Mtodos
CASTp
Como a NS3/NS2 serino protease no possui ligante cristalografico que permite
a identificao imediata do stio ativo da enzima, com isso, para prev possiveis stios
de ligao e dos resduos importantes da protena foi usado o servidor on-line CASTp
[12].
Docagem Molecular
A docagem molecular um mtodo utilizado para predizer o modo de ligao de
pequenas molculas na cavidade de interao de macromolculas, sendo capaz de
determinar as mudanas de conformao do ligante por meio de interao no alvo de
modo a formar um complexo receptor-ligante [13]. O processo de docagem compreende
duas etapas principais: o algoritmo de busca e a funo de pontuao, que esto
relacionadas predio do posicionamento (conformao e orientao) no interior da
enzima, alm de avaliao da afinidade de ligao [14-16]. Esta ferramenta
comumente empregada para selecionar estruturas promissoras para a avaliao
experimental por meio de procedimento de uma triagem virtual [13].
Os clculos de docagem molecular foram realizados com o modelo
cristalogrfico da enzima NS3/NS2B serino protease, recuperada do PDB com o cdigo
2FOM, utilizando os programas DOCK 6.5 [17], que usa o algoritmo incremental para a
realizao dos clculos; Molegro Virtual Docker (MVD 5.0) [18], que emprega o
algoritmo gentico com predio de cavidades e o AutoDock Vina (Vina 1.1.1) [19], que
utiliza o algoritmo gentico. Como a enzima de dengue no possui ligante
cristalogrfico o uso de diferentes programas de docagem molecular contribuem para
localizao do stio ativo da enzima [20]. Todas as simulaes utilizaram o cofator
NS2B que necessrio para a ativao da NS3 serino protease [5].
Para a realizao da docagem no programa DOCK 6.5 [17], a todos os ligantes
foram adicionados tomos de hidrognio e calculadas as cargas pelo mtodo AM1-BCC
[21] no programa Chimera [22]. Para o alvo, usando o programa dms [23], foi gerada
uma superfcie molecular de Connolly [24], e o mdulo SPHGEN [25] foi usado para
criar as esferas complementares superfcie da protena em um raio de 8 do ligante.
Em seguida, o mdulo grid [26] do programa DOCK 6.5 foi usado para gerar uma caixa
tridimensional localizada sobre o stio ativo da enzima com o tamanho de 60 para
englobar as esferas selecionadas. Finalizada a etapa de preparao do stio e dos
ligantes, iniciou-se a docagem flexvel e subsequente minimizao dos ligantes no stio
ativo da enzima, a qual foi mantida rgida.
No programa MVD 5.0 [18] o alvo e os ligantes foram preparados atravs do
mdulo de preparao padro do MVD. Para cada complexo, foram adicionados tomos
de hidrognio e as cargas atmicas parciais padres do programa. Os clculos de
Dinmica Molecular
A Dinmica Molecular (DM) uma ferramenta computacional usada na
Qumica Medicinal para o planejamento de frmacos [31]. A DM uma extenso da
Mecnica Molecular, onde o comportamento dinmico de um sistema molecular
simulado atravs da integrao numrica das equaes de movimento e fornece
informaes sobre o comportamento dinmico microscpico, dependente do tempo e
dos tomos individuais que compem o sistema [31]. Esta tcnica tem sido usada
extensivamente para auxiliar o planejamento de novos ligantes de um alvo teraputico
[31].
O mtodo hbrido QM/MM utiliza a possibilidade de se tratar sistemas
biomoleculares bastantes extensos e calcular a sua energia a um baixo custo
computacional (mtodos MM), aliados a capacidade de resolver problemas de reaes
Resultado e Discusso
Estrutura
Vina
17
-7,70
MVD
-93,33
Ranque
final
Ki
(M)
Interaes
com resduos de aminocidos
Dock
Vina
MVD
Dock
-42,26
23,0
Ser135,
His51,
Asp75,
Gly151
Asp167
Asn152
Thr120,
Asn167
Ile165,
Val147
Gly153
Asn167
2,20
25
-8,20
-98,97
-38,27
2,24
46,6
His51,
Gly153,
Try150,
Phe130
68
-8,00
-95,71
-38,12
2,12
36,8
Ser135,
His51
Figura 2: Mapa do potencial eletrosttico obtidos do programa Molden dos ligantes 17,
25 e 68, respectivamente
Isso pode ser observado, j que todos os ligantes fizeram interao com as
regies nucleofilicas presentes na poro amida da estrutura. O carbono da carbonila da
ligao peptdica dos inibidores peptidicos atacado pelo nucleofilo (serina ativada), o
oxianion inicia uma reao de eliminao que cliva a ligao peptidica, liberando o
novo N-terminal da protena, protonado pela His51 como pode ser observado no
resultado de docagem no programa Autodock Vina. Outras regies inibidoras
importantes so capazes de formar e estabilizar as interaes no covalentes com o stio
ativo da enzima.
Depois de 10000 ps de simulao de DM com o hbrido QM / MM, a anlise da
estrutura foi realizada sobre o complexo enzima-inibidor por meio da comparao dos
dados de RMSD.
(A)
(B)
(C)
Os resultados da anlise de decomposio de energia de interao por resduo
para os inibidores 17, 25 e 68 mostram que esses inibidores complexados a enzima
interagem fortemente com os resduos presentes na ala flexvel [45] da NS3/NS2B
serino protease do vrus da dengue, Ser34, Trp50, Lys73, Lys74 e Gly151, sendo a
Lys74 fortemente repulsiva.
As proteases sernicas em geral apresentam um stio ativo circundado por duas
alas flexveis em forma de um bolso que permite o acesso de substratos ou inibidores
com formas complementares[46]. A conformao da ala de inibio complementar ao
stio ativo da enzima a ser inibida permite uma ligao bastante forte entre a enzima e o
inibidor [46, 47].
O tomo de Lys74 poderia ser responsvel elevada atividade de inibio. Uma
vez que Lys74 est diretamente ligada a Asp75, a formao de uma ligao de
hidrognio entre Lys74 e o inibidor poderia induzir uma mudana conformacional do
Asp75, em particular, ou da regio da trade cataltica, em geral. Isso, provavelmente,
poderia interromper a transferncia de eltrons necessria para a ligao do substrato
com o stio ativo, portanto, afetando a atividade da protease. A interao entre os
ligantes com resduo de Lys73 pode contribuir diretamente para a mudana
conformacional do stio ativo, porm de uma forma menos intensa que o resduo de
Lys74 [48].
As interaes atrativas de energia de interao entre os ligantes e a protena
foram identificadas para os resduos de Ser34 (Figura 3A), Ser127 (Figura 3C) e Ser131
(Figuras 3A e 3B) so importantes para estabilidade do inibidor no stio alostrico da
enzima. J a interao com o resduo de Gly151 (Figuras 3A, 3B e 3C) corrobora com
os resultados da literatura e com os resultados obtidos na docagem molecular.
A serina protease do vrus da dengue apressenta outros locais de ligao alm do
stio ativo da enzima. Afim de identific-las foi utilizado o servidor on-line CASTp
[12]. Nas cavidades identificadas na Figura 1 foram observados as regies do stio ativo
e do stio alstrico da proteina.
Figura 1: Cavidades para a enzima NS3/NS2B serino protease do vrus da
dengue obtidas no servidor on-line CASTp
Concluso
As molculas derivadas da acrilamida usadas neste estudo, atravs da docagem
molecular confirmaram as informaes presentes na literatura, onde houve a
conservao de resduos importantes para a inibio da enzima, como a trade cataltica
His51, Ser135, Asp75. Atravs dessa anlise os trs compostos que apresentaram os
maiores valores de energia, constante de inibio e interaes foram submetidos
dinmica molecular. Atravs da dinmica molecular da estrutura do receptor-ligante, os
trs ligantes, 17, 25 e 68, selecionados para inibir a enzima NS3/NS2B serino protease
do vrus da dengue, atravs do grfico de RMSD, com o tempo de simulao de 10000
ps mostraram que os sistemas esto estveis. A decomposio de energia de interao
por resduo para os inibidores 17, 25 e 68, mostrou que os trs ligantes fizeram
interao com Ser34, Trp50, Lys74 e Gly151, sendo a Lys74 fortemente repulsiva. Essa
interao repulsiva indica que a inibio ocorre em um possvel stio alostrico da
enzima. Atravs desses resduos foi possvel observar que, por se tratar de uma serino
protease a ala flexvel da enzima fez interao com todas as estruturas, j que, em
geral, esse tipo de enzima apresenta um stio ativo circundado por duas alas flexveis
em forma de um bolso que permite o acesso de substratos, isso mostra a potencialidade
desses compostos para a inibio do vrus da dengue.
Resumo
A dengue uma doena infecciosa aguda transmitida pelo mosquito do gnero Aedes, sendo que
as reas de maior incidncia no mundo so regies tropicais e subtropicais. No h tratamentos
especficos, apenas so tratados os sintomas. A enzima NS3/NS2B serino protease (cdigo
PDB: 2FOM) essencial para o ciclo de vida do vrus, por isso um alvo promissor para o
desenvolvimento de frmacos contra a dengue. Derivados da acrilamida apresentam um grupo
aril e uma dupla ligao que so importantes para a interao da enzima do vrus da dengue.
Assim, derivados da acrilamida que apresentam valores de Ki foram submetidos docagem
molecular utilizando os programas Autodock Vina 1.1.1, Molegro Virtual Docker 5.0 e Dock
6.3. Atravs dos resultados da energia de docagem e interao no programa Ligplot+ e dos
valores da constante de inibio, foi possvel observar que os ligantes mais bem pontuados
fizeram interao de hidrognio com os resduos His51, Ser135, Asp75, Gly151 e Gly153,
sendo estas ligaes responsveis pela estabilizao dos ligantes no sitio da enzima. A partir
desses resultados, trs ligantes foram selecionados para a simulao da dinmica molecular
QM/MM, onde se observou atravs do grfico do RMSD que os ligantes tendem a estabilizao
no stio da enzima e atravs da decomposio de energia de interao por resduo foi
REFERNCIAS
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