
P(3HB), con un acumulacin de 70 a 80 % y una productividad de 2,42 g/L.h.
Las operaciones para la produccin de P(3HB-co-3HV) son similares a las
descritas anteriormente, pero la alimentacin se realiza con glucosa y cido
propinico. Normalmente el copolmero contiene 0-30 % de cido 3
hidroxivalrico, valor que puede ser incrementado a ms de 90 % con cidos
butrico y pentanoico.
El etanol tambin ha sido considerado como sustrato para la produccin
de P(3HB) por una mutante de C. necator. Asimismo el copolmero P(3HB-co3HV) se obtiene alimentando propanol y etanol bajo limitaciones de nitrgeno.
De igual manera, se ha reportado el uso de otras fuentes como cido lctico
con una produccin de 59 gL-1 de PHA; cido oleico con 32,5 g L -1, mezcla de
dixido de carbono e hidrgeno alcanzando 85 y 61,5 gL -1 de concentracin
celular y P(3HB) respectivamente despus de 40 horas y otros sustratos como
cido actico, steres, glicerol (Cuadro 5).
En un ensayo con C. necator, se realizaron fermentaciones por lote
alimentado en dos etapas, a escala (3 litros) usando tres concentraciones de
fructosa (5,10 y 15 gL-1). Para el medio de cultivo se realiz el balance de
materiales siguiendo la metodologa propuesta por Duarte (1995), mencionada
por Barbosa et al. (2005) y en la que se utiliza la siguiente reaccin:

C6H12O6 + 2,814 O2 + 0,75 NH3 = 3CH200,5 N0,25 + 4,14 H20 + 3 C02

35

Con base en esta ecuacin se estableci la relacin C:N en 6,85 gramos

de carbono por gramo de nitrgeno y se mantuvo constante en la primera etapa
para obtener una alta concentracin celular. En la segunda etapa las clulas
obtenidas se limitaron en la fuente de nitrgeno para permitir la acumulacin
del biopolmero. La mejor concentracin para la produccin de PHB fue 5 g. L -1,
con la que se obtuvo un porcentaje de acumulacin del 66,2 %, una velocidad
especifica de crecimiento de 0,5171 h-1 y una productividad de 0,1245 g PHB.L 1 -1
.h (Barbosa et al., 2005).

Cuadro 5. Produccin de P(3HB) por Cupriavidus necator utilizando diferentes

fuentes de carbono. X= biomasa, P=concentracin de P(3HB),
acmulo terico de P(3HB) en la biomasa, Qp = productividad

Sustrato
L-lctico+
actico
C02
Etanol
Glucosa
Glucosa
Hidrolizado
de tapioca
Aceite de
soya

Estrategia de
fermentacin

X
(g/L)

P
(g/L)

Acmulo
(% m/m)

Qp
(g/L.H)

Alimentada

75,0

54,8

73,1

1,30

Alimentada

91,3

61,9

67,8

1,55

Alimentada

63,5

47,0

74,0

0,94

Alimentada

164,0

121,0

76,0

2,42

Continua

67,1

47,6

72,1

1,23

Alimentada

106,0

61,9

57,5

1,03

Alimentada

126,0

94,8

76,0

0,99

11.2 Alcaligenes latus

El grupo Polymer Group Petrochemic Danubia (PCD) utiliza A. latus para
producir PHB con sucrosa como fuente de carbono. La sntesis de PHB est
asociada al crecimiento y la limitacin de algn nutriente no se utiliza para
inducir la acumulacin del polmero. El proceso de fermentacin se realiza con
A. latus aislado de suelo en California y que produce hasta un 80 % del peso
celular durante un crecimiento ilimitado. En un proceso fed batch ms de 1
tonelada de PHB puede ser obtenido en menos de 1 semana. Las
fermentaciones se realizan en tanques con agitacin pero tambin se utilizan
columnas de burbujas. La fermentacin se realiza en medio sales minerales
con sucrosa o glucosa como fuente de carbono. Si se aade cido propinico
como precursor se producen copolmeros de PHB/HV, as como tambin se
producen copolmeros 3HB/4HV (3 hidroxibutirato-co-4 hidroxivalerato) si se
36

aade 1,4 butanodiol como precursor. Despus de la fermentacin se cosechan

las clulas y se mantienen en suspensiones acuosas de 200 gL -1 para el
proceso de extraccin. La suspensin celular es tratada con solvente cloruro de
metileno, luego se centrifuga y el PHB disuelto y precipitado en el agua se
recupera como un polvo blanco y seco, con 99 % de pureza. La biomasa es
recuperada luego del proceso de extraccin y se puede utilizar como mejorador
del suelo.
La ventaja de utilizar A. latus frente a C. necator es su crecimiento ms
rpido, capacidad para utilizar fuentes de sucrosa baratas (residuos de
remolacha y caa) y la acumulacin de P(3HB) durante el crecimiento
alcanzando ms de 60 g L -1 de P(3HB) en cultivos alimentados con una
productividad de hasta 2,6 g.L-1.h-1 .
11.3 Azotobacter vinelandii
En la dcada del 60, se observ la acumulacin de PHAs en A.
beijerinckii principalmente con limitacin de oxgeno antes que nitrgeno. El
mutante de A. vinelandii acumula ms de 75 % de P(3HB) durante la fase
exponencial de crecimiento. La acumulacin no depende de la limitacin de
oxgeno, pero si se observa un mejora de la eficiencia para convertir la glucosa
a P(3HB). Se alcanza un rendimiento de 0,33 g P(3HB) por gramo de glucosa
que es superior a 0,05 obtenido por la cepa salvaje. La adicin de 0,05 a 0,2 %
de peptona de pescado, proteosa- peptona o extracto de levadura permite
hasta un 25 % de incremento en el rendimiento, sobre todo en cultivos bien
aireados, sin observarse mejora del crecimiento celular (Cuadro 6). El
copolmero P(3HB-co-3HV) puede ser sintetizado por A. vinelandii alimentando
con cido valrico u heptanoico durante la sntesis del polmero en residuos de
remolacha. Variando la concentracin de cido valrico
se obtienen
copolmeros con 23 % de unidades de cido hidroxivalrico
Las clulas del mutante A. vinelandii cultivadas en el medio con peptona
de pescado son frgiles y el P(3HB) puede ser extrado de manera fcil con
amoniaco acuoso 1 N (pH 11,4), a 45 C, por 10 minutos. La mezcla del
polmero obtenido tiene 94 % de P(3HB), 2 % de protena y 4 % de materiales
celulares residuales. Segn los resultados, el mutante A. vinelandii es un buen
candidato para la produccin de PHAs por su capacidad para utilizar sustratos
baratos y un eficiente proceso de purificacin; sin embargo, la productividad
debe ser incrementada mejorando la estrategia de fermentacin para alcanzar
a C. necator o A. latus.
Cuadro 6. Produccin de P(3HB) por Azotobacter vinelandii cultivado con
diferentes fuentes de nitrgeno

Fuente

de

P (3HB)

Biomasa
37

P(3HB)

nitrgeno
Ninguna
Peptona de pescado
Extracto de levadura
Triptona
Casaminocidos
Bactopeptona
Extracto de carne

(gL-1)

residual
(gL-1)
1,6
2,6
2,5
2,1
2,2
2,2
1,9

0,3
7,5
6,8
5,5
4,7
4,7
3,8

(%)
16
74
73
72
68
68
67

11.4 Metiltrofos
El metanol es una de los sustratos carbonados ms baratos que se
puede emplear en la produccin de PHAs. En un inicio la ICI patent el proceso
con Methylobacterium organophilum; sin embargo, el bajo porcentaje de
polmero acumulado haca difcil el proceso de recuperacin, por cuanto se
deba procesar una mayor cantidad de biomasa. No obstante, el bajo precio del
metanol ha sido atractivo para diversas investigaciones. De esta manera se
obtuvieron 136 gL-1 de P (3HB) en un cultivo alimentado con Methylobacterium
extorquens (antes Protomonas extorquens) usando 0,5 gL-1 de metanol como
fuente de carbono, a 30C y 2,5 ppm de oxgeno disuelto. Se determin que el
nitrgeno era requerido an en la fase de acumulacin a diferencia de C.
necator. Controlando la tasa C:N durante el cultivo alimentado la concentracin
celular final y P(3HB) fue 233 y 149 gL-1 respectivamente, en 170 horas, con
un rendimiento de 0,2 g de P(3HB) por gramo de metanol; sin embargo, la
productividad fue de 0,88 g P(3HB) L -1h-1, inferior a la de C. necator o
A. latus.
M. extorquens y Paracoccus denitrificans han sido utilizados para la
produccin del copolmero P(3HB-co-3HV) con metanol y n-alcohol amlico
como fuentes de carbono en un medio con limitacin de nitrgeno. Asimismo
Pseudomonas sp. acumul ms de 55 % de P(3HB) en un cultivo alimentado
con limitacin de nitrgeno. Por lo expuesto, el uso de los metiltrofos para la
produccin de PHA parece atractivo por la elevada concentracin de PHAs que
se puede obtener a partir de un sustrato barato como el metanol, no obstante el
contenido de PHAs as como el peso molecular (10 5) es ms bajo que el de
Alcaligenes sp. o Azotobacter sp.

11.5 Pseudomonas spp.

Algunas especies de Pseudomonas como P. oleovorans y en general
todas las Pseudomonas fluorescentes sintetizan PHAs de cadena media (6 a
14 carbonos) cuando se les cultiva en cidos alcanoicos de 6 a 10 carbonos
alcanzando 30 % de contenido de PHAs. En un cultivo alimentado de
P.oleovorans, con octano como fuente de carbono y un sistema eficiente de
38

transferencia de oxgeno, con alimentacin de magnesio y limitacin de amonio

se alcanz una concentracin celular y de PHAs de 37,1 y 12.1 gL -1,
respectivamente despus de 38 horas. As mismo, el contenido de PHA fue de
33 % y la productividad de 0,32 gL-1h-1. Por su parte, utilizando cido octanoico
como fuente de carbono y aadiendo intermitentemente sulfato de amonio y de
magnesio se obtuvieron 41,8 gL -1 de concentracin celular; 15,5 gL -1 de PHAs
y 37,1 % de contenido, despus de 45 horas. A su vez, con octanol que es
mucho ms barato que el cido octanoico se alcanz una concentracin de 14
gL-1 en 40 horas de fermentacin; sin embargo, el proceso de separacin fue
muy difcil y una gran cantidad de clulas quedaron atrapadas en la capa de
octanol despus de la centrifugacin.
Marsudi et al. (2007) cultivaron Pseudomonas putida en cido oleico
para producir PHAs de cadena media, alimentando con nitrgeno y carbono y
observaron que la acumulacin de PHAs se dio tambin durante la fase de
crecimiento. Despus de
horas se alcanz una concentracin celular de
-1
30,2 gL , un contenido de PHA de 44,8 % y una productividad de 0,188 g/L/h.
11.6 Escherichia coli recombinante
Los genes de C. necator fueron clonados en E. coli en 1988, alcanzando
un rendimiento de hasta 90 % de acumulacin de PHAs. La produccin de
P(3HB) por E. coli recombinante tiene ventajas como su rpido crecimiento,
uso de varios sustratos carbonados, gran acumulacin del polmero y la
prdida de las depolimerasas. Adems las purificacin del P(3HB) parece ser
ms fcil porque las clulas acumulan grandes porcentajes de P(3HB) en
grnulos con paredes frgiles que facilitan la extraccin; sin embargo, uno de
los problemas de emplear este recombinante es el uso de oxgeno puro para
obtener una elevada densidad celular.
11.7 Otros microorganismos
Dong et al. (2006) realizaron una fermentacin fed batch con Haloferax
mediterranei
(aqueobacteria
extremadamente
halfila,
aerobia,
quimiorgantrofa) utilizando glucosa y extracto de levadura como fuente de
carbono y nitrgeno respectivamente para la produccin de PHB. Despus de
117 horas, la concentracin celular fue de 85,8 gL -1 y 48,6 % de PHA,
caracterizado como poli (3-hidroxibutirato-co-3 hidroxivalerato) P (3HB-co-3HV
copolimero). Por su parte Lee et al. (1995) informaron que con 2 % de
almidn como fuente de carbono se alcanzaron 6 gL -1 de P(3HB), 60 % de
contenido y 0,33 gramos de P(3HB) por gramo de sustrato. As mismo, debido
a la dificultad para la contaminacin el cultivo continuo se pudo realizar
durante 3 meses.
12.

Produccin de PHAs y relacin costo-beneficio

An cuando las ventajas ecolgicas de los PHAs son notables, una
serie de factores limitan su adopcin plena como sustitutos de polisteres
39

sintticos. Los costos de produccin de PHAs son, hasta el momento mayores

que los de la produccin de polisteres sintticos. Para reducir los costos se
deben aislar cepas con mayor rendimiento y se debe optimizar el proceso en
cada operacin unitaria: seleccin de sustratos econmicos, optimizacin del
proceso de fermentacin y optimizacin de la extraccin y purificacin del
producto (Rivera y Nevrez, 2009; Arcos y Vargas, 2006).
La seleccin de los microorganismos para producir PHA se basa en
factores como la capacidad de la clula para utilizar fuentes de carbono
baratas, tasa de crecimiento, tasa de sntesis del polmero y cantidad mxima
de polmero que puede ser acumulada. Los ltimos tres afectan directamente la
productividad. La clonacin de los genes responsables de la biosntesis de
PHA en E. coli ha permitido obtener una cepa recombinante que alcanza 80 a
90 % de su peso celular seco con una concentracin del polmero superior a 80
gL-1 y una productividad mayor de 2 gL -1.h-1 en un proceso alimentado
(Dalcanton, 2006).
La productividad es definida como la cantidad de PHA producido por
unidad de volumen en una unidad de tiempo. Para una produccin de una
misma cantidad de PHAs por ao, un proceso con menor productividad
requiere mayor equipamiento. El efecto de la productividad sobre los costos de
produccin fue determinado comparando dos procesos de produccin de
P(3HB) por E. coli recombinante con cepas de diferente productividad. Para
una capacidad de produccin estimada en 100 000 t ao se observ que
cuando la productividad se increment de 1,98 g.L -1.h-1 a 3,2 g.L-1.h-1, los
costos de produccin disminuyeron de $5,37 a $ 4,491 Kg -1 P(3HB).
El contenido de PHA acumulado afecta la eficiencia del proceso de
extraccin. Para que el proceso sea rentable es necesario que la cepa
bacteriana productora sea capaz de acumular por lo menos 60 % de su masa
celular en PHAs. Este criterio elimina a las Gram positivas o aquellas no
capaces de acumular porcentajes elevados del polmero. El rendimiento y la
pureza del proceso de extraccin son dependientes del contenido de PHA. Una
menor cantidad de producto para la digestin puede ser utilizada para separar
los grnulos de PHAs de clulas con un mayor contenido de polmero. As
mismo, un bajo contenido de PHA lleva a grandes cantidades de sustrato
desperdiciado en otros fines metablicos. Comparando un cultivo alimentado
de A. latus con 50 % de contenido de P(3HB) y un rendimiento de 0,17 g
P(3HB) / g de sacarosa con un proceso en donde se alcanz 88 % del
polmero con 0,42 g de P (3HB) / g de sacarosa, se demostr que en el primer
caso el costo de extraccin fue de $ 4,48 kg -1 P (3HB) frente a $ 0,92 kg-1
P(3HB) en el segundo caso (Dalcanton, 2006).
13.

Sustratos para la produccin de polihidroxialcanoatos

40

Se conoce que en la mayora de las bacterias, la produccin de PHAs

est ligada a la escasez de nitrgeno o algn otro nutriente en relacin a una
abundante fuente de carbono, generalmente mono y disacridos o cidos
grasos. Los PHAs pueden ser producidos utilizando como fuente de carbono
materias primas como acetato, amidas, cido hidroxibutrico, cido propinico,
celulosa, glicerol, lactato, lignina, melaza, metano, aceite mineral, sacarosa,
suero de queso, triglicridos (Dantas, 2005). Una de las reas de oportunidad
para mejorar el proceso de produccin se centra en encontrar fuentes de
carbono econmicas, provenientes muchas veces de material considerado
como desecho o como subproducto abundante que ofrece por si mismo poco
valor (Rivera y Nevrez, 2009).
Los aceites de origen vegetal son una buena opcin para obtencin de
PHAs, puesto que son una fuente de carbono renovable y econmica y muchos
de los cidos grasos constituyentes de los aceites vegetales son insaturados,
por lo que pueden funcionar como precursores de monmeros insaturados que
son incorporados al polmero, lo que es esencial para algunos modificaciones
qumicas. Asimismo, el rendimiento terico de conversin de aceites vegetales
a PHAs est en el orden de 1,00 gg -1, comparado con el valor de conversin
de sacarosa de 0,33 gg-1 obtenido en la prctica industrial. La produccin de
PHAs en P. aeruginosa y P. putida fue evaluada utilizando 11 aceites vegetales
(girasol, tungue, mamona, linaza, palma, arroz, canola, maz, soya, algodn y
coco)y 10 combinaciones de stos. Los valores de PHAs acumulados por el
linaje IPT046 fueron significativamente superiores a aquellos observados para
el linaje IPT171 y alcanz hasta 60 % de la masa seca celular. El
hidroxioctanoato (3HO) y 3-hidroxidecanoato (3HD) representaron un
porcentaje mayor que 65 % de los monmeros detectados en el PHA producido
por los dos linajes bacterianos, utilizando cualquiera de los aceites (Avila,
2007).
Tambin se ha propuesto la produccin de PHAs en aceite comestible
post utilizado. Pseudomonas sp. DR2 acumul hasta un 23,52 % (peso-peso)
de PHAs de cadena mediana utilizando este sustrato como fuente de carbono.
Asimismo Grados et al. (2008) investigaron la produccin de PHAs por un
consorcio bacteriano cultivado en cidos grasos voltiles provenientes de la
digestin anaerobia de desechos agrcolas como rastrojos de Hordeum vulgare
cebada, Chenopodium quinoa quinua, Glycine max soya, Avena sativa
avena, Triticum sativum trigo, Medicago sativa alfalfa y cascarilla de Oryza
sativa arroz, observando una mayor cantidad de clulas con grnulos de PHA
(hasta 9 %, p/V) en la paja de cebada.
En una revisin de trabajos de investigacin realizada por Rivera y
Nevrez (2009) se demostr el uso de material de desecho para producir
PHAs en varios trabajos como el de Cho et al. (2001), en el que utilizaron agua
de desechos de la crianza de cerdos en la produccin de PHA por A. vinelandii
41

ATCC 53799. Este sustrato es rico en acetato, propionato y butirato y cuando

fue diluido a la mitad, A. vinelandii logr producir y almacenar PHAs hasta un
34 % (peso-peso); sin embargo, la adicin de 20 gL -1 de glucosa elev el
porcentaje hasta 63 %. Por su parte Van-Thuoc et al. (2007), utilizaron residuos
agrcolas para producir PHB con Halomonas boliviensis. Los residuos
consistan en salvado de trigo hidrolizado que result en una acumulacin de
PHAs de 33,8 % y al adicionar acetato de sodio y cido butrico se elev la
acumulacin hasta un 50 %.
Asimismo, se cultiv Haloferax mediterranei en hidrolizados de almidn
de maz, paja de arroz con almidn de maz as como suero, obteniendo PHAs
en las concentraciones de 20; 77,8 y 12,2 gL-1, correspondientes a porcentajes
de acumulacin en peso seco (Yp/x) de 50,8; 55,6 y 72,8 % respectivamente
(Chen et al., 2006; Ting et al., 2006 y Koller et al., 2007). Estos investigadores
sugieren la hidrlisis de los residuos agrcolas lo que acarrea un costo extra en
el proceso. Como una forma de superar este inconveniente se propone utilizar
un extracto enzimtico crudo de origen microbiano en lugar del uso de enzimas
purificadas (Rivera y Nevrez, 2009). Por su parte, Ramrez et al. (2005)
realizaron una fermentacin con Pseudomonas fluorescens en biorreactor air
lift con caldo melaza (10 gL-1), obteniendo 3,39 g L-1 de biomasa despus de
150 horas as como 3,34 gL-1 de PHAs, correspondientes a 98,5 %.
Otra forma de abordar la problemtica bsqueda de sustratos
econmicos consiste en aprovechar la materia prima abundante en una regin.
Lezza et al. (2007) mencionados por Rivera y Nevrez (2009) eligieron
Alcaligenes latus para producir PHB, usando como fuente de carbono savia de
maple que contiene 10-30 g L-1 de sacarosa, es abundante en pases del
hemisferio norte como Canad y puede representar una fuente renovable de
carbono para la produccin de PHB. Se acumul hasta 77 % (peso-peso) de
PHB bajo concentraciones limitadas de nitrgeno.
La industria tequilera en Mxico genera como residuo el bagazo de
agave que es la fibra residual que queda despus de cocinar, moler y extraer el
jugo fermentable de la pia de Agave tequilana Weber variedad azul. Se
considera que el 40 % del peso total del agave consumido corresponde al
bagazo residual por lo que se generan grandes volmenes de este desecho y
su disposicin constituye un problema ambiental; sin embargo, bacterias
degradadoras de celulosa como Microbulbifer degradans y de la lignina como
Sagittula stellata producen PHA y pueden ser la alternativa para reducir los
costos en la obtencin de estos polmeros (Gonzles et al., 2005).
En las plantas de tratamiento de aguas la disposicin final efectiva de
lodo producido en exceso constituye un problema ambiental. La produccin de
PHAs usando el lodo podra ser una solucin. Se ha demostrado que el lodo
desarrollado en proceso anaerobios-.aerobios para la remocin de fsforo
42

produce PHAs y bajo condiciones ptimas es posible obtener ms del 30 % de

peso seco del lodo (Arcos y Vargas, 2006).
14.

Influencia de los parmetros de cultivo en la produccin de PHB

La viabilidad econmica de un metabolito microbiano est determinada
de manera principal por la eficiencia del proceso, velocidad de crecimiento,
formacin del producto y el contenido intracelular del polmero por lo que se
debe maximizar la conversin de la fuente de carbono y finalmente la
productividad (Ackermann,1998, mencionado por Cholula, 2005).
La fuente de carbono y nitrgeno en el medio tienen gran efecto en la
sntesis de PHB. En el gnero Azospirillum la capacidad de acumular PHB bajo
condiciones microaeroflicas con o sin nitrgeno se regula principalmente de
dos modos diferentes o complementarias, uno definido por la presin de
oxgeno disuelto (P02) el cual se ha optimizado al 30 % y otro es la relacin C:N
con un valor mximo de 70, aunque se sabe que en las races de cereales la
relacin es de alrededor 30:1 Se ha observado que cuando Azospirillum
brasilense sp7es cultivado en un medio con alta presin parcial de oxgeno y
con cloruro de amonio como fuente de nitrgeno, el contenido de PHB es
menor al 1 %. En ausencia de cloruro de amonio y bajo condiciones de fijacin
de nitrgeno (microaeroflicas) en cultivo en lote, A. brasilense acumula cerca
del 75 % de su peso seco en PHB. Adicionando cloruro de amonio, el contenido
de PHB disminuye (Cholula, 2005).
Como material base para la fermentacin se utilizan carbohidratos como
glucosa, sacarosa y fructosa, as como aceites vegetales y glicerina derivada
de la produccin de biodiesel. Se ha determinado que para una eficiente
produccin de PHAs se debe mantener un valor ptimo de carbono. Para la
monitorizacin en una fermentacin con C. necator mutante se utilizaron dos
mtodos: estimacin de la tasa de evolucin del dixido de carbono (CER)
medida por espectrometra de gases y monitoreo automtico de la
concentracin de glucosa en el medio. La concentracin se mantuvo en 10-20
gL-1 y se utiliz una solucin de amoniaco para controlar el pH y suministrar una
fuente de nitrgeno durante la fase de crecimiento celular. Cuando ste alcanz
la concentracin deseada, se reemplaz la solucin de amonio por NaOH /
KOH para limitar el nitrgeno. Se encontr que la concentracin final de P(3HB)
y la productividad se incrementaron cuando la limitacin de nitrgeno se inici
en concentraciones celulares superiores a 70 gL -1, alcanzando 2,42 g.L-1.h-1,
164 gL-1, 121 gL-1 y 76 % de productividad, concentracin celular, P(3HB) y
contenido de PHB respectivamente despus de 50 horas de fermentacin. Por
el contrario, con 90 gL-1 la concentracin del polmero disminuy. Otro aspecto
a considerar es el nivel de fsforo o de nitrgeno en el medio de cultivo, pues al
reducirlo casi se duplican los rendimientos producto/biomasa.

43

Las fuentes nitrogenadas contribuyen fundamentalmente al crecimiento

microbiano ya que en la mayora de los casos contienen aminocidos libres
que pueden ser transportados a la clula sin necesidad de ser metabolizados,
lo cual sugiere un ahorro de energa y de tiempo para la multiplicacin celular.
Este aspecto ha sido estudiado en la sntesis de PHAs, concluyndose que en
general la adicin al medio de cultivo, de determinados aminocidos como la
metionina genera una mayor cantidad de polmero pues en su sntesis se
requieren ocho molculas de NADPH; sin embargo, Lasala et al. (2004)
informaron que M. plurifarium desarroll muy poco en medios con caseina,
soya, hidrolizado de levadura y peptona (una absorbancia no mayor de 1,13 =
0,45 g.L-1). Asimismo la adicin de glicina y asparagina no increment la
biomasa y por lo tanto no justifica su uso en el medio de cultivo porque
encarecera la produccin del polmero.
Respecto a la fuente de carbono, Mesorhizobium plurifarium en melaza y
glucosa alcanz un crecimiento abundante (1,152 y 1,169 gL -1), con una
acumulacin de PHAs de 146,03 y 192,05 gL -1. Por su parte, en sacarosa y
manitol se observ un crecimiento moderado (0,971 y 0,967 gL -1) que condujo
a mayores contenidos de polmero (361,90 y 336,51 mgL -1) en las clulas,
probablemente debido a que velocidades de crecimiento menores siempre
conducen a acumulaciones mayores de PHA. En este caso hasta 11,05 % con
glucosa y 37,27 % con sacarosa (Lasala et al.,2009).
En cuanto a la OTR (velocidad de transferencia de oxgeno), un
incremento se traduce en un aumento de la velocidad especfica de crecimiento
(u), debido a que los microorganismos aerobios en presencia de suficiente
fuente carbonada, la utilizan para el metabolismo energtico a travs de la
respiracin y con ella los procesos de biosntesis con lo cual queda NADH y
Acetil-CoA libres. Para Mesorhizonium plurifarium, el punto de cambio parece
estar en un valor de OTR cercano a 16 mM.L -1.h-1. En condiciones con mayor
aireacin (OTR =25,68 mM.L-1.h-1) se observ un crecimiento inestable, con
ciclos de incremento y prdida de biomasa as como en la produccin de
PHAs. Una oxigenacin elevada desviara el metabolismo hacia mayores
cuotas de respiracin, mayor oxidacin del sustrato y por lo tanto menor
disponibilidad de acetil-CoA para la produccin del polmero; sin embargo con
bajos niveles de oxigenacin y exceso de fuente carbonada, el metabolismo
energtico genera elevadas concentraciones de NADH y acetil-CoA que deben
ser convertidos en formas osmticamente neutras y que no afecten el balance
redox de las clulas, como sucede con los PHAs (Lasala et al., 2004).
Martnez et al.(2004) informaron de una cepa de Azospirillum brasilense
aislada de races de Sorghum halepense y productora de 1,5 gL -1del elemento
ms pequeo de la familia de PHA, el polihidroxibutirato (PHB). Los cultivos
realizados a pH inicial de
6,0; 6,8 y 7,4 mostraron rendimientos producto
biomasa (Yp/x) entre 9,6 y 7,4 %, alcanzado el rendimiento mximo a pH 6,8
44

para una tasa de crecimiento de 1,67 gL -1 y 0,16 gL-1 de PHB en 36 horas de

cultivo. Dicha produccin estuvo influenciada negativamente por altos niveles
de aireacin. La velocidad de la formacin del producto alcanz su valor mayor
equivalente a 0,06 mgL-1. h-1 para una OTR de 6,75 y mnimo de 0,035 mgL -1. h1
para 25,68. Para un OTR de 13,20 los valores mximos de Y p/x fueron los
ms altos tanto a 48 como a 72 horas con 300 y 420 mg L -1 respectivamente.
Por su parte, Franco et al. (2009), optimizaron condiciones de fermentacin y
aireacin para la acumulacin de PHB por Rhizobium tropici 3, determinando
que los valores mximos en el rendimiento se lograron con 472 r.minuto -1 y
1,55 vvm, mientras que para la produccin de PHB estos valores
correspondieron a 500 r. minuto-1 y 1 vvm.
Para la produccin de PHAs, el biorreactor Air lift tiene mltiples ventajas
respecto a la aireacin, debido a que las burbujas de aire ascendente
presentan mayores tiempos de residencia favoreciendo el proceso de
oxigenacin del medio de cultivo. Por el contrario, el biorreactor CSTR, provisto
de un sistema de agitacin mecnica, compuesto por un impeler unido a un
motor elctrico presenta un menor tiempo de residencia de las burbujas de aire
por lo que se requieren mayores flujos volumtricos con el fin de mantener
oxgeno disponible. Ramrez et al. (2005) estudiaron el desempeo de dos
tipos de biorreactores en la produccin de PHA con Pseudomonas fluorescens
y determinaron que en el biorreactor Air Lift se alcanz una concentracin
celular mxima de 3,39 gL-1 en 150 horas frente a 0,66 gL-1 despus de 167
horas, tiempo despus del cual se inici la fase estacionaria de crecimiento y la
produccin del polmero como un metabolito secundario.
En cuanto al inculo, en su mayora, las fermentaciones para la
obtencin de PHAs se han realizado con valores que oscilan entre 10 a 12%.
Con 10 % de inculo para Cupriavidus necator (Barbosa et al., 2005);
Haloferax mediterranei (Chen at al., 2000; Trong et al., 2006), Mesorhizobium
plurifarium (Lasala et al., 2004), Pseudomonas fluorescens (Ramrez et al.,
2005) y 12 % para Haloferax mediterranei (Koller et al., 2007). Respecto a la
temperatura, Dantas (2005) demostr que tambin influye en la produccin de
P(3HB), alcanzando el mayor rendimiento (0,65 mg del polmero por gramo de
sustrato) a 30 C durante 36 horas de fermentacin con C. necator. Por su
parte Marangoni et al. (2001) cultivaron esta bacteria en lactosa hidrolizada (20
gL-1) y observaron similares valores en la tasa especfica de crecimiento en la
primera y segunda fase de la fermentacin a 30 C (0,22 y 0,09 h-1) y 34 C
(0,25 y 0,09 h-1), concluyendo que debido a que el proceso es exotrmico, la
utilizacin de altas temperaturas (es este caso 34 C) es interesante porque
requiere menos energa para el enfriamiento del fermentador.
15.

Deteccin, extraccin y cuantificacin de PHAs

Las metodologas para detectar PHAs pueden ser realizadas in vivo as
como in vitro, siendo las ltimas ms sensibles, capaces de detectar una
45

cantidad de polmeros 100 veces menor. La deteccin in vivo se basa en la

utilizacin de diferentes tipos de colorantes en las colonias productoras: Sudan
Negro B para detectar en microscopio ptico comn, Azul de Nilo A para
detectar en microscopio con receptores de fluorescencia y Vermelho de Nilo
para detectar a travs de exposicin a luz ultravioleta. Las metodologas in
vitro adems de detectar la presencia de PHAs, permiten caracterizar y
cuantificar el polmero, inclusive sus monmeros. Ejemplo la espectrofotometra
de infravermemelho, cromatografa para resonancia nuclear magntica,
espectrometra de masas, cromatografa de permeacin en gel y colorimetra
de barrido diferencial (Gonzles et al., 2005). Una tcnica ms rpida para
identificar microorganismos productores de PHAs consiste en encontrar los
genes que codifican para las tres enzimas necesarias para la sntesis de PHAs:
ketotiolasa, acetoacetil CoA reductasa y PHA sintetasa (Revelo et al., 2007).
Para la deteccin rpida de PHAs en las clulas, las bacterias son
teidas con Sudan Negro B, indicando la naturaleza lipdica de los grnulos.
Asimismo, los grnulos tambin pueden teirse con Azul de Nilo A, una
oxazina que produce fluorescena naranja con excitacin a 460 nm (Avila,
2007). La tcnica que usa azul de Nilo se basa en el principio que los grnulos
de PHB muestran una fluorescencia fuerte naranja al ser teidos. Las clulas
de inters son expuestas al azul de Nilo al 10 % durante 10 minutos, Luego son
observados en longitud de onda de excitacin de 460 nm y son fotografiados
para su registro. El glucgeno y los polifosfatos no se tien. El colorante azul
de Nilo A es especfico para el PHB y no detecta otros PHA existentes. Las
placas de Petri con bacterias productoras de PHAs usando glucosa como
fuente de carbono y suplementadas con azul de Nilo A se colocan en la cmara
de luz ultravioleta en un ambiente oscuro y las colonias brillan (Arcos y Vargas,
2006).
La cuantificacin de polmero tipo PHA, se lleva a cabo mediante
cromatografa de gases, por espectrofotometra infrarroja con transformacin
de Fourier y por resonancia magntica nuclear (Lassala et al., 2004, Avila,
2007). En la mayora de los estudios reportados se usa cromatografa de
gases, empleando un patrn interno de cido benzoico que establece los
tiempos de retencin mediante los que se informa el tipo de estructura y la
cantidad de carbonos que pueden tener; sin embargo, para usar la
cromatografa de gases, es necesario una despolimerizacin del PHA una vez
extrado de la clula, formando metil-steres o propio-steres, dependiendo si
el mtodo aplicado es metanolisis o propionolisis, respectivamente. En el
mtodo espectrofotomtrico, el PHB es despolimerizado y deshidratado por
cido sulfrico hasta cido crotnico; sin embargo, otros compuestos tambin
pueden absorber a 200-235 nm.
Tambin se ha empleado el anlisis espectroscpico con Resonancia
Magntica Nuclear (H NMR) con 13C (13 C-NMR) para el estudio de la
46

estructura del PHA; sin embargo, para PHAs con monmeros saturados e
insaturados de cadena larga la 13C-NMR es mucho ms complicada por la
equivalencia de los cambios qumicos de los tomos de carbono y los patrones
protnicos del espectro de NMR, lo que dificulta la determinacin estructural
(Chen et al., 2006 ; Avila , 2007).
Despus del cultivo, las clulas con PHAs son separadas por procesos
convencionales como centrifugacin, filtracin o floculacin-centrifugacin.
Enseguida los procesos para la purificacin de PHAs extraen el polmero de las
clulas bacterianas con el uso de solventes orgnicos (hidrocarburos clorados)
como cloruro de metilo, cloroformo, carbonato de propileno y dicloroetano.
Estos solventes rompen las clulas solubilizando sus componentes, inclusive
los PHAs. Tambin se pueden usar compuestos orgnicos polares como la
acetona y el alcohol. Estos rompen el material celular pero no el polmero,
dejando los grnulos de PHAs intactos. Asimismo se puede utilizar una
combinacin de los dos procesos. Inicialmente se usa cloroformo, la solucin
resultante con el polmero solubilizado es filtrada para remover los restos. El
polmero es precipitado con metanol o etanol, dejando los lpidos de bajo peso
molecular en solucin (Dantas, 2005).
La empresa Imperial Chemical Industries utiliza una alternativa a la
extraccin con solventes y consiste en un tratamiento trmico de la biomasa
bacteriana para romper las clulas y desnaturalizar los cidos nucleicos. A
continuacin se realiza un tratamiento enzimtico y lavado con surfactantes
aninicos para solubilizar el material celular no deseado (restos celulares). Otro
proceso que rompe el material celular utiliza soluciones alcalinas de hipoclorito
de sodio. Los grnulos de PHA insolubles son separados de la fase acuosa por
centrifugacin. Este tipo de extraccin puede daar los grnulos. El
pretratamiento de las clulas con surfactantes ayuda a mejorar las
caractersticas del polmero extrado. El hipoclorito de sodio y cloroformo
tambin se pueden utilizar garantizando en simultneo una ruptura del material
celular y la migracin del polmero hacia la fase orgnica.
16.

Importancia de los PHAs en la supervivencia bacteriana

Los PHAs son polmeros acumulados por algunas bacterias en grnulos
intracelulares, en condiciones limitantes de nutrientes para el crecimiento y en
exceso de fuente de carbono. Cuando sta se agota, o si el nutriente limitante
es suministrado nuevamente, el PHA es despolimerizado y posteriormente
metabolizado. La utilizacin de los PHAs es considerada como una estrategia
desarrollada por las bacterias para incrementar su supervivencia en ambientes
cambiantes. Los PHAs son utilizados como fuente de carbono y energa en
escasez de nutrientes, como fuente de carbono y energa para el
enquistamiento y la esporulacin y como fuente de poder reductor para la
degradacin de compuestos txicos.
47

Trabajos realizados en laboratorio con C. necator y B. megaterium

salvajes y deficientes en la sntesis de PHB, demostraron que aquellas cepas
capaces de sintetizar el polmero de reserva tenan mayor supervivencia en
agua de ro y mayor capacidad de competencia que sus correspondientes
mutantes. Conclusiones similares se obtuvieron cuando se analiz la
supervivencia de B. megaterium utilizando microcosmos de suelo. Estos
experimentos sugirieron que la sntesis y utilizacin del polmero aumentaba la
supervivencia y la capacidad de competencia bacteriana en ambientes
naturales. Para analizar el efecto de la degradacin de los PHAs en la
supervivencia se compar la supervivencia en agua de ro de una cepa salvaje
de Pseudomonas putida con una cepa mutante en la enzima PHA
depolimerasa. Los resultados demostraron que la incapacidad de degradacin
de PHAs representa una desventaja para la supervivencia, tanto en agua de ro
estril como en agua de ro con la comunidad bacteriana normal. Adems se
comprob que la deficiencia en la capacidad de degradacin de PHAs tena
efectos negativos sobre el desarrollo de resistencia al estrs, observando una
menor supervivencia a la exposicin al etanol y al estrs trmico despus de
varios das de permanencia en agua de ro en las mutantes (de Almeida, 2004).
Cuando A. brasilense forma agregados, las clulas acumulan altas
cantidades de PHB en forma de grnulos y la envoltura celular presenta una
capa de electrones bien definida cerca de la membrana externa. En clulas no
agregadas no se observan los grnulos de PHB pero despus de 24 horas la
envoltura celular parece difusa y menos definida, observndose el inicio de la
acumulacin de PHB y la formacin de una capa delgada de exopolisacrido
durante la floculacin y enquistamiento de A. brasilense Sp7.La formacin de
PHB involucra una deshidrogenasa dependiente de NADH que compite por los
intermediarios del ciclo del cido tricarboxlico del sistema de transporte de
electrones (NADH, NADPH, ATP y acetil-CoA). Cuando la acumulacin de PHB
es interrumpida, hay ms intermediarios accesibles al ciclo de Krebs; sin
embargo, una mutante PHB negativa mostr ms agregacin que la cepa
silvestre en un medio con un relacin alta de C:N lo que demostr que la
produccin de exopolisacrido tambin compite por el poder reductor. Esta
mutante con un incremento en la capacidad para adherirse a la raz pero un
decremento en la supervivencia, demostr el papel del PHB como compuesto
de almacn de carbono y energa que promueve la supervivencia de la bacteria
cuando las fuentes exgenas son limitadas.
Razzaq et al. (2010) detectaron PHAs en cepas de Pseudomonas,
Citrobacter, Klebsiella, Escherichia y Enterobacter, a travs de la tincin
lipoflica de Sudan
Negro B y encontraron una mayor cantidad de grnulos
en las bacterias provenientes de lugares contaminados, sugiriendo la
necesidad de estos grnulos para sobrevivir donde los requerimientos bsicos
de carbono pueden estar cubiertos pero no as los de nitrgeno
48

17.

Degradacin de PHAs
Los PHAs pueden ser totalmente degradados por las bacterias que los
producen y por otras bacterias, hongos y algas (De Almeida et al., 2004). Los
microorganismos que degradan los PHAs poseen enzimas extracelulares como
las depolimerasas e hidrolasas que catalizan la ruptura del polmero en
compuestos solubles en agua que pueden ser procesados por las bacterias y
los hongos. Tambin pueden ser degradados por un mecanismo no bitico de
hidrlisis qumica especialmente en altos valores de pH.
La tasa de biodegradacin vara en funcin de la poblacin microbiana
presente en el ambiente, temperatura, pH, nutrientes presentes en el medio,
cristalinidad, aditivos y rea superficial de los polmeros. Los PHAs son slidos
insolubles en agua mientras que las depolimerasas son enzimas solubles, por
eso la degradacin acontece en una reaccin heterognea de dos etapas: la
primera es la adsorcin de la enzima a la superficie del polmero y la segunda
es la hidrlisis de las cadenas polimricas en el sitio activo de la enzima. La
hidrlisis siempre ocurre en una superficie entre las enzimas absorbidas y los
sitios de absorcin libres. Para un copolmero formado por P (3HB-co-4HB) se
ha observado una degradacin en 2 a 25 semanas, mientras que para una
pelcula de P (3HB) el tiempo vara de 0,5 a 50 semanas (Dantas, 2005).
La degradacin de los PHAs es dependiente de la estructura del
polmero debido a que las depolimerasas son enzimas altamente especficas
en cuanto al sustrato y tambin presentan estereoselectividad para unidades
de configuracin S. El tamao de la cadena tambin influencia disminuyendo la
tasa de degradacin y dificultando el crecimiento microbiano debido a un
aumento en la hidrofobicidad.
En C. necator la degradacin de P(3HB) se inicia por accin de la PHA
depolimerasa que forma cido (R)-3-hidroxibutrico que luego es oxidado por
una deshidrogenasa NAD especfica, originando acetoacetato. Posteriormente
ste es convertido en acetoacetil-CoA (Figura 14), el cual es un intermediario
comn de la sntesis y degradacin del P(3HB) (Saito, et al., 1993). As mismo
en Azospirillum spp. bajo condiciones de inanicin, la sntesis de PHAs cesa y
comienza su degradacin. Una depolimerasa unida a la membrana
probablemente degrada el PHB a su monmero D (-) B-hidroxibutirato, el cual
es oxidado hasta acetoacetato por la deshidrogenasa hidroxibutirato (BOHBDH) con la reduccin de NAD. La acetoacetato succinato CoA transferasa
cataliza la transferencia de CoA desde succinil CoA hasta acetoacetato para
producir acetoacetil CoA (Cholula, 2005).

49

Figura 14. Biosntesis y degradacin de P(3HB) en C. necator (1) 3cetotiolasa, (2)acetil-CoA reductasa dependiente de NADPH, (3)
acetoacetil-CoA reductasa dependiente de NADH,(4) PHA
polimerasa,(5) PHA depolimerasa, 6) -3-hidroxibutirato
deshidrogenasa, (7) acetoacetil-CoA sintetasa (Saito, et al.,
1993).
18. Aplicaciones de los PHAs
Los PHAs son termoplsticos y pueden ser procesados por los equipos
tradicionales, utilizndose mayormente en pelculas, inyeccin y extrusin. As
mismo tienen aplicaciones en el mbito medicinal y farmacetico, debido a su
biodegradabilidad y solubilidad en el cuerpo humano.
-

Aplicaciones industriales: Transportadores biodegradables para la

liberacin controlada de fertilizantes, fungicidas, herbicidas e insecticidas,
redes de pesca, embalajes para alimentos, frascos, recipientes,
emulsificantes, materia prima para la produccin de tintes, adhesivos.
Aplicaciones mdicas: Grapas, jeringas, suturas, materiales osteosintticos
como placas seas, trasportadores biodegradables para la liberacin
controlada de drogas y medicamentos.
Precursores para la sntesis qumica de sustancias pticamente activas

Una de las ms importantes aplicaciones del PHB es como material para

aplicaciones biomdicas en filamentos de suturas, portadores de drogas y
50

generacin de constructos para el crecimiento celular, debido a que resulta

biocompatible. Es particularmente importante el hecho que el producto de la
degradacin del PHB, es decir D(-)-3-hidroxibutirato es un metabolito
intermediario comn presente en las clulas animales y se ha detectado
tambin en grandes cantidades en el plasma sanguneo humano, lo cual
reafirma su biocompatilidad.

19. Referencias bibliogrficas

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