Anlisis molecular y tcnicas de amplificacin molecular.

PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa): La reaccin en cadena de la polimerasa

es una reaccin enzimtica in vitro que amplifica millones de veces una secuencia
especfica de DNA durante varios ciclos repetidos. Para ello, la reaccin aprovecha la
actividad de la enzima DNA-polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente
el DNA en las clulas. Los elementos importantes en la reaccin son el templado o molde
(ADN o ADNc), la enzima, los oligonucletidos o primers, los desoxirribonucletidos
trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina), el in magnesio (Mg +), una
solucin amortiguadora o buffer y agua. Todos estos elementos interactan en tres etapas
principales de las que se compone la PCR: desnaturalizacin, hibridacin y extensin. Los
equipos en donde se realiza la reaccin son llamados termocicladores, los cuales estn
diseados para establecer un sistema homogneo en donde las condiciones de
temperatura y tiempo necesarios no se modifiquen en cada uno de los ciclos.
Aplicaciones: se utiliza para para amplificar cantidades muy pequeas de DNA, analizar
y amplificar DNA de mezclas celulares, para la identificacin gentica como herramienta
forense para la identificacin de personas.
PCR Multiplex: requiere que los primers guen la amplificacin de regiones nicas de
DNA en combinacin de muchos primers bajo un simple set de condiciones de reaccin.
Posteriormente debe haber mtodos disponibles para el anlisis de cada producto de
amplificacin de la mezcla de todos los productos.
Aplicaciones: se utiliza en microbiologa diagnostica como prueba simultanea para
diferentes agentes en la misma reaccin, por ejemplo para identificar el virus Herpes
simplex 1 y 2 en un mismo ensayo o el virus de la influenza tipo A y B.
PCR Asimtrico: genera DNA de cadena sencilla debido a concentraciones desiguales
de primers en la reaccin. Ocurren dos fases: produccin de DNA de doble cadena
seguido por la produccin de DNA de cadena sencilla.
Aplicaciones:
Nested PCR: se efecta haciendo entre 15 y 30 ciclos con un primer conjunto de primers
y despus otros 15 a 30 ciclos con un segundo conjunto de primers respecto a una regin
interna del producto de ADN amplificado en primer lugar. As pues, el fragmento ms largo
producido en la primera ronda de PCR se utiliza como ADN molde para la segunda PCR.
Aplicaciones: se aplica en el diagnstico clnico de patgenos que se encuentran en
pequeas cantidades en sangre y tejidos, principalmente virus.
qPCR: es un tipo de PCR para medir la cantidad de secuencias especficas de DNA. Se
utiliza un colorante que se une a la doble cadena del DNA para cuantificar el progreso del
PCR en cada ciclo de sntesis.

Aplicaciones: se utiliza en la deteccin de microorganismos patgenos en el diagnstico

clnico.
Differential Display PCR: se realiza una transcripcin reversa de mRNAs utilizando un
set de primers oligo dT anclados; despus se realiza la amplificacin de las especies
cDNA de cada fraccin de un set de primers arbitrarios y primers anclados;
posteriormente se realiza una separacin por electroforesis de los fragmentos resultantes;
entonces se reamplifican los diferentes fragmentos que se estn buscando, clonndolos y
secuencindolos; por ltimo se realiza una confirmacin de expresin diferencial
(Northern blotting).
Aplicaciones: extensivo anlisis de expresin de genes entre grandes poblaciones de
clulas.
Amplified fragment length polymorphism (AFLP PCR): pertenece a la categora de
tcnicas de amplificacin de fragmentos de restriccin selectivos el cual se basa en la
ligacin de adaptadores a fragmentos de restriccin genmica seguido de una PCR
basado en la amplificacin con primers especficos a los adaptadores.
Aplicaciones: construccin de mapas de marcadores genticos de muy alta densidad
para su aplicacin en la investigacin del genoma, anlisis de la diversidad gentica en
distintas especies vegetales, deteccin de algunos polimorfismos.
Amplificacin dependiente de helicasa (HDA): se utiliza una DNA helicasa para
separar un DNA de doble cadena (dsDNA) y generar plantillas de cadena simple para la
hibridacin del primer y la subsecuente extensin. Como la DNA helicasa desenrolla
enzimticamente dsDNA, el calor inicial de desnaturalizacin y los subsecuentes pasos
del termociclador requeridos para el PCR pueden ser todos omitidos. HDA proporciona un
simpe esquema de amplificacin de DNA: una temperatura desde el inicio hasta el final de
la reaccin.
Aplicaciones: deteccin de la presencia de algn microorganismo en una muestra.
Hibridacin in situ fluorescente (FISH): se basa en la hibridacin de DNA nuclear con
una sonda de DNA marcada con un fluorforo en la interfase celular o en la fijacin de los
cromosomas en metafase en un portaobjetos.
Aplicaciones: aplicaciones diagnosticas para la identificacin de anomalas en los
cromosomas.
Electroforesis en Gel con Gradiente de Desnaturalizacin/Temperatura
(DGGE/TGGE): DGGE se basa en la migracin de fragmentos amplificados por PCR en
geles de acrilamida. El ambiente desnaturalizante se crea por mantener una temperatura
uniforme entre 50 y 65 C y un gradiente desnaturalizante lineal formado por urea y
formamida. El incremento de una concentracin desnaturalizante separa las cadenas
dobles de DNA en dominios distintos. Cuando un dominio alcanza su temperatura de
desnaturalizacin en una posicin particular del gel ocurre una transicin de hlice doble a

parcialmente desnaturalizada, y la migracin de la molcula prcticamente se detiene. Las

variaciones en la secuencia de los dominios causa que sus temperaturas de
desnaturalizacin sean diferentes dentro del gradiente desnaturalizante, logrndose la
separacin de los dominios de manera efectiva.
TGGE explota los principios de DGGE, sin utilizar los geles de gradiente qumico
desnaturalizante, hacindolo ms simple y rpido. El DNA amplificado se aplica a un gel
de poliacrilamida que contiene urea. Durante la electroforesis, la temperatura se
incrementa gradual y uniformemente. El resultado es un gradiente de temperatura lineal
en el transcurso de la electroforesis. El ambiente desnaturalizante se forma por una
concentracin constante de urea en el gel, combinado con el gradiente de temperatura
temporal.
Aplicaciones: se pueden detectar mutaciones puntuales por la separacin de los
fragmentos de DNA que difieren en su secuencia de una base nitrogenada, anlisis de la
estructura y dinmica de comunidades microbianas complejas.
Small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA): se utiliza la tcnica de PCR para amplificar
la pequea subunidad ribosomal del RNA de los genes de una bacteria. Se utiliza un
primer del PCR marcado con un compuesto fluorescente para permitir la deteccin del
producto amplificado. El producto es diferido con enzimas de restriccin y se emplea un
una unidad de electroforesis capilar con un detector de fluorescencia inducido por laser
detectando nicamente los fragmentos con la marca fluorescente.
Aplicaciones:
Analisis de restriccin de ADN ribosomal amplificado (ARDRA): Esta tcnica se basa
en la digestin del gen ribosomal 16S previamente amplificado mediante la PCR con lo
cual el producto obtenido se separa mediante electroforesis en gel de agarosa para una
identificacin adecuada. La identificacin se lleva a cabo comparando los perfiles de
bandas experimentales con los obtenidos mediante anlisis in silico evitando que
especies diferentes exhibieran perfiles similares.
Aplicaciones: se aplica para la identificacin de cepas diferencindolas entre si utilizando
la subunidad 16S del rDNA amplificado.
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPDs): es un tipo de reaccin PCR en el cual
los segmentos de DNA amplificados son aleatorios. Se utilizan pequeos primers de
oligonucletidos sintticos de 10 bases aproximadamente de secuencias aleatorias. Los
productos de amplificacin son generalmente separados en geles de agarosa y teidos
con bromuro de etidio.
Aplicaciones: Es comnmente usado como un marcador molecular en estudios de
diversidad gentica.
Terminal fragment length Polymorphism: la tcnica emplea PCR en el cual uno de los
primers est marcado fluorescentemente en la terminacin 5 y se utiliza para amplificar la

regin seleccionada de los genes de la bacteria que codifican 16S rRNA del DNA total de
una comunidad. El producto de la PCR se digiere con enzimas de restriccin y el
fragmento de restriccin terminal marcado fluorescentemente fue medido utilizando un
secuenciador de DNA automatizado.
Aplicaciones: se utiliza para evaluar la diversidad compleja de las comunidades
bacterianas y para comparar rpidamente la diversidad y estructura de las comunidades
de diferentes ecosistemas.