Las protenas son macromolculas complejas que juegan muchos importantes
papeles en la regulacin de los procesos de mantenimiento de la vida en los
organismos vivos. La protena tiene su funcin especfica gobernada por la secuencia de aminocidos constituyentes y una resultante en tres dimensiones (3D) estructura. Una protena que funciona sufre cambios estructurales dando lugar a una conformacin funcional especfico en un precisamente controlada de forma y puede residir transitoriamente en relativamente estable conformaciones intermedias. Por lo tanto, podemos aproximar las transiciones estructurales de una protena por una serie de cuasi-equilibrio procesos a travs de los intermediarios transitorios. En general, una transicin entre los intermedios transitorios se produce en una amplia gama de escalas de tiempo de sub-picosegundo al segundo, y en escalas de longitud de subangstroms a decenas de angstroms. Probar tales movimientos rpidos y de pequea amplitud de protenas, necesitamos una herramienta experimental que no slo est equipado con excelente resolucin espacio-temporal, pero tambin es aplicable a las protenas en condiciones fisiolgicas (es decir, en fase de solucin acuosa). La dinmica de las transiciones estructurales de protenas han sido por lo tanto ahora estudiado principalmente mediante el uso de espectroscopia con resolucin temporal, 01.04 cristalografa de rayos X resuelta en el tiempo, 5-8 y multidimensional resonancia magntica nuclear (RMN) spectroscopy.9,10 Sin embargo, cada uno de esos mtodos experimentales tiene su propia limitacin, y ninguno de ellos satisface todos los requisitos anteriores necesarios para sondeando movimientos rpidos y pequeas de protenas en solucin. En esto Al respecto, de rayos X de resolucin temporal solucin de dispersin (TRXSS), tambin conocido como liquidography de rayos X resuelta en el tiempo (TRXL), 11 a 17 es una tcnica complementaria muy adecuado para la investigacin de la protena dinmica estructural en solucin. Como se muestra esquemticamente en la figura 1, la tcnica hace uso de un esquema que emplea la bomba-sonda (1) un pulso de bombeo ptico que inicia transiciones estructurales de protenas fotoactivos y (2) un pulso de rayos X de la sonda que detecta subsiguiente cambios estructurales despus fotoexcitacin. Puesto que los rayos X dispersarse fuera de todos los pares atmicos en una molcula de protena, una radiografa patrn de dispersin proporciona informacin sobre la estructura global de la protena con subangstrom sensibilidad estructural. Adems, TRXSS es fcilmente aplicable a las protenas en solucin acuosa con la ayuda de modelos tericos y por lo tanto es apropiado para la investigacin de la dinmica estructural de protenas en fisiolgica condiciones. Por lo tanto, TRXSS puede servir como una herramienta nica y eficaz los que las sondas en tiempo real dinmica estructural de protenas en solucin y complementa otras sondas de la dinmica de protenas.
SENSIBILIDAD ESTRUCTURAL DE TIEMPO RESUELTO- XRAY SOLUCIN DISPERSIN
TRXSS se basa en la dispersin elstica de los fotones de rayos X fuera atmica
pares en las molculas y su resolucin espacial est determinada por la Perfil de la intensidad de dispersin como una funcin del ngulo de dispersin. Aqu examinamos si la sensibilidad espacial de solucin de rayos X dispersin es lo suficientemente alta como para detectar los cambios conformacionales
implicados en transiciones funcionales de una protena. Para ello, dinmica
molecular realizados (MD) simulaciones para cito-cromado c (Cyt c) y mioglobina (Mb) para resaltar estructural cambios de amplitudes grandes y pequeas, respectivamente. Para Cyt c, nos simulado el proceso de desplegado que se produce por las transiciones a travs de diversas conformaciones de diferentes tamaos. El mximo desviacin de la raz cuadrada media de las posiciones de los tomos C (C-RMSD) entre la estructura desplegada simulado y el nativo estructura era 10,2 . Por diversas conformaciones desplegadas generada por la simulacin MD como se muestra en la Figura 2a, se curvas de dispersin esttica tericos calculados utilizando Crysol18 y posteriormente obtenidas curvas de dispersin de la diferencia conformaciones desplegadas restando la dispersin esttica curva de la estructura plegada nativa. La dispersin de la diferencia curvas exhiben caractersticas oscilatorias en un q-rango de 0 a 0,3 A-1 La intensidad de dispersin en esta regin de ngulo pequeo llamado pequeas ngulo X-ray solucin de dispersin (SAXS) es sensible a la variacin en la forma general y las dimensiones de una protena. En consecuencia, la Figura 2 muestra claramente que la amplitud de la curva de diferencia de dispersin en la regin de SAXS aumenta gradualmente a medida que la conformacin de Cyt c cambia hacia el estado desplegado, lo que indica que el cambio en la conformacin global de una protena puede ser fcilmente detectado por TRXSS. Para Mb, probamos diferentes conformaciones utilizando el MD simulacin. En comparacin con el caso de Cyt c, la estructural variacin de Mb fue restringido a un grado mucho menor, y dos conformaciones representativas se muestran en la Figura 2b tienen C-RMSD de slo el 0,4 . Como puede verse en la Figura 2b, la diferencia curvas de dispersin para las dos conformaciones representativas muestran caractersticas oscilatorias en una q-intervalo de 0,2 a 1,0 -1 intensidad de dispersin en esta regin de gran ngulo llamado ngulo amplio X-ray dispersin de la solucin (WAXS) es sensible a la pequea amplitud movimientos de una protena. Por consiguiente, las formas de la diferencia dispersin curvas cambian significativamente con el cambio en el conformacin de Mb, especficamente sutil reordenamiento de hlices constituyendo la protena. Este resultado muestra que incluso una pequea variacin de la conformacin de la protena se puede detectar con sensibilidad por el cambio de amplitud de la curva de diferencia de dispersin en el WAXS regin y por lo tanto demuestra que TRXSS tiene un potencial para detectar tanto grandes como pequeos cambios estructurales de una protena. Aqu observamos que TRXSS es sensible a los cambios en el mundial conformacin de las protenas, por ejemplo, terciaria y cuaternaria cambios estructurales, y por lo tanto su subangstrom estructural sensibilidad slo se aplica a los movimientos de estructuras secundarias (por ejemplo, -hlice). En contraste, de rayos X de resolucin temporal cristalografa puede detectar cambios estructurales a nivel atmico, que Es decir, los movimientos de los tomos individuales. En este sentido, tiene TRXSS resolucin espacial limitada en comparacin con la radiografa de resolucin temporal cristalografa.
ANLISIS ESQUEMA DE TIEMPO RESUELTO-DATOS DE
DISPERSIN Aunque las simulaciones de la seccin anterior demuestran que los cambios estructurales en una protena pueden ser detectados fcilmente por el diferencia dispersin curvas, sigue siendo un reto para extraer el cambios estructurales detallados de la protena a partir de la dispersin curvas. El primer paso hacia la identificacin de las estructuras 3D de la intermedios de protenas es extraer las curvas de diferencia de la dispersin que reflejan directamente las caractersticas estructurales de la reaccin intermedios y la cintica de transicin entre ellos. Esta tarea puede llevarse a cabo por el anlisis cintico basado en singular descomposicin de valor (SVD) y el anlisis de componentes principales(PCA), que nos permite dilucidar la dinmica estructural de protenas, incluyendo la diferencia de dispersin curvas de especies estructuralmente distinguibles, la llamada especies asociadas diferencia curves.19,20 dispersin Una vez se obtienen la diferencia en especies asociadas curvas de dispersin, que pueden ser utilizados para revelar los detalles de los cambios estructurales entre la protena intermediado el uso de herramientas de anlisis estructural se describen a continuacin. Ab Initio Reconstruccin de Conformacin Global Protein La forma molecular de una protena intermedia se puede extraer fcilmente de la diferencia de las especies asociadas a la dispersin de la curva por el mtodo de reconstruccin forma utilizada en el anlisis convencional SAXS. En primer lugar, una curva de dispersin "esttica" de especies asociadas se construye para cada intermedio mediante la adicin de una curva de dispersin esttica para el estado fundamental a la diferencia de las especies asociadas a escala dispersin curva. Entonces, de la esttica especies asociadas curva de dispersin, una funcin de distribucin par, P (r), y el radio de giro, Rg, se obtienen para cada especie intermedios por parte de la Fourier indirecta utilizando la transformada de software.21 GNOM Finalmente, utilizando la funcin de distribucin de par ptimo y la especie-asociado curva de dispersin esttica, el modelado de cuentas ab initio es implementado para reconstruir la forma molecular de la intermedia mediante el software.22 Dammin En el ab initio reconstruccin forma de una protena, la estructura de la protena es descrito como una coleccin de tomos de taln densamente empaquetadas dentro de una volumen limitado. La configuracin espacial de azar tomos de grano orientado es variada hasta que la discrepancia entre la curva de dispersin esttica especies-asociado y el terico curva de dispersin calculado para los tomos de taln se reduce al mnimo. Por cada diferencia curva de dispersin de las especies asociadas, esta reconstruccin procedimiento de construccin se repite varias veces para hacer una estructura de la piscina que refleja la fluctuacin estructural de la protena. A partir de esta estructura de la piscina, la forma representativa de la protena se reconstruye para determinar una estructura promedio de cada intermedio. Refinamiento estructural ayuda de Modelado de cuerpo rgido Adems de la forma molecular, estructuras ms detalladas de la intermedios de protenas se pueden obtener mediante la realizacin estructural refinamiento con la ayuda de modelado de cuerpo rgido aplicado a la diferencia dispersin patrones en ambas regiones SAXS y WAXS.
Este mtodo se basa en la suposicin de que el corto-orden unidades
estructurales de la protena, por ejemplo, alfa-hlices, en el estructura cristalina, que se usa como la estructura inicial, son mantenido como cuerpos rgidos en solucin. Una vez que se divide la totalidad protena en varios cuerpos rgidos, podemos encontrar el ptimo posiciones y orientaciones de los cuerpos rgidos que producen una curva de dispersin terica ajustada la dispersin experimental curva manteniendo al mismo tiempo estabilidades qumicas de la protena. Por la optimizacin, que minimizar el valor de una funcin objetivo, E, definida por una suma de (1) un valor de 2 que representa la discrepancia entre las curvas de dispersin tericos y experimentales y (2) un valor de penalizacin que representa la inestabilidad qumica. Evitar quedar atrapado en los mnimos de energa local, la minimizacin es llevado a cabo por diversas estructuras iniciales generadas por aleatoriamente mover los cuerpos rgidos en una estructura cristalogrfica plantilla. Los menor valor de la funcin objetivo se busca basa en un Monte Carlo algoritmo de simulacin, que se mueve cuerpos rgidos al azar. Por el minimizacin de diversas estructuras iniciales, seleccionamos la protena estructuras que dan valores de la funcin objetivo debajo de un cierto umbral como estructuras candidatos de una protena intermedia. El esquema general del anlisis de los datos para los datos de TRXSS protenas se resumen en la figura 3. En las secciones siguientes, se presentan dos ejemplos representativos donde el estructural dinmica de transiciones estructurales de protenas fotoinducida eran revelado utilizando los mtodos de anlisis descritos anteriormente.
GLOBAL Cambios conformacionales:
SEALIZACIN DE PROTENAS AMARILLO fotoactivos Como ejemplo de demostrar la idoneidad de TRXSS a investigar los cambios conformacionales globales de las protenas, que investigado la fotorreaccin de la protena amarilla fotoactivo (PEP). PEP es un fotorreceptor de luz azul y sirve como una seal mdulo de transduccin que convierte los estmulos de luz externas en una seal biolgica (Figura 4a) 0.23 En la absorcin de la luz azul, PEP se somete a un proceso de sealizacin que no acompaa a slo el isomerizacin-trans-cis a del cromforo, cido p-cumrico (PCA), sino tambin el cambio en la conformacin global de la matrix.6,24-26 protenas tanto, PEP es un buen sistema para que demuestra la sensibilidad estructural de TRXSS for global cambios estructurales. Mediante la realizacin de anlisis cintico en el TRXSS seales de tipo salvaje PEP muestran en la Figura 4b, 19 se extrajo el cintica de la fotociclo PEP (Figura 4c). Especficamente, la anlisis cintico cedi cinco componentes cinticos (10 microsegundos, 279 mu s, 1,3 ms, 23 ms, 650 ms) y asociados con la estructural transiciones entre cuatro intermedios (denominado pR1, pR2, PB1, y pB2) que constituye el fotociclo de PEP. A partir de la cintica anlisis, hemos extrado la diferencia de dispersin de las especies asociadas curvas (Figura 4D), que contienen la informacin sobre la las estructuras de los productos intermedios transitorios, y dependiente del tiempo poblaciones de intermedios individuales (Figura 4E). El especies curvas de diferencia de dispersin asociados en la figura 4d muestran
amplitudes significativas en la regin de ngulo pequeo de 0,04 a 0.3 A-1 Que
indica el cambio en la conformacin global de la protena entera. Extraer el conformacional Cambios Globales Si bien podemos tener una estimacin aproximada del cambio estructural de un protena de la patrn oscilatorio de una dispersin de diferencia curva, una imagen ms intuitiva puede obtenerse mediante la caracterizacin la forma de una molcula de protena en el espacio real. Para ello, anlisis estructural realizado basado en la forma ab initio reconstruccin como se describe en una seccin anterior. De acuerdo a el resultado de la reconstruccin forma mostrada en la Figura 5a, una lado de la protena sobresale en las transiciones a la pR1 y pR2 productos intermedios, y el saliente crece gradualmente con la progreso de la fotociclo, resultando en la pB2 intermedio con el volumen mximo de protena estimado a partir del radio de giro (Rg). En particular, la forma molecular de pB2 est en buenasacuerdo con la estructura atomista de sealizacin putativo estado de tipo salvaje del PEP (AP cdigo 2KX6) determinada a partir de un combinacin de mltiples sondas estructurales (ciervo, RMN, y X-rayos de dispersin) 0.27 Este buen acuerdo confirma la integridad de la conformacin de la protena reconstruido a partir de los datos TEXAS solo. La parte sobresaliente observado en todos los productos intermedios de la PYP fotociclo fue asignado a la regin N-terminal. Comparativa de Cintica y Dinmica Estructural en la solucin y fases cristalinas. La cintica extrada de los datos TRXSS proporciona una rara oportunidad de comparar directamente el efecto del ambiente sobre la Cintica de la protena. Result que, como se muestra en la Figura 5a, b, la modelo cintico para la fotociclo de PEP en fase de solucin determinado por TRXSS es consistente con la de cristalino fase obtiene por Laue crystallography.6 de rayos X de resolucin temporal En concreto, el PEP fotoexcitado tanto cristalina y fases de solucin experimenta grandes bifurcados transiciones a travs de dos tipos de productos intermedios desplazadas al rojo (PR1 y PR2) a la azul- desplazado pB1 intermedia en escalas de tiempo comparables. En el otro lado, la transicin pB1 pB2, lo que conduce a la formacin del estado de sealizacin, exhibe dinmicas muy diferentes en los dos fases, es decir, la pB1 pB2 transicin se produce en 1,3 ms en solucin, pero es mucho ms lento en cristal (18 ms). Por el contrario, la recuperacin de la pG de pB2 se acelera en la fase cristalina. Para comparar la magnitud de los cambios conformacionales con el progreso de la fotociclo PEP en cristal y solucin, trazada en la figura 5c el cambio de Rg para cada intermedio respecto a la estructura de PG. Se puede observar que el cambio de Rg en (0,9 ) es de 1 orden de magnitud mayor que en el cristal (0,07 ). El movimiento de la regin N-terminal es restringido en el cristal debido a un contacto de cristal mientras que la N-terminal puede moverse libremente en solucin. El lento pB1 pB2 transicin que acompaa pequeo cambio conformacional y la recuperacin acelerada de pG en la fase cristalina directamente demuestran cmo los contactos de cristal afectan a la estructural dinmica de la PEP.
Transiciones estructurales SUTILES: alostricos
TRANSICIN DE HEMOGLOBINA homodimricos Como se muestra arriba, PEP implica bastante grande conformacional cambios, pero muchas protenas efecto nico pequeo estructural perturbaciones. Por ejemplo, las estructuras cristalinas de la oxigenada desoxigenadas (T) tensos, estados de homodimrico (relajado, R) y hemoglobina (HBI), caracterizada por crystallography de rayos X exhibir una pequea diferencia estructural, dando slo el 0,6 RMSD. HBI tiene una estructura ms simple que la hemoglobina (Figura 6a) y exposiciones ligando cooperativa actividad de unin, y por lo tanto es una buena sistema modelo para el estudio de los cambios estructurales alostricos. Sin embargo, la dinmica estructural detallada de HBI asociados con el efecto alostrico no haba sido entendido por completo. A abordar estas cuestiones y examinar el efecto de la mutacin en la transicin estructural de protenas, se aplic a la TRXSS HBI protena de tipo salvaje lig con ligandos CO, HBI (CO) 2, y su mutante F97Y, donde Phe97 en cada subunidad fue reemplazado por tirosina. Se ha sabido que el residuo Phe97 es volteado durante el transition.28 R-T Cintica de HBI y el efecto de la mutacin. Seales TRXSS de tipo salvaje y F97Y HBI son muy diferentes de entre s despus de 1 microsegundo Como puede verse en la Figura 6b, que muestra la efecto de la mutacin sobre la dinmica estructural de la alostrico transicin. Mediante la realizacin de anlisis cintico basado en SVD y PCA en las seales TRXSS, hemos extrado la cintica de la alostrico transicin. Se identificaron tres intermedios estructuralmente distintas I1 denomina, I2, e I3 que sufren transiciones estructurales a raz de una modelo cintico comn tanto de tipo salvaje y F97Y (Figura 6c) 0,20 La cintica mostrar que la transicin de I2 I3 tiene de dos a constantes de tiempo dependiendo del grado del ligando la disociacin y por lo tanto revelan que el solos y liganded formas unliganded de cada accin intermedia de la misma estructura, proporcionando evidencia directa de que la fotolisis ligando de slo unos nica subunidad induce el mismo cambio estructural como el fotlisis completa de ambas subunidades hace. adems, el cintica global se acelera por un orden de magnitud en F97Y, excepto para la transicin de la I1-I2 y de la geminada-I2 a I1- recombinacin. Especialmente, en F97Y, la transicin R-T desde I2 a I3 se acelera significativamente y se convierte en ms rpido que el la recombinacin geminada, que resulta en la extincin prctica de la recombinacin geminada (Figura 6d). La aceleracin en F97Y es coherente con una afinidad de unin ligando ms fuerte del mutante. Las formas de tipo salvaje y F97Y tienen especies asociadas idnticos diferencia dispersin curvas para los intermedios I1 y I2 (figura 6b), que indica el efecto insignificante de la mutacin en el estructuras de I1 e I2. En contraste, la de tipo salvaje y la F97Y formas mutantes muestran distintivamente diferentes especies asociadas diferencia curvas de dispersin para el intermedio I3, lo que significa que la estructura de la I3 intermedia es perturbada en gran medida por el Mutacin F97Y. Para distinguir las dos estructuras diferentes de la I3 intermedia, les etiqueta como I3 y las formas mutantes F97Y, respectivamente. Dinmica Estructural de HBI
Las estructuras detalladas de los compuestos intermedios que intervienen en el
transicin alostrica de HBI se puede extraer mediante la realizacin de refinamiento estructural asistido por el modelado de cuerpo rgido en el Diferencia de dispersin curvas de especies asociadas de I1, I2, I3 F97Y como se describe en un section.20 anterior Desde el estructural I3 refinamiento, para cada intermediario, obtuvimos una serie de estructuras candidatos cuya terica curvas de dispersin as coincida con la correspondiente diferencia especies asociadas experimental ENCE dispersin curva como se muestra en la Figura 7a. Los detalles de los cambios estructurales terciarios de tipo salvaje HBI lata ser visualizado por parcelas de desplazamiento, que muestran el desplazamiento de residuos de aminocidos inducidas por una protena estructural transicin como una funcin de la secuencia de aminocidos. Los desplazamiento se define por la diferencia de distancia entre el tomo C en un residuo y el tomo de hierro del hemo en el mismo subunidad. Las parcelas de desplazamiento de las estructuras de candidatos intermedios individuales se muestran en la Figura 7b (panel superior), donde los desplazamientos de I1, I2 e I3 a HBI (CO) 2, I1 e I2, respectivamente. El desplazamiento promedio parcela de I1 respecto a HBI (CO) 2 muestra que el bucle CD (residuo, 50-59) y la hlice G se alejan del hemo, mientras que el E y F hlices se mueven hacia el hemo en la transicin de HBI (CO) 2 a I1. La trama desplazamiento de I2 en relacin con exposiciones I1 slo una ligera fluctuacin, lo que indica que la estructura terciaria permanece casi intacto durante la transicin de I1 a I2. Entonces el transicin desde I2 a I3 las hlices como se muestra en el diagrama de desplazamiento de I3 Las parcelas de desplazamiento de I3 de HBI desoxi (cdigo PDB 4SDH) con relacin a la estructura de HBI (CO) 2 (cdigo PDB 3SDH) son similares entre s, excepto para las regiones terminales, como se muestra en la Figura 7b (panel inferior). Esta observacin indica que la estructura terciaria de I3 es similar a la estructura del estado T en cristal. Cuanto menor desplazamiento de las hlices en las regiones terminales de HBI en el WT e I3 F97Y para la de tipo salvaje WT, y WT se calcularon en relacin WT acompaa a la reordenacin de todo WT y la estructura cristalogrfica WT con respecto a I2. fase cristalina se puede atribuir a los movimientos restringidas por los contactos de cristal. Subunidad Rotacin y contraccin de HBI Tambin cuantificado los cambios estructurales cuaternario utilizando un par de parmetros estructurales, el ngulo de rotacin y la subunidad la distancia entre los tomos de hierro de hemes. Esos dos parmetros estructurales son parmetros clave que describen cambio estructural cuaternario debido a la afinidad de unin ligando-de HBI es modulada por la rotacin de la subunidad y el hidrgeno red de enlace que conecta los dos hemes.30,31 Figura 7c muestra los ngulos de rotacin de la subunidad y las distancias hemo hemeen las estructuras candidatos de intermedios individuales. Los formacin de I1 e I2 no implica ninguna subunidad notable rotacin o contraccin de la distancia hemo-hemo. En contraste, la transicin desde I2 a I3 (ngulo de rotacin subunidad = 3,4 ) y la disminucin de la heme- distancia hemo (un 1,3 ). Sobre la base de este resultado, llegamos a la conclusin de que I1 e I2 corresponden a los estados R y I3 estado. Para F97Y HBI, podemos ver que la
formacin de I3 acompaa la rotacin subunidad 2,9 pero no implica
cualquier disminucin de la distancia hemo-hemo. El sin cambios distancia hem hem de I3 la presencia de Tyr97 frente a la interfaz en un form.28 desoxi
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS
En esta cuenta, hemos demostrado que TRXSS tiene estructural la sensibilidad suficiente para probar la gran y pequea amplitud movimientos de protenas en tiempo real, por ejemplo, el cambio en el conformacin mundial e incluso terciaria y cuaternaria sutil cambios estructurales. Aunque TRXSS ha sido hasta ahora muy xito en la revelacin de la dinmica estructural de protenas en solucin, todava queda mucho margen de mejora. Por ejemplo, mediante la combinacin de TRXSS con simulaciones MD, 32 nos podrn obtener la informacin ms directa sobre la cintica de transicin y las vas a nivel atmico. Adems, teniendo en cuenta que la informacin estructural contenida en solucin resuelta en el tiempo los datos de dispersin es limitada en comparacin con la de cristalogrfica datos, una variedad de esquemas para aumentar el contenido de la informacin son en fase de desarrollo, tales como scattering33 anisotrpico y pesado etiquetado tomo. Adems, con el desarrollo de la libre de rayos X lseres de electrones (XFELs), la resolucin de tiempo y TRXSS34,35 crystallography36 de rayos X resuelta en el tiempo se ha mejorado abajo a escala de tiempo de femtosegundos. Mediante la realizacin de femtosegundo de rayos X la dispersin de la solucin en las instalaciones de XFEL, uno ser capaz de hacer una salto adelante para investigar la dinmica ultrarrpida de protenas en subpicosegundo escalas de tiempo. WT acompaa a la rotacin de las subunidades F97Y puede explicarse considerando